Los hongos de la familia Botryosphaeriaceae causan daños en la madera de la vid en regiones vitícolas de todo el mundo. Para caracterizar las distintas enfermedades de madera de la vid en planta adulta y para conocer el impacto de estos patógenos en Cataluña, se llevó a cabo un muestreo en viñedos afectados de diferentes denominaciones de origen catalanas. Los resultados confirmaron la existencia en Cataluña de las tres enfermedades de la vid más comunes en planta adulta (yesca, eutipiosis y BDA [black dead arm]), y evidenciaron asimismo la dificultad para diagnosticarlas, debido a la múltiple y frecuente concurrencia de éstas sobre una misma planta. Las especies fúngicas aisladas con mayor frecuencia fueron Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia mediterranea, Eutypa lata y distintas especies de Botryosphaeriaceae. Dentro de esta familia se identificaron seis especies, siendo por orden de abundancia Diplodia seriata, Neofusicoccum parvum, Dothiorella viticola, Botryosphaeria dothidea, N. luteum y N. vitifusiforme. La controversia taxonómica que presenta la familia Botryosphaeriaceae, debido a las similitudes morfológicas entre taxones, se resolvió con el estudio combinado de la morfología de los conidios de los anamorfos y la información molecular de distintas regiones del ADN. Mediante la técnica de la PCR-cooperativa y el empleo posterior de una sonda de hibridación específica, se desarrolló una herramienta molecular de gran sensibilidad para la detección rápida y rutinaria de las especies de Botryosphaeriaceae. La sonda se diseñó sobre la región nuclear del ITS (espaciadores internos de transcripción) del ARNr, e identificó de forma específica a un grupo de siete especies de Botryosphaeriaceae (las seis aisladas de vides catalanas más Diplodia mutila). Profundizando en la caracterización de la familia, se estudió la capacidad de cinco especies (B. dothidea, Di. seriata, Do. viticola, N. luteum y N. parvum) para producir micotoxinas. Todos los aislados estudiados produjeron compuestos hidrofílicos fitotóxicos, aunque N. luteum y N. parvum destacaron por la fitotoxicidad que también mostraron sus compuestos lipofílicos. Esto corroboró los resultados de las pruebas de patogenicidad, en las que N. luteum y N. parvum mostraron una gran virulencia. Dothiorella viticola, N. vitifusiforme y Di. seriata mostraron una virulencia débil o nula, mientras que B. dothidea mostró un carácter patogénico intermedio. Sobre la susceptibilidad del hospedador a los distintos patógenos, se observó que el portainjerto Ru140 fue el menos susceptible y el 41B el más susceptible, mientras que las seis variedades de uva ensayadas (Cabernet-Sauvignon, Garnacha, Macabeo, Parellada, Tempranillo y Xarel·lo) no mostraron diferencias claras de susceptibilidad. Se constató que algunas especies vegetales que comparten su hábitat con la vid, como almendros, encinas, jaras, melocotoneros y nogales, son susceptibles a algunas especies de Botryosphaeriaceae, y que por tanto podrían actuar como hospedadores alternativos de los patógenos. De los factores abióticos que podrían afectar al desarrollo de las enfermedades se estudió el estrés hídrico. Los resultados obtenidos mostraron que tanto el estrés hídrico como el patógeno N. parvum alteraron parámetros fisiológicos y de crecimiento de la vid, aunque no se observó un efecto combinado de ambos sobre la planta. Además, la longitud de las necrosis vasculares causadas por N. parvum no aumentó significativamente con el estrés hídrico, confirmando que N. parvum es un patógeno primario y no un patógeno de debilidad. / Species in the fungal family Botryosphaeriaceae are known for causing grapevine trunk diseases in grape-producer regions worldwide. Declining vineyards were surveyed in Catalonia (NE Spain) to characterize those diseases on adult plants and to identify their causing agents. Most comon grapevine trunk diseases (esca, Eutypa dieback and black dead arm disease) were confirmed to occur in Catalonia. However, concurrence of symptoms in the same plant, belonging to at least two different diseases, often difficults disease diagnosis. Most frequently isolated fungal pathogens were Phaeomoniella chlamydospora, Fomitiporia mediterranea, Eutypa lata and several species of Botryosphaeriaceae. Six botryosphaeriaceous species were identified, in decreasing abundance order: Diplodia seriata, Neofusicoccum parvum, Dothiorella viticola, Botryosphaeria dothidea, N. luteum and N. vitifusiforme. The controversy in the taxonomy of Botryosphaeriaceae due to confusing morphological similarities among the species was resolved by combining the study of conidial morphology and multigene nucleotide data. A sensitive tool for a rapid detection of Botryosphaeriaceae species was developed based on the co-operational PCR technique and the use of a hybridization probe. The probe was designed to target the ITS region (internal transcribed spacers) of the rRNA repeat. It identified specifically the above Botryosphaeriaceae species isolated from grapevine plus Diplodia mutila. Five botryosphaeriaceuos species were tested for mycotoxin production, namely B. dothidea, Di. seriata, Do. viticola, N. luteum and N. parvum. All species produced hydrofilic phytotoxic compounds, and N. luteum and N. parvum were also shown to produce low-weight lipophilic toxins. These results support the high virulence showed by N. luteum and N. parvum in the patogenicity test. Virulence of Dothiorella viticola, N. vitifusiforme and Di. seriata was weak to low, while B. dothidea showed an intermediate virulence. In terms of host susceptibility, rootstock 140Ru was the less susceptible to the botryosphaeriaceous fungi tested while 41B was the most susceptible one. However, no great differences in susceptibility were observed among the six grapevine varieties tested (Cabernet Sauvignon, Grenache, Macabeo, Parellada, Tempranillo and Xarel·lo). Some plant species from the surroundings of vineyards, namely almond, peach and walnut trees, holm oak and rockroses, were shown to be susceptible to some Botryosphaeriaceae species. It is hypothesized that these species could act as alternative hosts for those pathogens. Hydric stress in combination with N. parvum infection was studied as a potential factor that could affect disease development. Physiological and growth parameters of grapevine were modified by both hydric stress and N. parvum main effects, but no combined effects were detected. Vascular necroses were similar in both stressed and non-stressed grapevines, therefore N. parvum is not considered as a weakness pathogen.

