Der cGMP-Signalweg ist als einer der Hauptregulatoren von diversen Funktionen in Eukaryoten bekannt; allerdings ist seine Funktionsweise in Protozoen wenig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Guanylatcyclase, gekoppelt mit N-terminalen P4-ATPase, in intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii gemeldet. Eine in silico-Analyse wies auf eine Aktivierung der Guanylatcyclase durch Heterodimerisierung ihrer Cyclasedomänen hin und ermöglichte wertvolle Einsichten in mögliche Funktionen ihrer ATPase-Domäne. Dieses Protein (477-kDa) bezeichnet als TgATPaseP-GC in dieser Studie, lokalisiert in der Plasmamembran am apikalen Pol des Parasiten. TgATPaseP-GC ist unempfänglich gegenüber genetischer Deletion und seine CRISPR/Cas9 unterstützte Spaltung beendet den lytischen Zyklus von T. gondii vorzeitig. Darüber hinaus reduzierte ein Cre/loxP-vermittelter Knockdown von TgATPaseP-GC die Synthese von cGMP im Tachyzoiten und inhibierte das Parasitenwachstum aufgrund von Beeinträchtigungen Motilitäts-abhängiger Prozesse des Austretens und Eindringens. Trotz seiner zeitlich beschränkten Funktion ist TgATPaseP-GC konstitutiv während des ganzen lytischen Zyklus exprimiert, welches eine post-translationale Regulierung des cGMP-Signalweges bedingt. Nicht zuletzt impliziert das Vorhandensein von TgATPaseP-GC-Orthologen in anderen Alveolata eine divergente Umfunktionierung der cGMP-Signalwege in Protozoen. Darüber hinaus wurde ein optogenetischer Ansatz verwendet, um den cGMP-Weg durch eine photo-aktivierte Rhodopsin-Guanylat-Cyclase (RhoGC) in T. gondii zu exprimiert. Dieses System erlaubte eine kontrollierte Erhöhung von cGMP durch Licht in einer schnellen und reversiblen Weise. Die Anregung von RhoGC stimulierte signifikant die Parasitenmotilität, deren Auswirkung auch mit erhöhten Eindringen und Austreten überwacht wurde; im Gegensatz zum genetischen Knockdown von TgATPaseP-GC. Das System ermöglicht die Vermittler des cGMP-Signalwegs durch Phosphoproteomics zu identifizieren. / cGMP signaling is known as one of the master regulators of diverse functions in eukaryotes; however, its architecture and functioning in protozoans remain poorly understood. In the scope of this thesis, an exclusive guanylate cyclase coupled with N-terminal P4-ATPase was reported in an obligate intracellular parasite Toxoplasma gondii. In silico analysis indicated an activation of the guanylate cyclase by heterodimerization of its two cyclase domains and offered valuable insights into possible functions of its ATPase domain. This bulky protein (477-kDa), termed in this study as TgATPaseP-GC to reflect its envisaged multifunctionality, localizes in the plasma membrane at the apical pole of the parasite. TgATPaseP-GC is refractory to genetic deletion, and its CRISPR/Cas9-assisted disruption aborts the lytic cycle of T. gondii. Besides, Cre/loxP-mediated knockdown of TgATPaseP-GC reduced the synthesis of cGMP in tachyzoites and inhibited the parasite growth due to impairments of motility-dependent egress and invasion events. Notably, despite its temporally restricted function, TgATPaseP-GC is expressed constitutively throughout the lytic cycle, entailing a post-translational regulation of cGMP signaling. Not least, the occurrence of TgATPaseP-GC orthologs in several other alveolates implies a divergent functional repurposing of cGMP signaling in protozoans. Furthermore, an optogenetic approach was utilized to induce cGMP pathway by a photo-activated rhodopsin-guanylate cyclase (RhoGC) in T. gondii. The system enabled a light-control of cGMP elevation on crucial steps of lytic cycle in a fast, spatial and reversible manner. Excitation of RhoGC significantly stimulated the parasite motility of which impact was also monitored with an increased host-cell invasion and egress; as opposed to the genetic knockdown of TgATPaseP-GC. Having an established optogenetic system in the parasite allows to identify downstream targets of cGMP signaling via phosphoproteomic analysis.

