A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica da América Latina causada pelo fungo dimórfico Paraccoccidioides brasiliensis. Os TLRs, e os CLRs são \"Receptores de Reconhecimento Padrão\" (PRRs) que reconhecem os \"Padrões Moleculares Associados aos Patógenos\" (PAMPs). O objetivo deste trabalho foi caracterizar os receptores de macrófagos de camundongos resistentes (A/J) e susceptíveis (B10.A) ao P. brasiliensis envolvidos na interação com o fungo, através do estudo do efeito do tratamento dos macrófagos com agonistas ou antagonistas dos receptores de manose (MR), receptores do tipo Toll 4 (TLR4), receptores de beta-glucanas (dectina-1) e receptores de complemento CR3 (CD11b/CD18), na interação fungo-macrófago. O tratamento dos macrófagos com o agonista de MR (manana), ativou ambos os macrófagos A/J e B10.A. O bloqueio dos receptores MR, TLR4 e CR3 com anticorpos monoclonais específicos, induziu inibição dos macrófagos, mostrando a importância destes receptores no reconhecimento dos carboidratos presentes na parede do fungo. O tratamento com os agonistas de dectina-1 (laminarina e curdlan) induziram ativação dos macrófagos, porém de maneira distinta entre as linhagens. A laminarina pareceu ativar macrófagos B10.A e inibir A/J; curdlan por sua vez, pareceu ativar macrófagos A/J e inibir B10.A.Estes dados sugerem que diferentes perfis de ativação dos macrófagos atuem no reconhecimento do fungo. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis of Latin America caused by Paraccoccidioides brasiliensis, a dimorphic fungus. The TLRs and CLRs are \"Pattern Recognition Receptors\" (PRRs) which recognize \"Pathogen Associated Molecular Patterns\" (PAMPs). The aim of our work was to characterize the macrophages receptors from resistant (A/J) and susceptible (B10.A) mice to P. brasiliensis involved in the interaction with the fungus. We studied the effect of macrophages treatment with agonists or antagonists of mannose receptors (MR), Toll like receptors 4 (TLR4), <font face=\"Symbol\">b-glucans receptors (dectin-1) and complement receptors CR3 (CD11b/CD18), in the interaction fungus-macrophages. The macrophages treatment with mannan agonist of MR activated both A/J and B10.A macrophages. The blockade of MR, TLR4 and CR3 receptors with specific monoclonal antibodies, induced macrophages inhibition, showing the importance of these receptors in the recognition of common carbohydrates presents on the cell wall of the fungus. The macrophages treatment with laminarin and curdlan agonists of dectin-1, induced macrophages activation, however in the distinct manner between both macrophages lineages. Laminarin appeared to activate B10.A macrophages and inhibit A/J; whereas curdlan appeared to activate A/J macrophages and inhibit B10.A. These data suggest that a different profile of macrophages activation plays in the fungus recognition.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) is an alphaherpesvirus associated with meningoencephalitis, an important disease of cattle in South America. Differential modified live vaccines that allow differentiation between vaccinated and naturally infected animals have been used in programs for control and eradication of porcine and bovine herpesvirus infections in several countries. Like in other alphaherpesviruses, the enzyme thymidine kinase (TK) and the glycoprotein E (gE) are related with pathogenicity and virulence of BoHV-5. Thus, the present study aimed to produce and characterize BoHV-5 viruses defective in TK and gE genes out of a Brazilian wild-type strain (SV507/99). In the first part of this study, several BoHV-5 clones resistant to brivudin (BVDU), a nucleoside analog which select TK-deficient virus, were selected. One such clone (BoHV-5/R-27) demonstrated to be genetically stable in vitro, and displayed the same kinetics of replication, plaque size and morphology in cell monolayers compared to the parental strain. Moreover, BoHV-5/R-27 was shown to be attenuated for rabbits since no clinical signs were observed after intranasal inoculation. These results demonstrate that BoHV-5 is sensitive to BVDU; BVDU-resistant mutants can be selected, and the BoHV-5/R-27 resistant virus retained its ability to replicate in tissue culture and was attenuated for rabbits. In the second part of the study, three recombinants BoHV-5 strains defective in gE, TK and both genes were constructed using the strain SV507/99 as a background and were characterized in vitro. Homologous recombination in cell culture was used to delete and substitute the entire or part of the coding regions of gE and TK for the green fluorescent protein (GFP) and betagalactosidase (β-gal) genes, respectively. The absence of gE and TK genes was confirmed by immunoblotting and PCR, respectively. In vitro characterization of the recombinant viruses (BoHV-5 gEΔ, BoHV-5 TKΔ and BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrated that the deletions did not affect their kinetics of replication when compared to the parental strain. However, recombinants BoHV-5 gEΔ and BoHV-5 gE/TKΔ produced smaller plaques than BoHV-5 TKΔ and SV507/99. This study demonstrated the viability of the recombinant BoHV-5 viruses, which can be further used in pathogenesis studies and for vaccine development as well. The third part of this study evaluated the immunogenicity in cattle of two inactivated oil-adjuvanted vaccines containing SV507/99 or BoHV-5 gE/TKΔ infected cell cultures. For this, forty calves (20 animals/group) were vaccinated on days 0 and 22 post-vaccination (pv) and serum samples collected at different time points pv were tested for neutralizing antibodies against the homologous BoHV-5 strain and against several heterologous BoHV-5 and bovine herpesvírus type 1 (BoHV-1) isolates. All vaccinated animals seroconverted after the second vaccination (mean titers of 17.5 for the SV507/99 group and 24.1 for the BoHV-5 gE/TKΔ group), and the neutralizing antibody titers remained up to day 116 pv, showing a gradual reduction. Cross-serology with heterologous BoHV-5 and BoHV-1 isolates indicated that both vaccinated groups reacted similarly to the same virus, but with higher magnitude against BoHV-5 isolates. These results demonstrated that the inactivated vaccine using the BoHV-5 gE/TKΔ recombinant induced a satisfactory serological response. Based on the fact that gE can be used as a negative serological marker, this strains can be an alternative as a differential vaccine. In summary, the presented results describe the production and characterization of BoHV-5 strains defective for two genes associated with virulence. The recombinant strains can be used in pathogenesis studies and constitute potential candidate for differential vaccines. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um alfaherpesvírus associado com meningoencefalite, uma doença de grande importância em bovinos na América do Sul. Vacinas atenuadas por manipulação genética e contendo marcadores antigênicos que permitem a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente têm sido utilizadas com sucesso no controle e erradicação de infecções por herpesvírus suínos e bovinos em vários países. Como em outros alfaherpesvirus, a enzima timidina quinase (TK) e glicoproteína E (gE) estão relacionados com a patogenicidade e virulência do BoHV-5. Assim, o presente trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar cepas do BoHV-5 defectivas na TK e gE a partir de uma amostra brasileira (SV507/99). Na primeira parte do estudo foram selecionadas variantes resistentes a brivudin (BVDU), um análogo de nucleosídeo que seleciona vírus defectivos na atividade TK. Um clone viral resistente ao BVDU (BoHV-5/R-27) demonstrou ser geneticamente estável in vitro, replicou com a mesma cinética e produziu placas com diâmetro e morfologia similares às da cepa parental. A atenuação do variante BoHV-5/R-27 foi confirmada pela inoculação intranasal em coelhos, nos quais não produziu enfermidade. Os resultados demonstram que variantes do BoHV-5 resistentes ao BVDU podem ser selecionados e que mantém a capacidade de replicar em cultivo celular e são atenuados para coelhos. Na segunda parte do trabalho, três cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas nos genes da gE, TK e ambos foram construídas a partir da cepa parental SV507/99 e caracterizadas in vitro. A técnica de recombinação homóloga foi utilizada para substituir integral ou parcialmente a região codificante dos genes da gE e TK pelos genes da proteína verde fluorescente (GFP) ou betagalactosidase (β-gal), respectivamente. A deleção das sequências da gE e TK foram confirmadas por immunoblotting e PCR, respectivamente. A caracterização in vitro das cepas recombinantes (BoHV-5 gEΔ; BoHV-5 TKΔ e BoHV-5 gE/TKΔ) demonstrou que as deleções não alteraram a capacidade de replicação em cultivo celular, embora as cepas BoHV-5 gEΔ e BoHV-5 gE/TKΔ produzissem placas menores do que a cepas BoHV-5 TKΔ e parental. Desta maneira, demonstrou-se que os vírus recombinantes são biologicamente viáveis, podendo ser utilizados em estudo de patogenia ou como candidatos a cepas vacinais. Na terceira parte do estudo foi avaliada a imunogenicidade em bovinos de duas formulações vacinais inativadas oleosas, produzidas a partir de cultivos celulares infectados com a cepa parental (SV507/99) ou recombinante BoHV-5 gE/TKΔ. Para isso, quarenta bovinos (20 animais por grupo) foram vacinados nos dias 0 e 22 pós-vacinação (pv) e amostras de soro, coletadas a diferentes intervalos pós-vacinação, foram testadas para anticorpos neutralizantes contra a cepa homóloga e frente a diferentes isolados de BoHV-5 e herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1). Todos os animais vacinados soroconverteram após a segunda dose da vacina (títulos médio de 17,5 para o grupo SV507/99 e 24,1 para o grupo BoHV-5 gE/TKΔ) e os níveis de anticorpos neutralizantes foram detectados até o final do experimento (dia 116 pv), porém com redução gradual. A sorologia cruzada com amostras heterólogas do BoHV-5 e BoHV-1 indicou que ambos os grupos reagiram em níveis similares frente ao mesmo vírus, no entanto, com maior magnitude contra amostras de BoHV-5. Os resultados demonstram que a vacina experimental composta por antígenos do BoHV-5 gE/TKΔ recombinante induziu resposta sorológica em níveis semelhantes ao induzida pela vacina produzida a partir do vírus parental. Dessa forma, e considerando-se a gE como marcador sorológico negativo, essa cepa recombinante se constitui em uma alternativa para possível vacina diferencial. Em resumo, os resultados apresentam a obtenção e caracterização de cepas recombinantes do BoHV-5 defectivas em dois genes associados com virulência. Essas cepas podem ser utilizadas em estudos de patogênese e, sobretudo, se constituem em candidatos potenciais para a formulação de vacinas diferenciais.