Con el objetivo de determinar la frecuencia de presentación de la Enfermedad de la Línea Blanca (ELB), se examinaron los cascos de 16 equinos de la raza Caballo Peruano de Paso de un criadero privado en el distrito de Cieneguilla; y de 23 equinos del cruce Hannoveriano - Pura Sangre de Carrera pertenecientes al Hospital Veterinario Central del Ejército, ubicado en el distrito de Chorrillos (Lima – Perú). El método diagnóstico empleado fue la observación clínica de la zona de unión pared - suela durante el recorte de casco. Todos los equinos examinados (100%) presentaron ELB por lo menos en un casco. Sólo se reportaron lesiones de grado leve y grado moderado presentes en 50 (32%) y en 69 (44.2%) cascos examinados, respectivamente. No se reportaron los cuadros clínicos de grado severo anteriormente publicados por Kuwano et al. (1998) y Oke (2003). De cada animal con ELB se seleccionó un casco afectado, para la evaluación microbiológica e histológica. Se realizaron cultivos de tejido córneo en Agar Sabouraud - dextrosa más Cloranfenicol, en condiciones de anaerobiosis. La identificación fúngica consideró las características macroscópicas de la colonia y la morfología microscópica. Se obtuvieron 28 aislamientos positivos, de los cuales 10 correspondieron a hongos patógenos (Scopulariopsis spp. Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum y Trichophyton schoenlii). Para la observación histológica, se utilizó la técnica de sección standard de parafina con previo ablandamiento de las muestras en ácido nítrico. En todos los cascos se observó un proceso degenerativo del tejido córneo, siendo 9 los casos asociados a bacterias y 4 los casos con presencia conjunta de hongos y bacterias. El examen histológico permitió determinar grados de lesión en función del estrato córneo afectado. Palabras Claves: Equinos, cascos, hongos, tejido córneo. / With the objective to determine the frequency of presentation of the White Line Disease (WLD), the hooves of 16 Peruvian Paso horses of a private equine center and of 23 Hannoverian - Thoroughbred crossbred horses pertaining to Central Veterinary Hospital of the Army (Lima – Peru), were examined. The diagnostic method used was the clinical observation of the area of union wall – sole during the hoof trimming. All the evaluated equines (100%) had WLD at least in one hoof. Only were reported lesions of light grade and moderate grade in 50 (32%) and in 69 (44.2%) examined hooves, respectively. The clinical cases of the severe grade previously reported by Kuwano et al. (1998) and Oke (2003) were not observed. Of each animal with WLD an affected hoof was selected for the microbiological and histological evaluation. Cultures of horny tissue in Agar Sabouraud – Dextrose more Chloramphenicol under anaerobic conditions were carried out. The fungal identification considered the macroscopic features of the colony and the microscopic morphology. 28 positive isolations were obtained, of which 10 corresponded to pathogenic fungus (Scopulariopsis spp. Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum and Trichophyton schoenlii). For the histological observations, the technique of standard section of paraffin was used with previous softening of the samples in nitric acid. In all the hooves a degenerative process of the horny tissue was observed, being 9 the cases associated to bacterias and 4 the cases with combined presence of fungus and bacterias. The histologic exam allowed to determine lesion grades in function of the affected horny stratum. Key Words: Equines, hooves, fungus, horny tissue.

