Orientador: José Ricardo de Arruda Miranda / Coorientador: Diana Rodrigues de Pina / Banca: Rinaldo Pôncio Mendes / Banca: André Petean Trindade / Resumo: A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma importante doença sistêmica que acomete os pulmões, e mesmo após tratamento eficaz deixa sequelas como fibrose e enfisemas pulmonares. É muito importante que as sequelas provenientes da doença sejam quantificadas com precisão. Assim, a Tomografia Computadorizada de Alta Resolução (TCAR) se tornou o exame de diagnóstico por imagem mais utilizado para a avaliação das sequelas da PCM. O diagnóstico auxiliado por sistemas computacionais pode ajudar a produzir uma avaliação mais precisa das sequelas (fibrose e enfisema) causadas pela PCM. Esta pesquisa tem como objetivo o desenvolvimento de algoritmos em ambiente computacional Matlab® capazes de quantificar objetivamente fibrose e enfisema em pacientes com PCM confirmada. O algoritmo consiste em selecionar a região de interesse (ROI), e por meio da utilização de máscaras, filtros de densidades e operadores morfológicos, obter a quantificação da área lesionada em relação à área sadia do pulmão. O método proposto foi testado em 30 exames de TCAR de pacientes com PCM confirmada. Os resultados das quantificações objetivas foram comparados com as avaliações visuais realizadas por um especialista da área de radiologia, e apresentaram uma maior diferença de 39,14% para fibrose e 18,7% para enfisema. Para validar a eficiência do método proposto nessa pesquisa, em distinguir as estruturas pulmonares e realizar suas quantificações, foi construído um fantoma virtual pulmonar. Os valores da composição do fantoma foram comparados com os valores obtidos pelo algoritmo, apresentando diferença de 11,5% para enfisema e de 4,5% para fibrose. Em relação à comparação dos resultados das composições dos fantomas com a avaliação visual realizada pelo radiologista, foi verificada uma diferença de 40% e 23% para fibrose e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The paracoccidioidomycosis (PCM) is a major systemic disease affecting the lungs, and even after effective treatment leaves sequelae such as fibrosis and pulmonary emphysema. It is very important that the sequelae from disease be quantified with greater accuracy. Thus, the High Resolution Computed Tomography (HRCT) has become the diagnostic imaging test most widely used to assess the sequelae of the PCM. The computer-aided diagnosis systems can help produce a more precise assessment of the sequelae (fibrosis and emphysema) caused by PCM. This research aims to develop algorithms in environment Matlab® capable of objectively quantify fibrosis and emphysema in patients with PCM. The algorithm consists of selecting the region of interest (ROI), and by the use of masks, density filters and morphological operators, to obtain the quantification of lesion area compared to the area of healthy lung. The proposed method was tested on 30 HRCT scans of patients with PCM. The results of objective quantification were compared with visual evaluations performed by specialist radiology, and showed a greater difference of 39.14% and 18.7% for fibrosis and emphysema, respectively. To validate the efficiency of the proposed method in this research, in distinguishing lung structures and conduct their baseline, we built a virtual phantom lung. The values of the composition of the phantom were compared with the values obtained by the algorithm, showing a difference of 11.5% to emphysema and fibrosis to 4.5%. In comparing the results of compositions of the phantoms with the visual evaluation performed by the radiologist, there was a difference of 40% and 23% for fibrosis and emphysema, respectively. The objective quantification of fibrosis and emphysema is the original PCM. The results show the feasibility and reliability... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Eduardo Bagagli / Banca: Patrícia Sammarco Rosa / Banca: Paulo Sérgio Rodrigues Coelho / Resumo: Não disponível / Abstract: Taking into account that paracoccidioidomycosis infection occurs by inhalation of the asexual conidia produced by Paracoccidioides sp. in its saprobic phase, this work presents the collection of aerosol samples as an option for environmental detection of this pathogen, by positioning a cyclonic air sampler at the entrance of armadillo burrows. Detection strategies included: direct culture, extinction technique culture and Nested PCR of the ITS1-5.8S-ITS2 region, as well as the evaluation of one armadillo (D. novemcinctus) as positive control for the studied area. Although the pathogen could not be isolated by the culturing strategies, the aerosol sampling associated with molecular detection by Nested PCR proved the best method for detecting Paracoccidioides sp. in the environment. Most of the ITS sequences obtained herein presented high similarity with the homologous sequences of P. lutzii from GenBank database, suggesting that this Paracoccidioides species may be not exclusive to mid-western Brazil as proposed so far / Mestre

No período de agosto a outubro de 1992, foi realizado um estudo de prevalência de positividade cutânea à histoplasmina e à paracoccidioidina nas cidades de Cachoeira do Sul, situada no Vale do rio Jacuí, e de Santo Ângelo, na encosta ocidental do Planalto, Rio Grande do Sul, Brasil. A prevalência foi avaliada por testes intradérmicos histoplasmina e paracoccidioidina em 193 soldados de Cachoeira do Sul e 161 soldados de Santo Ângelo. Ambas as populações do sexo masculino e idade variando entre 17 e 19 anos. Em Cachoeira do Sul, considerando as leituras de 24 e 48horas, a prevalência de testes positivos à histoplasmina foi de 89% e à paracoccidioidina de 82%. Em Santo Ângelo 48% das reações intradérmicas foram positivas à histoplasmina e 39% à paracoccidioina. Houve relação estatísticamente significativa na cidade de Santo Ângelo para os indivíduos histoplasmina positivos com galinheiro em casa e para os que haviam participado da limpeza de galinheiro e/ou de local habitado por morcegos. Foi realizado radiograma de tórax em aproximadamente 6% dos indivíduos reatores fortes. Em Cachoeira do Sul, 17% e em Santo Ângelo, 30% dos radiogramas apresentavam calcificação.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides sp. A doença é endêmica na maior parte dos países da América Latina, sendo os pulmões os órgãos mais afetados. O diagnóstico de PCM é feito com base na história clínica e epidemiológica, e confirmado pela visualização microscópica das estruturas fúngicas do Paracoccidioides a partir de secreções ou tecidos. Por vezes, a apresentação clínica e os achados histopatológicos da PCM simulam os de outras doenças, como a sarcoidose, e ocasionalmente são encontradas nas lesões formas excepcionalmente pequenas do Paracoccidioides, que podem ser confundidas com outros fungos, como o Histoplasma capsulatum. O presente trabalho objetivou identificar e caracterizar os casos que simularam sarcoidose e os que apresentaram formas pequenas de Paracoccidioides dentre os 856 casos de paracoccidioidomicose diagnosticados no Laboratório de Micologia do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, no período de 1981 a dezembro de 2013. Foram identificados 8 casos mimetizando a sarcoidose e 12 apresentando formas pequenas de Paracoccidoides. Dos casos que simularam a sarcoidose, todos eram fumantes do sexo masculino, com idades variando entre 27 e 59 anos (média = 42,5 anos) e apresentaram tosse produtiva, infiltrado fibronodular bilateral aos exames de imagem e granulomas sarcoides na biópsia pulmonar, recebendo prednisona como tratamento inicial. O diagnóstico de PCM, nestes casos, foi realizado por meio de cortes histológicos corados ao GMS (n=8), exame direto do escarro (n=2) e imunodifusão (n=4). Dentre os casos que apresentaram formas pequenas do Paracoccidioides, todos eram fumantes, tinham idades variando entre 33 e 68 anos (média = 55,58 anos), 10 eram do sexo masculino, e 10 apresentavam sintomas consistentes com os da PCM (dois pacientes eram assintomáticos). O diagnóstico etiológico, em todos os casos, foi realizado por meio de cortes histológicos seriados corados ao GMS (que revelaram as formas multibrotantes patognomônicas do Paracoccidioides) e corroborado por exame direto do escarro (n=3), imunodifusão (n=6) e cultura (n=1). Com isto, ressalta-se a importância da consideração dos diagnósticos diferenciais da paracoccidioidomicose. Visto que a sarcoidose é um diagnóstico de exclusão, o achado de granulomas epitelioides sem necrose deve incitar a busca ativa por agentes etiológicos com a utilização das colorações de ZN e GMS. E nos casos em que se encontram formas pequenas ou pouco usuais do Paracoccidioides, devem-se realizar cortes histológicos seriados e escalonados corados ao GMS e utilizar técnicas laboratoriais complementares, como imunodifusão e cultura, para assegurar o seu diagnóstico. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic infection caused by the fungus Paracoccidioides sp. The disease is endemic in most Latin American countries, and the lungs are the most affected organs. The diagnosis of PCM is based on clinical and epidemiological features, and confirmed by the microscopic visualization of yeasts of Paracoccidioides from clinical specimens. Sometimes the clinical presentation and histopathological findings of PCM mimic those of other diseases, such as sarcoidosis, and occasionally exceedingly small forms of Paracoccidioides are found in lesions, which can be confused with other fungi, such as Histoplasma capsulatum. This study aimed to identify and characterize the cases that simulated sarcoidosis and those with small forms of Paracoccidioides among the 856 cases of paracoccidioidomycosis diagnosed in the Mycology Laboratory of the Hospital Complex Santa Casa de Porto Alegre, from 1981 to December 2013. 8 cases were identified mimicking sarcoidosis and 12 with small forms of Paracoccidoides. All the cases that mimicked sarcoidosis were male smokers, aged between 27 and 59 years (mean = 42.5 years) and had productive cough, bilateral fibronodular infiltrates on X-ray and sarcoid granulomas in the lung biopsy, receiving prednisone as initial treatment. The diagnosis of PCM in these cases was carried out by histological sections stained with GMS (n = 8), direct examination of sputum (n = 2) and immunodiffusion (n = 4). Among the cases with small forms of Paracoccidioides, all were smokers, aged between 33 and 68 years (mean = 55.58 years), 10 were male, and 10 had symptoms consistent with PCM (two patients were asymptomatic). The etiologic diagnosis in all the 12 cases was made by serial tissue sections stained with GMS (which revealed the multibudding pathognomonic forms of Paracoccidioides) and confirmed by direct examination of sputum (n = 3), immunodiffusion (n = 6) and culture (n = 1). In conclusion, it is emphasized the importance of considering the differential diagnosis of paracoccidioidomycosis. Since sarcoidosis is a diagnosis of exclusion, the finding of epithelioid granulomas without necrosis should encourage the active search for etiologic agents with the use of ZN and GMS stains. And in cases in which small or unusual forms of Paracoccidioides are found, serial histological sections stained with GMS and complementary laboratory techniques such as immunodiffusion and culture should be performed to ensure their diagnosis.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2018-06-29T18:20:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T15:03:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Luiz Paulo Araújo dos Santos - 2015.pdf: 1282200 bytes, checksum: ceda1b43513d7bf6756357d40f977117 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2015-01-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Pathogens can find different carbon sources in host niches generating propionyl-CoA, among them propionate. This compound is toxic to the organism if accumulated within the cell, and can be generated in the host tissue by the metabolism of