QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.

Die Entdeckung der Kanalrhodopsine (ChRs) C1 und C2 aus der Grünalge Chlamydomonas reinhartii vor 10 Jahren brachte die neue Proteinfamilie der lichtgesteuerten Ionenkanäle hervor. Diese 7-Transmembranproteine verwenden all-trans Retinal, um Licht einer bestimmten Wellenlänge zu absorbieren. Bei Lichtabsorption isomerisiert das Retinal und das Protein öffnet daraufhin seine Pore, die es Ionen wie H+, Na+ und Ca2+ erlaubt, abhängig von ihrem elektrochemischen Gradienten, die Membran zu passieren. Insbesondere in der Neurophysiologie findet seit kurzem das C2 eine breite Anwendung, da seine Expression in Nervenzellen es erlaubt, mittels kurzer Lichtpulse die elektrische Aktivität dieser Zellen zu kontrollieren. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die beiden neuen ChRs V1 und V2 aus der mehrzelligen Grünalge Volvox carteri elektrophysiologisch charakterisiert. Hierbei zeigte sich, dass V2, ähnlich wie C2, im blauen Spektralbereich absorbiert und auch, dass sich die kinetischen Eigenschaften stark ähneln. Dagegen besitzt V1 eine um 70 nm längerwellig verschobene Absorption auf 535 nm bei einer ~ 10 x langsameren Abklingkinetik als C2. Durch die schlechte Membranintegration von V1 in eukaryotischen Zellen ist der Photostrom gering und die Anwendungen in Neuronen stark eingeschränkt. Um die Membranintegration zu verbessern, wurden einzelne Helices von V1 gegen die entsprechenden Helices der anderen ChRs ausgetauscht. Hierbei wurde eine Chimäre C1V1-25, die aus den ersten 2 Helices von C1 und den restlichen 5 Helices von V1 besteht, entwickelt. Die Chimäre besitzt weiterhin eine rotverschobene Absorption bei 539 nm, einen 4 x höheren Photostrom als V1 und der doppelt so hoch ist wie der von C2. / The discovery of the channelrhodopsins (ChRs), C1 and C2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii 10 years ago, created the new protein family of light-gated ion channels. Those 7-Transmembranproteins are utilizing all-trans retinal to absorb light at specific wavelength. Upon light absorption the retinal isomerizes which leads to opening of a protein pore allowing ions such as H+, Na+ and Ca2+ to pass the membrane depending on their electrochemical gradient. In the last years C2 attracted a lot of attention in neuroscience since its expression in neurons allows to control their electrical properties with short light pulses. This work presents the electrophysiological characterization of two new ChRs V1 and V2 from the multicellular agla Volvox carteri for the first time . V2 absorbs light in the blue visible range like C2 and almost identical kinetic properties. In contrast, V1 exhibit a 70 nm redshifted absorption towards 535 nm and a ~ 10 x slower off-kinetic than C2. Since V1 displays only weak membrane targeting the resulting overall small photocurrent in eukaryotic cells significantly hampered its application in neuronal cells. To improve membrane targeting and to retain redshifted absorbance helices from V1 were exchanged with the corresponding helices from the other ChRs. A chimera called C1V1-25, which consists out of the first 2 helices from C1 and the last 5 helices from V1 showed a absorbance maximum at 539 nm and exhibit a 4 times higher photocurrent even beeing 2 times higher then the one of C2.

Plants secrete peptide ligands and use receptor signaling to respond to stress and control development. Understanding these phenomena is key to improving plant health and productivity for food, fiber, and energy applications. Phytosulfokine (PSK), a sulfated peptide hormone, regulates plant cell division, growth, and stress tolerance via specific phytosulfokine receptors (PSKRs). This study uses fiber-optic fluorescence microscopy to elucidate trafficking of PSK in live plants. The microscope features two-color optics and an objective lens connected to a 1-m coherent imaging fiber mounted on either a conventional upright microscope body or 5-axis positioning system (X–Y–Z plus pitch and yaw). PSK and fluorescently-labelled PSK were delivered into roots and leaves of various Arabidopsis thaliana genotypes, and their movement was non-destructively tracked with the microscope. High-resolution (3–5 µm) epifluorescence micrographs confirmed that PSK is mobile in plants and levels of PSKR1, PSKR2, or both may impact the trafficking of PSK.