Microorganisms are present in a variety of sources, including food, water, animals, environment as well as the human body. They can be harmless or harmful. The latter is also called pathogenic and their detection is extremely important due to health and safety reasons. It is well known that food contaminated with bacteria can produce a number of foodborne diseases. As a consequence, thousands of euros are invested each year in medical treatments trying to keep the population healthy. There are more than 250 known foodborne diseases. For example, outbreaks of salmonellosis have increased in many countries in the last decades being Salmonella Infantis one of the most important etiological agents associated with this enteric disease. Moreover, due to the wide distribution of the microorganisms, they can also contaminate foods in the field as well as during the storage stage. In that sense, filamentous fungi are one of the etiological agents responsible for most post-harvest food spoilage producing quality losses and economic devaluation. On the other hand, the invasive fungal infections due to yeast have risen considerably in recent years. Candidiasis is the so-called disease produced by Candida albicans. This is an opportunistic infection that affects immunocompromised patients requiring costly treatment with advanced medicine. Several methods have been proposed so far to detect pathogenic microorganisms. Conventional culture is highly selective and sensitive but they also require several days to yield the results. To simplify and automate the identification of both bacteria and fungi rapid biochemical kits have been developed. Although the results obtained with these kits are comparable to the traditional biochemical tests they also need 1 or 2 days to obtain results. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can be applied for the direct identification of pathogenic microorganisms in real samples. This immuno-based method has been widely used in both food and the medical sector with high sensitivity. Nevertheless, the main disadvantage of this method is that it can also be time-consuming because a pre-enrichment of the sample is often required in order to achieve low limits of detection. As a consequence, many researchers have addressed their efforts towards the development of alternative methods to allow the rapid detection of pathogens. Molecular biology-based methods, specifically polymerase chain reaction (PCR) and real-time PCR are nowadays the most common tools used for pathogen detection. They are highly sensitive and allow the quantification of the target. In addition, microarray platforms of DNA have been developed in order to analyse hundreds of targets simultaneously. However, this technique is costly and reagent-consuming. The introduction of biosensors has brought new alternatives in pathogenic detection. Biosensors are the most used tools in pathogenic detection after PCR, culture methods and ELISA. They provide rapid results after the sample has been taken. However, their real application lies in achieving selectivities and sensitivities comparable to the established methods and at low cost. Since carbon nanotubes (CNTs) were discovered by Iijima, many papers have reported their unique electronic and optical properties which, together with their size, make these nanostructures interesting materials in the development of biosensing platforms. Their very high capacity for charge transfer between heterogeneous phases makes them suitable as components in electrochemical sensors. The electrical conductivity of the CNTs is highly sensitive to changes in their chemical environment and, as a result, they have been successfully applied in the study of molecular recognition processes. An approach for the direct electrical detection of biomolecules integrates CNTs as transducer elements within a field-effect transistor (FET) configuration. The main advantages of this kind of configuration lies in that the conducting channel is usually located on the surface of the substrate and as a result, they are extremely sensitive to any change in the surrounding environment. Moreover, CNTFET devices can operate at room temperature and in ambient conditions. At the beginning of this research (2006) electrochemical CNTFETs based on single walled carbon nanotubes had not been applied to detect bacteria or fungi. Only the interaction between CNTs and bacteria had been explored, but without sensing purposes. Therefore, this thesis reports the first CNTFET devices applied to the detection of pathogenic microorganisms. First, the background and the introduction containing the state of the art are presented covering relevant investigations made in the last years. Next, the main analytical methods are described. These descriptions involve detailed information of all procedures, analytical tools and materials used throughout this research work. In the following chapters, the application of the CNTFETs for the determination of bacteria, yeast and moulds is presented throughout the scientific articles published along the development of the thesis. Briefly, the first device developed was applied to the detection of Salmonella Infantis in a simple matrix (0.85 % saline solution) and it was proven for first time, that this kind of sensor was able to detect, at least, 100 cfu/mL of the bacteria in just one hour with high selectivity. Subsequently, we enlarged the application field to other types of microorganisms: Candida albicans. In this study we improved not only the detection limit of the devices to 50 cfu/mL but also we proved the selectivity of the CNTFETs against possible interference that can be present in real samples like serum proteins. Finally, the devices were applied to the detection of the mould Aspegillus flavus in real samples. In this assay the response time was 30 minutes and a high sensitivity (10 µg of A. flavus / 25 g of rice) was obtained. As the final chapters, general conclusions extracted from the overall work and annexes are reported. It can be stated that nanomaterials displaying extraordinary properties like carbon nanotubes can be combined with biological entities to obtain highly sensitive and selective biosensors able to detect bacteria, yeasts and moulds in a very short time. In future work, other performance parameters such as, long term stability, robustness and reusability must be studied further and contrasted with standard methods before thinking of the commercialization of the devices. / Los microorganismos están presentes en una gran variedad de orígenes, incluyendo alimentos, agua, animales, medio ambiente también como en el propio cuerpo humano. Estos pueden ser beneficiosos o perjudiciales. Los microorganismos perjudiciales reciben el nombre de patógenos y su detección es de gran importancia por razones de salud y seguridad. Es bien conocido que los alimentos contaminados con bacterias pueden producir cierto número de enfermedades. Como consecuencia de esto, miles de euros se invierten cada año en