Espécies de Candida com relevância clínica diferem entre si com relação a aspectos como prevalência clínica, virulência e perfil de resistência a antifúngicos. Formulamos a hipótese de que estas diferenças podem ocorrer devidas em parte à capacidade relativa distinta destas espécies de resistirem ao estresse oxidativo que é imposto por fagócitos durante a patogênese da candidíase. Nesse contexto, poucos são os estudos de resposta ao estresse oxidativo (REO) em espécies que não Candida albicans. Assim, esse trabalho teve por objetivo investigar a REO in vitro em isolados de referência e clínicos de 8 espécies de Candida – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis e C. tropicalis. Para tal, foi avaliado o grau de resistência a oxidantes, a capacidade de adaptação, a indução de enzimas antioxidantes, os níveis de glutationa total, a capacidade antioxidante total e a indução de dano oxidativo a proteínas e lipídios através de metodologias atuais. C. albicans, C. glabrata e C. krusei apresentaram maior resistência ao estresse oxidativo nas condições testadas, C. parapsilosis e C. tropicalis resistência média e C. dubliniensis, C. famata e C. guilliermondii foram mais sensíveis. Todas as espécies demonstraram capacidade adaptativa e indução de enzimas antioxidantes. Os níveis de glutationa total mostraram redução intracelular frente ao estresse oxidativo. A capacidade antioxidante total foi variável entre espécies. Outros testes (efeito de meio condicionado e de moléculas quorum-sensing – tirosol e farnesol - no crescimento, capacidade de proteção cruzada e oxidante total) foram empregados sem sucesso. Ainda, verificamos em isolados de C. albicans a relação entre capacidade de resistirem a oxidantes e produção de fosfolipase e protease. Os resultados indicaram ausência de correlação entre estes fatores. Espécies com sistema antioxidante mais frágil são também as que ocorrem com menor frequência em infecções sistêmicas ou resistem menos ao efeito dos antifúngicos. É interessante investigar se C. albicans, C. glabrata e C. krusei tiram vantagem efetiva de um sistema antioxidante mais potente para causarem candidíase disseminada ou resistirem a drogas. A caracterização detalhada da REO pode proporcionar a descoberta de novos alvos para a ação de antifúngicos no futuro. / Candida species with clinical relevance differ in therms of clinical prevalence, virulence and profile of resistance to antifungal agents. We hypothesized that these differences may be due in part to the relative ability of these species to resist oxidative stress that is imposed by phagocytes in the pathogenesis of candidiasis. In this context, there are few studies of the oxidative stress response (OSR) in different species than C. albicans. Thus, this study aimed to investigate the in vitro OSR considering isolates of eight Candida species – C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. parapsilosis and C. tropicalis. To this purpose, we evaluated the resistance degree to oxidants, the adaptability, the induction of antioxidant enzymes, levels of total glutathione, total antioxidant status and induction of oxidative damage to proteins and lipids by current methodologies. C. albicans, C. glabrata and C. krusei showed greater resistance to oxidative stress in the conditions tested; C. parapsilosis and C. tropicalis showed an intermediate resistance and C. dubliniensis, C. famata and C. guilliermondii were more sensitive to oxidative stress. All species showed adaptive capacity and induction of antioxidant enzymes. The levels of total glutathione showed intracellular reduction against oxidative stress. The total antioxidant capacity was variable between species. Other tests (effect of conditioned medium and quorum-sensing molecules - farnesol and tirosol – on growth, ability of cross-protection and total oxidant status) were tested without success. Still, we found in isolates of C. albicans the relationship between ability to resist oxidation and production of phospholipase and protease. The results indicated no correlation between these factors. Species with weaker antioxidant system are also those that occur less frequently in systemic infections or are less resistant to the effect of antifungal agents. It is interesting to investigate if C. albicans, C. glabrata and C. krusei take effective advantage of a more powerful antioxidant system to cause disseminated candidiasis or resist drugs. The detailed characterization of the OSR can provide the discovery of new targets for the action of antifungals in the future.