Leptospirose é uma zoonose mundial que causa grandes prejuízos econômicos e sociais. Os mecanismos de patogenicidade da leptospira ainda não estão totalmente elucidados. Nesse trabalho foi avaliado o papel de três proteínas hipotéticas de superfície na patogenia da leptospirose: LIC11009, LIC11360 e LIC11975. Os genes foram clonados a partir do DNA da L. interrogans sorovar Copenhageni e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de afinidade. RT-qPCR mostrou a transcrição dos genes em leptospiras. As proteínas recombinantes reagiram com soro de humanos diagnosticados com leptospirose. rLIC11009 induziu somente resposta imune Th1 em camundongos, enquanto que rLIC11360 e rLIC11975 induziram resposta Th1 e Th2. As três proteínas recombinantes se ligaram à laminina e plasminogênio, enquanto rLIC11360 e rLIC11975 também se ligaram à fibronectina plasmática e fibrinogênio. Em adição, rLIC11360 se ligou ainda aos reguladores do sistema complemento fator H e C4BP. Os resultados sugerem que as proteínas estudadas podem auxiliar a leptospira a evadir e invadir o hospedeiro. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis that causes great economic and social losses. The pathogenic mechanisms of leptospira are not yet fully elucidated. In this study we evaluated the role of three hypothetical surface proteins in the leptospiral pathogenesis: LIC11009, LIC11360 and LIC11975. Genes were cloned from DNA of L. interrogans serovar Copenhageni and the recombinant proteins were purified by affinity chromatography. RT - qPCR data have shown that the genes are fully transcribed in leptospires. Recombinant proteins reacted with sera from humans diagnosed with leptospirosis. rLIC11009 induced Th1 immune response in mice, whereas rLIC11360 and rLIC11975 promoted both Th1 and Th2. The three recombinant proteins interacted with laminin and plasminogen while, rLIC11360 and rLIC11975, also interacted with plasma fibronectin and fibrinogen. In addition, rLIC11360 interacted with the complement regulators factor H and C4BP. These results suggest that the proteins tested can help leptospires to evade and invade the host.

A leptospirose é uma zoonose de distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira. Resultados experimentais demonstraram que a patogênese pode estar relacionada com a capacidade destas bactérias em aderir a proteínas da matriz extracelular, escapar da resposta imune do hospedeiro e de produzir toxinas. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas por Leptospira interrogans sorovar Pomona estirpe Fromm kennewicki (patogênica) e Leptospira biflexa sorovar Patoc estirpe Patoc I (saprófita), através de análise proteômica. As leptospiras foram cultivadas em meio EMJH suplementado com soro de coelho ou albumina bovina. Os sobrenadantes foram filtrados, dialisados e liofilizados para aplicação das tecnologias de análise proteômica utilizando gel bidimensional e análise em solução. A análise dos peptídeos obtidos, nos dois procedimentos, foi realizada utilizando-se LC/MS/MS. Foi possível a identificação de 159 proteínas diferentes nas amostras de L.interrogans, entre as quais 64 foram positivas em pelo menos uma das ferramentas usadas para a predição. Em L. biflexa, 104 proteínas diferentes foram identificadas, entre elas 43 proteínas foram positivas pela análise in silico. Entre as proteínas identificadas, estão aquelas que possuem peptídeo sinal sec ou tat dependentes. Em outras, a predição da localização celular é desconhecida ou podem ter múltiplos sítios de localização, e ainda, proteínas que não possuem peptídeo sinal e que podem ser secretadas por mecanismos não convencionais. Muitos destas são proteínas hipotéticas sem domínios conservados detectados. No que diz respeito à atividade proteolítica, foi identificada a presença de metaloproteases no secretoma de L.interrogans. Não houve detecção da presença significativa de proteases bacterianas em amostras de L. biflexa. A identificação e a caracterização funcional de proteínas secretadas poderão contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos e no desenvolvimento de novas estratégias para o tratamento e prevenção de leptospirose. / Leptospirosis is a zoonosis of worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira. The mechanisms by which leptospires invade the host and cause the disease are not yet fully understood. Experimental results have shown that the pathogenesis may be related to the ability of these bacteria to bind to extracellular matrix proteins, to escape hosts immune responses and to produce toxins. This work aimed to identify secreted proteins by Leptospira interrogans serovar Pomona strain Fromm kennewicki (pathogenic) and Leptospira biflexa serovar strain Patoc Patoc I (saprophyte) through proteomic analysis. The leptospires were grown in EMJH supplemented with rabbit serum or BSA. Supernatants were filtered, dialyzed and lyophilized to proteomic technology, two-dimensional gel and non-gel. The analysis of the obtained peptides in two procedures was performed using LC/MS/LC. It was possible to identify 159 different proteins in the samples of L.interrogans; among them, 64 were positive proteins in at least one of the tools used for prediction. In L. biflexa, 104 different proteins were identified; among them, 43 positive proteins were positive by in silico analysis. Among the identified proteins are those that possess sec or tat dependent signal peptide. In others, the prediction of the cellular location is unknown or may have multiple sites of localization, and even proteins which have no signal peptide can be secreted by unconventional mechanisms. Many of these are hypothetical proteins with no detected putative conserved domains. The presence of metalloproteases has been identified in the L.interrogans´ secretome, using proteolytic assay. There was no significant detection of the presence of bacterial proteases in samples of L. biflexa. The identification and functional characterization of secreted proteins may contribute to the elucidation of pathogenic mechanisms and in the developing of new strategies for the treatment and prevention of leptospirosis.