tratamientos médicos para mantener la salud de la población. Existen más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos. En las últimas décadas se ha incrementado por ejemplo, la incidencia de brotes de salmonelosis en muchos países, siendo Salmonella Infantis uno de los agentes etiológicos más importantes asociados con la producción de esta enfermedad entérica. Debido a la amplia distribución de los microorganismos, estos pueden llegar también a contaminar alimentos durante su cultivo como durante la fase de almacenamiento. En este sentido, los hongos filamentosos son en gran parte los agentes etiológicos responsables del deterioro de alimentos después de la cosecha produciendo pérdidas en la calidad y devaluación económica. Por otra parte, las infecciones fúngicas invasivas producidas por levaduras han aumentado considerablemente en los últimos años. Candidiasis, es la enfermedad producida por Candida albicans. Esta es una de las infecciones más comunes que afectan pacientes inmunocomprometidos requiriendo tratamientos de elevado coste. Se han propuesto varios métodos hasta la fecha para la detección de microorganismos patógenos. El cultivo es el método de referencia utilizado para la detección y cuantificación de bacterias. Tiene la ventaja de ser altamente selectivo y sensible pero tiene el inconveniente de requerir varios días para obtener un resultado. Para simplificar y automatizar la identificación de bacterias y hongos se han desarrollado kits bioquímicos rápidos. Aunque los resultados obtenidos usando esta clase de kits son comparables a las pruebas bioquímicas tradicionales, también 1 o 2 días son requeridos para la obtención de resultados. El enzimoinmunoensayo ("Enzyme Linked Immunosorbent Assay", ELISA) es un método immunológico de gran sensibilidad que se utiliza ampliamente para detectar y cuantificar microorganismos patógenos, tanto en el sector médico como en el alimentario. Sin embargo, su principal desventaja es que a veces el tiempo de análisis puede aumentar considerablemente, específicamente cuando se realizan etapas de pre-enriquecimiento de la muestra para disminuir el límite de detección. Como consecuencia, muchos investigadores han dirigido sus esfuerzos hacia el desarrollo de métodos más rápidos. Los métodos basados en el uso de la biología molecular, específicamente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la PCR en tiempo real, son hoy en día las herramientas más comúnmente usadas para la detección de patógenos. Estas técnicas son altamente sensibles y permiten la cuantificación del patógeno. Adicionalmente, se han desarrollado chips con plataformas de DNA para analizar cientos de patógenos simultáneamente. Sin embargo, esta técnica es costosa y requiere el uso de muchos reactivos. La introducción de los biosensores ha contribuído a generar nuevas alternativas para la detección de patógenos. Los biosensores son las herramientas más usadas en la detección de patógenos después de la PCR, los métodos convencionales y el ELISA. Tienen la ventaja de proporcionar respuestas rápidas entre la toma de muestra y la obtención de los resultados. No obstante, el reto para su aplicación en muestras reales radica en alcanzar selectividades y sensibilidades comparables a los métodos convencionales ya establecidos y a un costo económico reducido. Desde que Iijima descubrió los nanotubos de carbono (CNTs) se han publicado numerosos trabajos sobre sus excelentes propiedades electrónicas y ópticas, las cuales, en conjunción con su tamaño, hacen de estas nanoestructuras materiales interesantes en el desarrollo de plataformas de biodetección. Los CNTs presentan una gran capacidad de transferencia de carga entre estructuras heterogéneas. Ello les confiere una gran utilidad en la elaboración de sensores de tipo electroquímico. Su conductividad eléctrica varía de forma muy acusada con cambios en su ambiente químico y, como resultado, se han aplicado con éxito en el estudio de procesos de reconocimiento molecular. Una metodología para la detección directa de biomoléculas integra los CNTs como elementos transductores dentro de una configuración de transistor de efecto campo (FET). Las principales ventajas de esta clase de configuraciones radican en que el canal conductor se localiza sobre la superficie del substrato y, como resultado, es altamente sensible a cualquier cambio en el medio ambiente. Además, los CNTFETs pueden operar a temperatura y, humedad ambientales. Al inicio de esta tesis (2006), todavía no se habían aplicado los CNTFETs basados en nanotubos de carbono monocapa a la detección de bacterias y hongos. Sólo se había estudiado la interacción entre los CNTs y bacterias, pero sin el objetivo de detección. Por tanto, esta tesis aporta los primeros CNTFETs aplicados a la detección de microorganismos patógenos. En primer lugar, se presentan los antecedentes y la introducción, donde se realiza una revisión crítica y actualizada de los métodos e investigaciones más relevantes para detectar microorganismos patógenos. Posteriormente, se incluye un capítulo con la información detallada de todos los procedimientos experimentales, herramientas analíticas y materiales utilizados a lo largo del trabajo de investigación. En los siguientes capítulos, se presenta la aplicación de CNTFETs en la determinación de bacterias, mohos y levaduras mediante artículos científicos publicados a lo largo del desarrollo de la tesis. Brevemente, el primer dispositivo desarrollado se aplicó a la detección de Salmonella Infantis en una matriz simple (solución salina 0.85 %) y se comprobó por primera vez que esta clase de sensores eran capaces de detectar al menos 100 ufc/mL de la bacteria en tan solo una hora con alta selectividad. Seguidamente, se amplió el campo de aplicación a otro tipo de microorganismo, Candida albicans. En este estudio, se mejoró no sólo el límite de detección de los dispositivos a 50 ufc/mL sino que también se mejoró la selectividad de los CNTFETs frente a posibles interferentes que pueden estar presentes en muestras reales, tales como proteínas séricas. Finalmente, se aplicaron los dispositivos a la detección del moho Aspergillus flavus en muestras reales. En este ensayo, el tiempo de respuesta fue de 30 minutos y se obtuvo una buena sensiblidad (10 µg de A. flavus / 25 g de arroz). Como parte final de la tesis, se presentan las conclusiones generales extraídas a lo largo del trabajo completo junto con los anexos. Puede concluirse que, gracias a las propiedades únicas de los nanotubos de carbono, dichos nanomateriales pueden combinarse con entidades biológicas (como los anticuerpos) para obtener biosensores altamente sensibles y selectivos capaces de detectar bacterias, levaduras y mohos en un tiempo de análisis muy reducido. Como trabajo futuro, se deberán estudiar otros parámetros de calidad de los dispositivos tales como la estabilidad a lo largo del tiempo, la robustez o su reutilización con el fin de contrastarlos con los métodos estándar antes de poder iniciar la comercialización de este tipo de sensores.

