A presença de inibidores no plasma e soro de animais resistentes ao veneno de serpentes, assim como no plasma ou soro de serpentes imunes a seu próprio veneno, é amplamente conhecida. Um grupo destes inibidores são os inibidores de metaloproteases do veneno de serpente (SVMPs), eles têm sido caracterizados do ponto de vista físico químico, porém a falta de informações estruturais e termodinâmicas acerca da sua inibição sobre as SVMPs, tem permanecido como um grande obstáculo para sua aplicação terapêutica ou desenvolvimento como ferramentas moleculares. Por tanto, isolamos um novo inibidor de metaloproteases a partir do soro de C. d. terrificus, por nós denominado crotaini, e realizamos a caracterização cinética de sua interação com a bothropasina, uma das principais metaloproteases do veneno de B. jararaca, e da mesma forma, caracterizamos cineticamente a interação desta metaloprotease com dos inibidores já conhecidos, DM40 e DM43, isolados do soro de D. marsupialis. Determinando as constantes cinéticas mediante cinética enzimática e ressonância plasmônica de superfície (SPR) no Biacore T200. Os valores obtidos permitiram estabelecer que a interação entre o crotaini e a bothropasina, é de alta afinidade, além de evidenciar a sua ligação de forma equimolar e estável. Assim mesmo, o crotaini apresentou uma constante de inibição menor às constantes determinadas para o DM40 e DM43. Adicionalmente, estudos de interação após tratamento quelante da enzima permitem prever que existem diferenças respeito aos domínios estruturais envolvidos na interação do crotaini com a bothropasina, em comparação aos inibidores DM40 e DM43. / The presence of inhibitors in plasma or serum from snake venom - resistant animals is well known. These inhibitors are also present in plasma and serum of snakes that are immune to their own venom. A group of these molecules are snake venom metalloprotease inhibitors (SVMPIs). Although the physicochemical properties of these inhibitors are well established, the lack of structural and thermodynamic information has been a bottleneck for their therapeutic use and development as molecular tools. In this work a new metalloprotease inhibitor was isolated from C. d. terrificus, and named crotaini. The kinetic interaction of crotaini with bothropasin, one of the main metalloproteases from the B. jararaca venom, was investigated. Similarly, the kinetic interactions of crotaini with the inhibitors DM40 and DM43, isolated from D. marsupialis serum, were also studied. The kinetic constants were determined by enzymatic kinetics and surface plasmonic resonance (SPR) in a Biacore T200. The obtained values enabled us to demonstrate the high affinity of the inhibitors toward the metalloprotease, achieved through an equimolar and stable complex formation. In addition, studies of interactions of the metaloprotease bothropasin with its inhibitors in the presence of chelant agents revealed differences between that established with crotaini as compared with those made with DM40 and DM43.

Les Thrombopénies Induites par l’Héparine (TIH) sont une complication sévère des traitements par l’héparine dues à des IgG qui ciblent le facteur plaquettaire 4 modifié par l’héparine (FP4/H) et induisent une activation cellulaire via FcγRIIA, conduisant à des complications thrombotiques. Nous avons caractérisé 5B9, IgG1 monoclonale chimérique anti-FP4/H mimant parfaitement les anticorps de TIH et qui est donc un excellent outil pour étudier la physiopathologie des TIH. La pathogénicité des anticorps (Ac) de TIH implique leur fixation aux FcγR. Nous avons montré que le clivage de la région charnière des IgG de TIH par IdeS inhibe ces interactions IgG-FcγR et supprime la pathogénicité des Ac. Nous avons aussi construit un Antibody-Drug Conjugate (ADC) antithrombotique, en bioconjuguant le tirofiban (inhibiteur de l’agrégation plaquettaire) et 5B9 déglycosylé grâce à un linker clivable par la thrombine, protéase générée en excès lors d’une TIH. / Heparin Induced Thrombocytopenia (HIT) is a rare but severe complication of heparin treatments. HIT is due to IgG antibodies specific to platelet factor 4 modified by heparin (PF4/H), which activate blood cells, (especially platelets) after binding to FcγRIIA, this process explaining frequent thrombotic complications. We characterized 5B9, a chimeric IgG1 targeting PF4/H and which fully mimics human HIT antibodies. Therefore, 5B9 is a perfect tool for studying the physiopathology of HIT. IgG antibodies to PF4/H are pathogenic by interacting with FcγR. In this regard, we showed that cleavage by IdeS, a bacterial protease, of the hinge of anti-PF4/H IgG, fully suppressed their pathogenicity. Furthermore, we designed an antithrombotic Antibody-Drug Conjugate that combined tirofiban, a GPIIbIIIa inhibitor with deglycosylated 5B9 using a thrombin cleavable linker.