amino acids isoleucine, valine and methionine, or by the metabolism of odd-chain fatty acids. Therefore, during infection, the propionyl-CoA metabolism to nontoxic nutrient and usable energetically is of great relevance. Nonetheless, there are no studies about the propionyl-CoA metabolization pathway in fungi of the genus Paracoccidioides, causer of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of high incidence in Latin America. Thus, to characterize of which metabolic pathway this fungus utilizes to propionyl-CoA metabolization, it was made a search the genes coding to enzymes of methylcitrate cycle in genome of Paracoccidioides spp. and were identified genes coding to the three exclusive enzymes of this cycle, which are methylcitrate synthase, methylcitrate dehydrogenase and methylcitrate lyase. After analysis of growth and viability, which demonstrated that Paracoccidioides lutzii utilizes propionate as carbon source, it was made gene expression analysis of enzymes of methylcitrate cycle and was observed that are regulated in response to propionate. Additionally, the enzymatic activity of the MCS showed that this enzyme is active inside of fungal cells and also when is secreted, as well as its dual capacity of to act with a citrate synthase and metylcitrate synthase. Finally, the proteomic profile of P. lutzii in propionate showed enzymes induction of methylcitrate cycle, glyoxylate cycle, amino acid metabolism and gluconeogenesis, and the repression of glycolytic pathway, fermentation and fatty acid synthesis, which demonstrated of metabolic rearrangement to supply the cellular energetic demand, metabolizing propionate. In this sense, to understand the mechanism of propionyl-CoA metabolism in P. lutzii provides data for visualization of metabolic adaptation that this fungus makes use in different colonization of niches. / Micro-organismos patogênicos podem encontrar em nichos do hospedeiro diferentes fontes de carbono geradoras de propionil-CoA, dentre elas, o propionato. Este composto é tóxico para a célula se acumulado no seu interior, e pode ser gerado nos tecidos do hospedeiro pelo metabolismo dos aminoácidos isoleucina, valina e metionina, ou pelo metabolismo de ácidos graxos de cadeia ímpar. Portanto, durante a infecção, o metabolismo de propionil-CoA a um nutriente não tóxico e aproveitável energeticamente se faz de grande relevância. Contudo, não há estudos sobre a via de metabolização de propionil-CoA em fungo do gênero Paracoccidioides, causador da paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Sendo assim, para caracterização de qual via metabólica este organismo utiliza para metabolização de propionil-CoA, foi feita uma busca dos genes codificantes para enzimas do ciclo do metilcitrato no genoma de Paracoccidioides spp. e foram identificados genes codificantes para as três enzimas exclusivas desse ciclo, as quais são metilcitrato sintase, metilcitrato desidrogenase e metilcitrato liase. Após análise de crescimento e viabilidade, a qual demonstrou que Paracoccidioides lutzii utiliza propionato como fonte de carbono, foi feita a análise de expressão gênica das enzimas do ciclo do metilcitrato e observou-se que são reguladas em resposta ao propionato. Adicionalmente, a atividade enzimática da MCS demonstrou que essa enzima é ativa no interior da célula fúngica ou mesmo quando é secretada. Além disso, foi demostrada sua capacidade de atuar também como uma citrato sintase. Por fim, o perfil proteômico de P. lutzii em propionato mostrou a indução do ciclo do metilcitrato, ciclo do glioxilato, metabolismo de aminoácidos e gliconeogênese, e a repressão de vias como glicólise, fermentação e síntese de ácidos graxos, os quais demonstram o rearranjo metabólico para suprir a demanda energética celular metabolizando propionato. Neste sentido, entender os mecanismos pelo qual P. lutzii lança mão para metabolizar propionil-CoA permite a compreensão dos mecanismos de adaptação metabólica que esse fungo lança mão em diferentes nichos de colonização.