A raiva é uma doença aguda, progressiva e infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos, causada pelo vírus da raiva (RABV). Embora possa ser prevenida por vacina, continua sendo um grave problema de saúde pública, além de ser responsável pela morte de seres humanos e muitos outros animais, incluindo os de interesse econômico. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre polimorfismos dos genes que codificam as proteínas P e L de amostras de RABV pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3 e períodos de incubação e títulos em camundongos. Para isso, foram selecionadas amostras isoladas de diferentes reservatórios de raiva de mamíferos das Ordens Carnivora e Chiroptera e amostras de bovinos, de áreas endêmicas para o vírus da raiva. As sequências obtidas foram utilizadas para a construção de árvores filogenéticas para procurar os padrões de segregação de linhagens. Os resultados mostraram que não houve marcadores ou polimorfismos que explicam as variações nos períodos de incubação e de letalidade entre cepas pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3. Esta informação pode ser usada para discussões sobre a importância de reservatórios de raiva, a dinâmica do vírus da manutenção e evolução das diferentes formas desta zoonose entre os animais infectados, contribuindo para um estudo mais aprofundado sobre a busca de marcadores moleculares para patogênese. / Rabies is an acute, progressive and infectious disease of the central nervous system of mammals, caused by Rabies virus (RABV). Although preventable by vaccine, it remains a serious public health problem, and is responsible for the death of humans and many other animals, including those of economic interest. This study aimed to assess the relationship between polymorphisms in genes encoding the P and L proteins of RABV samples belonging to antigenic variants 2 and 3 and incubation periods and titers in mice. For this, samples isolated from different mammalian rabies reservoirs of the Orders Carnivora and Chiroptera and samples of cattle from endemic areas for rabies virus were selected. The sequences obtained were used to construct phylogenetic trees to search for the segregation patterns of strains. The results showed that there were no markers or polymorphisms that explain variations in incubation periods and lethality amongst strains belonging to antigenic variants 2 and 3. This information might be used for discussions about the importance of rabies reservoirs, the dynamics of the virus maintenance and evolution of the different forms of this zoonotic disease among infected animals, contributing to further study about the search for molecular markers for pathogenesis.

A raiva é uma doença aguda, progressiva e infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos, causada pelo vírus da raiva (RABV). Embora possa ser prevenida por vacina, continua sendo um grave problema de saúde pública, além de ser responsável pela morte de seres humanos e muitos outros animais, incluindo os de interesse econômico. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre polimorfismos dos genes que codificam as proteínas P e L de amostras de RABV pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3 e períodos de incubação e títulos em camundongos. Para isso, foram selecionadas amostras isoladas de diferentes reservatórios de raiva de mamíferos das Ordens Carnivora e Chiroptera e amostras de bovinos, de áreas endêmicas para o vírus da raiva. As sequências obtidas foram utilizadas para a construção de árvores filogenéticas para procurar os padrões de segregação de linhagens. Os resultados mostraram que não houve marcadores ou polimorfismos que explicam as variações nos períodos de incubação e de letalidade entre cepas pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3. Esta informação pode ser usada para discussões sobre a importância de reservatórios de raiva, a dinâmica do vírus da manutenção e evolução das diferentes formas desta zoonose entre os animais infectados, contribuindo para um estudo mais aprofundado sobre a busca de marcadores moleculares para patogênese. / Rabies is an acute, progressive and infectious disease of the central nervous system of mammals, caused by Rabies virus (RABV). Although preventable by vaccine, it remains a serious public health problem, and is responsible for the death of humans and many other animals, including those of economic interest. This study aimed to assess the relationship between polymorphisms in genes encoding the P and L proteins of RABV samples belonging to antigenic variants 2 and 3 and incubation periods and titers in mice. For this, samples isolated from different mammalian rabies reservoirs of the Orders Carnivora and Chiroptera and samples of cattle from endemic areas for rabies virus were selected. The sequences obtained were used to construct phylogenetic trees to search for the segregation patterns of strains. The results showed that there were no markers or polymorphisms that explain variations in incubation periods and lethality amongst strains belonging to antigenic variants 2 and 3. This information might be used for discussions about the importance of rabies reservoirs, the dynamics of the virus maintenance and evolution of the different forms of this zoonotic disease among infected animals, contributing to further study about the search for molecular markers for pathogenesis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-12T16:45:26Z