A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) pelos neutrófilos, que representa um mecanismo essencial da imunidade inata contra agentes infecciosos, pode ser desencadeada por imunocomplexos (IC) associados ou não com componentes do sistema complemento. Os IC são normalmente eliminados da circulação pela ligação aos receptores de complemento do tipo 1 em eritrócitos, que os transportam até o baço e o fígado, onde são fagocitados por macrófagos residentes. Porém, defeitos neste mecanismo de eliminação podem levar à deposição de IC nos vasos e tecidos. Em algumas doenças inflamatórias, onde ocorre uma intensa deposição de IC, pode acontecer o recrutamento e a ativação maciça de neutrófilos pelos IC. Nessa situação, os mecanismos endógenos de defesa tecidual não conseguem controlar as alterações desencadeadas pelos fatores oxidantes e líticos liberados pelos neutrófilos, levando à possível lesão tecidual e consequências funcionais e estruturais para o organismo. Nessa perspectiva, tem-se intensificado, nos últimos anos, a procura por novos compostos terapêuticos com capacidade de reduzir os danos aos tecidos adjacentes ao acúmulo de IC, neutrófilos, ERO e enzimas líticas, expostos a níveis deletérios desses componentes. Assim, neste trabalho foi avaliado o potencial antioxidante de um conjunto de dez derivados 3-fenilcumarínicos no metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos estimulados por ICs, empregando-se o ensaio de quimioluminescência dependente de luminol e de lucigenina (QLlum e QLluc, respectivamente). Posteriormente, foi avaliada a citoxicidade das amostras, através do ensaio de exclusão do azul de tripan e medida da atividade da lactato desidrogenase liberada, bem como sua capacidade de sequestrar HOCl e inibir a atividade das enzimas NADPH oxidase e mieloperoxidase (MPO). Observou-se que todas as amostras avaliadas inibiram a QLlum e a QLluc, sendo que cinco delas tiveram efeito inibitório maior que ou igual a 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. Este efeito biológico não foi mediado pela citotoxicidade das 3-fenilcumarinas, nas condições avaliadas. Dentre essas amostras, o derivado 3-fenilcumarínico C13, que foi o mais efetivo em inibir a QLluc, possui duas características que parecem estar relacionadas com tal efeito: um grupo substituinte orto-diidroxi no esqueleto cumarínico e um grupo metilenodioxila no anel fenílico. Além do mais, todas as substâncias que possuem o grupo metilenodioxila no anel fenílico (C1, C6, C6a, C13, C13a) apresentaram efeito inibitório da QLluc maior que as respectivas análogas sem este substituinte (C15, C18, C18a, C24, C24a). A inibição da QLluc parece ser independente da inibição da atividade da NADPH oxidase, visto que as substâncias apresentaram efeito inibitório discreto no consumo de O2 pelos neutrófilos estimulados por IC. Por outro lado, as amostras C13 e C24, que têm em comum a presença do grupo substituinte 6,7-diidroxi, apresentaram os maiores efeitos inibitórios sobre a QLlum, apresentando IC50 semelhante. Essas duas substâncias também foram as mais ativas em inibir a atividade da enzima MPO e em sequestrar o HOCl. Para esses dois ensaios, a atividade biológica observada foi dependente do número de hidroxilas na estrutura do derivado 3-fenilcumarínico. Os resultados deste trabalho mostram que a atividade antioxidante dos derivados 3-fenilcumarínicos sobre o metabolismo oxidativo de neutrófilos humanos está relacionada às características estruturais dessas moléculas. Dentre a série de substâncias avaliadas, C13 e C24 são as amostras mais promissoras para uso como protótipos de moléculas com aplicação terapêutica na modulação desta função neutrofílica. / Production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils, which is an essential mechanism of innate immunity against infectious agents, can be triggered by immune complexes (IC) associated or not with components of the complement system. IC are normally cleared from the circulation by binding to complement receptor type 1 on erythrocytes and transport to spleen and liver, where they are phagocytized by resident macrophages. However, defects in this clearance mechanism can lead to deposition of IC in vessels and tissues, favoring neutrophil chemotaxis. In some inflammatory diseases there is intense deposition of IC, which triggers massive recruitment and activation of neutrophils. In these situations, the endogenous tissue defense mechanisms are not able to regulate the local disorders provoked by the oxidant and lytic compounds released by neutrophils, and tissue damage as well as structural and functional consequences to the organism might occur. In this perspective, the last years have been marked by an intense search for new therapeutic compounds able to reduce the damage to tissues surrounding the site of accumulation of IC, neutrophils, ROS and lytic enzymes, exposed to deleterious levels of these components. So, the present work reports the evaluation of the antioxidant potential of ten 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil oxidative metabolism stimulated with IC, through the luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence assay (QLlum and QLluc, respectively). Further, cytotoxicity of the samples was evaluated by the trypan blue exclusion assay and measurement of lactate dehydrogenase activity, as well as their ability to scavenge HOCl and inhibit NADPH-oxidase and myeloperoxidase (MPO) activity. We found that all the samples inhibited QL-lum and QLluc, being the inhibitory effect of five of them higher than or equal to 50% (C6, C13, C13a, C24 e C24a)*. This biological effect was not mediated by cytotoxicity of the 3-phenylcoumarins, under the conditions assessed. Compound C13, which was the most effective inhibitor of QLluc among the set of phenylcoumarins tested, has two structural features that seem to be related to this effect: an orto-dihydroxyl group in the coumarin moiety and a methylenedioxyl group attached to the phenyl ring. Moreover, the inhibitory effect of all 3-phenylcoumarins bearing the methylenedioxyl group (C1, C6, C6a, C13, C13a) was higher than that found to their analogues without this group (C15, C18, C18a, C24, C24a). The CLluc inhibition by phenylcoumarins seems to be independent of inhibition of NADPH-oxidase activity, since these compounds had a slight inhibitory effect in the O2 consumption by IC-stimulated neutrophils. On the other hand, compounds C13 and C24, which shares the 6,7-dihydroxyl group, had the highest inhibitory effects on CLlum with similar IC50 values among the samples tested. These compounds were also the most active ones to inhibit MPO activity and scavenge HOCl. Such biological effects were dependent on the number of hydroxyl groups in the 3-phenylcoumarin moiety. The results of this work show that the antioxidant activity of 3-phenylcoumarin derivatives in the oxidative metabolism of human neutrophils is related to the structural characteristics of these molecules. Among the set of compounds evaluated, C13 and C24 are the most promising samples to be used as prototypes of moleculse with therapeutic application in the modulation of neutrophil function.