Les antipsychotiques sont administrés chroniquement pour prévenir de nouveaux épisodes psychotiques dans la schizophrénie. Ces médicaments diminuent l’activité des récepteurs dopaminergiques de type 2. Diminuer chroniquement la transmission dopaminergique induit des compensations pouvant mener à une sensibilisation du système dopaminergique. Cette sensibilisation pourrait diminuer l’efficacité des antipsychotiques et exacerber la psychose. Chez le rat, la sensibilisation dopaminergique induite par les antipsychotiques augmente les effets psychomoteurs et motivationnels des agonistes dopaminergiques. Le premier objectif de la présente thèse était de caractériser les substrats neuronaux régulant l’expression de la sensibilisation dopaminergique évoquée par les antipsychotiques. Ceci est important afin d’améliorer le traitement à long terme de la schizophrénie. Pour ce faire, des rats ont reçu un traitement cliniquement pertinent à l’antipsychotique halopéridol. Ce traitement sensibilise aux effets psychomoteurs de l’agoniste dopaminergique d-amphétamine. Cet indice comportemental de sensibilisation dopaminergique a été utilisé pour déterminer les contributions spécifiques du système dopaminergique et l’implication des effets centraux de la d-amphétamine. Puisqu’il y a une relation étroite entre le stress et l’activité dopaminergique, les réponses liées au stress ont également été mesurées. Ceci est important, puisque le stress exacerbe la psychose. La présente thèse démontre que les récepteurs dopaminergiques régulent de manière distincte la sensibilisation dopaminergique. En effet, la transmission via les récepteurs de type 2 exacerbe cette sensibilisation, alors que la transmission via les récepteurs de type 1 la tempère. Également, la présente thèse suggère que des processus périphériques sont nécessaires à l’expression de la sensibilisation dopaminergique. De plus, la sensibilisation pourrait augmenter les réponses au stress. En effet, cette sensibilisation est renversée lorsque la synthèse de l’hormone de stress corticostérone est inhibée, en plus d’être associée à certains comportements suggérant un stress augmenté. Chez le rat, la sensibilisation dopaminergique évoquée par les antipsychotiques potentialise également les effets motivationnels des stimuli conditionnés prédisant des récompenses. Lorsque ces stimuli acquièrent trop de valeur motivationnelle, ils peuvent motiver des comportements pathologiques. Ainsi, une potentialisation de la valeur motivationnelle des stimuli conditionnés provoquée par les antipsychotiques pourrait avoir des implications importantes dans des processus motivationnels anormaux dans la schizophrénie, tels que la psychose et la forte prévalence de toxicomanie. Ainsi, le deuxième objectif de la présente thèse était d’étudier les mécanismes neurobiologiques régulant les effets comportementaux des stimuli conditionnés, particulièrement le rôle du noyau basolatéral de l’amygdale. Ici, le rôle de ce noyau a été étudié chez des animaux non traités aux antipsychotiques, puisque sa contribution reste incomprise. Ce travail pourrait révéler des mécanismes neurobiologiques potentiellement impliqués dans la sensibilisation dopaminergique évoquée par les antipsychotiques. La présente thèse démontre que l’activation optogénétique de l’amygdale basolatérale potentialise les effets comportementaux des stimuli conditionnés, en augmentant leur valeur motivationnelle et leur capacité à guider le comportement vers des récompenses imminentes. Ainsi, une activité excessive de l’amygdale basolatérale pourrait attribuer trop de pouvoir aux stimuli conditionnés, et ceci pourrait jouer un rôle dans l’état motivationnel anormal provoqué par les antipsychotiques. La présente thèse identifie de nouveaux mécanismes par lesquels les antipsychotiques et les stimuli conditionnés favorisent des réponses pathologiques. / Schizophrenia requires long-term antipsychotic treatment to prevent psychosis relapse. Antipsychotic drugs temper psychotic symptoms by reducing dopamine D2 receptor-mediated signalling. Chronically decreasing dopamine transmission produces neuronal compensation leading to supersensitivity to dopamine stimulation. In patients, this dopamine supersensitivity would compromise antipsychotic efficacy and exacerbate psychotic symptoms. In laboratory animals, antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity enhances the psychomotor and reward-enhancing effects of dopamine agonists. The first objective of the present thesis was to characterize the biological substrates mediating the expression of antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity, a necessary work for developing better long-term treatment strategies. To do so, rats were chronically exposed to a clinically relevant antipsychotic treatment regimen, using the drug haloperidol. Haloperidol produces dopamine supersensitivity, as indicated by an exaggerated psychomotor response to the dopamine agonist d-amphetamine. This behavioural index of supersensitivity was used to examine the specific contributions of the dopamine system and the central effects of d-amphetamine. Given that there is a close relationship between stress and dopamine activity, it was also determined whether antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity alters stress-like responses. This is important to consider because stress is a contributing factor to psychosis relapse. The