A Dengue e a Febre Aftosa são infecções virais que ocorrem tanto no Brasil como no mundo, apresentando enorme impacto socioeconômico. As proteases virais são reconhecidas como alvos de grande interesse para o planejamento de antivirais, devido ao seu papel fundamental no ciclo de vida de muitos vírus, incluindo-se os flavivirus (vírus da Dengue DENV) e os picornavirus (vírus da Febre Aftosa FA). Com o objetivo de buscar e identificar novos inibidores de proteases virais (da NS2B/NS3pro do DENV ou da Lbpro do vírus da FA) propusemos modelos de busca virtual, incluindo diferentes filtros de seleção (ex. farmacofórico, drug-like, similaridade e ancoramento) aplicados, sequencialmente, a bancos de dados de compostos comerciais (280x103 a 23x106 compostos). A seleção final dos compostos foi sempre feita por inspeção visual. Para NS2B/NS3pro do DENV, construíram-se quatro modelos de busca virtual (Modelo I-DENV a Modelo IV-DENV). O primeiro foi construído, baseando-se na estrutura cristalográfica ligada a um inibidor peptidomimético, e aplicado ao banco ZINC. Ao final, dez compostos foram comprados e submetidos a testes de inibição enzimática, frente à NS2B/NS3pro, para validação experimental deste modelo. Dois compostos mostraram alguma atividade inibitória (IC50 150 - 300 µM). Visando-se melhorar estes resultados, a flexibilidade da NS2B/NS3pro foi incluída, usando simulações de dinâmica molecular (DM), e um novo banco de dados construído (ZINC-Curated). Através de uma análise extensiva do banco ZINC-Curated, usando ferramentas estatísticas/quimiométricas, confirmou-se que este foi enriquecido com compostos com características de fármacos. Outros três modelos de busca virtual foram construídos incluindo-se diferentes informações obtidas nas simulações de DM. O modelo II-DENV foi feito usando ancoramento e aplicado ao banco ZINC-Curated, selecionando dezesseis compostos. Nenhum deles apresentou atividade inibitória significativa frente à NS2B/NS3pro do DENV. Os modelos III-DENV e IV-DENV utilizaram modelos farmacofóricos, que tiveram seus desempenhos previamente avaliados usando dados de literatura, e foram aplicados aos bancos NCI e ZINC-Curated, respectivamente. O modelo III-DENV selecionou quinze compostos, tendo quatro deles apresentado atividade inibitória (IC50 30 - 100 µM). O modelo IV-DENV selecionou dezoito compostos, sendo quatro ativos frente a esta protease (IC50 4 - 90 µM), representando uma taxa de acerto de ~22 %. Ainda, uma série de treze análogos estruturais do composto mais ativo foi construída, sendo três deles também ativos. Portanto, as modificações incluídas na busca virtual permitiram melhorar, significativamente, os resultados obtidos. Para Lbpro do vírus da FA, construíram-se dois modelos de busca virtual (Modelos I-FA e II-FA). O primeiro foi construído usando sua estrutura cristalográfica, sem ligantes, e uma série in house de potenciais inibidores covalentes. Seis compostos foram selecionados e testados frente à Lbpro, tendo dois deles baixa atividade inibitória (IC50 300 - 600 µM). A partir da disponibilidade da estrutura da Lbpro com ligante, o modelo IIFA foi construído e aplicado ao banco ZINC-Curated, selecionando quinze compostos. Estes foram adquiridos e testados frente à Lbpro, não apresentando atividade inibitória significativa. Assim, as modificações incluídas ainda não foram suficientes para selecionar inibidores mais potentes. No entanto, estes modelos/resultados contribuíram para o entendimento da(s) interação(ões) no sítio ativo da Lbpro. / Dengue and Food-and-mouth disease are viral infections that occur in Brazil and in the world, causing a huge socioeconomic impact. Viral proteases are recognized as targets for antiviral design, because they are crucial for the life cycle of many viruses, such as flavivirus (Dengue virus DENV) and picornavirus (Food-and-mouth disease virus FMDV). In order to discovery novel inhibitors of viral proteases (of NS2B/NS3pro of DENV or of Lbpro of FMDV) virtual screening models were proposed comprising a sequence of different filters (e.g. pharmacophore, drug-like, similarity and docking) applied to databases of commercial compounds (280x103 to 23x106 compounds). In all models, the final selection of compounds was always done by visual inspection. For DENV NS2B/NS3pro, four virtual screening models were proposed (Model I-DENV to Model IV-DENV). Model I-DENV was built, based on the crystal structure bound to a peptidemimetic inhibitor, and applied to ZINC database. Finally, ten compounds were purchased and submitted to enzymatic assays against this protease to the experimental validation of this model. Two compounds showed some inhibitory activity (IC50 150 - 300 µM). In order to improve these results, NS2B/NS3pro flexibility was included, using molecular dynamics (MD) simulations, and a novel database was built (ZINC-Curated). Throughout an exhaustively analysis of ZINC-Curated, using statistical/chemometrics tools, we confirmed that this new database was enriched with drug like compounds. Other three virtual screening models were built including different information from MD simulations. Model II-DENV was built using docking and applied to the ZINC-Curated database, selecting sixteen compounds. None of them showed a significant inhibitory activity against DENV NS2B/NS3pro. Models III-DENV and IV-DENV were built using pharmacophore models, which have their performance previously evaluated using literature data, and applied to NCI and ZINC-Curated databases, respectively. Model III-DENV selected fifteen compounds, showing four of them inhibitory activity (IC50 30 - 100 µM). Model IV-DENV selected eighteen compounds. Four of them were active against this protease (IC50 4 - 90 µM), representing a hit rate of ~22 %. Moreover, a set of thirteen structural analogues of the most active compound were built, being three of them also active. Thus, the modifications done in the virtual screening procedure really improved our results. For FMDV Lbpro, two virtual screening models were built (Models I-FMDV and II-FMDV). The first one was based on the crystal structure, without ligands, and used a set of in house potential covalent inhibitors. Six of the in house compounds were selected and tested against this protease. Two of them showed a weak inhibitory activity (IC50 300 - 600 µM). Later on, the Lbpro bound with ligands was available being therefore used to build another model. Model II FMDV was applied to the ZINC-Curated database, selecting fifteen compounds that were purchased and also tested against the target protease. But none of them showed a significant inhibition. Thus, the incorporated changes were not enough to retrieve active compounds. However, these models/results contributed to better understand Lbpro binding site interactions