Objetivo general Determinar los mecanismos por los cuales los microorganismos intestinales interaccionan con las células del hospedador en especial en lo que respecta a aquellos eventos relacionados con su transporte dentro de células del sistema inmune y al antagonismo de los efectos de patógenos intestinales por microorganismos probióticos. Objetivos específicos 1. Determinar qué tipo de interacciones se establecen entre B. cereus y células fagocíticas. Determinación del destino intracelular y la supervivencia de este microorganismo. 2. Establecer la capacidad de otros microorganismos de interferir en la interacción de B. cereus con células epiteliales y células dendríticas. Estudio de la respuesta generada sobre estas células. 3. Desarrollo de un modelo murino de infección con B. cereus.

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Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-02-15T10:25:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 799374 bytes, checksum: 48ad1bf284d72b05051fcbc5968a3766 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-15T10:25:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 799374 bytes, checksum: 48ad1bf284d72b05051fcbc5968a3766 (MD5) Previous issue date: 2015-03-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / De forma a proteger a colônia de micro-organismos que habitam o solo e são capazes de infectar operárias e seu jardim de fungo, as formigas-cortadeiras desenvolveram diversos mecanismos de defesa, como por exemplo, o sistema imune capaz de encapsular pequenas partículas infecciosas, a produção de antimicrobianos pelas glândulas metapleurais, e a simbiose com actinomicetos, bactérias filamentosas presentes na cutícula e que também produzem antimicrobianos. A partir disso, o objetivo deste trabalho foi infectar três grupos de operárias de Acromyrmex subterraneus subterraneus e Acromyrmex subterraneus molestans (operárias externas ao jardim de fungo, operárias do jardim sem camada visível de actinomicetos e operárias do jardim com camada visível de actinomicetos) com duas espécies de fungos entomopatogênicos, Aspergillus ochraceus e Metarhizium anisopliae, e verificar se a presença das bactérias filamentosas influenciaria na capacidade de sobrevivência e na resposta imune das formigas. Nos testes de mortalidade, as operárias foram infectadas e isoladas individualmente em placas de Petri, sendo avaliadas durante 10 dias. As suspensões de esporos aumentaram as taxas de mortalidade em ambas as subespécies. Porém, em nenhuma delas foi encontrada relação entre a presença dos actinomicetos e a maior capacidade de sobrevivência dos grupos de operárias. Quando os efeitos das suspensões de esporos foram comparados em cada grupo de operárias, ocorreram efeitos semelhantes nos dois grupos de Ac. subterraneus subterraneus que não possuíam camada visível de actinomicetos; em Ac. subterraneus molestans, as suspensões causaram efeitos semelhantes apenas nas operárias internas sem camada visível das bactérias filamentosas. A resposta imune foi medida através do processo de encapsulação. Enquanto M. anisopliae causou efeito imunossupressor, A. ochraceus não produziu o mesmo resultado. Ambas as suspensões mostraram que as operárias externas ao jardim de fungo possuem sistema imune mais eficiente. / To protect the colony from microorganisms which inhabit the soil and are capable of infecting workers and their fungus garden, leaf-cutting ants developed many defense mechanisms, e.g., the immune system capable of encapsulating small infectious particles, the production of antimicrobial substances by metapleural glands, and the symbiosis with actinomycete, filamentous bacteria that live in the cuticle and are also capable of producing antimicrobial substances. The objective of this study was to infect three groups of Acromyrmex subterraneus subterraneus and Acromyrmex subterraneus molestans workers (those outside the fungus garden, those inside the fungus garden without visible actinomycete covering the body, and those inside the fungus garden with visible actinomycete covering the body) with two species of entomopathogenic fungi, Aspergillus ochraceus and Metarhizium anisopliae, and to verify if the filamentous bacteria presence would influence the survival capacity and the immune response of the ants. During mortality tests, workers were infected and individually isolated in Petri dishes and evaluated during 10 days. We found that spore suspensions increased the mortality rates of both subspecies. However, in none of them there was a relationship between actinomycete presence and the increased capacity of survival of the groups of workers. When the effects of the spore suspensions were compared in each of the groups of workers, similar effects occurred in the two groups of Ac. subterraneus subterraneus which didn’t have visible actinomycete covering the body; in Ac. subterraneus molestans, the suspensions caused similar effects only in the workers inside fungus garden without visible actinomycete covering the body. The immune response was measured through encapsulation. While M. anisopliae caused immunosuppressive effect, A. ochraceus did not produce the same result. Both suspensions indicated that workers outside fungus garden have a more effective immune system.