present thesis first reveals that D1- and D2-mediated transmissions contribute distinctively to the expression of antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity, with D2 transmission promoting this supersensitivity and D1 transmission tempering it. The present thesis also provides evidence that peripheral processes play a necessary role in dopamine supersensitivity. Additionally, antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity could potentiate stress-like responses. Indeed, the expression of supersensitivity is reversed by inhibition of the synthesis of the stress hormone corticosterone and is linked with some signs of heightened stress-related behaviours. In rats, antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity potentiates the incentive motivational effects of reward-predictive conditioned stimuli. When these stimuli acquire too much motivational value, they motivate maladaptive responses. Hence, the increased motivational value of conditioned stimuli elicited by antipsychotic exposure could be involved in impaired motivational processes found in schizophrenia, such as psychosis and the greater vulnerability to drug addiction. Thereby, the last goal of the present thesis was to investigate the neurobiological substrates mediating the behavioural effects of reward-predictive stimuli, with a special focus on the role of the basolateral nucleus of the amygdala. This was investigated in antipsychotic-naïve rats because there are important caveats in our current understanding of the functional role of the basolateral amygdala. Such investigation could give novel insights on the neurobiological effects of antipsychotic-evoked dopamine supersensitivity. Here it is shown that optogenetic stimulation of basolateral amygdala neurons potentiates the behavioural effects of conditioned stimuli, by increasing their motivational value and their ability to guide behaviour toward impending rewards. The implication for this is that excessive activity in the basolateral amygdala could attribute too much motivational power to conditioned stimuli, and this could be involved in the abnormal motivational state produced by antipsychotic drugs. Taken together, the present thesis provides novel mechanisms by which antipsychotic drugs and reward-predictive stimuli promote maladaptive responses.

Les ganglions de la base (GB) forment un réseau de structures sous-corticales impliquées dans la motricité volontaire, mais aussi dans des aspects plus cognitifs et motivationnels du comportement moteur. La dopamine est un neuromodulateur essentiel au bon fonctionnement de ce réseau. La synapse cortico-sous-thalamique (cortico-NST) est une synapse glutamatergique (excitatrice) transmettant les informations corticales au noyau sous-thalamique (NST), ce qui forme la première partie d’une des trois voies des GB : la voie hyperdirecte. La voie cortico-NST est impliquée dans des tâches de type « go-no-go » (arrêt d’un acte moteur débuté) et dans les effets bénéfiques de la stimulation cérébrale profonde du NST sur les symptômes de la maladie de Parkinson. Cependant, les propriétés des synapses cortico-NST ne sont pas connues. Ce manque d’informations provient, en partie, de l’anatomie particulière de cette voie, qui rend l’étude in vitro de la synapse cortico-NST difficile. L’utilisation de l’optogénétique nous a permis de contourner ce problème. En associant cette technique à l’électrophysiologie sur tranches de cerveaux de rongeur, nous avons mis en évidence un effet inhibiteur des récepteurs dopaminergiques D5 sur la transmission cortico-NST. Nous montrons également que les propriétés de plasticité à court terme de cette synapse lui permettent de réduire l’influence des messages corticaux à haute fréquence sur le NST. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent que l’optogénétique est un bon moyen d’étudier la synapse cortico-NST in vitro et contribuent à améliorer la compréhension des propriétés de la cette synapse. / Basal ganglia (BG) are a group of subcortical nuclei involved in action selection and in cognitive and motivational aspects of motor behavior. Dopamine is essential for proper functioning of BG. The cortico-subthalamic (cortico-STN) synapse is a glutamatergic (excitatory) synapse involved in signal transmission from cortex to subthalamic nucleus (STN). The cortico-STN synapse is the first synapse in the hyperdirect pathway, one of the three pathways of BG. Even if the cortico-STN pathway is involved in “go-no-go” tasks (stopping of an already started motor act) and in the beneficial effects of the high frequency stimulation of the STN on Parkinsonian symptoms, properties of the cortico-STN synapse are not well described. The lack of data is due, at least in part, to the specific anatomy of the cortico-STN pathway which does not allow the use of standard methods in vitro. The use of optogenetics allowed us to circumvent this issue. By coupling this approach with electrophysiology on brain slices in rodents, we show that dopaminergic D5 receptors stimulation reduces glutamatergic transmission at cortico-STN synapses. We also show that short-term plasticity properties of this synapse reduce the influence of high frequency cortical inputs on the STN. Our findings indicate that optogenetics enables studying the cortico-STN synapse in vitro and contributes to improving our knowledge of the properties of the synapse.