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12. / Introduction: We have previously showed that in an elastase-induced model of emphysema, the treatment with a serine protease inhibitor rBmTI-A, resulted in an improvement of tissue destruction in mice. Considering that smoking is the main risk factor for the development of COPD, and the cigarette smoke (CS) exposure is considered the best model to reproduce physiopathologic similarities with such disease in humans, this study aimed to verify the rBmTI-A treatment on the physiopathological processes involved in the development of cigarette smoke-induced emphysema. Methods: To induce pulmonary emphysema, animals were exposed to cigarette smoke (twice a day/ 30 minutes/ 5 days per week/ for 12 weeks) and the control animals were exposed to room air. Two treatment protocols with rBmTI-A inhibitor were performed. In the first one, animals received two administrations of rBmTI-A inhibitor or its vehicle (Saline Solution 0.9%) by nasal instillation, one dose at 24 hours after the end of exposure to tobacco smoke and another one, 7 days after the first instillation of the inhibitor. In the second protocol, animals received 3 rBmTI-A inhibitor administrations during the exposition time (1st dose: 24 hours before the start of exposure to cigarette smoke; 2nd dose: one month after the start of exposure, 3rd dose: two months after the start). After the end of exposure and treatment protocols, animals were submitted to procedures for collection of respiratory mechanics and evaluation of the Mean Linear Intercept (Lm). For the second protocol, we also measured the volume proportion of collagen and elastic fibers, the density of positive cells for MAC-2, MMP-12 and -9, TIMP-1, GP91phox and TNF-alfa in lung parenchyma by immunohistochemistry. Also, we evaluated the measurement of polymorphonuclear cells and the lung gene expression for MMP-12 and 9 by RT-qPCR. Results and Discussion: Treatment with the serine protease inhibitor rBmTI-A attenuated the development of emphysema only in the second protocol, when it was administered during exposure to cigarette smoke. Although Smoke-rBmTIA and Smoke-VE groups showed an increase of Lm measure compared to Control groups, there were a decrease in the Smoke-rBmTIA group compared to Smoke-VE group. The same response was observed for the analysis of volume proportion of elastic and collagen fibers in parenchyma. In addition, we observed an increase of macrophages, MMP-12, MMP-9 and TNF-alfa; in groups exposed to cigarette smoke, but treatment with rBmTI-A inhibitor only decreased the number of positive cells for MMP-12. We did not observed difference between the experimental groups in lungs gene expression for MMP- 12 and 9, and the same behavior was observed for the amount of polymorphonuclear cells in parenchyma. Moreover, we observed an increase of GP91phox and TIMP-1 in groups treated with rBmTI-A. Conclusions: These results suggest that rBmTI-A inhibitor was not effective for treatment of parenchymal lesions after established disease. However, this inhibitor attenuated the development of disease when administered during the induction of emphysema, possibly by an increase of GP91phox and TIMP-1, accompanied by a decrease of MMP-12

INTRODUÇÃO: Os corticosteróides são considerados padrão-ouro no tratamento da asma, porém, existem asmáticos graves que não obtém controle dos sintomas, o que suscita a busca por novas terapias. Os inibidores de proteinases têm sido estudados no controle de diversos processos inflamatórios, dentre estes, encontra-se Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJETIVO: Avaliar se a proteina bifuncional de planta, CrataBL, que tem função lectínica e se liga a carboidratos, modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e nos septos alveolares de camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Trinta e dois camundongos machos Balb-c SPF (6-7 semanas, 25-30 g) foram divididos em 4 grupos: C (controle), OVA (sensibilizados - 50 ug de ovalbumina intraperitoneal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados - 1% de ovalbumina nos dias 22, 24, 26, 28); C+CR (controle tratados com CrataBL - 2 mg/kg/i.p dos dias 22 a 28); OVA+CR (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com CrataBL - 2 mg /kg/i.p dos dias 22 a 28). No dia 29, realizamos: (i) hiperresponsividade à metacolina - resposta máxima de resistência (Rrs) e elastância (Ers) do sistema respiratório; (ii) quantificação do número total de células, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA); (iii) análise histopatológica do pulmão por morfometria para quantificação de eosinófilos, fração de volume de fibras colágenas e elásticas; (iiii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2alfa nas vias aéreas e nos septos alveolares e ELISA para quantificação da concentração de IL-4, IL-5 e IFN-y. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+CR comparado ao grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com CrataBL nos animais sensibilizados atenuou o número de células totais, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no FLBA, o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas tanto nas vias aéreas quanto nos septos alveolares quando comparados ao grupo OVA. O tratamento com CrataBL atenuou os níveis de concentração de IL-4, IL-5 e IFN-y em comparação ao grupo OVA (p < 0,05), a partir do método ELISA. CONCLUSÕES: CrataBL atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Contudo, mais estudos são necessários para verificar se este inibidor pode ser uma potencial ferramenta terapêutica para a asma / RATIONALE: Corticosteroids are considered the gold standard in the treatment of asthma, however, there are severe asthmatics who do not get control of symptoms, which raises the search for new therapies. The proteinase inhibitors have been studied in the control of various inflammatory processes, including such inhibitors is Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJECTIVE: To evaluate the proteinase inhibitor CrataBL modulates the bronchial responsiveness to methacholine, inflammation, remodeling and activation of oxidative stress in the airways and alveolar septa of mice with chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Thirty two SPF Balb-c male mice (6-7 weeks, 25-30 g) were divided into 4 groups: control (C), OVA (sensitized - 50 ug ovalbumin intraperitoneal (i.p) on days 0 and 14 and challenged - 1% ovalbumin on days 22, 24, 26, 28); C+CR (control treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p of 22 to 28); OVA+CR (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p from day 22 to 28). On the 29th, we held: (i) hyperresponsiveness to methacholine and maximal responses were obtained resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) quantification of total cells, macrophages, polymorphonuclear cells and lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid (BALF); (iii) histopathological analysis of the lungs by morphometry to quantify the eosinophils, volume fraction of collagen and elastic fibers; (iiii) immunohistochemistry for quantification of positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NFk-beta cells and volume fraction of 8-iso-PGF2? in airway and alveolar septa and ELISA for quantification of concentration of IL-4, IL-5 e IFN-y (p < 0.05). RESULTS: There was attenuation of the maximal response Rrs and Ers in the OVA+CR group compared to OVA (p < 0.05). Treatment with CrataBL in sensitized animals attenuated the number of total cells, macrophages, lymphocytes, and polymorphonuclear cells in BALF, the number of eosinophil positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, iNOS, MMP -9, TIMP-1, TGF-beta, NF-kB cells and volume fraction of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers in both the airways and alveolar septa compared to OVA group. Treatment with CrataBL attenuated concentration levels of IL-4, IL-5 and IFN-y compared to OVA group (p < 0.05) from the ELISA method.CONCLUSIONS: CrataBL attenuated bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in this experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. However, more studies are needed to determine if this inhibitor can be a potential therapeutic tool for asthma

As aminoacil tRNA sintetases (AaRSs) são enzimas essenciais na síntese de proteínas assegurando a correta relação entre os aminoácidos e seus tRNA cognatos. O genoma mitocondrial dos tripanossomatídeos perdeu os genes codificantes dos tRNAs, assim os tRNA mitocondriais são codificados no núcleo e importados do citoplasma. O código genético do kinetoplasto desvia do código genético pela utilização do códon de terminação UGA para a decodificação do códon do triptofano. Um único gene codificando o tRNATrp(CCA) observado no genoma de Leismania é responsável pela incorporação do aminoácido triptofano durante a síntese proteíca na mitocôndria. Para decodificar os dois códons do Trp (UGA e UGG) a base na posição 34 do tRNATrp(CCA) passa por um evento de editoração, convertendo o ribunuclotídeo C34 em U34, produzindo o tRNATrp(UCA) capaz de decodificar o códon UGA. Nesse trabalho foram caracterizadas duas triptofanil tRNA sintetases de Leishmania major. De acordo com experimentos de ?western blotting? e análises ?in silico? das seqüências de aminoácidos, uma enzima tem localização citoplasmática (LmTrpRS1) enquanto a outra mitocondrial (LmTrpRS2). Os mRNAs dos dois genes foram definidos por experimentos de 5? e 3? RT-PCR. As duas enzimas foram clonadas em diversos vetores de expressão procariotos e eucariotos. A LmTrpRS1 foi obtida somente na fração insolúvel, já a LmTrpRS2 foi obtida na fração solúvel quando clonada no vetor de expressão pET28a. Esta porém mostrou-se instável precipitando rapidamente após sua purificação. Os ensaios enzimáticos realizados com a mesma mostraram que ela é capaz de reconhecer os tRNAsTrp editado e não editado. Modelagem molecular por homologia com as duas proteínas foi realizada usando a proteína citoplasmática humana como molde, para estudar a interação entre a proteína e o tRNATrp. Xylella fastidiosa é um bactéria gram negativa limitada ao xilema, responsável por um grande número de doenças economicamente importantes, como a doença de Pierces em videiras, Clorose variegata do Citrus (CVC) e a doença da requeima das folhas em outras plantas incluindo, amendoeira, ameixeira, louro, amoreira e café. Em todos os casos a X. fastidiosa afeta o xylema da planta causando redução na produção de frutos. Nesse trabalho nós mostramos a estrutura da Xylellaína, uma cisteíno protease desse patógeno. A estrutura foi resolvida por dispersão anômala a um único comprimento de onda, utilizando cristais de xylellaína selenometionina substituídos. A estrutura da Xylellaína foi refinada até 1,65 Å de resolução, mostrando enovelamento similar às proteínas da família da papaína, porém algumas características interessantes como uma região N-terminal composta por 38 aminoácidos cobrindo o sulco ativo da enzima, um intrigante ribonucleotídeo encontrado fora do sítio ativo da enzima e um ?loop? semelhante ao ?loop? de oclusão presente na catepsina B. / The aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) are essential enzymes in protein synthesis that ensure the correct match between amino acids and their cognate tRNAs. The mitochondrial (kinetoplast) genome of trypanossomatids lacks tRNA genes, and therefore nucleus-encoded tRNAs are imported from the cytoplasm, the kinetoplast genetic code deviates from the universal code in that UGA instead of UGG encodes for tryptophan. A single nucleus-encoded tRNATrp(CCA) is responsible for Trp insertion during organellar protein synthesis. To decode both Trp codons (UGA and UGG), tRNATrp(CCA) undergoes a single C to U editing event at position 34 of the anticodon yielding to versions of the tRNA in the mitochondria with anticodon CCA and UCA, permitting UGA decoding. This work have characterized two Leishmania major tryptophanyl-tRNA synthetase, acording western blotting experiments and ?in silico? sequence analisis one of cytoplasmatic localization (LmTrpRS1) and another from mitochondria localization (LmTrpRS2). The mature mRNA transcripts for both genes were defined by 5? and 3? RT-PCR. Both enzymes were cloned into several expressions vectors. LmTrpRs1 was obtained as an insoluble protein and LmTrpRs2 expressed into the soluble fraction in pET28a expression system. LmTrpRS2 protein, however, is unstable precipitating shortly after purification. The enzymatic assay showed that this enzyme is able to recognize both tRNATrp. Molecular modeling for LmTrpRS1 and LmTrpRS2 were constructed using the cytoplasmatic human tryptophanyl tRNA synthetase as a model, to study the interaction between proteins and tRNATrp. Xylella fastidiosa is a xylem-limited, gram-negative bacteria responsible for a large number of economically important plant diseases, such as Pierces disease in grapevines, citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet oranges and leaf scorch diseases in other plants, including almond, plum, oleander, mulberry and coffee. In all cases, X. fastidiosa infects the plant xylem and impairs fruit production. Here, we report the crystal structure of xylellain, a cystein protease from X. fastidiosa. The structure was solved by single-wavelength anomalous dispersion (SAD) using seleno-methionine containing xylellain crystals. The final structure of Xylellaína was refined against the best native data set (1.65 Å) showing R/Rfree= 17/21. Xylellain shares fold similar to Papain like Family, but contains some interesting features, like a 38 N-terminal tail covering the active site cleft; one intriguing ribonucleotide found outside the active site and one loop that resemble the ocluding loop from cathepsin B.