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[ES] La lesión medular traumática (LM) se refiere a una condición neurológica en la que un insulto mecánico interrumpe la adecuada comunicación de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso central (SNC), resultando en la pérdida de función locomotora por debajo del área lesionada. Lamentablemente, en la actualidad aún no existe cura efectiva para restaurar la funcionalidad después de una LM. La búsqueda de un tratamiento eficiente sigue siendo un gran desafío debido a nuestra aún incompleta comprensión de la multitud de procesos biológicos desencadenados por la lesión. La terapia celular destaca como la aproximación más recurrente para el tratamiento de la LM. En las últimas décadas, se han explorado varias estrategias celulares, siendo una de las más prometedoras el trasplante de células progenitoras neurales (CPN). Muchos estudios preclínicos demostrado el potencial del trasplante de CPN para proporcionar una recuperación motora en modelos animales, sin embargo, las mejoras funcionales en ensayos clinicos humanos son limitadas. Por lo tanto, aún se deben realizar esfuerzos para descubrir la cascada precisa de procesos moleculares a lo largo de la fisiopatología de LM, así como el mecanismo subyacente de los CPN. En ese contexto, el Capítulo 1 del presente trabajo tuvo como objetivo proporcionar una caracterización de los cambios en el perfil transcripcional medular a lo largo de las diferentes etapas temporales de una lesión severa contusiva. Además, hemos descrito el impacto transcripcional del trasplante de CPN en ratas lesionadas. Hemos demostrado que mientras la LM conllevó una fuerte desregulación de varios componentes de señalización de AMPc (entre ellos EPAC2), el trasplante de CPN pudo restaurar estas alteraciones transcripcionales. Para explorar el papel de EPAC2 en el mecanismo terapéutico mediado por CPN, realizamos un experimento de inhibición sostenida de EPAC2 mediante la administración de ESI-05. En comparación con los animales solo trasplantados, los animales CPN +ESI-05 mostraron un aumento en el área de cicatriz, una exacerbación de la polarización de la microglía hacia un perfil inflamatorio y una ampliación de la brecha de neuronas preservadas a lo largo de la lesión, sugiriendo que el trnasplante de CPN en el contexto de LM implican un mecanismo dependiente de EPAC2, reduciendo la neuroinflamación y proporcionando un entorno neuro-permisivo. El Capítulo 2 explora el potencial del AMPc para la regeneración de la LM. Hemos diseñado una estrategia innovadora para inducir AMPc en las neuronas corticoespinales a través de la activación optogenética de un adenilato ciclasa foto-inducible (bPAC). La estimulación optogenética en ratas con una hemisección dorsal torácica promovió una recuperación locomotora en comparación con el grupo control. Además, la estimulación de bPAC aumentó el número de neuronas marcadas retrógradamente desde el segmento lumbar tanto en la corteza motora como en la formación rafe-reticular, pero no en el núcleo rojo.La inmunotinción del tracto rafespinal mostró que la estimulación de bPAC aumenta el ratio de axones serotonérgicos caudales a la lesión correlacionando con una mejora funcional. Por último, la depleción del sistema serotoninérgico mediante la administración de 5,7-Dihydroxytryptamina suprimió la abolió la mejora mediada por bPAC, confirmando la implicación de la vía serotoninérgica en la recuperación de los animales estimulados. En resumen, se han proporcionado nuevos conocimientos sobre los cambios transcripcionales que ocurren a lo largo de la progresión de la LM y tras el trasplante de CPN, con énfasis en la señalización de AMPc. La manipulación optogenética de AMPc en las neuronas corticoespinales después de la LM ha demostrado ser efectiva para la recuperación funcional y permitido descubrir una ruta cortical alternativa a través del tracto descendente serotoninérgico / [CA] Lesió medul·lar traumàtica (LM) es una condició neurològica en la qual un traumatisme interromp la comunicació adequada dels impulsos a través del sistema nerviós central (SNC), amb el resultat de la pèrdua de la funció locomotora per baix de la zona lesionada. Lamentablement, en l'actualitat encara no hi ha una cura efectiva per a restaurar completament la funcionalitat de la medul·la espinal després de la lesió. La recerca d'un tractament eficient per a la LM roman un repte complex a causa de la nostra comprensió encara incompleta de la gran quantitat de processos biològics desencadenats per la lesió primària. La teràpia cel·lular destaca com l'aproximació més recurrent per al tractament de la LM. En les dècades passades, s'ha explorat diverses estratègies basades en cèl·lules i una de les més prometedores és el trasplantament de cèl·lules progenitores neurals (CPN). Molts estudis preclínics han demostrat el potencial del trasplantament de CPN per proporcionar una recuperació motora en models animals, no obstant això, les millores funcionals en pacients humans tractats són limitades. Per tant, encara s'han de fer esforços per a descobrir la cascada precisa de processos moleculars al llarg de la fisiopatologia de la LM, així com el mecanisme subjacent dels CPN. El Capítol 1 del present treball va tindre com a objectiu proporcionar una caracterització dels canvis en el perfil transcripcional espinal al la llarga de les diferents etapes temporals de una lesió contusiva. A més, s'ha descrit l'impacte transcripcional del trasplantament d'CPN en animals lesionats. S'ha demostrat que mentre la LM va causar una forta desregulació de diversos components de senyalització de AMPc (sent EPAC2 el gen més regulat a la baixa), el transplantament de CPN van ser capaç de restaurar les alteracions derivades de la LM. Per a explorar el paper d'EPAC2 en el mecanisme terapèutic mediat per CPN, es va realitzar un experiment de inhibició sostinguda d'EPAC2 degut a l'administració d'ESI en animals lesionats. En comparació amb els animals només trasplantats, els animals CPN+ESI-05 van mostrar un augment de l'àrea de cicatriu, una exacerbació de la polarització de les micròglies cap a un perfil inflamatori i una ampliació de la bretxa de neurones preservades a través de la lesió.Aquests resultats suggereixen que el trasplantament de CPN en el context de la LM involucren un mecanisme depenent d'EPAC2, reduint la neuroinflamació i proporcionant un entorn més neuropermissiu. El Capítol 2 va tindre com objectiu explotar el potencial de regeneració de AMPc dissenyant una nova estratègia per a les induccions artificials de AMPc en les neurones corticoespinals mitjançant l'activació optogenètica d'una adenilat ciclasa fotoinduïble (bPAC). L'estimulació diària de AMPc en rates que pateixen una hemisècció dorsal toràcica va promoure una recuperació en comparació amb els control. L'estimulació de bPAC va augmentar el nombre de neurones marcades retrògradament des del segment lumbar, tant a l'escorça motora com a la formació rafe-reticular, però no al nucli roig. A més, la immunotinció del tracte rafespinal va mostrar que l'estimulació de bPAC va augmentar la ràtio d'axons serotoninèrgic cabals a la lesió, cosa que es va correlacionar significativament amb una millora dels paràmetres funcionals. Finalment, la depleció del sistema serotoninèrgic mitjançant l'administració de 5,7-Dihydroxytryptamina va abolir la millora mediada per bPAC, confirmant la implicació de la via serotoninèrgica en la recuperació. En resum, la investigació ha proporcionat coneixements sobre els canvis transcripcionals que tenen lloc a la llarga de la progressió de la LM i després del trasplantament de CPN, amb un èmfasi especial en la senyalització d'AMPc. La manipulació optogenètica d'AMPc a les neurones corticoespinals després de la LM ha demostrat ser efectiva per a la recuperació funcional i ha permès descobrir una ruta cortical alternativa a través del tracte descendent serotoninèrg / [EN] Traumatic spinal cord injury (SCI) refers to a neurological condition in which a mechanic insult disrupts the proper communication of the impulses through the central nervous system (CNS), resulting on the loss of locomotor function below the injured area. Unfortunately, nowadays there is still no effective