The Lateral Habenula (LHb) have been implicated in both reward-seeking behavior and in depressive disorders due to its modulatory effects on dopamine rich areas. Excitatory projections from LHb target GABAergic interneurons of both ventral tegmental area (VTA) and rostromedial tegmental nucleus (RMTg) and consequently provide strong inhibition on VTA‟s dopaminergic neurons. These reward related signals are provided to LHb from distinct neuronal populations in internal Globus Pallidus (GPi). Here by using a dual viral combination of an adeno-associated helper virus (AAV) and a genetically modified rabies virus that displays specific transsynaptic retrograde spread we are providing anatomical evidence for a strong innervations of the LHb by VGLUT2+ glutaminergic and SOM+ GABAergic GPi neurons. Our results provide the first direct evidence for both an excitatory and an inhibitory projection m, from GPi to the LHb. Given the importance of the LHb as a modulatory nucleus of the dopaminergic system, the definition of its connectivity and function will give valuable insights in the understanding of both reward-seeking behavior and depressive disorders.

The generation and application of human stem-cell-derived functional neural circuits promises novel insights into neurodegenerative diseases. These networks are often studied using stem-cell derived random neural networks in vitro, with electrical stimulation and recording using multielectrode arrays. However, the impulse response function of networks is best obtained with spatiotemporally well-defined stimuli, which electrical stimulation does not provide. Optogenetics allows for the functional control of genetically altered cells with light stimuli at high spatiotemporal resolution. Current optogenetic investigations of neural networks are often conducted using full field illumination, potentially masking important functional information. This can be avoided using holographically shaped illumination. In this article, we present a digital holographic illumination setup with a spatial resolution of about 8 µm, which suffices for the stimulation of single neurons, and offers a temporal resolution of less than 0.6 ms. With this setup, we present preliminary single-cell stimulation recording of stem-cell derived induced human neurons in a random neural network. This will offer the opportunity for further studies on connectivity in such networks.