A infecção crônica do trato respiratório é responsável pela grande morbidade e mortalidade em pacientes com fibrose cística (FC). P. aeruginosa, S. aureus e bactérias do complexo Burkholderia cepacia (CBc) estão entre os patógenos mais encontrados em pulmões de pacientes com FC, mas também são encontradas outros bacilos gram-negativos não fermentadores (BGN-NF) emergentes como Achromobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia, Ralstonia sp., Pandoraea sp., entre outros. A correta caracterização desses patógenos impacta na sobrevida e qualidade de vida desses pacientes, e é um dos grandes desafios para laboratórios de microbiologia clínica devido à similaridade fenotípica entre eles. Este estudo tem como objetivo avaliar e propor estratégias e esquema de identificação acessível à maioria dos laboratórios para a identificação de BGN-NF emergentes e listar bactérias isoladas de pacientes com FC atendidos no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP (HCFMRP-USP), com ênfase nos BGN-NF emergentes. Foram utilizados meios de cultura seletivos, reação em cadeia da polimerase (PCR), análise de polimorfirmos (RFLP). Foram coletadas 264 amostras clínicas de 107 pacientes com FC no HCFMRP-USP entre julho/2011 a setembro/2012. Inicialmente, para selecionar os BGNNF dos pacientes com FC, deve ser realizada triagem fenotípica (coloração de Gram, teste da oxidação/fermentação de glicose e produção de oxidase). Devido à dificuldade de identificação dos BGN-NF emergentes por provas bioquímicas, deve ser realizada PCR com DNA destes microrganismos para identificação de gênero e/ou espécie, utilizando os primers específicos, nas condições estabelecidas pela padronização, a qual foi realizada para aumentar a especificidade de alguns primers que apresentaram amplificação de produtos inespecíficos. Provas bioquímicas convencionais devem ser realizadas para confirmar gêneros e identificar algumas espécies não detectadas por PCR, e para resultados fenotípicos diferente da PCR deve ser realizado API® - NE. Para identificação das bactérias do CBc, deve ser realizado análise de polimorfismo, o qual se mostrou mais efetivo do que PCR para identificação de espécies e genomovares. Dos 107 pacientes, 17 estavam colonizados por bactérias do CBc, 13 colonizados por Achromobacter sp., 10 colonizados por S. maltophilia, 2 colonizados por Ralstonia sp. e um paciente colonizado por Cupriavidus sp. e Pandoraea sp., com um isolamento de cada gênero. Os genomovares mais prevalentes foram B. cenocepacia IIIB, seguido de B. vietnamiensis, B. pyrrocinia, B. cepacia e B. multivorans. A maioria dos BGNNF esteve presente em crianças com idade até 17 anos. Os meios de cultura seletivos foram extremamente necessários por permitir o isolamento de vários BGN-NF, não isolados em outros meios de cultura utilizados. A metodologia de identificação empregada foi capaz de identificar todos BNG-NF isolados e pode ser muito útil e acessível à maioria dos laboratórios clínicos. / Chronic infection of the respiratory tract accounts for the high rate of morbidity and mortality of patients suffering from cystic fibrosis (CF). P. aeruginosa, S. aureus and bacteria of the Burkholderia cepacia (BCc) complex are among the pathogens most commonly found in the lungs of CF patients, but other emergent non-fermenting gram-negative bacilli (NFGNB), such as Achromobacter sp., Stenotrophomonas maltophilia, Ralstonia sp., Pandoraea sp., among others, are found as well. The correct identification of these pathogens affects the survival rate of patients and, due to their phenotypic similarity, presents itself as one of the great challenges that clinical microbiology laboratories face. The purpose of this study is to evaluate and propose strategies and methods that are accessible to the majority of laboratories for identifying emergent NFGNBs and listing isolated bacteria (with a focus on emergent NFGNB) in CF patients receiving routine care at the Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo - USP (HCFMRPUSP). The study employed selective culture media, polymerase chain reaction (PCR) and restriction fragment length polymorphism (RFLP). From July 2011 to September 2012, 264 clinical samples were gathered from 107 CF patients at the HCFMRP-USP. A phenotypic screening (Gram staining, oxidase production and oxidation/fermentation of glucose) should be conducted as the first step to select the NFGNBs of CF patients. Due to the difficulty in identifying emergent NFGNBs via biochemical tests, a PCR using the DNA of these microorganisms should be carried out to identify their genus and/or species. The PCR should utilize the specific primers, at conditions established by this study, which was performed to increase the specificity of some primers that showed nonspecific amplification products. Conventional biochemical tests should be conducted to confirm genera and identify some species that the PCR failed to detect, and, in the case of phenotypic results that differ from those of the PCR, an API bacterial identification test should be conducted. RFLP analysis proven more effective than PCR in identifying species and genomovars, should be conducted to identify BCc bacteria. Of the 107 patients, 17 had positive cultures for BCc, 13 for Achromobacter sp., 10 for S. maltophilia, two for Ralstonia sp. and one patient had positive culture for Cupriavidus sp. and Pandoraea sp., with the genera isolated from each other. The most prevalent genomovar was the B. cenocepacia IIIB, followed by B. vietnamiensis, B. pyrrocinia, B. cepacia and B. multivorans. The majority of the NFGNBs were present in children up to age 17. Selective culture media were extremely necessary to allow the isolation of various NFGNBs that could not be isolated via alternative culture media. The identification methodology employed enabled the identification of all isolated NFGNBs and can be very useful and accessible to the majority of clinical laboratories.