Introdução: Uma proporção significante de pacientes infectados por HIV-1 (pacientes HIV-1+) tratados com inibidores de protease (IPs) desenvolve mutações de resistência. Estudos recentes têm mostrado que células T CD8+ de pacientes HIV- 1+ reconhecem epitopos de Pol incluindo mutações selecionadas por drogas. Nenhum epitopo CD4+ da protease foi descrito na base de dados de Los Alamos. Objetivo: Considerando que a protease de HIV-1 é alvo de terapia antiretroviral e que essa pressão pode selecionar mutações, nós investigamos se mutações selecionadas por IPs afetariam o reconhecimento de epitopos da protease de HIV-1 por células T CD4+ em pacientes tratados com IPs. Nós investigamos o reconhecimento de três regiões da protease preditas de conter epitopos de células T CD4+ bem como mutações induzidas por IPs por células T CD4+ em pacientes HIV- 1+ tratados com IPs. Materiais e Métodos: Quarenta pacientes HIV-1+ tratados com IPs foram incluídos (30 em uso de Lopinavir/ritonavir, 9 em uso de Atazanavir/Ritonavir e 1 em uso exclusivo de Atazanavir). Para cada paciente determinou-se a seqüência endógena da protease de HIV-1, genotipagem viral e tipagem HLA classe II. Utilizamos o algoritmo TEPITOPE para selecionar peptídeos promíscuos, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR, codificando as três regiões da protease de HIV-1 cepa HXB2 (HXB2 4-23, 45-64, e 76-95) e 32 peptídeos adicionais contidos nas mesmas regiões incorporando as mutações induzidas por IPs mais freqüentes no Brasil. Os 35 peptídeos foram sintetizados. Respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ aos peptídeos foram determinadas por ensaios de proliferação com diluição do corante CFSE. Ensaios de ligação a alelos HLA classe II foram realizados para confirmar a promiscuidade desses peptídeos e avaliar a habilidade de se ligarem a moléculas HLA presentes em cada paciente. Resultados: Todos os peptídeos foram reconhecidos por pelo menos um paciente e respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ a pelo menos um peptídeo da protease de HIV-1 foram encontradas em 78% e 75% dos pacientes, respectivamente. A terceira região (Protease 76 95) foi a mais freqüentemente reconhecida. Ao compararmos as respostas de células T às seqüências da protease do HIV-1 endógeno, observamos que a maioria dos pacientes não foi capaz de reconhecer peptídeos idênticos às essas seqüências, porém reconheceram peptídeos variantes diferentes das mesmas regiões. Apenas sete pacientes responderam às seqüências endógenas. Verificamos que diversos peptídeos endógenos que não foram reconhecidos apresentaram ausência de ligação a alelos HLA portados por estes pacientes, sugerindo que mutações selecionadas por pressão imune tenham levado ao escape de apresentação de antígeno e evasão de resposta de linfócitos T CD4+. Alternativamente, isso poderia ser explicado pela presença de um vírus replicante distinto presente no plasma uma vez que somente foram obtidas seqüências provirais. Conclusão: Epitopos selvagens e mutantes da protease do HIV-1 reconhecidos por células T CD4+ foram identificados. Também verificamos que a maior parte dos pacientes não reconheceu as seqüências da protease endógena enquanto que reconheceram seqüências variantes. O reconhecimento de seqüências não-endógenas poderia ser hipoteticamente conseqüência de alvo de populações HIV-1 minoritárias; protease de HERV que contém regiões de similaridade com a protease do HIV-1; ou seqüências de HIV-1 presentes apenas em parceiros virêmicos. A falha de reconhecimento de seqüências endógenas seria mais provável devido ao escape imune, do que ao nível de apresentação ou reconhecimento por células T. Isso implica em uma conseqüência patofisiológica na evasão de respostas de células T contra a protease de HIV-1 e no fato de ser tradicionalmente considerada uma proteína pouco antigênica / Introduction: A significant proportion of protease inhibitor (PI)-treated HIV-1 infected (HIV-1+) patients develop resistance mutations. Recent studies have shown that CD8+ T cells from HIV-1 patients can recognize antiretroviral drug-induced mutant Pol epitopes. No HIV-1 protease CD4 epitopes are described in the Los Alamos database. Aims: Given that the protease of HIV-1 is a target of antiretroviral therapy and this pressure may lead to the selection of mutations, we investigated whether PI-induced mutations affect the recognition of HIV-1 protease epitopes by CD4 + T cells in PI-treated patients. We investigated the recognition of three protease regions predicted to harbor CD4+ T cell epitopes as well as PI-induced mutations by CD4+ T cells of PI-treated HIV-1+ patients. Methods: Forty PI-treated HIV-1+ patients were included (30 undergoing Lopinavir/ritonavir, 9 undergoing Atazanavir/ritonavir and 1 undergoing exclusively Atazanavir treatment). For each patients, the endogenous HIV-1 protease sequence, viral genotype and HLA class II typing were determined. We used the TEPITOPE algorithm to select promiscuous, multiple HLA-DR-binding peptides encoding 3 regions of HIV-1 HXB2 strain protease (HXB2 4-23, 45-64, and 76-95) and 32 additional peptides contained in the same regions, but encompassing the most frequent PI-induced mutations in Brazil. The 35 peptides were thus synthesized. Proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against peptides were determined by the CFSE dilution assay. HLA class II binding assays were made to confirm the promiscuity of these peptides and evaluate their ability to bind the HLA molecules carried by each patient. Results: All tested peptides were recognized by at least one patient and proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against at least one HIV-1 protease peptide were found in 78% and 75% patients, respectively. The third region (Protease 76-95) was the most frequently recognized. By comparing T-cell responses to HIV-1 endogenous protease sequences, we found that most patients failed to recognize identical peptides of those sequences, but recognized different variant peptides of the same region. Only seven patients responded to endogenous sequences. We found that several endogenous peptides that failed to be recognized showed no binding to the HLA alleles carried by that given patient, suggesting that mutations selected by immune pressure have led to escape of antigen presentation, as well as direct escape of the CD4+ T cell response. Alternatively, it could have been due to the presence of a different replicating virus in the plasma-since we only obtained proviral sequences. Conclusion: Wild-type and mutant HIV-1 protease epitopes recognized by CD4+ T cells were identified. We also found that most patients failed to recognize their endogenous protease sequences, while they recognized variant sequences. The recognition of non-endogenous sequences could hypothetically be a consequence of targeting a minor HIV-1 population; HERV protease, that contains regions of similarity with HIV-1 protease; or HIV-1 sequences present only in viremic partners. The failure to recognize endogenous sequences is most likely due to immune escape, either at the level of presentation or direct T cell recognition. This may have a pathophysiological consequence on evasion of T cell responses against protease and the fact that it has been considered traditionally a poorly antigenic HIV-1 protein.