cure to completely restore the functionality of the spinal cord after the injury. Cell therapy is the most recurring approach for SCI treatment. In the past decades several cell-based strategies have been explored, being one of the most promising the transplantation of neural progenitor cells (NPCs). Many pre-clinical studies evidenced the potential of the NPCs transplantation to provide a substantial motor recovery in animal models, yet functional improvements in clinical trials have been limited. Therefore, efforts still need to be made in disclosing the precise cascade of molecular processes along SCI pathophysiology as well as the NPCs underlying mechanism. In that context, Chapter 1 of the present work aimed to provide a comprehensive characterization of the spinal transcriptional changes along the different temporal stages of rats suffering a severe contusive injury. Additionally, we have described the transcriptional impact of acute and subacute NPCs transplantation in injured animals. Interestingly we have shown that while SCI caused a strong dysregulation of several cAMP-signaling components (being EPAC2 the most downregulated gene), NPCs was able to restore SCI-derived alterations over this pathway with EPAC2 significant upregulation. In order to further explore EPAC2 role in NPCs-mediated therapeutical mechanism we performed a loss-of-function experiment by sustained EPAC2 inhibition via ESI-05 administration along with NPCs transplantation after SCI. Compared with only transplanted animals, NPCs+ESI-05 animals showed increased scar area, exacerbated microglia polarization into an inflammatory profile and widened gaps of preserved neurons across the lesion. Overall, these results suggest that NPC therapeutic mechanisms in the context of SCI involve an EPAC2-dependent mechanism, reducing neuroinflammation and providing a neuro-permissive environment. Chapter 2 aimed to further explore cAMP potential for SCI regeneration. We designed a novel strategy for artificial cAMP inductions in corticospinal neurons via optogenetic activation of a photoinducible adenylyl cyclase (bPAC). Daily optogenetic cAMP stimulation in rats suffering a thoracic dorsal hemisection, which completely disrupt the dorsal aspect of the corticospinal tract (CST), promoted and early and sustained locomotor recovery compared to non-treated control animals. We have shown that bPAC stimulation increased the number of retrograde traced neurons from the lumbar segment both in the motor cortex and the raphe-reticular formation, but not in the red nuclei. Moreover, immunolabelling of the raphespinal tract by 5-HT showed that bPAC stimulation increased the ratio of descending serotoninergic axons caudal to the injury which significantly correlated with improved functional parameters. Our results from corticobulbar projection study, WGA trans-synaptic tracing, and P-CREB analysis suggest that bPAC modulation of cortico-serotonergic pathway might occurs at the brainstem level. Lastly, the serotonergic system depletion by 5,7-Dihydroxytryptamine administration suppressed bPAC-mediated recovery, confirming the implication of the serotonergic tract in the recovery of stimulated animals. In summary, our research has provided new insights into the transcriptional changes that occur along SCI progression and after NPCs transplantation with a special emphasis on cAMP signaling. Optogenetic cAMP manipulation in corticospinal neurons after SCI has proven to be effective for functional recovery and allowed to unveil a cortical rerouting pathway through the serotonergic descending tract. / This research was funded by FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-BC21/ERDF]. Part of the equipment employed in this work was funded by Generalitat Valenciana and cofinanced with ERDF funds (OP ERDF of Comunitat Valenciana 2014– 2020) and the UE; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) incluido en el Programa Operativo FEDER de la Comunidad Valenciana 2014-2020. B. MartinezRojas was supported by a grant from the Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana and the European Social Fundation ACIF/2019/120. / Martínez Rojas, B. (2024). Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202972