No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-24T21:25:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-24T21:25:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FrederickMendesAguiar.pdf: 1843726 bytes, checksum: 4fb24b86358626af48318bf95c8540c0 (MD5) / A macha-alvo, causada pelo fungo Corynespora cassiicola, tornou-se uma das mais importantes doenças da parte aérea do tomateiro e pepineiro em diversas regiões produtoras do Brasil e do mundo nos últimos anos. Além do tomate e pepino, este fungo apresenta uma grande diversidade de hospedeiras sendo relatado em mais de 350 espécies de plantas, distribuídas por mais de 80 países. Os isolados deste fungo também apresentam uma grande diversidade morfológica, principalmente em relação à coloração da colônia, tamanho e formato dos conídios, dificultando ainda mais sua identificação e caracterização. Outra dificuldade relacionada à mancha-alvo é a ausência de cultivares comerciais resistentes e de fungicidas recomendados para o tomate e o pepino no Brasil, sendo um grande desafio para seu controle. Em função dos problemas apresentados, esta tese teve como objetivo investigar a variabilidade genética, morfométrica e patogênica entre isolados de Corynespora de diferentes plantas hospedeiras e regiões geográficas e verificar in vitro a sensibilidade micelial de isolados de Corynespora a diferentes fungicidas. Na caracterização molecular todos os isolados avaliados foram identificados como pertencentes à espécie C. cassiicola. Quanto à distribuição e a resolução intraespecífica dos isolados avaliados, as sequências obtidas das regiões genômicas ITS e fator de elongação 1-α apresentaram limitada resolução intraespecífica dos isolados quanto à hospedeira de origem e região geográfica de coleta nas respectivas árvores filogenéticas. Já a árvore filogenética com as sequências do gene β-tubulina apresentou melhor distribuição dos isolados quanto à hospedeira de origem, com formação de dois clados distintos, cada um representado em sua maioria por isolados provenientes da cultura do tomate e do pepino. Os treze isolados de C. cassiicola utilizados na caracterização morfométrica apresentaram grande variabilidade quanto à cor da colônia, com a ocorrência de seis diferentes cores; quanto à textura micelial, os isolados dividiram em sete com textura fina e seis com textura cotonosa; e quanto ao formato da colônia, com predominância da forma poligonal. A taxa de crescimento micelial foi de 6,05 mm/d. As dimensões dos conídios variaram de 7,39 a 386,05 μm de comprimento, 5,8 a 14,08 μm de largura e 0 a 24 para o número de pseudoseptos. Os três isolados de C. cassiicola avaliados confirmaram patogenicidade às suas hospedeiras de origem. Somente oito espécies de plantas avaliadas não apresentaram suscetibilidade aos isolados. Após caracterização molecular, morfométrica e patogênica dos isolados de C. cassiicola avaliados, concluiu-se que, exceto para a região β-tubulina, nenhuma relação entre a hospedeira de origem e a região geográfica de coleta dos isolados foi estabelecida neste estudo. No teste de sensibilidade a fungicidas, em ensaios preliminares foi obtida a dose efetiva capaz de inibir o crescimento micelial de C. cassiicola em 50% (DE50). Nos resultados, os fungicidas clorotalonil e carbendazim apresentaram altos valores da DE50 para a maioria dos isolados avaliados, com média superior a 50 mg.L-1. Para o fungicida tebuconazole, os valores da DE50 variaram de 0,50 a 18,79 mg.L-1. Já para os fungicidas pyrimethanil, fludioxonil e cyprodinil, verificou-se menores valores da DE50 quando comparados aos fungicidas anteriores. Após estes ensaios, as concentrações obtidas foram de 1 mg.L-1 para o fungicida fludioxonil, 3 mg.L-1 para cyprodinil, 5 mg.L-1 para boscalid e fluopyram, 10 mg.L-1 para tebuconazole, azoxystrobin e pyrimethanil e 50 mg.L-1 para clorotalonil e carbendazim. Os resultados obtidos no teste de inibição do crescimento micelial (ICM) de 55 isolados de C. cassiicola, mostraram uma variação entre os fungicidas e os isolados avaliados. O fungicida fludioxonil na concentração de 1 mg.L-1 apresentou maior valor de ICM quando comparado aos demais fungicidas avaliados, com valor médio de 85,69%. Já o fungicida clorotalonil apresentou menor valor de ICM, com média de 31,56%. O isolado EH-1710 apresentou maior valor de ICM de 74,14%, já o isolado EH-2125 apresentou o menor valor entre os isolados avaliados, com média de 34,57%. Os resultados obtidos evidenciam uma grande expectativa de efeitos satisfatórios do fungicida fludioxonil no controle da mancha-alvo. Já os fungicidas carbendazim, pyrimethanil, azoxystrobin e, principalmente, clorotalonil apresentam grande possibilidade de desenvolvimento de resistência dos isolados de C. cassiicola. / Target spot, caused by the fungus Corynespora cassiicola, has been one of the most important disease of the aerial parts of the tomato and cucumber plants in different regions of Brazil and world in the last years. Besides the tomato and cucumber, this fungus has a big host diversity, detected in more than 350 plants, distributed by more than 80 countries. The isolates of this fungus also have a big morfological diversity, mainly in relation to colony colour, conidia size and shape. These characters difficult its identification and characterization to species level. Another difficult concerning to target spot is the absence of resistant cultivars and fungicides recommended for tomato and cucumber in Brazil, representing a big challenge for its control. In function on the presented problems, this thesis aimed to investigate the genetic