Os sistemas convencionais de tratamento de águas residuárias frequentemente utilizados em países tropicais não eliminam nutrientes, gerando impactos de eutrofização em corpos hídricos. Além disso, há uma crescente discussão quanto à finitude desses nutrientes e os impactos produtivos na geração de seus subprodutos. Nesse sentido, este estudo buscou avaliar o crescimento de Chlorella sorokiniana, a recuperação de nutrientes e a remoção de patógenos em fotobiorreatores tubulares (FBR). O experimento foi conduzido em fotobiorreatores, com caminho óptico de 50 mm, os quais foram alimentados com efluentes de reatores anaeróbios compostos por uma mistura de dejetos suínos e esgoto doméstico, e foi conduzido em quatro etapas. Na etapa inicial, o experimento foi conduzido em escala de bancada sob condições naturais para adaptação das microalgas ao esgoto. Posteriormente, foi feito em condições controladas para avaliação da influência do CO2 e da temperatura no processo (reator de 3 L e vazão de ar 0,2 vvm) nas temperaturas de 32 e 38°C. Depois, foi feita ampliação de escala com regime contínuo e em batelada sob condições naturais (211 L, 0,15 vvm e 2,19 L/h). E, por fim, avaliou-se a separação de algas da fase líquida e a remoção de Giardia spp. e Criptosporidium spp. Como resultados, o experimento obteve: a recuperação de fósforo de 97% e remoção de 91% para nitrogênio; a biomassa atingiu 1,15 g/L como crescimento máximo; o tanino se mostrou como um potencial coagulante para separação sólido-líquido, obtendo eficiência de 95,2% de remoção de turbidez e remoção de patógenos atingiu 2,97 log. No entanto, as altas temperaturas (acima de 45°C) comprometeram o sistema, bem como o acúmulo de nitrito que inibiu as bactérias nitratantes. Observou-se, portanto, que tanto para a temperatura de 38 °C, bem como para de 32°C, o sistema apresentou bom desempenho. Vale ressaltar que não foi necessário controle de pH, e que o crescimento sem adição de CO2 foi mais efetivo. Desse modo a tecnologia se mostrou favorável para tratamento de efluentes com nutrientes. / Conventional wastewater treatment systems often used in tropical countries do not eliminate nutrients, generating impacts of eutrophication on water bodies. In addition, there is a growing discussion about the finiteness of these nutrients and the productive impacts in the generation of their by-products. In this sense, this study sought to evaluate the growth of Chlorella sorokiniana, nutrient recovery and the removal of pathogens in tubular photobioreactors (FBR). The experiment was conducted in tubular photobioreactors with 50 mm optical path, which were fed effluents from anaerobic reactors composed of pig manure and domestic sewage and was conducted in four stages. In the initial stage, the experiment was conducted on bench scale under natural conditions to adapt the microalgae to the sewage. Subsequently, it was done under controlled conditions to evaluate the influence of CO2 and temperature in the process (3 L reactor and 0.2 vvm air flow) at temperatures of 32 and 38°C. Afterwards, continuous and batch scale scaling was carried out under natural conditions (211 L, 0.15 vvm and 2.19 L/h). Finally, the algae separation from the liquid phase and the removal of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. were evaluated. As results, the experiment obtained: the recovery of phosphorus of 97% and removal of 91% for nitrogen; The biomass reached 1.15 g/L as maximum growth; The tannin was shown to be a potential coagulant for solid-liquid separation, obtaining 95.2% turbidity removal efficiency and removal of pathogens reaching 2.97 log. However, high temperatures (above 45°C) compromised the system as well as the accumulation of nitrite that inhibited nitrifying bacteria. It was observed, therefore, that the optimum growth temperature was shown at 38°C, and that at 32°C also showed good performance. It is worth noting that Ph-control was not necessary, and growth without CO2 addition was more effective. In this way, the technology proved to be favorable for wastewater treatment with nutrients.

Las plantas son capaces de modificar los patrones de desarrollo tras percibir ciertos tipos de estrés. En Arabidopsis, se identificó PCC1 como un regulador positivo de la transición floral en respuesta al estrés generado por irradiación con luz UV-C. El análisis de plantas transgénicas pPCC1::GUS muestra que PCC1 se expresa durante los primeros días de desarrollo en estomas y haces vasculares de cotiledones. En hojas verdaderas en formación se detecta tinción GUS en su parte basal, incluyendo los haces vasculares, y se va extendiendo completamente a toda la superficie de hojas completamente formadas. Líneas que expresan construcciones de RNAi para PCC1 (iPCC1) presentan reducidos niveles de FT y, consecuentemente, una floración más tardía. El mecanismo por el cual PCC1 podría regular la transición floral parece estar relacionado con alteraciones en la transmisión de la señal por luz. Concomitantemente, las plantas iPCC1 muestran fenotipos parcialmente escotomorfogénicos en los distintos tipos de luz ensayados de forma independiente de la acumulación y señalización de GAs. El transcriptoma diferencial de plantas iPCC1 versus plantas silvestres muestra una clara implicación de PCC1 en procesos relacionados con defensa. De acuerdo con este hecho, hemos observado que las plantas iPCC1 son más susceptibles a la infección con el oomiceto hemi-biotrofo Phytophtora brassicae y más resistentes al hongo necrotrofo Botrytis cinerea. Además, las líneas iPCC1 presentan una regulación al alza de genes de respuesta a ABA, y una mayor sensibilidad a esta fitohormona para los distintos fenotipos analizados. Finalmente, entre los genes alterados en las líneas iPCC1 se observa una sobrerepresentación de genes implicados en el metabolismo y en el transporte de lípidos. La pérdida de función de PCC1 conlleva una reducción del 70% en los niveles de fosfatidilinositol, y en menor medida de otros tipos de