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierte Ionenkanäle motiler Algen. Heterolog exprimiert erlauben sie es, Ionenflüsse durch Licht zu steuern. Bevorzugt geleitet werden von den meisten ChRs Protonen. Ausprägung und Wirkung lichtaktivierter Protonenflüsse sowie der molekulare Mechanismus protonenselektiver ChRs werden in vorliegender Arbeit untersucht und zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge genutzt. Eine besonders hohe Protonenselektivität zeigten die grün- und rotlicht-aktivierten Kanäle CsChR und Chrimson aus den Algen Chloromonas subdivisa und Chlamydomonas noctigama. Im spektroskopisch detailliert untersuchten CrChR2 aus Chlamydomonas reinhardtii änderte sich die Protonenselektivität nach Anregung mit einem ns-Laserblitz sogar innerhalb eines Aktivierungszyklus und war insbesondere nach Öffnung des Kanals sowie in Folge der Lichtadaptation hoch. Als unentbehrlich für eine effiziente Protonenleitung erwiesen sich in allen drei Kanälen konservierte, titrierbare Reste entlang der Pore, deren individuelle Bedeutung für die Protonenleitung sich je nach Protein wesentlich unterschied. Entsprechend genügte in Chrimson der Austausch einzelner Glutaminsäuren des extrazellulären Halbkanals, dieses in einen grün- oder rotlichtaktivierten Natriumkanal zu transformieren. Aminosäuresubstitutionen der unmittelbaren Retinalumgebung verschoben hingegen das Aktionsmaximum von Chrimson röter als 600 nm und damit röter als in allen bisher beschriebenen ChRs. In Chrimson versperrt hierbei ein zusätzliches äußeres Tor den extrazellulär Halbkanal, während die Retinalbindetasche in Struktur und funktionaler Bedeutung der einzelnen Reste wesentlich jener der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ähnelt. Als Zwei-Komponenten-Optogenetik wurden schließlich protonen-, kationen- und anionenleitende ChRs unterschiedlicher Farbsensitivität fusioniert sowie lichtgetriebene Protonenpumpen mit protonenaktivierten Ionenkanälen kombiniert und neue optogenetische Perspektiven eröffnet. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels from green algae. Expressed in host cells they are used to control ion fluxes by light and are widely applied in Neurosciences. Although generally classified as either cation or anion channels, most ChRs preferentially conduct protons. This thesis compares proton conductance of different ChRs, examines the molecular mechanism of proton selective ChRs and explores the usage of light regulated proton fluxes in two-component-optogenetics. Proton selectivity varied strongly among different ChRs and was most pronounced for the green- and red-light activated channels CsChR and Chrimson from the algae Chloromonas subdivisa and Chlamydomonas noctigama, that conducted predominantly protons even at high pH. In CrChR2 from Chlamydomonas reinhardtii proton selectivity also changed during a single activation cycle and was especially high directly after channel opening and later on following light adaptation. In all three channels efficient proton conductance depended on conserved titratable residues along the pore with different contribution of the individual side chains in each protein. The substitution of single glutamic acids in the extracellular half pore converted Chrimson into a green or red-light activated sodium channel. A single point mutation close to the retinal chromophore shifted peak absorption of Chrimson beyond 600 nm - further red than all other cation conducting ChRs. Whereas the retinal binding pocket of Chrimson resembles the proton pump Bacteriorhodpsin, the overall pore structure corresponds to other ChRs, but features an additional outer gate, that occludes the extracellular half pore and is important for both, proton selectivity and red light absorption. Finally different Two-Component-Optogenetic approaches combined proton and anion selective ChRs of distinct colour as well as light-driven proton pumps and proton-activated ion channels with major prospect for future optogenetic applications.