variability, morphometric and pathogenic among Corynespora isolates from different geographic regions and test the in vitro mycelial sensitivity of Corynespora isolates to different fungicides. In the molecular characterization all isolates were identified as C. cassiicola. As to distribution and intraspecific resolution of isolates, the sequences obtained from genomic regions ITS and elongation factor 1-α showed limited intraspecific resolution of the isolates as to host of origin and geographical region of collection in its phylogenetic trees. The phylogenetic tree with the sequences of β-tubulin gene showed better distribution of isolates as to its host of origin. In this tree it was formed two distinct clades, each one represented mostly by isolates from tomato and cucumber crop. Thirteen isolates of C. cassiicola used in morphometric characterization showed big variability as to color, with occurrence of six different colors; as to texture, with isolates divided into seven presenting fine texture and six with cottony texture; and as to colony shape, with predominance of polygonal shape. The mycelial growth rate was 6.05 mm/d. The dimensions of the conidia ranged from 7.39 to 386.05 mm in length, 5.8 to 14.08 mm in width and 0 to 24 for the number of pseudosepts. The three isolates of C. cassiicola tested confirmed pathogenicity to its host of origin. Only eight species of plants tested didn't show susceptibility to isolates. After molecular, morphometric and pathogenic characterization of isolates of C. cassiicola tested, was concluded that, except for β-tubulin region, no relationship between host of origin and geographical region of isolates was established in this study. In the fungicidal sensitivity test was performed in preliminary tests to determine the actual dose able of inhibiting the mycelial growth of C. cassiicola by 50% (ED50). In the results, the fungicide chlorothalonil and carbendazim showed great ED50 values to majority of isolates, with average higher to 50 mg.L-1. For the tebuconazole fungicide the values of ED50 varied from 0.50 to 18.79 mg L-1. The pyrimethanil, cyprodinil and fludioxonil fungicides presented lower values of DE50 when compared to the former fungicides. After these tests, the ED50 concentrations found were 1 mg.L-1 to fludioxonil, 3 mg.L-1 to cyprodinil, 5 mg l-1 to boscalid and Fluopyram, 10 mg.L-1 to tebuconazole, azoxystrobin and pyrimethanil and 50 mg L-1 to chlorothalonil and carbendazim. The results obtained in the inhibition test of mycelial growth (ICM) of 55 isolates of C. cassiicola, showed a variation among fungicides and isolates tested. The fludioxonil fungicide at a concentration of 1 mg L-1 showed higher ICM when compared to fungicides tested, with average of 85.69%. Already chlorothalonil fungicide showed the lowest ICM values with average of 31.56%. EH-1710 showed higher ICM of 74.14% and the isolate EH-2125 showed the lowest value of ICM among the isolates tested, with average of 34.57%. The results show a great expectation of good effects of fludioxonil fungicide on target spot control. Already carbendazim fungicides, pyrimethanil, azoxystrobin and chlorothalonil showed great possibility of development of resistance of isolates of C. cassiicola.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) the agent of meningoencephalitis in cattle - is an important pathogen of cattle in South America and efforts have been made to produce safer and more effective vaccines. This dissertation relates an investigation of the virulence in rabbits of three BoHV-5 recombinants, vaccine candidates, defective in the glycoprotein E (BoHV-5gEΔ), thymidine kinase (BoHV-5TKΔ) and both genes (BoHV-5gEΔTKΔ). To this, four groups of eight rabbits each were inoculated intranasally with each recombinant or the parental strain (SV507/99) and monitored thereafter. At day 42 post inoculation (pi) the inoculated animals were submitted to dexamethasone (Dx) administration to reactivate latent infection. At day 70 pi, all animals were euthanized and the brain was collected for investigation of latent viral DNA by PCR. Rabbits inoculated with the parental virus shed virus between days 2 and 8 pi and all rabbits (n=8) developed neurological disease and died or were euthanized in extremis, between days 7 and 13 pi. Among the animals inoculated with the recombinants, viral shedding was detected between days 2 and 10 pi, in 7 out of 8 rabbits of the BoHV-5gEΔ group, in 6 out of 8 rabbits of the BoHV-5TKΔ group and in 3 out of 8 of the BoHV-5gEΔTKΔ group. In spite of variable levels of virus shedding, all rabbits inoculated with the recombinants seroconverted, developing virus-neutralizing antibodies in titers from 2 to 256 at day 42 pi. The rabbits inoculated with the parental virus showed a wide distribution of the virus in their brains, including the olfactory bulbs, cortices, medulla oblongata, pons, midbrain and thalamus. Three out of eight rabbits inoculated with the recombinant BoHV-5gEΔ developed neurological signs at days 10 and 15pi. A more restricted virus distribution, confined mainly to cerebral cortices and thalamus was detected in the brain of these animals. Rabbits inoculated with the recombinants BoHV-5TKΔ (n=8) or BoHV-5gEΔTKΔ (n=8) remained healthy during the experiment. Dx administration to rabbits inoculated with the three recombinants at day 42 pi did not result in viral reactivation, as demonstrated by lack of seroconversion or virus shedding. Nevertheless, viral DNA was detected in the trigeminal ganglia or olfactory