Zellen benutzen Signalwege ein, um auf Änderungen in ihrer unmittelbaren Umgebung zu reagieren. Der Signalweg des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung vieler zellulärer Prozesse, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung und Migration. Obwohl die Hauptkomponenten der TGFβ-Signalgebung in den letzten Jahrzehnten identifiziert und erforscht wurden, ist das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens durch das Fehlen von Methoden eingeschränkt, die die Steuerung der TGFβ-Signalgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein optogenetisches System (das optoTGFβ-System) entwickelt, bei dem Licht dazu verwendet wird, die TGFβ-Signalgebung zeitlich und räumlich präzise zu steuern. Erstens wurde die Funktionalität des optoTGFβ-Systems durch Vergleich mit dem endogenen TGFβ-Signalsystem überprüft. Zweitens wurde durch das gleichzeitige Überwachen der subzellulären Translokation der Rezeptoren und der Smad-Proteine mittels „Live Cell Imaging“ gezeigt, dass die TGFβ-Signalgebung durch Modulation der Lichtstimulationen in einzelnen Zellen spezifisch aktiviert werden kann. Drittens wurde in Kombination mit der mathematischen Modellierung die Dynamik der TGFβ-Signalgebung im optoTGFβ-System quantitativ bestimmt. Die räumliche und zeitliche Präzision der optischen Kontrolle machen das optoTGFβ-System zu einem neuartigen und leistungsfähigen Methode für die quantitative Analyse und Manipulation von TGFβ-Signalen auf Einzelzellebene. / Cells employ signaling pathways to make decisions in response to changes in their immediate environment. Transforming Growth Factor β (TGFβ) signaling pathway plays pivotal roles in regulating many cellular processes, including cell proliferation, differentiation and migrations. Although the principal components of TGFβ signaling have been identified and explored in recent decades, understanding its dynamic behavior is limited by the lack of tools that allow the control of TGFβ signaling at high spatiotemporal resolution. In this thesis, we developed an optogenetic system (the optoTGFβ system), in which light is used to control TGFβ signaling precisely in time and space. First, we validated the functionality of the optoTGFβ system by comparing it with the endogenous TGFβ signaling system. Second, by simultaneously monitoring the subcellular translocation of the receptors and Smad proteins using live cell imaging, we showed that TGFβ signaling can be specifically activated in single cells through modulating the light stimulations. Third, in combination with mathematical modeling, we quantitatively characterized the dynamics of TGFβ signaling in the optoTGFβ system. The spatial and temporal precision of optical control makes the optoTGFβ system a novel and powerful tool for quantitative analyses and manipulation of TGFβ signaling at the single cell level.

Mikrobielle Rhodopsine sind lichtsensitive Proteine, die von Mikroorganismen exprimiert werden um Licht wahrzunehmen oder dessen Energie zu nutzen. Ionen-transportierende mikrobielle Rhodopsine begründeten das Feld der Optogenetik. Hier erlauben sie transmembrane Ionenflüsse lichtsensitiv zu machen und neuronale Aktivität mit Licht zu steuern. Eine zielführende Nutzung beruht auf ihrer molekularen Charakterisierung, um sie dem Experiment anzupassen und es sinnvoll zu entwerfen. Teil I der Arbeit beschäftigt sich mit dem rotverschobenen Kanalrhodopsin ReaChR. Obwohl es mit breitem, nicht gaussförmigen Aktionsspektrum mit maximalen Strömen um 600 nm publiziert wurde, zeigte das Blitzlichtspektrum hier maximale Aktivität bei 535 nm ohne Besonderheiten. Mit steigender Intensität und längeren Pulsen verbreiterte sich das Spektrum; sehr ähnlich zum publizierten Spektrum. Dieses einzigartige Verhalten wird durch sekundäre Photochemie erklärt, welche zu einem komplexen Photozyklus mit lichtinduzierten Übergangen führt. Mutationen an Schlüsselpositionen wurden genutzt, um ReaChR über die publizierten Daten hinaus zu charakterisieren und neue Eigenschaften zu generieren. In Teil II wurde die auswärtsgerichtete Natriumpumpe KR2 elektrophysiologisch charakterisiert, was zuvor von schlechter Membranständigkeit in Säugetierzellen verhindert wurde. Ein verbessertes KR2 mit höherer Membranständigkeit und 60-fach größeren Photoströmen erlaubte Selektivitätsmessungen, welche zeigten, dass der Strom von Natriumionen getragen wird, wohingegen nichts auf Protonentransport hindeutete. Bei ausreichender Substratkonzentration war der Strom anders als bei Chlorid- oder Protonenpumpen von der Membranspannung unabhängig. Die Expression in Mausneuronen ermöglichte die reversible Unterdrückung von Aktionspotentialen mit Licht, wobei der Ausstrom von Kationen einen komplementären Weg zur neuronale Aktivitätsunterdrückung bietet, wenn etablierte Werkzeuge schlecht oder nicht funktionieren. / Microbial rhodopsins are photosensitive proteins utilized by fungi, algae, and prokaryotes to sense light or harness its' energy. Ion transporting microbial rhodopsins initiated the field of optogenetics, where they are applied to render transmembrane ion fluxes light sensitive and control neuronal activity with light. Part I of the thesis focused on the electrophysiological characterization of the red-shifted channelrhodopsin ReaChR. Although published with a broad, non-Gaussian shaped action spectrum peaking around 600 nm, the flash action spectra of ReaChR recorded here had a maximum at 535 nm without peculiarities. Increasing intensities and prolonging illumination broadened the spectrum, which finally peaked around 600 nm. This unique behavior stems from pronounced secondary photochemistry leading to a complex photocycle with various light-induced transitions especially under constant illumination. Mutations at key positions like the central gate, DC-pair or counter ions were employed to characterize the properties of ReaChR beyond published data and engineer new features. In part II an electrophysiological characterization of the outward Na+ pump KR2 was pursued, which was hindered by poor membrane targeting in mammalian cells before. Engineering of eKR2 improved membrane targeting and lead to 60-fold larger photocurrents than in the wild type. Selectivity measurements revealed that the stationary photocurrent is primarily carried by sodium with no evidence for proton transport. At sufficient substrate concentration stationary photocurrents were independent of the membrane voltage distinguishing eKR2 from proton and chloride pumps. Finally, eKR2 reliably and reversibly inhibited action potential firing already at 0.5 mW/mm2 green illumination in cultured hippocampal mouse neurons. Inhibiting action potential firing through cation extrusion poses a complementary way of neuronal silencing in contexts where established tools are unfavorable or even impossible to use.