Orientador: Sisi Marcondes Paschoal / Dissertação (mestrado) Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T08:12:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopes-Pires_MariaElisa_M.pdf: 587163 bytes, checksum: da754de9ce10b146c6cb1043d6b01555 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O LPS é capaz de ativar diferentes células, incluindo plaquetas, causando a liberação de mediadores inflamatórios como o óxido nítrico, interleucinas e espécies reativas de oxigênio (ROS). Vários trabalhos têm sido publicados sobre os efeitos do LPS sobre a reatividade plaquetária, mas os resultados ainda são conflitantes e os mecanismos envolvidos nas cascatas de sinalização desencadeada pelo LPS permanecem indefinidos. Portanto, utilizamos plaquetas isoladas de ratos tratados com LPS para investigar o papel das ROS na modulação da agregação plaquetária. Os ratos foram injetados com LPS (1 mg / kg, i.p.) e após, 2 a 72 h depois, a agregação plaquetária foi avaliada. As espécies reativas de oxigênio foram determinadas através da sonda 2', 7'-dichlorofluorescein diacetato (DCFH-DA). A agregação plaquetária induzida por ADP foi, tempo-dependente, reduzida 4 a 72 h após a injeção LPS, e este efeito inibitório foi aumentado quando plaquetas foram incubadas com PEG-SOD, PEG-catalase ou N-acetilcisteína (NAC). O tratamento de ratos com NAC (150 mg / kg i.p., 30 minutos após a injeção LPS) impediu a inibição da agregação plaquetária. A incubação de plaquetas de animais controle com LPS (100 e 300 µg/ml, 2 h) in vitro não afetou a produção de ROS. Nas plaquetas de ratos tratados com LPS, ativadas com ADP, a produção de ROS foi significativamente maior comparado com os ratos controle. Este aumento da produção de ROS foi significativamente reduzido quando as plaquetas foram incubadas in vitro com o inibidor da NADPH-oxidase (DPI). O tratamento de ratos com NAC impediu o aumento da produção de ROS pelo LPS. Como conclusão, a produção sistêmica de ROS em resposta ao tratamento in vivo de LPS desempenha um importante papel modulatório na agregação plaquetária. / Abstract: LPS activates different cells, including platelets, causing the release of inflammatory mediators like nitric oxide, interleukins and reactive oxygen species (ROS). It has been published several reports about the effects of LPS on platelet reactivity but the results are still conflicting and the mechanisms underlying the LPS signaling pathway remains unclear. Therefore, we have used platelets isolated from LPS-treated rats to investigate the role of ROS in modulating the platelet aggregation. Rats were injected with LPS (1 mg/kg, i.p.), and at 2 to 72 h thereafter, platelet aggregation was evaluated. Reactive-oxygen species was determined 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA). ADP-induced platelet aggregation was time-dependently reduced at 4 to 72 h after LPS injection, and this inhibitory effect was augmented when platelets were incubated with PEG-SOD, PEG-catalase or N-acetylcysteine (NAC). Treatment of rats with NAC (150 mg/kg i.p., 30 min after LPS injection) prevented the inhibition of platelet aggregation. Incubation of control platelets with LPS (100 and 300 µg/ml, 2 h) in vitro did not affect the ROS production. In ADP-activated platelets of LPS-treated rats, ROS production was significantly higher compared with control rats. This increased ROS production was significantly reduced when platelets were incubated in vitro with the NADPH-oxidase inhibitor (DPI). Treatment of rats with NAC prevented the increased ROS production by LPS. In conclusion, systemic or in situ ROS production in response to in vivo LPS treatment plays an important modulatory role on platelet aggregation. / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Este trabalho apresenta dados relativos a oxidação de melatonina catalisada por peroxidase de rábano (HRP, horseradish peroxidase) e mieloperoxidase (MPO). Em presença de peróxido de hidrogênio (H2O2), HRP catalisa a oxidação de melatonina com formação de um produto de clivagem do anel indólico, a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina. Esta reação consome oxigênio e apresenta quimiluminescência na região de 440-540 nm. Quimiluminescência e a formação da quinuramina também foram observados quando HRP/H2O2 foram substituídos por neutrófilos ativados por acetato de forbol miristato ou zimosan opsonizado. Em neutrófilos, tanto a emissão de luz quanto a formação do produto foram inibidos pela adição de azida, um inibidor de MPO. Superóxido dismutase tem um forte efeito inibidor sobre a emissão de luz enquanto que catalase e ácido úrico não apresentam qualquer efeito. A oxidação de melatonina por neutrófilos ativados pode ser relevante in vivo e estar associada com algumas das funções descritas