bulbs of all these animals at day 28pDx, demonstrating they were latently infected. These results showed that the three recombinants were able to establish latent infection yet they were not easily reactivated by Dx administration. In summary, the recombinants BoHV-5TKΔ and BoHV-5gEΔTKΔ are attenuated for rabbits and constitute potential vaccine candidates. / O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), agente da meningoencefalite herpética bovina, possui grande importância na América do Sul e tem motivado pesquisas para o desenvolvimento de vacinas eficazes e seguras. Essa dissertação relata a investigação da virulência em coelhos de três recombinantes do BoHV-5, candidatos vacinais, contendo deleções nos genes da glicoproteína E (gE) (BoHV-5gEΔ), da enzima timidina quinase (TK) (BoHV-5TKΔ) e deleção dupla nos genes da gE e TK (BoHV-5gEΔTKΔ). Para isso, quatro grupos de oito coelhos cada foram inoculados pela via intranasal com um dos recombinantes ou com a cepa parental (SV507/99) e monitorados nos dias seguintes à inoculação. No dia 42 pós-inoculação (pi) realizou-se a administração de dexametasona (Dx) para reativar a infecção latente e no dia 70 pi a eutanásia para a coleta do encéfalo para a pesquisa de DNA latente por PCR. Os coelhos inoculados com o vírus parental (SV507/99) excretaram vírus nas secreções nasais entre os dias 2 e 8 pós-inoculação (pi), e todos (n=8) desenvolveram doença neurológica e morreram ou foram submetidos à eutanásia in extremis entre os dias 7 e 13 pi. Excreção viral entre os dias 2 e 10 pi também foi detectada em 7 de 8 coelhos inoculados com o BoHV-5gEΔ; 6 de 8 inoculados com BoHV-5TKΔ e 3 de 8 inoculados com BoHV-5gEΔTKΔ. Apesar dos níveis variáveis de excreção viral, os animais inoculados com os três recombinantes soroconverteram, apresentando anticorpos neutralizantes em títulos entre 2 e 256 no dia 42 pi. Nos animais inoculados com o vírus parental, o vírus foi detectado amplamente disseminado no encéfalo, incluindo o bulbo olfatório, córtices, bulbo, ponte, mesencéfalo e tálamo. Dentre os animais inoculados com o recombinante BoHV-5gEΔ, três desenvolveram doença neurológica, nos dias 10 e 15 pi. Uma distribuição viral restrita aos córtices e tálamo foi detectada no encéfalo desses animais. Os coelhos inoculados com os recombinantes BoHV-5TKΔ (n=8) e BoHV-5gEΔTKΔ (n=8) permaneceram saudáveis. A administração de dexametasona (Dx) no dia 42 pi não resultou em reativação da infecção por nenhum dos recombinantes, demonstrada por ausência de soroconversão ou excreção viral em secreções. Entretanto, o DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo ou no bulbo olfatório de todos esses animais no dia 28 pDx (70dpi), demonstrando o estabelecimento da infecção latente. Esses resultados demonstram que os recombinantes são capazes de estabelecer a infecção latente, mas não são facilmente reativados pela administração de Dx. Em resumo, os recombinantes BoHV-5TKΔ e BoHV-5gEΔTKΔ são atenuados para coelhos constituindo-se, assim, em candidatos vacinais em potencial.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This study describes aspects of the pathogenesis of bovine herpesvirus-5 (BoHV-5) infection in goats and rabbits. The study performed in goats was aimed at investigating the susceptibility of this species to BoHV-5 infection, due its potential role as a virus reservoir. Young goats were inoculated intranasally with three Brazilian BoHV-5 isolates (SV-507, G1; SV-609, G2; and EVI-88, G3) and monitored thereafter regarding to virus shedding, clinical signs and antibody response. The acute infection was characterized by virus shedding in nasal secretions for up to 14 days post-inoculation (pi) in titers reaching up to 105.97 TCID50/mL, mild respiratory signs and seroconversion. At day 60 pi, two animals of each group were euthanized for tissue collection to search viral DNA. The remaining animals were submitted to dexamethasone (Dx) administration to reactivate latent infection. Dx treatment resulted in virus reactivation in 75% (9/12) animals, as ascertained by virus shedding (8/12), and/or seroconversion (3/12). Latent viral DNA was detected in the trigeminal ganglia (TG) and/or in the main olfactory bulb (MOB) of all goats euthanized at days 60 pi and 40 post-dexamethasone. These results demonstrate that goats are susceptible to BoHV-5 acute and latent infection and may shed virus upon reactivation of latency. Thus, this species should be considered a potential reservoir for BoHV-5 in areas where goats and cattle are raised in close contact. The second experiment was aimed at investigating the role of the olfactory pathway in the transport of BoHV-5 to the brain of rabbits. For this, thirty days-old rabbits had the MOB surgically removed and were subsequently inoculated intranasally (IN) or conjunctivally (IC) with the strain SV-507 of the BoHV-5. Intranasal inoculation resulted in neurological disease in 100% of the control animals (with MOB), with clinical signs starting between days 5 and 10 pi; in the group submitted to MOB ablation only one animal (9.1%) developed neurological signs (started at day 17 pi). Following IC inoculation 10/12 (83.3%) control rabbits (with MOB) developed neurological disease with clinical signs starting between days 11 and 20 (mean 15.3 days). Furthermore, 10/12 rabbits lacking the MOB also developed neurological disease starting between days 9 and 15 pi (mean 12.5 days). These results demonstrate that both the olfactory and the trigeminal pathways may be used by BoHV-5 to