Glucose homeostasis is fundamental for all living organisms. In vertebrates, the hormone insulin regulates the metabolism of carbohydrates, fats and proteins. In order to sustain the glucose homeostasis, the pancreatic β-cells, which produce and secrete insulin, must coordinate their efforts to secrete the right amounts of insulin required by the organism. In vitro studies, have suggested that a subpopulation of β-cells, referred to as “hub-cells”, coordinate islet Ca2+ dynamics during insulin secretion. However, it is unclear whether the hub-cell model pertains to an in vivo scenario, where the islet is densely vascularized and innervated. In this thesis, we employed the genetically-encoded calcium indicator GCaMP6, confocal imaging and optogenetics, to characterize the Ca2+ dynamics of the zebrafish β-cells in vivo. We found that pancreatic β-cells present endogenous Ca2+ spikes in vivo under basal conditions. These Ca2+ spikes are rapidly suppressed after lowering glucose levels via insulin administration. In addition, the temporal inhibition of blood flow decreases the Ca2+ spikes, suggesting that β-cells are systemically connected. Furthermore, β-cells show a synchronized response to a pericardial glucose injection. Specifically, we found that Ca2+ spikes originate and emanate from a subset of β-cells that are the first to respond to a glucose stimulus. We define these cells as “leader-cells”. We tested if these cells could coordinate the islet in vivo by employing 2-photon laser ablation. Whereas ablation of control cells had no significant effect on the amplitude and duration of the subsequent Ca2+ spikes responses, ablation of leader cells led to a reduction in the Ca2+ response. Furthermore, we developed systems for optogenetic interrogation of β-cells in vivo. We show that the light-gated Cl- ion pump halorhodopsin (NpHR) can be applied to inhibit β-cell depolarization in the zebrafish. We also present the optically orthogonal system of the red Ca2+ indicator K-GECO1 in combination with the blue-shifted channelrhodopsin CheRiff to activate individual β-cell in vivo. Using these new tools, we provide examples where the activation of individual β-cells showed heterogeneous potential to trigger influx of Ca2+ in the rest of the β-cells. Overall, our results led us to propose a hierarchical model of islet coordination. In contrast to the majority of β-cells, which occupy the bottom of the hierarchy since they present low capability to recruit other cells, the leader cells occupy the top levels, being capable to coordinate a majority of the islet’s β-cells.:List of figures xii List of Tables xiii 1. Introduction 1 1.1. Diabetes and insulin 1 1.2. The endocrine pancreas 2 1.3. The diabetes pandemic 4 1.4. β-cell development in zebrafish and mammals 4 1.5. β-cells function and heterogeneity 6 1.6. β-cell coordination 8 1.7. Genetically-encoded calcium indicators 10 1.8. Genetically-encoded optogenetic actuators 13 1.9. Models to study In vivo β-cell coordination 16 2. In vivo β-cell Ca2+ dynamics 19 2.1. β-cells present endogenous Ca2+ spikes in vivo, which are not present ex vivo 19 2.2. Insulin injection reduces endogenous β-cell Ca2+ activity 22 2.3. Pharmacological inhibition of β-cell Ca2+ spikes interferes with glucose control 24 2.4 Transient blood flow interruption decreases β-cell calcium spikes 26 2.5 Glucose bolus leads to a synchronous response of β-cells 29 3. Leader β-cells coordinates Ca2+ dynamics in vivo 32 3.1. High speed 2D and 3D imaging reveals “leader” β-cells 