Seit mehr als 10 Jahren kann biologische Aktivität durch eine Vielzahl photosensorischer Proteine beeinflusst werden. In diesem als Optogenetik bezeichneten Forschungsgebiet, werden Kationen leitende Kanalrhodopsine (CCRs) als lichtinduzierte neuronale Aktivatoren eingesetzt. Diese Arbeit soll zur Vervollständigung von optogenetischen Werkzeugen durch die Entwicklung Anionen leitender Kanalrhodopsine (ACRs) dienen, um die bestehenden Nachteile mikrobieller lichtgetriebener Ionenpumpen zu überwinden, die bislang zur neuronale Inhibition genutzt wurden. Der Austausch von E90 in C. reinhardtii Kanalrhodopsin 2 (CrChR2) durch positiv geladene Aminosäuren führte zu Entwicklung Chlorid leitender ChRs (ChloCs), die jedoch eine Restkationen-permeabilität aufwiesen. Durch Substitution zweier weiterer negativen Ladungen innerhalb des Ionenpermeationsweges, konnte die Kationenleitung vollständig aufgehoben werden. Parallel wurde durch A. Berndt et al. ein inhibitorisches C1C2 (iC1C2), basierend auf der CrChR1/2 Chimäre entwickelt. Wie auch bei den ChloCs, zeigte iC1C2 verbesserungswürdige biophysikalische Eigenschaften. Mutagenesestudien des Ionenpermeationsweges führten zur Entwicklung der verbesserten Nachfolgervariante iC++. Um ausgehend von weiteren CCRs neuartige ACRs zu entwickeln (eACRs), wurden die zuvor angewandten Mutagenesestrategien auf weitere CCRs übertragen. Zwei neue eACRs, Phobos und Aurora, mit jeweils blau- und rotverschobenen Aktionsspektrum konnten generiert werden. Bistabile eACRs wurden erzeugt, die ein lichtgesteuertes Schalten zwischen offenen und geschlossenen Zuständen ermöglichen. Schlussendlich wurde ein natürlich vorkommendes ACR (nACR) aus Proteomonas sulcata (PsACR1) identifiziert und charakterisiert. Die Maximalaktivität von PsACR1 zählt mit 540 nm zu den am stärksten rotverschobenen unter den nACRs. Elektrophysiologische und spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich der Photozyklus von PsACR1 signifikant von jenen der CCRs unterscheidet. / For more than 10 years, photosensory proteins have developed as powerful tools to manipulate biological activity. In this research field termed optogenetics, cation-conducting channelrhodopsins (CCRs) mainly are utilized as light-induced neural activators. This study aimed at a complementation of the optogenetic tool box by engineering anion-conducting channelrhodopsins (ACRs) to overcome the existing drawbacks of microbial light-driven ion pumps utilized for neural inhibition so far. Replacement of E90 in the cation-conducting C. reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) with positively charged residues reversed the ion selectivity and yielded chloride-conducting ChRs (ChloCs). Applied in neuronal cell culture, ChloCs showed residual cation permeability occasionally leading to excitation instead of the desired inhibition. Further charge elimination within the ion permeation pathway completely abolished cation conduction. In parallel, an inhibitory C1C2 (iC1C2) was developed by A. Berndt et al. based on a CrChR1/2 chimera. Though, iC1C2 displayed unsatisfactory biophysical properties as well. Further mutational modifications of the ion permeation pathway led to the development of the improved successor variant iC++. A systematic transfer of both conversion strategies to other CCRs was conducted to create engineered ACRs (eACRs) with distinct biophysical properties. Two novel eACRs, Phobos and Aurora, with blue- and red-shifted action were obtained. Additionally, step-function mutations greatly enhanced the operational light sensitivity and enabled temporally precise toggling between open and closed states using two different light colors. Finally, a natural ACR (nACR) originating from Proteomonas sulcata (PsACR1) was identified and characterized. With a maximum activation at 540 nm it is one of most red-shifted nACRs. Single turnover electrophysiological measurements and spectroscopic investigations revealed an unusual photocycle compared to that of CCRs.