para mieloperoxidase e melatonina. A possível implicação biológica da oxidação de melatonina por neutrófilos, especialmente em condições inflamatórias, é discutida. / In the presence of hydrogen peroxide, horseradish peroxidase (HRP) catalyzes the production of N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine from melatonin. This reaction consumes oxygen and exhibits chemiluminescence in the 440-540 nm region. The excited cleavage product derived from the thermolysis of an intermediate dioxetane is suggested to be the emitting species. Chemiluminescence and the indole ring cleavage product were also observed when HRP/H2O2 was replaced by phorbol myristate acetate or opsonized zymosan-activated neutrophils. Azide, a myeloperoxidase inhibitor, strongly suppressed melatonin oxidation. Superoxide dismutase has a strong inhibitory effect on light emission but catalase and uric acid are without effect on the emission. The oxidation of melatonin by activated neutrophils may be relevant to the in vivo functions of myeloperoxidase and melatonin. The possible biological implication of melatonin oxidation by neutrophils, especially in inflammatory conditions, is discussed.

Embora a cisplatina (cis-diaminocloroplatina II) seja um efetivo agente anticâncer, seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido ao seu potencial nefrotóxico. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais e danos ao DNA nuclear devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como superóxido e radicais hidroxila. O aumento na produção destas espécies de oxigênio causa liberação de citocromo c no citosol, iniciando uma cascata de eventos que leva à morte celular por apoptose. A proteção seletiva da mitocôndria contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina nos tecidos intactos tais como os rins, é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. O presente estudo investigou os efeitos da cisplatina na bioenergética, no estado redox e no estresse oxidativo mitocondrial renal, bem como o potencial protetor da dimetiltiouréia (DMTU), um antioxidante seqüestrador de radicais hidroxila, com relação à toxicidade renal induzida pela cisplatina. Método: Ratos Wistar machos adultos pesando de 200 a 220 g foram divididos em quatro grupos de 8 animais cada. Ao primeiro grupo foi administrada cisplatina (10 mg/ kg) por via intra peritonial (i.p.). O segundo grupo recebeu somente injeções de DMTU (500 mg/kg, i.p., seguida de 2 injeções diárias de 125 mg/Kg, i.p). O terceiro grupo de animais foi tratado com DMTU (500 mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.), seguida de 2 injeções diárias de DMTU (125 mg/Kg, i.p.). O grupo controle recebeu somente solução salina (1ml/200g, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após a injeção de cisplatina (ou salina). Resultados: O tratamento com a cisplatina resultou em uma marcante diminuição da função renal demonstrada pela elevação dos níveis plasmáticos de uréia e de creatinina, concomitante a uma significativa alteração nos parâmetros relacionados à função Resumo ix mitocondrial (síntese de ATP, estado 3 da respiração, RCR, ADP/O, potencial de membrana e transporte de cálcio); ao estresse oxidativo mitocondrial (oxidação da cardiolipina, atividade da aconitase, lipoperoxidação, níveis de proteína carbonila e proteína sulfidrila); ao estado redox mitocondrial (oxidação do NAD(P)H, relação glutationa reduzida e glutationa oxidada) e à apoptose (atividade da caspase 3). O pré-tratamento dos animais com DMTU preveniu a falência renal aguda e as alterações dos parâmetros mitocondriais , sendo capaz de inibir a morte celular por apoptose. Conclusão: Os resultados demonstram o papel central da mitocôndria na falência renal aguda induzida pela cisplatina, bem como o efeito protetor do DMTU e sugerem que o desenvolvimento de potentes seqüestradores de radicais hidroxila, passíveis de uso clínico, poderia contribuir de forma marcante na prevenção dos danos renais resultantes da quimioterapia com este fármaco. / Although cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) is an effective anticancer agent, its clinical use is highly limited predominantly due to its adverse effects on renal functions. Many studies have shown that cisplatin causes mitochondrial dysfunction and direct injury to nuclear DNA by generating reactive oxygen species such as superoxide and hydroxyl radicals. Overproduction of reactive oxygen species causes the release of cytochrome c into cytosol, thereby triggering the sequence of events leading to cell death via apoptosis. The selective protection of mitochondria against reactive oxygen species generated by cisplatin in intact tissues, such as kidney, is of critical importance in the chemotherapy of patients with cancer. The