32 3.2. Pan-islet response to glucose is impaired after leader β-cells ablation 41 4. Optically orthogonal toolset for in vivo optogenetics and Ca2+ imaging 46 4.1. Development of optogenetics actuators systems in zebrafish β-cells 46 4.2. Red fluorescent calcium reporters in zebrafish β-cells 47 4.3. In vivo temporal optogenetic silencing of β-cells 50 4.4. In vivo temporal optogenetic silencing of a subset of β-cells can inhibit the islet response 52 4.5. In vivo temporal optogenetic activation of β-cells 55 5. Discussion and future directions 61 5.1. β-cell calcium spikes are systemically influenced 61 5.2. First responder β-cells are present in vivo 64 5.3. Leader β-cells coordinate Ca2+ influx in vivo 66 5.4. β-cell optogenetic interrogation shows heterogeneous potential of individual β-cells for islet coordination 68 6. Materials and methods 75 6.1. Zebrafish strains and husbandry 75 6.2. Transgenic lines generation 76 6.3. Glucose measurements 77 6.4. Pericardial injection of glucose and insulin 77 6.5. Live imaging 77 6.6. Fast whole islet live imaging 78 6.7. Selective two-photon laser ablation of leader cells in the zebrafish islet. 78 6.7. Selective one-photon optogenetic interrogation of β-cells in the zebrafish islet. 79 6.8. Islet blood flow imaging 80 6.9. Mechanical heart stop 80 6.10. Immunostaining 80 6.11. TUNEL assay 81 6.12 Image analysis of GCaMP6s fluorescence intensity from in vivo imaging. 82 6.13 Quantification of GCaMP6s fluorescence intensity 82 6.14 Spatial drift correction images. 83 6.15 Statistical analysis 84 7. References 85 8. Annexes 90 9. Acknowledgments 97 / Die Glukosehomöostase ist für alle lebenden Organismen von grundlegender Bedeutung. Bei Wirbeltieren reguliert das Hormon Insulin den Stoffwechsel von Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen. Um die Glukosehomöostase aufrechtzuerhalten, müssen die β-Zellen der Bauchspeicheldrüse, welche Insulin produzieren und absondern, ihre Bemühungen koordinieren, um die richtigen Mengen an Insulin zu sekretieren, die der Organismus benötigt. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass eine Subpopulation von β-Zellen, die als „Hub-Zellen“ bezeichnet werden, die Insulinsekretion der Inseln koordiniert. Es ist jedoch unklar, ob sich die Hub-Cell-Theorie auf ein in-vivo-Szenario bezieht, bei dem die Insel dicht vaskularisiert und von Neuronen innerviert ist. In dieser Arbeit verwendeten wir den genetisch kodierten Calcium-Indikator GCaMP6, konfokale Bildgebung und Optogenetik, um die Ca2+-Dynamik der Zebrafisch-β-Zellen in vivo zu charakterisieren. Wir fanden heraus, dass Pankreas-β-Zellen in vivo unter basalen Bedingungen endogene Ca2+-Spitzen aufweisen. Diese Ca2+-Spitzen werden nach Senkung des Glukosespiegels durch Insulinverabreichung schnell unterdrückt. Darüber hinaus verringert die zeitliche Hemmung des Blutflusses die Ca2+-Spitzen, was darauf hindeutet, dass β-Zellen systemisch verbunden sind. Darüber hinaus zeigen β-Zellen eine synchronisierte Reaktion auf die perdikale Glukoseinjektion. Insbesondere fanden wir heraus, dass Ca2+-Spitzen von den β-Zellen hervorgerufen werden, die zuerst auf den Glukosestimulus reagieren. Wir definieren diese Zellen als 'Leader-Zellen'. Wir haben in vivo durch den Einsatz einer 2-Photonen-Laserablation getestet, ob diese Zellen die Insel koordinieren können. Während die Ablation von Kontrollzellen keinen signifikanten Einfluss auf die Amplitude und Dauer der nachfolgenden Ca2+-Spitzenreaktionen hatte, führte die Ablation von Leader-Zellen