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica caracterizada por ser uma doença granulomatosa. As formas benignas da doença são caracterizadas por uma infecção localizada, contendo granulomas compactos com poucos fungos; já nas formas mais graves, ocorre um processo granulomatoso frouxo com focos de necrose e intensa disseminação fúngica. Objetivou-se avaliar o desenvolvimento de lesões granulomatosas em baço, fígado, pulmão e epiplon de camundongos, após infecção pela via intraperitoneal com o isolado de alta virulência, Pb18, em diferentes períodos de infecção após tratamento com fármacos, os quais possuem mecanismo de ação relacionado com a alteração no balanço entre a síntese e degradação dos produtos do colágeno, interferindo diretamente na formação do granuloma A citocina IFN-<font face=\"Symbol\">g, o antibiótico Tetraciclina e as drogas antiinflamatórias Lumiracoxib e Celecoxib. Avaliamos a presença de alguns componentes do granuloma (colágeno, células do infiltrado inflamatório, de citocinas primordiais para sintese/degradação da MEC do granuloma, presença de P. brasiliensis). / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis that is endemic in Latin America, whose causative agent is the thermal dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). PCM is a granulomatous disease, and the formation of granulomas can be understood as a mechanism of the body to block and limit the invasiveness of the fungus or its antigenic components, once unable to lyse them. Bening forms of the disease are characterized by a localized infection, where granulomasa are compact and contain few fungi. More severe forms present loose granulomatous processes with foci of necrosis and severe fungal. Studies in which granulomatous response was developed in resistant (A/J) and susceptible (B10.A) mice to the high virulence isolate Pb18 showed the presence of different patterns of injuries related to the type of extracellular matrix (ECM) components and the different cells types in the area, suggesting a important role of these elements in the formation and constitution of the granuloma and thus the outcome of infection. In our project, we aimed to evaluate the development of granulomatous lesions in the spleen, liver, lung and omentum of mice susceptible to PCM after intraperitoneal infection with Pb18, at different periods of infection (acute and chronic) with or without treatment with drugs. These drugs have mechanisms of action closely related to the change in the balance between synthesis and degradation of collagen Thus, they interfere directly in the granuloma formation and in maintaining the viability of fungi and also with the development of fibrosis. Which is a common and devastating sequelae of numerous infections including the PCM, with the characteristic proliferation of fibroblasts and deposition of ECM. The treatments were chosen based on prior knowledge on their effects on the course of experimental murine PCM. IFN-<font face=\"Symbol\">g was chosen due to its antifibrotic effect, being an activator of macrophages in infection by P. brasiliensis and increasing the fungicidal effect of neutrophils. The antibiotic tetracycline was used because of its inhibitory effect on the synthesis of extracellular matrix, limiting antimicrobial activity and the ability of collagenase to degrade ECM. Finally, the antiinflammatory drugs Celecoxib and Lumiracoxib (inhibitors of the COX-2 enzyme) 11 were used because they cause an increase in the expression of collagen type III and type IV. We analyzed the components of the granuloma (collagen, inflammatory cells, cytokines essential for synthesis / degradation of the ECM of the granuloma, the presence of P. brasiliensis). Among the cytokines analyzed, we studied the importance of TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 in the formation of granulomas and regulation of matrix metalloproteinases (MMP) synthesis and function. We analyzed TGF-<font face=\"Symbol\">b because it negatively modulate the secretion of nitric oxide by macrophages and promote the accumulation of ECM and is believed to be the central mediator of the process of fibrosis in several pathologies. IFN-<font face=\"Symbol\">g was studied because of its correlation to the preferential Th1 immune response in diseases and infectious processes of fungal and bacterial infections, and also because it modulates fibroblast function.

A Paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, endêmico na América Latina, especialmente Brasil. Para melhor avaliarmos a resposta imune celular frente a diferentes componentes do fungo, como gp43, considerada o antígeno imunodominante de P. brasiliensis, filtrado de cultura livre de gp43 (Filtrado), e gp43 tratada com metaperiodato (meta), utilizamos os ensaios de linfoproliferação e ELISA para detecção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. Os resultados com relação à gp43 corroboram dados da literatura e de nosso laboratório demonstrando que gp43 é o antígeno imunodominante do fungo e pode estar envolvido no mecanismo de anergia dos linfócitos T de pacientes com a micose ativa. Com o Filtrado observamos respostas linfoproliferativas positivas, porém menores que com gp43, também evidenciando a anergia de linfócitos T de pacientes, e a indução de IL-10 em células de controles curados, podendo representar assim um mecanismo de imunossupressão. Com relação à meta, esta não induziu resposta linfoproliferativa nem a síntese de citocinas, sugerindo não ser um antígeno apropriado para esse tipo de avaliação. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, endemic in latin América, specially Brazil. To better understand the cellular immune responses to different components of the yeast, such as gp43, considered the immunodominant antigen, a culture filtrate free of gp43 (CF), and gp43 treated with metaperiodate, we used lymphoproliferative assays and ELISA to detect the cytokines IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. The results with gp43 were consistent with the literature and previous with data from our Laboratory showing that gp43 is the immunodominant antigen of P. brasiliensis and is likely involved with the anergy of T-cells from patients. With CF we observed positive, but weaker, proliferative responses. It also evidenced the T-cell anergy of patients and the preferential induction of IL-10 in cells from cured controls. The latter can represent a mechanism of anergy induction. With meta, we observed that neither induce proliferative responses nor cytokine secretion, being apparently an inappropriate antigen for use in cellular immunoassays.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

A presença de IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN e MMPs foi avaliada em camundongos infectados com o fungo Paracoccidioides brasiliensis (Pb). Aos 15 dias, IFN-<font face=\"symbol\">g foi observado em granulomas (Gr), aumentando em resistentes (A/J) aos 120d. Suscetíveis (B10.A) tiveram mais macrófagos e células gigantes (CGs) OPN+, alta carga fúngica e baixo NO aos 15d. A/J tiveram aumento em OPN, maior NO e menor carga fúngica do que B10.A aos 120d. Camundongos infectados apresentaram MMP9 em macrófagos, GCs e Pb e atividade de MMP9 e MMP2. Aos 15d, KOiNOS tiveram Gr com necrose, debris de Pb e OPN e seus controles, Gr com muitos Pbs e OPN. Aos 120d, os controles apresentaram Gr extensos contendo muitos Pbs e expressão de OPN; KOiNOS tiveram Gr compactos com células OPN+ ou lesões residuais com pouca OPN e baixa carga fúngica. Maiores níveis de OPN foram detectados em KOiNOS. A OPN está associada com gravidade no início da infecção, mas com certo controle na fase tardia e no desenvolvimento e organização do Gr. Sugere-se que a presença de MMPs exerça influência no padrão do Gr e na disseminação fúngica. / We studied IFN-<font face=\"symbol\">g, NO, OPN and MMPs in mice infected with the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). IFN-<font face=\"symbol\">g was found in granulomas (Gr) at 15d and increased in resistant mice (A/J) at 120d. At 15d, macrophages and giant cells (MGCs) were more OPN+ in susceptible mice (B10.A) which had high fungal load and low NO. At 120d, A/J had numerous intensely stained OPN(+) cells and higher NO and lower fungal load than B10.A. MMP9 was found in macrophages, MGCs and Pb of infected mice, which had MMP9 and MMP2 activity. At 15d, KOiNOS had Gr with necrosis, altered Pb and OPN; controls had Gr with many Pb and OPN. At 120d, controls had large Gr with many Pb and OPN expression; KOiNOS had compact Gr with OPN+ cells or residual Gr with weak OPN and decreased fungal load. More OPN levels were detected in KOiNOS. OPN is associated with infection severity at the beginning and with some control at later stages of infection and is involved in Gr development and organization. We show the presence of MMPs and suggest their influence in Gr pattern and in Pb dissemination.

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica que tem como agente etiológico o P. brasiliensis e afeta os pulmões, áreas mucocutâneas e o sistema mononuclear-fagocitário. Trabalhos anteriores usando camundongos BALB/c atímicos e eutímicos demonstraram que os animais deficientes de células T são mais suscetíveis à infecção pelo P. brasiliensis e indicaram que a imunidade celular e natural são fundamentais para promover a resistência e o controle da doença. Com base nestes dados, nosso trabalho teve por objetivo demonstrar a importância de alguns mediadores da resposta imune natural durante a PCM murina. Utilizamos como abordagem experimental a depleção de IFN-&#947;, IL-12, leucócitos PMN e células NK em camundongos BALB/c atímicos e eutímicos infectados por via intratraqueal com leveduras de P. brasiliensis. Nossos