present study examined the effects of cisplatin on renal mitochondrial bioenergetics, redox state and oxidative stress as well as the protective potential of dimethylthiourea (DMTU), a hydroxyl radical scavenger, against the cisplatin-induced nephrotoxicity. Methods: Adult male Wistar rats weighing 200 to 220g were divided into 4 groups with 8 animals each.. The first group was given a single intraperitoneal (i.p.) injection of cisplatin (10 mg/kg). The second group was given only DMTU (500 mg/kg body weight, i.p, followed by intraperitoneal injections of 125 mg/Kg twice a day until sacrifice). A third group of animals was given DMTU (500 mg/kg body weight, i.p.), just before cisplatin injection (10 mg/kg body weight, i.p.), followed by intraperitoneal injections of DMTU (125 mg/Kg body weight) twice a day until sacrifice. The control group was treated only with saline solution (1ml/200g body weight, i.p.). Animals were sacrificed 72 hours after the treatment. Results: Cisplatin treated animals presented a marked impairment of the renal function evidenced by the elevation of plasmatic creatinine and urea levels simultaneously to a significant alteration of the parameters related to: (a) the mitochondrial function assessed by ATP synthesis, Summary xi state 3 respiration, RCR, ADP/O ratio, membrane potential, calcium uptake; (b) the mitochondrial oxidative stress assessed by cardiolipin oxidation, aconitase activity, lipid peroxidation, protein carbonyls and protein sulphydryl; (c) the mitochondrial redox state assessed by NADPH/NADP+ ratio, GSH/GSSG ratio and (d) apoptosis assessed by caspase-3 activity. DMTU substantially inhibited cisplatin-induced mitochondrial injury and cellular death by apoptosis, thereby suppressing the occurrence of acute renal failure. Conclusions: Results show the central role of the mitochondria in the cisplatin-induced renal acute failure, the protective potential of DMTU and suggest that the development of potent hydroxyl radical scavengers suitable for use in man could minimize the adverse effects of cisplatin in the kidney of patients under chemotherapy.

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1β, TNF-α, VEGF-α e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2αβ foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1β, TNF-α e VEGF-α. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e β2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2α β e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2αβ, IL-1-β, TNF--α, VEGF- α and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2αβ were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-β, TNF-α and VEGF--α. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -α2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2αβ (CINC-2αβ) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

A caprinocultura no Brasil vem crescendo consideravelmente nos últimos anos. No entanto, este crescimento é limitado pela qualidade espermática pós-descongelamento, o que inviabilizaria a utilização de biotecnologias aplicadas à reprodução (e.g., inseminação artificial e transferência de embriões). Um dos motivos para a queda na qualidade espermática pós-descongelação é o ataque das espécies reativas de oxigênio (ROS), que podem levar a danos em membrana, acrossomo, mitocôndria e DNA. Uma alternativa para a melhora na qualidade espermática de amostras criopreservadas de caprinos seria o tratamento do meio diluidor com a antioxidantes. No entanto, é fundamental identificar a espécie reativa de oxigênio mais deletéria ao sêmen de caprinos para determinar o antioxidante ideal. O objetivo do presente estudo foi identificar a ROS mais deletéria ao sêmen de caprinos e, com isso, tratar o diluidor com antioxidantes específicos para a destruição da mesma. No experimento 1, amostras espermáticas de 12 bodes foram submetidas á incubação com 3 sistemas de produção de ROS e um subproduto da peroxidação de lipídeos, conhecida por também levar a danos oxidativos. As amostras espermáticas foram submetidas a incubação com xantina (20mM) e xantina oxidase (ânion superóxido), sulfato de ferro (4mM) e ascorbato (20mM- Radical hidroxila), peróxido de hidrogênio (H2O2; 20 mM) e malondialdeído (20 mM). Após a incubação as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a morfologia, motilidade, membrana (eosina/nigrosina), acrossomo (Rosa Bengala/ Fast Green), mitocôndria (3,3 diaminobenzidina) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS, avalia a susceptibilidade do espermatozóide ao estresse oxidativo). Os resultados do experimento 1 indicaram que a ROS mais deletéria ao espermatozóide caprino é o H2O2, que levou a danos de membrana plasmática e mitocôndria. Assim, no Experimento 2, o diluidor para a criopreservação do sêmen caprino