zu einer signifikanten Verringerung der GCaMP-Reaktion. Darüber hinaus haben wir Systeme für die optogenetische Abfrage von β-Zellen in vivo entwickelt: Wir zeigen, dass die lichtgesteuerte Cl—Ionenpumpe Halorhodopsin (NpHR) angewendet werden kann, um die Depolarisation von β-Zellen in vivo zu hemmen. Wir präsentieren auch das optisch orthogonale System des roten Ca2+-Indikators K-GECO1 in Kombination mit dem blauverschobenen Channelrhodopsin CheRiff, um einzelne β-Zellen in vivo abzufragen. Unter Verwendung dieser neuen Werkzeuge liefern wir Beispiele, bei denen die Aktivierung einzelner β-Zellen ein heterogenes Potenzial für die Auslösung des Ca2+-Einstroms in die übrigen β-Zellen in vivo zeigte. Insgesamt bietet diese Studie Hinweise darauf, dass eine Untergruppe von β-Zellen ein hohes Potenzial zur Koordination der Ca2+-Dynamik der Insel in vivo aufweist.:List of figures xii List of Tables xiii 1. Introduction 1 1.1. Diabetes and insulin 1 1.2. The endocrine pancreas 2 1.3. The diabetes pandemic 4 1.4. β-cell development in zebrafish and mammals 4 1.5. β-cells function and heterogeneity 6 1.6. β-cell coordination 8 1.7. Genetically-encoded calcium indicators 10 1.8. Genetically-encoded optogenetic actuators 13 1.9. Models to study In vivo β-cell coordination 16 2. In vivo β-cell Ca2+ dynamics 19 2.1. β-cells present endogenous Ca2+ spikes in vivo, which are not present ex vivo 19 2.2. Insulin injection reduces endogenous β-cell Ca2+ activity 22 2.3. Pharmacological inhibition of β-cell Ca2+ spikes interferes with glucose control 24 2.4 Transient blood flow interruption decreases β-cell calcium spikes 26 2.5 Glucose bolus leads to a synchronous response of β-cells 29 3. Leader β-cells coordinates Ca2+ dynamics in vivo 32 3.1. High speed 2D and 3D imaging reveals “leader” β-cells 32 3.2. Pan-islet response to glucose is impaired after leader β-cells ablation 41 4. Optically orthogonal toolset for in vivo optogenetics and Ca2+ imaging 46 4.1. Development of optogenetics actuators systems in zebrafish β-cells 46 4.2. Red fluorescent calcium reporters in zebrafish β-cells 47 4.3. In vivo temporal optogenetic silencing of β-cells 50 4.4. In vivo temporal optogenetic silencing of a subset of β-cells can inhibit the islet response 52 4.5. In vivo temporal optogenetic activation of β-cells 55 5. Discussion and future directions 61 5.1. β-cell calcium spikes are systemically influenced 61 5.2. First responder β-cells are present in vivo 64 5.3. Leader β-cells coordinate Ca2+ influx in vivo 66 5.4. β-cell optogenetic interrogation shows heterogeneous potential of individual β-cells for islet coordination 68 6. Materials and methods 75 6.1. Zebrafish strains and husbandry 75 6.2. Transgenic lines generation 76 6.3. Glucose measurements 77 6.4. Pericardial injection of glucose and insulin 77 6.5. Live imaging 77 6.6. Fast whole islet live imaging 78 6.7. Selective two-photon laser ablation of leader cells in the zebrafish islet. 78 6.7. Selective one-photon optogenetic interrogation of β-cells in the zebrafish islet. 79 6.8. Islet blood flow imaging 80 6.9. Mechanical heart stop 80 6.10. Immunostaining 80 6.11. TUNEL assay 81 6.12 Image analysis of GCaMP6s fluorescence intensity from in vivo imaging. 82 6.13 Quantification of GCaMP6s fluorescence intensity 82 6.14 Spatial drift correction images. 83 6.15 Statistical analysis 84 7. References 85 8. Annexes 90 9. Acknowledgments 97

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QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.