Introdução: Demonstramos previamente que em modelo experimental de enfisema pulmonar induzido por instilação de elastase, o inibidor de serinoprotease rBmTI-A promoveu a melhora da destruição tecidual em camundongos. Considerando que o tabagismo é o principal fator de risco para o desenvolvimento da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e que o modelo de exposição à fumaça de cigarro é considerado o que melhor mimetiza esta doença em humanos, este estudo teve por objetivo verificar a ação do inibidor para serinoproteases rBmTI-A sobre os processos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento do enfisema pulmonar, em modelo de exposição ao tabaco. Métodos: Para a indução do enfisema pulmonar, os animais foram expostos à fumaça de cigarro (duas vezes ao dia/ 30 minutos/ 5 dias por semana/ durante 12 semanas), e os animais controle permaneceram expostos ao ar ambiente. Dois protocolos de tratamento com o inibidor rBmTI-A foram realizados. No primeiro, os animais receberam duas administrações do inibidor rBmTI-A ou de seu veículo (Solução Salina 0,9%) por via intranasal, sendo a primeira após 24h do término das exposições ao cigarro e outra, 7 dias após à primeira instilação do inibidor. No segundo protocolo, os animais receberam 3 administrações do inibidor rBmTI-A, durante o tempo de exposição (1ª dose: 24h antes do início da exposição à fumaça de cigarro; 2ª dose: um mês após o início da exposição; 3ª dose: dois meses após o início). Após o término dos protocolos de exposição e tratamento, os animais foram submetidos aos procedimentos para coleta dos dados de mecânica respiratória e avaliação do Intercepto Linear Médio (Lm). Para o segundo protocolo, realizamos também as medidas para quantificação de fibras de colágeno e elástica, da densidade de células positivas para MAC-2, MMP-12 e 9, TIMP-1, Gp91phox e TNFalfa; no parênquima através de imunohistoquímica, contagem de células polimorfonucleares além da expressão gênica de MMP-12 e 9 no pulmão através de RT-qPCR. Resultados e Discussão: O tratamento com o inibidor para serinoprotease rBmTI-A atenuou o desenvolvimento do enfisema pulmonar apenas no segundo protocolo, quando foi administrado durante a exposição à fumaça de cigarro. Embora os grupos Fumo-rBmTIA e Fumo-VE apresentem aumento de Lm comparados aos grupos controles, houve uma redução deste índice no grupo Fumo-rBmTIA comparado ao grupo Fumo-VE. O mesmo comportamento foi observado para as análises de proporção em volume de fibras de elástica e colágeno no parênquima. Além disto, observamos aumento de macrófagos, MMP-12, MMP-9 e TNFalfa; nos grupos expostos à fumaça de cigarro, mas o tratamento com o inibidor rBmTI-A diminuiu apenas a quantidade de células positivas para MMP-12. Na avaliação da expressão gênica para MMP-12 e 9, não observamos diferença entre os grupos experimentais e o mesmo comportamento foi observado para a quantidade de células polimorfonucleares no parênquima. Além disso, observamos aumento de GP91phox e TIMP-1 nos grupos tratados com rBmTIA. Conclusões: Tais resultados sugerem que o inibidor rBmTI-A não foi efetivo como tratamento da lesão após a doença instalada. Entretanto, atenuou o desenvolvimento da doença quando administrado durante a indução do enfisema, possivelmente através do aumento de GP91phox e TIMP-1, acompanhados pela diminuição de MMP-12. / Introduction: We have previously showed that in an elastase-induced model of emphysema, the treatment with a serine protease inhibitor rBmTI-A, resulted in an improvement of tissue destruction in mice. Considering that smoking is the main risk factor for the development of COPD, and the cigarette smoke (CS) exposure is considered the best model to reproduce physiopathologic similarities with such disease in humans, this study aimed to verify the rBmTI-A treatment on the physiopathological processes involved in the development of cigarette smoke-induced emphysema. Methods: To induce pulmonary emphysema, animals were exposed to cigarette smoke (twice a day/ 30 minutes/ 5 days per week/ for 12 weeks) and the control animals were exposed to room air. Two treatment protocols with rBmTI-A inhibitor were performed. In the first one, animals received two administrations of rBmTI-A inhibitor or its vehicle (Saline Solution 0.9%) by nasal instillation, one dose at 24 hours after the end of exposure to tobacco smoke and another one, 7 days after the first instillation of the inhibitor. In the second protocol, animals received 3 rBmTI-A inhibitor administrations during the exposition time (1st dose: 24 hours before the start of exposure to cigarette smoke; 2nd dose: one month after the start of exposure, 3rd dose: two months after the start). After the end of exposure and treatment protocols, animals were submitted to procedures for collection of respiratory mechanics and evaluation of the Mean Linear Intercept (Lm). For the second protocol, we also measured the volume proportion of collagen and elastic fibers, the density of positive cells for MAC-2, MMP-12 and -9, TIMP-1, GP91phox and TNF-alfa in lung parenchyma by immunohistochemistry. Also, we evaluated the measurement of polymorphonuclear cells and the lung gene expression for MMP-12 and 9 by RT-qPCR. Results and Discussion: Treatment with the serine protease inhibitor rBmTI-A attenuated the development of emphysema only in the second protocol, when it was administered during exposure to cigarette smoke. Although Smoke-rBmTIA and Smoke-VE groups showed an increase of Lm measure compared to Control groups, there were a decrease in the Smoke-rBmTIA group compared to Smoke-VE group. The same response was observed for the analysis of volume proportion of elastic and collagen fibers in parenchyma. In addition, we observed an increase of macrophages, MMP-12, MMP-9 and TNF-alfa; in groups exposed to cigarette smoke, but treatment with rBmTI-A inhibitor only decreased the number of positive cells for MMP-12. We did not observed difference between the experimental groups in lungs gene expression for MMP- 12 and 9, and the same behavior was observed for the amount of polymorphonuclear cells in parenchyma. Moreover, we observed an increase of GP91phox and TIMP-1 in groups treated with rBmTI-A. Conclusions: These results suggest that rBmTI-A inhibitor was not effective for treatment of parenchymal lesions after established disease. However, this inhibitor attenuated the development of disease when administered during the induction of emphysema, possibly by an increase of GP91phox and TIMP-1, accompanied by a decrease of MMP-12