Sensorische Photorezeptorproteine vermitteln vielfältige Lichtreaktionen in allen Domänen des Lebens. Oftmals dienen verschiedene, durch helikale ‚Linker’ gekoppelte, Module der Lichtperzeption (Sensor) und der Umwandlung in ein biologisches Aktivität (Effektor). Der Zusammenbau chimärer Photorezeptoren aus unterschiedlichen Sensoren und Effektoren ermöglicht die präzise und minimalinvasive Regulation zellulärer Signalwege mit Hilfe von Licht, zu therapeutischen oder analytischen Zwecken. Eine große Herausforderung stellt dabei die korrekte Fusion der Linker beider Module dar, die Kommunikation zwischen Sensor und Effektor erlaubt. Die vorliegende Arbeit nimmt sich diesem Problem an und untersucht Strategien zum effizienten Bau chimärer Photorezeptorproteine. Ein rationaler, auf Sequenz- und Strukturhomologie der parentalen Proteine basierender Ansatz wurde maßgeblich durch unzureichendes Verständnis der funktionellen Mechanismen dieser modularen Proteinen erschwert. Die neuentwickelte und PATCHY-Methode umgeht dieses Hindernis, indem sie eine Bibliothek von Chimären aller Kombinationen der parentalen Linker generiert, welche anschließend mittels bakterieller Testsysteme nach funktionalen Varianten durchsucht wird. Angewendet auf die Fusion eines LOV-Blaulichtsensors und eines Histidinkinase-Effektors fanden sich sowohl lichtaktivierte, als auch zu lichtreprimierte Chimären, deren Linkerlängen jeweils einer Heptadenperiodizität folgten. Dass weniger als 5% aller Linkerkombinationen zu lichtregulierten Chimären führten, deutet zudem auf eine feine Abstimmung von Linkersequenz und Proteinfunktion hin. Die systematische Analyse von Fusionsvarianten mit PATCHY dient daher nicht nur der Entwicklung chimärer Rezeptorproteine zur Manipulation zellulärer Prozesse. Sondern sie zeigt darüber hinaus, komplementär zum rationalen Ansatz, molekulare Faktoren auf, die zur Modulkompatibilität und Signaltransduktion modularer Rezeptorproteine beitragen. / Sensory photoreceptor proteins mediate diverse responses to ambient light in all domains of life. Often distinct modules coupled by helical linkers enable light perception (sensor) and biological output function (effector). Rewiring different sensor and effector modules into photoreceptor chimeras allows using light to control target cellular processes with high spatiotemporal accuracy and minimal invasiveness for therapeutic or analytical purposes. Thereby, a major design challenge is fusing the linkers from both modules in a way that preserves signal transduction within the chimera. The present study tackles this issue and explores strategies for engineering photoreceptor chimeras. An initial rational-design approach guided by sequence and structure homology of the parent proteins was greatly hampered by insufficient knowledge of signaling mechanisms within these modular proteins. A novel and easy-to-use brute-force strategy, termed PATCHY (primer-aided truncation for the creation of hybrid enzymes) circumvents this problem by generating a complete library of fusion variants between target modules harboring all combinations of the parent linkers. Screening fusion libraries of a LOV (light-oxygen-voltage) blue-light sensor coupled to a histidine-kinase effector yielded light-induced and light-repressed chimeras, each group complying with a heptad periodicity of linker lengths. With less than 5% of all possible variants exhibiting light regulation, a delicate fine-tuning of linker sequence and protein function became evident. Thus, systematic testing of fusion variants with PATCHY not only facilitates the development of photoreceptor chimeras for manipulating cellular processes. Complementary to rational design, it also reveals molecular cues determining module compatibility and signal transduction in modular signal receptors.

This thesis describes work from both the University of Cambridge in the lab of Berthold Hedwig and from the HHMI Janelia Research Campus in the lab of Michael Reiser. At the University of Cambridge, my work involved the development and demonstration of a method for electrophoretically delivering dyes and tracers for anatomical and functional imaging into animals that are not amenable to genetic labelling techniques. Using this method in locusts and crickets - model systems of particular interest for their acoustic communication - I successfully delivered polar fluorescent dyes and tracers through the sheath covering the auditory nerve, simultaneously staining both the peripheral sensory structures and the central axonal projections without destroying the nerve's function. I could label neurons which extend far from the tracer delivery site on the nerve as well as local neuron populations through the brain's surface. I used the same method to deliver calcium indicators into central neuropils for in vivo optical imaging of sound-evoked activity, as well as calling song-evoked activity in the brain. The work completed at the Janelia Research Campus began with the development of a modern version of a modular LED display and virtual reality control system to enable research on the visual control of complex behaviors in head-fixed animals. The primary advantages of our newly developed LED-based display over other display