resultados indicaram que a depleção de leucócitos PMN não alterou a gravidade da doença, entretanto essas células parecem exercer importante papel na modulação da síntese de citocinas em animais atímicos. A IL-12, por sua vez, demonstrou ter ação relevante na resposta ao P. brasiliensis em animais deficientes de células T, pois a sua neutralização levou ao aumento do número de leveduras viáveis recuperadas nos órgãos de disseminação (fígado e baço). Os animais eutímicos que foram tratados com AcM anti IL-12 apresentaram exacerbação da doença pulmonar e esplênica mas em ambas as linhagens não encontramos quaisquer alterações nas reações de HTT e no tempo de sobrevida. Os nossos experimentos confirmaram o papel fundamental do IFN-&#947; no controle doença tanto nos animais eutímicos que apresentaram redução das reações de HTT e exacerbação da doença, como também nos deficientes de células T que demonstraram, além do aumento da gravidade da doença, a redução do tempo de sobrevida. Analisamos também a participação da célula NK por serem consideradas fontes expressivas da síntese de IFN-&#947;. Observamos a exacerbação da doença pulmonar e a disseminação do fungo para o fígado e baço nos animais atímicos. A depleção dessas células em animais eutímicos induziu somente o agravamento da infecção pulmonar, sem maior comprometimento de outros órgãos. A reação de HTT e a taxa de mortalidade não sofreram alterações em ambas as linhagens. As células NK demonstraram atuar como moduladoras da síntese de imunoglobulinas em animais atímicos e de citocinas em eutímicos e também participaram da quimiotaxia de leucócitos PMN nos períodos iniciais da PCM. Em conclusão, usando um modelo experimental homogêneo (cepa infectante e linhagens de hospedeiros definidos) pudemos, pela primeira vez, demonstrar que o IFN-&#947; é o mais importante mediador da imunidade natural na imunoproteção ao P. brasiliensis. Verificamos também a contribuição relativa da IL-12 e dos leucócitos PMN na proteção da PCM pulmonar. Além disso, também pela primeira vez, foi caracterizada in vivo a importância das células NK no controle da infecção pelo P. brasiliensis. / The Paracoccidioidomicose (PCM) is a systemic infection caused by P. brasiliensis and affects the lungs, mucocutaneous areas and the mononuclear-phagocitary system. Previous works using athymics and euthymics BALB/c mice demonstrated that T cells deficient animals are more susceptible to the infection and indicated that the cellular and natural immunity is essential to promote the resistance and the control of disease. Based in these data, the objective of our work was demonstrated the importance of some natural mediators during murine PCM immune response. As experimental protocols we used the systemic depletion of IFN-&#947;, IL-12, PMN leukocytes and NK cells in athymics and euthymics BALB/c mice infected by intratracheal route with P. brasiliensis yeasts. Our results indicated that PMN leukocytes depletion did not alter the severity of infection; however these cells showed to exert important function in the cytokines synthesis modulation in athymics mice. In turn, the IL-12 demonstrated relevance action in T cells deficient mice response to P. brasiliensis infection, its neutralization induces an increased of viable yeasts numbers recovered in the dissemination organ (liver and spleen). The euthymics animals treated with anti IL-12 MAb presented an exacerbation of pulmonary and spleenic disease but in both species did not finds any alteration in the HTT reaction or survival times. Our experiments confirm the fundamental action of IFN-&#947; in disease control in both strains that showed decreased in the HTT reaction, disease exacerbation. These depletion in T cells deficient mice it also induced a decreased in survival times. We also analyzed the NK cells participation because are considered important sources of IFN-&#947; synthesis. We observed in athymics mice an exacerbation of pulmonary disease and fungal dissemination to liver and spleen. This depletion, in euthymics, mice induces only the pulmonary infection aggravation, other organs were not affected. The HTT reaction and mortality alterations were not observed in both strains. We demonstrated that NK cells acting as immunoglobulins synthesis modulators in athymics mice and the cytokines in euthymics mice and also participated of PMN leukocytes attractive in early PCM. In conclusion, using an experimental homogeneous model (infectant agent and strains hosts defined) we demonstrated for the first time that the IFN-&#947; is the most important mediator of the natural immunity in the immunoprotection to the P. brasiliensis. We also verificated the relative contribution of IL-12 and PMN leukocytes in the PCM pulmonary protection. Moreover, we also characterized, for the first time in vivo, the NK cells importance to the control of P. brasiliensis infection.