foi suplementado com catalase e Glutationa Peroxidase (GPx), antioxidantes enzimáticos responsáveis pela destruição do H2O2. A análise estatística dos dois experimentos foi realizada através do SAS system for Windows. Os resultados do experimento 2 não revelaram efeitos benéficos para nenhuma das variáveis e com a utilização de ambos os antioxidantes. De fato, a catalase apreesntou efeitos deletérios à membrana plasmática das amostras criopreservadas com 240 UI/mL de catalase quando comparadas ao controle (13,42±2,96% e 25,08±4,80% de espermatozóides com membrana íntegra, respectivamente). De fato, estudos anteriores indicam que as concentrações de catalase em sêmen de caprinos são extremamente baixas, o que indicaria que o tratamento com as dosagens utilizadas de catalase pode ter sido excessivo. Além disto, diferentes antioxidantes aparentemente atuam em diferentes regiões do espermatozóide, sendo que, apenas a combinação de diferentes antioxidante poderia ser eficiente. Por outro lado, os resultados do Experimento 1 foram obtidos em amostras frescas, sendo que provavelmente, em amostras criopreservadas, a espécie reativa mais deletéria poderia ser outra. / The goat production in Brazil has grown considerably in recent years. However, this growth is limited by the post-thaw sperm quality, which would impais the use of biotechnologies applied to reproduction (e.g., artificial insemination and embryo transfer). One reason for the decline in sperm quality after thawing is the attack of reactive oxygen species (ROS), which can lead to damage of membrane, acrosome, mitochondria and DNA. An alternative to improve the quality of cryoprerved goat sperm samples would be the treatment of the extender with antioxidants. However, it is crucial to identify the reactive oxygen species more deleterious to semen of goats to determine the ideal antioxidant. The aim of this study was to identify the ROS more deleterious to semen of goats and thereby to treat the extender with specific antioxidants for the destruction of this ROS. In experiment 1, sperm samples from 12 goats were incubated with 3 systems of production of ROS and a by-product of lipid peroxidation, known to also lead to oxidative damage. The sperm samples were subjected to incubation with xanthine (20 mM) and xanthine oxidase (superoxide anion), iron sulfate (4 mM) and ascorbate (20mM-hydroxyl radical), hydrogen peroxide (H2O2, 20 mM) and malondialdehyde (20 mM). After incubation the samples were evaluated for sperm morphology, motility, membrane (eosin / nigrosin), acrosome (Rose Bengal / Fast Green), mitochondria (3.3 diaminobenzidine) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS, assesses the susceptibility of sperm to oxidative stress). The results of experiment 1 indicated that ROS most deleterious to the goat sperm is the H2O2, especially due to damages to the plasma membrane and mitochondria. Thus, in Experiment 2, the extender for cryopreservation of goat semen was supplemented with catalase and glutathione peroxidase (GPx), enzymatic antioxidants responsible for the destruction of H2O2. Statistical analyses were performed using the SAS system for Windows. The results of experiment 2 revealed no beneficial effects of the use of neither catalase oor GPx. In fact, catalase showed deleterious effects on the plasma membrane of cryopreserved samples; Samples treated with 240 IU / mL of catalase showed a lower percentage of sperm with intact membrane when compared with controls (13.42 ± 2.96 ± 4.80% and 25.08%, respectively ). In fact, previous studies indicate that concentrations of catalase in semen of goats are very low, which indicates that catalase treatment with the dosages used in the present study may have been excessive. Apparently different antioxidants work in different regions of the sperm, and only the combination of different antioxidant could be effective. Moreover, the results of Experiment 1 were obtained in fresh samples, and probably, in cryopreserved samples, other ROS could be the most deleterious.

Este estudo objetivou avaliar os efeitos da melatonina sobre a qualidade e as taxas de blastocistos bovinos PIV. A melatonina é um poderoso eliminador de radicais livres e tem efeitos benéficos na PIV de algumas espécies. Foram feitas sessões de PIV (n=12), sendo aspirados os folículos (2 a 7 mm) de ovários obtidos de abatedouro. Complexos cumulus oócito (COCs) que apresentavam cumulus compacto e oócito com citoplasma homogêneo foram selecionados e randomicamente distribuídos ente os grupos controle (GC) e tratado com Melatonina (GM). Submetidos a MIV por 22h em 400&micro;l de TCM199(Dia-1). Para a FIV COCs foram transferidos para 400&micro;l de meio de fertilização, inseminado com sêmen descongelado previamente submetido ao gradiente