lípidos polares como la fosfatidilserina o la fosfatidilcolina. Además, el análisis de la composición de ácidos grasos de cada tipo de lípidos polares revela un mayor grado de insaturación de sus cadenas laterales, fundamentalmente en la fosfatidilserina y el fosfatidilinositol. PCC1 es una proteína asociada a la membrana plasmática por su extremo carboxiterminal, el cual es responsable además de la formación de homodímeros. Aunque queda por dilucidiar los mecanismos por los cuales PCC1 puede regular procesos tan dispares molecularmente como la respuesta a patógenos y la transición floral, hemos observado que PCC1 interacciona con la subunidad CSN5 del signalosoma (CSN), lo que sugiere que PCC1 podría actuar como un regulador de la función de CSN, y en última instancia, de la degradación de proteínas por ubiquitinación. / Mir Moreno, R. (2013). Caracterización molecular y funcional del gen PATHOGEN AND CIRCADIAN CONTROLLED 1 (PCC1) en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/29751 / TESIS

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Anna Carolina da Costa.pdf: 691308 bytes, checksum: 6714037f8e5e5965d7add36bb39f6e67 (MD5) Previous issue date: 2010-02-25 / This study was conducted on 12 dairy farms and in laboratories Bacteriology and Quality of Milk, both of the School of Veterinary Medicine Federal University of Goias objective of this study to characterize the microorganisms in milk from cows with subclinical mastitis and relate the pathogens identified with the variation of cell count somatic (CCS), also identify the risk factors and the likely sources of infection to subclinical mastitis, by visual observations, application of questionnaires, by isolation and identification of pathogens from the hands of milkers, swabs and solutions liners and pre posdipping. The profile sensitivity to key antimicrobial and bactericidal effect of the extract of Calendula officinalis has been determined on the pathogens isolated in most cases subclinical mastitis in herds. To evaluate the variation of CCS in relation to the pathogens involved, we used analysis of frequency and Chi-square, and the risk factors were analyzed for Logistic regression to test associations between variables and increased CCS. It was found that agents with higher frequency of isolation were S. aureus (28.8% of samples), E. coli (19.8%) and Enterobacter spp. (11.3%). CCS average herd was approximately 875 x 103cél/mL, and the type etiologic agent of a significant influence on the variation in SCC. It was found that S. aureus and Streptococcus spp. were responsible for greater increase in SCC, with an average of 1192 x 1174 x 103cél/mL and 103cél/mL, respectively. This variation was significantly higher (p <0.05) when compared to the average SCC in milk were the other isolates microorganisms: S. coagulase negative, Pseudomonas spp., E. coli and Enterobacter spp. It was found that the risk factors that showed significant association with increased SCC were unsatisfactory hygiene environment and milker, inadequate drying of the teats, and factors related to milking equipment, such as poor maintenance and inadequate cleaning. The hands of the milkers and the sets of liners were able to convey both the infectious agents as the environment, important in epidemiology of bovine mastitis. It was also concluded that the extract of marigold showed bactericidal activity in vitro against S. aureus isolates, and antimicrobial agents used showed variation in the spectrum of sensitivity. / O presente trabalho foi conduzido em 12 explorações leiteiras e nos Laboratórios de Bacteriologia e de Qualidade de Leite, ambos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. Objetivou-se neste estudo caracterizar a população microbiana presente no leite de vacas com mastite subclínica e relacionar os patógenos identificados com a variação da contagem de células somáticas (CCS), além de identificar os fatores de risco e as prováveis fontes de infecção para a mastite subclínica, através de observações visuais, aplicação de questionários, pelo isolamento e identificação de patógenos das mãos de ordenhadores, suabes de teteiras e em soluções de pre e posdipping. O perfil de sensibilidade aos principais antimicrobianos e o efeito bactericida do extrato da Calendula officinalis foi determinado sobre os patógenos mais isolados em casos de mastite subclínica dos rebanhos estudados. Para avaliação da variação da CCS em relação aos patógenos envolvidos utilizou-se análises de frequência e o teste de qui-quadrado, e para os fatores de risco foram realizadas análises de Regressão Logística para testar associações entre as variáveis e o aumento da CCS. Constatou-se que os agentes com maior frequência de isolamento foram S. aureus (28,8% das amostras), E. coli (19,8%) e Enterobacter spp. (11,3%). A CCS média dos rebanhos foi de aproximadamente 875 x 103cél/mL, sendo que o tipo de agente etiológico apresentou efeito significativo sobre a variação na CCS. Verificou-se que S. aureus e Streptococcus spp. foram os responsáveis pela maior elevação da CCS, com média de 1.192 x 103cél/mL e 1.174 x 103cél/mL, respectivamente. Essa variação foi significativamente maior (p < 0,05) ao ser comparado às CCS médias do leite em que foram isolados os demais microrganismos: S. coagulase negativo, Pseudomonas spp., E. coli e Enterobacter spp. Verificou-se que os fatores de risco que apresentaram associação significativa com o aumento da CCS foram higiene insatisfatória do ambiente e ordenhador, secagem inadequada dos tetos, e fatores relacionados ao equipamento de ordenha, como falta de manutenção e limpeza inadequada. As mãos dos ordenhadores assim como os conjuntos de teteiras foram capazes de veicular tanto os agentes contagiosos quanto os ambientais, importantes na epidemiologia da mastite bovina. Conclui-se também que o extrato de calêndula apresentou atividade bactericida in vitro sobre S. aureus isolados, e os antimicrobianos utilizados apresentaram variação no espectro de sensibilidade.