INTRODUÇÃO: Os corticosteróides são considerados padrão-ouro no tratamento da asma, porém, existem asmáticos graves que não obtém controle dos sintomas, o que suscita a busca por novas terapias. Os inibidores de proteinases têm sido estudados no controle de diversos processos inflamatórios, dentre estes, encontra-se Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJETIVO: Avaliar se a proteina bifuncional de planta, CrataBL, que tem função lectínica e se liga a carboidratos, modula a hiperresponsividade brônquica à metacolina, inflamação, remodelamento e estresse oxidativo nas vias aéreas e nos septos alveolares de camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica. MÉTODOS: Trinta e dois camundongos machos Balb-c SPF (6-7 semanas, 25-30 g) foram divididos em 4 grupos: C (controle), OVA (sensibilizados - 50 ug de ovalbumina intraperitoneal (i.p) nos dias 0 e 14 e desafiados - 1% de ovalbumina nos dias 22, 24, 26, 28); C+CR (controle tratados com CrataBL - 2 mg/kg/i.p dos dias 22 a 28); OVA+CR (sensibilizados e desafiados com ovalbumina e tratados com CrataBL - 2 mg /kg/i.p dos dias 22 a 28). No dia 29, realizamos: (i) hiperresponsividade à metacolina - resposta máxima de resistência (Rrs) e elastância (Ers) do sistema respiratório; (ii) quantificação do número total de células, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no fluido do lavado broncoalveolar (FLBA); (iii) análise histopatológica do pulmão por morfometria para quantificação de eosinófilos, fração de volume de fibras colágenas e elásticas; (iiii) imunohistoquímica para quantificação de células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2alfa nas vias aéreas e nos septos alveolares e ELISA para quantificação da concentração de IL-4, IL-5 e IFN-y. A significância foi considerada quando p < 0,05. RESULTADOS: Houve atenuação da resposta máxima de Rrs e Ers no grupo OVA+CR comparado ao grupo OVA (p < 0,05). O tratamento com CrataBL nos animais sensibilizados atenuou o número de células totais, macrófagos, linfócitos e células polimorfonucleares no FLBA, o número de eosinófilos, células positivas para IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, iNOS, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, NF-kB e fração de volume de 8-iso-PGF2alfa, fibras colágenas e elásticas tanto nas vias aéreas quanto nos septos alveolares quando comparados ao grupo OVA. O tratamento com CrataBL atenuou os níveis de concentração de IL-4, IL-5 e IFN-y em comparação ao grupo OVA (p < 0,05), a partir do método ELISA. CONCLUSÕES: CrataBL atenuou a hiperresponsividade brônquica, a inflamação, o remodelamento e o estresse oxidativo nesse modelo experimental de inflamação pulmonar alérgica crônica. Contudo, mais estudos são necessários para verificar se este inibidor pode ser uma potencial ferramenta terapêutica para a asma / RATIONALE: Corticosteroids are considered the gold standard in the treatment of asthma, however, there are severe asthmatics who do not get control of symptoms, which raises the search for new therapies. The proteinase inhibitors have been studied in the control of various inflammatory processes, including such inhibitors is Crataeva tapia Bark Lectin (CrataBL). OBJECTIVE: To evaluate the proteinase inhibitor CrataBL modulates the bronchial responsiveness to methacholine, inflammation, remodeling and activation of oxidative stress in the airways and alveolar septa of mice with chronic allergic pulmonary inflammation. METHODS: Thirty two SPF Balb-c male mice (6-7 weeks, 25-30 g) were divided into 4 groups: control (C), OVA (sensitized - 50 ug ovalbumin intraperitoneal (i.p) on days 0 and 14 and challenged - 1% ovalbumin on days 22, 24, 26, 28); C+CR (control treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p of 22 to 28); OVA+CR (sensitized and challenged with ovalbumin and treated with CrataBL - 2 mg / kg / i.p from day 22 to 28). On the 29th, we held: (i) hyperresponsiveness to methacholine and maximal responses were obtained resistance (Rrs) and elastance (Ers) of the respiratory system; (ii) quantification of total cells, macrophages, polymorphonuclear cells and lymphocytes in bronchoalveolar lavage fluid (BALF); (iii) histopathological analysis of the lungs by morphometry to quantify the eosinophils, volume fraction of collagen and elastic fibers; (iiii) immunohistochemistry for quantification of positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, MMP-9, TIMP-1, TGF-beta, iNOS, NFk-beta cells and volume fraction of 8-iso-PGF2? in airway and alveolar septa and ELISA for quantification of concentration of IL-4, IL-5 e IFN-y (p < 0.05). RESULTS: There was attenuation of the maximal response Rrs and Ers in the OVA+CR group compared to OVA (p < 0.05). Treatment with CrataBL in sensitized animals attenuated the number of total cells, macrophages, lymphocytes, and polymorphonuclear cells in BALF, the number of eosinophil positive IL-4, IL-5, IL-13, IFN-y, iNOS, MMP -9, TIMP-1, TGF-beta, NF-kB cells and volume fraction of 8-iso-PGF2alfa, collagen and elastic fibers in both the airways and alveolar septa compared to OVA group. Treatment with CrataBL attenuated concentration levels of IL-4, IL-5 and IFN-y compared to OVA group (p < 0.05) from the ELISA method.CONCLUSIONS: CrataBL attenuated bronchial hyperresponsiveness, inflammation, remodeling and oxidative stress in this experimental model of chronic allergic pulmonary inflammation. However, more studies are needed to determine if this inhibitor can be a potential therapeutic tool for asthma