descontínuo de Percoll&reg;, e incubados por 18h (dia0). As células do cumulus dos presumíveis zigotos foram removidas com hialuronidase e pipetagem sucessiva, sendo então cultivados (CIV) em 400&micro;l de KSOM- BSA (Dia 1). No Dia 3, foi avaliada a taxa de clivagem em estereomicroscópio e adicionados 400&micro;l KSOM-20% SFB. No Dia 5, 200&micro;l de meio foram removidos e 400&micro;l KSOM-10% SFB adicionado. No dia 7 foi avaliado o estágio de desenvolvimento dos embriões, e as porcentagens calculadas em relação ao total de presumíveis zigotos. Todos os procedimentos foram realizados em placa de 4 poços (Nunc Multidishes&reg;) sem cobertura de óleo mineral Na MIV e no CIV, os grupos receberam ou 0ng/ml ou 50ng/ml de melatonina, GC e GM, respectivamente. No Dia 7, de 4 sessões de PIV, todos os blastocistos expandidos foram corados com Iodeto de Propídeo e Hoechst 33342. Os demais blastocistos expandidos, das outras sessões, foram vitrificados, assim como todos os presentes no Dia 8. Uma amostra deste meio foi retirada para avaliação da concentração de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente os embriões foram descongelados e cultivados para a avaliação do efeito da melatonina sobre os embriões no cultivo pós-descongelação. A análise estatística foi feita usando SAS system for Windows 9.2&reg;. Dados paramétricos foram submetidos ao teste T de Student e os não paramétricos ao Wilcoxon, diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. Blastocistos expandidos do GM apresentaram maior número de células, sendo que estas apresentaram porcentagem menor de ruptura de membrana que os do GC. A melatonina não influenciou as taxas de clivagem, de blastocistos no Dia 7 nem a taxa de blastocistos passíveis de vitrificação. Não foi observado efeito da melatonina sobre a tolerância dos embriões à vitrificação nem no período de cultivo após o descongelamento. Inesperadamente, a melatonina aumentou a concentração de TBARS no meio. A melatonina melhorou a qualidade embrionária, contudo suas propriedades antioxidantes não foram evidenciadas. / This aimed to evaluate melatonin effect over bovine embryo quality and rates on in vitro embryo production procedures (IVP). Melatonin is an effective free radical scavenger and beneficial effects of melatonin have been demonstrated in IVP for some species. Embryo production sessions (12) were performed; follicles (2 to 7 mm) were aspirated from slaughterhouse-derived ovaries. Cumulusoocyte complexes (COCs) who had a compact cumulus and oocyte with homogeneous cytoplasm were selected and randomly allocated (35 to 55 per group) on either control Group (CG) or Melatonin Treatment Group (MG). COCs underwent in vitro maturation (IVM) for 22 hours in 400&micro;l of TCM199 (Day -1). For in vitro fertilization (IVF) COCs were moved to fertilization medium 400&micro;l and were inseminated with previously submitted to discontinuous PercollTM gradient, frozenthawed semen, incubated for 18 hours (Day 0). After IVF presumptive zygotes were striped from remaining cumulus cells by incubation with hyaluronidase and gentile pipetting, then moved to 400&micro;l of KSOM- BSA (Day 1). On Day 3 embryos were inspected under a stereomicroscope to evaluate cleavage rate, and 400&micro;l KSOM-20% FCS was added. On Day 5 200&micro;l of medium were removed and 400&micro;l KSOM-10% FCS was added. On Day 7 embryos were evaluated regarding their developmental stage, percentages (%) were calculated over the total of presumptive zygotes, expanded blastocysts were vitrified. All procedures were performed on a Nunc MultidishesTM 4 well dish without mineral oil overlay. During IVM and IVC groups received either 0ng/ml or 50 ng/ml of melatonin, CG and MG respectively. On Day 7 out of 4 replicates all expanded blastocysts were dyed with Propidium Iodide and Hoechst. Remaining expanded blastocysts ass well as all the expanded blastocysts on Day 8 were vitrified. A medium sample was withdrawn for thiobarbituric acid assay (TBARS). Latter embryos were thawed and cultured aiming to evaluate melatonin effect over cryotolerance and post thaw culture system. Statistical analysis was performed using SAS system for Windows 9.2TM parametric data was submitted to student T-test and non parametric to Wilcoxon. Differences were considered meaningful when p<0,05. Expanded blastocysts from MG presented more cells and less cells with ruptured membrane than the ones from CG. But melatonin treatment neither influenced cleavage nor Blastocyst rates on Day 7, nor the rate of blastocysts that can be vitrified. Neither over embryos cryotolerance nor over post thaw culture system. Unexpectedly melatonin increased TBARS levels on medium. Melatonin improves bovine embryo quality however its antioxidant properties were not demonstrated.