technologies are its high-speed operation, brightness uniformity and control, precise synchronization with analog inputs and outputs, and its ability to be configured into a variety of display geometries. Utilizing the system's fast display refresh rates, I conducted the first accurate characterization of the upper limits of the speed sensitivity of Drosophila for apparent motion during flight. I also developed a flexible approach to presenting optic flow scenes for functional imaging of motion-sensitive neurons. Finally, through the on-line analysis of behavioral measures, image rendering, and display streaming with low latency to multi-color (UV/Green) LED panels, I demonstrated the ability to create more naturalistic stimuli and interactive virtual visual landscapes. Lastly, I used this new visual display system to explore a newly discovered cell-type that had been implicated in higher-order motion processing from a large genetic screen of visually-guided behavior deficits. Using genetic silencing and activation methods, and by designing stimuli that modeled the optic flow encountered during different types of self-motion, colleagues in the Reiser lab and I showed that this cell-type - named Lobula Plate Columnar 1 (LPC1) - is required for the stopping behavior of walking flies caused by back-to-front translation motion but is not involved in the rotational optomotor response. Using calcium imaging, I found that LPC1 was selectively excited by back-to-front motion on the eye ipsilateral to the neuron population and inhibited by front-to-back motion on the contralateral eye, demonstrating a simple mechanism for its selectivity to translation over rotation. I also examined an anatomically similar cell type - named Lobula-Lobula Plate Columnar type 1 (LLPC1) - and found that its selectivity results from a similar but opposite calculation for the detection of front-to-back translational motion. The detection of back-to-front motion had previously been hypothesized to be useful for collision avoidance, and this work provides a neural mechanism for how this detection could be accomplished, as well as providing a platform from which to explore the larger network for translation optic flow.

Les ganglions de la base (GB) forment une boucle complexe avec le cortex et le thalamus qui est impliquée dans la sélection de l’action et le contrôle du mouvement. Les activités oscillatoires synchronisées dans le réseau des GB ont été proposées comme pouvant jouer un rôle essentiel dans la coordination du flux de l’information au sein de ces circuits neuronaux. Ainsi, leur dérégulation dans le temps et l’espace pourrait devenir pathologique. Dans la maladie de Parkinson (MP), l’expression anormalement élevée d’oscillations neuronales comprises dans les gammes de fréquences beta (β, 10-30 Hz) serait la cause des déficits moteurs (akinétique et bradykinétique) de cette maladie. Cependant, les réseaux neuronaux à l’origine des oscillations β et l’implication physiopathologique de celles-ci restent encore inconnus. Le noyau sous-thalamique (NST) est un carrefour anatomique des GB situé au centre de réseaux potentiellement impliqués dans l’émergence de ces états hyper-synchronisés. L’objectif de cette thèse était de déterminer le rôle causal des principales entrées du NST (i.e. le cortex moteur, le globus pallidus, et le noyau parafasciculaire du thalamus) dans le maintien et la propagation des oscillations β. Pour cela, nous avons développé des approches de manipulation optogénétique combinées à des enregistrements électrophysiologiques in vivo dans un modèle rongeur de la MP. L’ensemble de nos travaux démontre la contribution respective des différents circuits neuronaux interrogés et souligne l’importance du globus pallidus dans le contrôle de la propagation et du maintien des oscillations β dans l’ensemble de la boucle des GB. / The basal-ganglia (BG) form a complex loop with the cortex and the thalamus that is involved in action selection and movement control. Synchronized oscillatory activities in basal-ganglia neuronal circuits have been proposed to play a key role in coordinating information flow within this neuronal network. If synchronized oscillatory activities are important for normal motor function, their dysregulation in space and time could be pathological. Indeed, in Parkinson’s disease (PD), many studies have reported an abnormal increase in the expression level of neuronal oscillations contain in the beta (β) frequency range (15-30 Hz). These abnormal β oscillations have been correlated with two mains symptoms of PD: akinesia/bradykinesia. However, which BG neuronal circuits generate those abnormal β oscillations, and whether they play a causal role in PD motor dysfunction is not known. The subthalamic nucleus (STN) is a key nucleus in BG that receives converging inputs from the motor cortex, the parafascicular thalamic nucleus and the globus pallidus. Here, we used a rat model of PD combined with in vivo electrophysiological recordings and optogenetic silencing to investigate how selective manipulation of STN inputs causally influence BG network dynamic. Our data highlight the causal role of the globus pallidus in the generation and propagation mechanisms of abnormal β-oscillations.