Genes de plantas que codificam inibidores de enzimas digestivas de insetos têm sido introduzidos em plantas cultivadas visando o controle de pragas. Os inibidores de proteinases estão presentes nos tecidos vegetais, principalmente nas sementes, e atuam em resposta a ataques por herbívoros e patógenos. Inibidores de serino-proteinases (IPs) dos tipos Bowman-Birk e Kunitz isolados de sementes de soja foram inseridos em variedades de cana-de-açúcar para aumentar a resistência à broca Diatraea saccharalis (Fabr.), principal praga desta cultura. Para utilização de plantas geneticamente modificadas contendo inibidores de proteinases é necessário um conhecimento profundo de sua sustentabilidade e segurança ambiental, determinando a estabilidade da característica inserida e os seus efeitos nos organismos não-alvo. O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos diretos e indiretos de inibidores de proteinases de soja em organismos não-alvos: um parasitóide larval, Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae); um patógeno, Metarhizium anisopliae (Mestch.) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes); um polinizador, Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) e um decompositor, Scheloribates praeincisus (Berlese) (Acari: Oribatida: Scheloribatidae); associados à cultura da cana-de-açúcar. O consumo de Kunitz e BBI não afetou a sobrevivência de S. praeincisus. Por outro lado, a ingestão dos inibidores semi-purificados e purificados do tipo Kunitz diminuiu a duração das fases imaturas de S. praeincisus. A ingestão de folhas de cana GM expressando inibidores de proteinases (Kunitz e BBI) não afetou o tempo de desenvolvimento e a sobrevivência dos imaturos deste oribatídeo quando comparada à ingestão de suas isolinhas. Os inibidores de proteinases semi-purificados e purificados não afetaram a duração dos períodos larval e pupal, o peso e número de pupas e percentual de emergência do parasitóide C. flavipes em D. saccharalis. Por outro lado, a proporção de fêmeas em relação a machos de C. flavipes foi maior no tratamento onde as lagartas foram alimentadas com dieta contendo 0,5% de inibidores semi-purificados comparado-se à testemunha. A proporção fêmea:macho foi significativamente maior também quando os parasitóides foram alimentados com o inibidor do tipo Kunitz em relação ao controle e aos parasitóides alimentados com BBI. A adição de 0,5% (p/v) de inibidores de proteinases semi-purificados e 0,05% (p/v) de inibidores purificados do tipo Kunitz nos meios de cultura MC e BDA resultaram em maiores crescimento vegetativo e produção de conídios de M. anisopliae. Os inibidores purificados do tipo BBI não alteraram a esporulação do fungo. Os resultados dos estudos com A. mellifera não foram conclusivos e novas investigações precisam ser conduzidas para esclarecer os potenciais efeitos de inibidores de proteinases em abelhas. De uma forma geral, observou-se que os inibidores de proteinases (Kunitz e BBI) não afetaram negativamente os organismos não-alvo testados. Por outro lado, a ingestão de inibidor do tipo Kunitz alterou positivamente alguns parâmetros biológicos de C. flavipes, M. anisopliae e S. praeincisus. / Genes of plants expressing insect proteinase inhibitors have been introduced into plants for pest control. Proteases inhibitors are present in plant tissues, mainly in seeds, and act in response to predators and pathogens. The Bowman-Birk type and Kunitz type of serine proteases inhibitors (PI) from soybean seeds are been used to increase resistance of sugarcane to Diatraea saccharalis (Fabr.), the most important pest of this crop. The sustainability and environmental safety of PI crops is still unknown. For these reasons, it is necessary to understand the stability and the non-target effects of this new trait. The objective of this study was to evaluate the direct and indirect effects of soybean PI on the following non-target organisms associated to sugarcane: the larval parasitoid, Cotesia flavipes (Cam.) (Hymenoptera: Braconidae); the entomopathogen, Metarhizium anisopliae (Mestch.) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes); the pollinator Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) and the soil mite involved in the process of recycling organic matter, Scheloribates praeincisus (Berlese) (Acari: Oribatida: Scheloribatidae). Kunitz and BBI did not affect S. praeincisus survival. On the other hand, Kunitz semi-purified and purified inhibitor ingestion reduced duration of the immature stages of S. praeincisus. Ingestion of GM senescent leaves did not have an effect on mite immatures development time and survival compared to ingestion of its isolines leaves. The semi-purified and purified proteinases inhibitors did not alter either the duration of larval and pupal stages of C. flavipes on D. saccharalis, or weight and number of pupae and parasitoid emergence. In other hand, the parasitism and proportion of female was higher on the treatment where caterpillars were fed with diet containing 0.5% of semi-purified inhibitors, comparing to control. The ratio female:male was significantly higher also when parasitoids were fed to the Kunitz type inhibitor compared to the control and BBI. The addition of 0.5 % (w/v) of semi- purified proteinase inhibitors and 0.05% (w/v) of Kunitz type purified inhibitors on two culture media (CM and PDA), resulted in increase of vegetative growth and production of conidia. BBI type purified inhibitors did not change the fungus sporulation. The results from the studies with A. mellifera were not conclusive and investigations are needed to clarify the potential impact of proteinase inhibitors on A. mellifera. Overall, proteinase inhibitors (Kunitz and BBI) did not negatively affect the non-target organisms tested. Conversely, ingestion of the Kunitz type of proteinase inhibitors altered positively some biological parameters of C. flavipes, M. anisopliae and S. praeincisus.