A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o tipo mais comum de epilepsia em adultos. Estudos experimentais têm descrito aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) na morte neuronal relacionada à excitotoxicidade, presente em muitas doenças neurodegenerativas, incluindo a epilepsia. O objetivo deste estudo foi avaliar a participação das EROs e da NADPH oxidase na morte neuronal no hipocampo de ratos submetidos ao modelo de ELT induzido pela pilocarpina (PILO). Os métodos utilizados foram a dihidroetidina (DHE) para determinar a geração de EROs, Fluoro-Jade B (detecta a degeneração de neurônios) e o tratamento com apocinina (APO), um antioxidante e inibidor da NADPH oxidase durante 7 dias prévios à injeção de PILO. Ratos machos Wistar adultos (n=5/grupo) foram submetidos à indução do status epilepticus (SE) e sacrificados após diferentes períodos (3, 6, 12 e 24 horas do início do SE). O giro denteado (GD) apresentou morte neuronal e aumento da geração de EROs em todos os períodos avaliados após indução de SE. Na região CA1, foi observada morte neuronal após 24 horas e aumento da geração em 6 e 24 horas. Na região CA3 morte neuronal e geração de EROs foram observadas após 24 horas do início do SE. O tratamento com APO diminuiu os níveis de EROs e morte neuronal em todas as regiões avaliadas. Nossos resultados indicam que o estresse oxidativo contribui para a morte neuronal durante o SE induzido por PILO. Além disso, pode-se sugerir que a NADPH oxidase está envolvida nesse processo, uma vez que o tratamento com APO diminuiu a neurodegeneração presente neste modelo de epilepsia / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent form of epilepsy in adults. Experimental data have described an increase of reactive species oxygen (ROS) generation in relation to the neuronal death related to excitotoxicity, which occurs in many neurodegenerative diseases, including epilepsy. The aim of this study was to evaluate the participation of ROS generated by NADPH oxidase in the cell death observed in the hippocampus of rats submitted to the pilocarpine (PILO) model of TLE. Dihydroethidium (DHE) oxidation and Fluoro-Jade B assays were peformed in order to detect ROS generation and neurodegeneration, respectively. Moreover, treatment of rats with apocynin (APO), an antioxidant and NADPH oxidase inhibitor, was also performed for 7 days prior to induction of status epilepticus (SE). Male Wistar rats (n=5/group) were submitted to PILO injection for SE induction and sacrificed after different periods (3, 6, 12 and 24 hours after SE establishment). The dentate gyrus (DG) present clear neurodegeneration, as well as an increase of ROS generation, in all analysed periods. In the CA1 area neuronal death was observed at 24h and ROS generation after 6h and 24h after SE establishment. In the CA3 area neuronal death and ROS generation were detected 24h after SE induction. APO treatment was effective in decreasing both ROS production and neurodegeneration in all three hipocampal areas. These results reinforce the idea that oxidative stress contributes to the neuronal death ensuing after SE induced by pilocarpine. In addition, as the APO treatment decreased neurodegeneration present in this epilepsy model, we suggest an involvement of ROS generated by NADPH oxidase in TLE

Bicarbonato é uma importante espécie química para os seres vivos, sendo o principal tampão celular, alem de apresentar uma negligenciada atividade redox. Isquemia é um evento no qual existe inibição do aporte de nutrientes e oxigênio, sendo a reperfusão o retorno do fluxo de nutrientes e oxigênio, que é acompanhada por alta produção de radicais livres e morte celular. Nessa tese estudamos o efeito da presença de bicarbonato durante a isquemia-reperfusão. Em nosso modelo nós mantivemos o pH constante e modulamos a quantidade de bicarbonato enquanto células, órgãos e animais foram submetidos a isquemia-reperfusão. Utilizamos condições sem a presença de bicarbonato, a concentração basal sanguínea e uma concentração mais alta simulando o acúmulo de bicarbonato em condições isquêmicas. Nesses diversos modelos mostramos que a presença de bicarbonato aumenta o dano provocado por isquemia-reperfusão e provoca um aumento do acúmulo de proteínas oxidadas. A presença do bicarbonato não modifica a respiração, produção de espécies reativas de oxigênio, ou a morfologia mitocondrial, também não detectamos mudança na atividade do proteassoma e nos indicadores de autofagia geral. Entretanto detectamos um acúmulo de marcadores autofágicos na fração mitocondrial indicando inibição da mitofagia. Essa inibição foi confirmada ao detectarmos o acúmulo de uma proteína degradada especificamente por mitofagia enquanto não houve mudança em outra degradada pelo proteassoma. Além disso, ao inibirmos farmacologicamente a autofagia, reproduzimos o fenótipo causado pelo bicarbonato mesmo na sua ausência. Em conclusão, a presença de bicarbonato é deletéria em condições de isquemia/reperfusão devido a inibição da mitofagia / Bicarbonate is an important molecule in all living being, acting as the main cellular buffer. However, its biological and redox activity has been mostly neglected to date. Ischemia is an event in which an inhibition of nutrient availablity and oxygen flow occurs, while reperfusion is the return of nutrients and oxygen, accompanied of a burst of reactive oxygen species production and cell death. Here, we studied the effects of bicarbonate during cardiac ischemia-reperfusion. In our model, we kept the pH stable and changed the concentration of the bicarbonate. We then subjected cells, organs and animals to ischemia-reperfusion under conditions where there was no presence, basal blood concentration or a higher concentration of bicarbonate. In these diverse models, we found that the presence of bicarbonate increased damage after a ischemia-reperfusion, and promoted the accumulation of oxidized proteins. Bicarbonate did not change respiration, production of reactive oxygen species or the morphology of the mitochondria. There were also no changes in proteasome activity and in global autophagy markers, although there was an accumulation of mitophagy markers. We also found that mitophagy was responsible for the increased damage observed, since pharmacological inhibiting of autophagy abolished the increased damage caused by the presence of bicarbonate. In conclusion the presence of bicarbonate is deleterious in ischemia-reperfusion due mitophagy inhibition