invade the brain of rabbits after experimental infection. The transport by the olfactory pathway is faster and more efficient, while the trigeminal transport is slower and less efficient. These results add important information to the knowledge about the neuropathogenesis of alphaherpesvirus infection. / O presente estudo descreve aspectos da patogenia da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) em caprinos e coelhos. O estudo em caprinos teve como objetivo investigar a susceptibilidade da espécie ao BoHV-5, devido ao seu possível papel como reservatório do vírus. Para isto, caprinos jovens foram inoculados pela via intranasal (IN) com três isolados brasileiros do BoHV-5 (SV-507, G1; SV-609, G2; e EVI-88, G3) e monitorados nos aspectos virológicos, clínicos e sorológicos. A fase aguda caracterizou-se por excreção viral em secreções nasais por um período de até 14 dias pós-inoculação (pi) em títulos de até 105,97 DICC50/mL, sinais respiratórios brandos e soroconversão. No dia 60 pi, dois animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia para a coleta de tecidos e pesquisa de DNA viral. Os animais restantes foram submetidos à administração de dexametasona (Dx), na tentativa de reativar a infecção latente. A administração de Dx resultou em reativação da infecção latente em 75% (9/12) animais, detectada pela excreção viral (8/12) e/ou soroconversão (3/12). O DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) e/ou no bulbo olfatório (BO) de todos os animais eutanasiados nos dias 60 pi e 40 pós-dexametasona. Esses resultados demonstram que caprinos são susceptíveis a infecção aguda e latente pelo BoHV-5 e podem excretar vírus durante a reativação da infecção. Portanto, essa espécie pode ser considerada um potencial reservatório do BoHV-5 em áreas onde caprinos e bovinos são criados conjuntamente. O segundo experimento teve como objetivo investigar a importância da via olfatória na invasão do encéfalo de coelhos pelo BoHV-5. Para isto, coelhos recém desmamados foram previamente submetidos à ablação cirúrgica do BO e inoculados pela via IN ou conjuntival (IC) com a cepa SV-507 do BoHV-5. A inoculação IN resultou no desenvolvimento de doença neurológica em 100% dos animais controle (com BO), com início dos sinais clínicos entre os dias 5 e 10 pi. No grupo submetido à ablação do BO apenas um animal (9,1%) apresentou sinais neurológicos (início dia 17 pi). Após a inoculação IC, 10/12 (83,3%) coelhos controle (com BO) desenvolveram doença neurológica com o início dos sinais entre os dias 11 e 20 (média 15,3 dias); 10/12 coelhos (83,3%) sem o BO também desenvolveram a doença neurológica, com os sinais iniciando entre os dias 9 e 15 pi (média 12,5 dias). Esses resultados demonstram que tanto a via olfatória como a via trigeminal podem ser utilizadas pelo BoHV-5 para invadir o SNC de coelhos após infecção experimental. Porém, o transporte pela via olfatória é mais rápido e mais eficiente enquanto que a via trigeminal atua como via de acesso mais lento e menos eficiente. Esses resultados são importantes para um melhor conhecimento sobre a neuropatogênese das infecções pelos alfaherpesvírus.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Contagious ecthyma (orf) is a cutaneous disease that affects sheep and goats, and may be occasionally transmitted to humans. The disease is caused by orf virus (ORFV). ORFV infection produces croustous and proliferative lesions, usually on the nostrils and labial commissures of lambs, and also in the udder, teat skin and coronary bands of adults animals. The pathogenesis of ORFV infection is poorly understood and a search for an adequate animal model is required, yet the disease has been already reproduced in sheep, goats and rabbits. This dissertation relates the clinical, virological and pathological aspects of ORFV infection in rabbits and mice experimental inoculated. Ten rabbits, ten mice and two lambs were inoculated intradermally after skin scarification with an hypodermic needle. A viral suspension of ORFV IA-82 strain (108.5TCID50/mL) was inoculated in the internal face of the ear, back skin and labial commissure of rabbits; internal face of the ear of mice. Lambs were inoculated in the labial commissures and in the internal face of hind limbs. All animals were monitored clinically, virologically, and pathologically for 21 days. All rabbits developed clinical signs in the inoculation sites, begining with mild hyperemia that evolved to macules, papules, vesicle, pustules and scabs. Lesions appeared at days 3 and 4 post-inoculation (pi) and lasted to 3 to 10 days. Viral shedding was detected from days 2 to 14pi. Histological examination of lesions revealed focal proliferative dermatitis with ballooning degeneration and eosinophilic intracytoplasmic inclusions in keratinocytes, histological hallmarks of contagious ecthyma in sheep. A similar, albeit much milder clinical course was observed in 5 out of 10 inoculated mice. All lambs presented characteristic contagious ecthyma clinical and histopathologycal lesions from days 3 to 18pi, and the virus was recovered from lesions between days 2 and 19pi. At day 28pi, seroneutralization test (SN) was unable to detect neutralizing antibodies in all inoculated animals. These findings show that ORFV replicates and produce local lesions in rabbits and mice. However, rabbits are more susceptible to infection and disease, and may be used as an animal model to study some aspects of ORFV pathogenesis. / O ectima contagioso (ou orf) é uma doença infecto-contagiosa de pele que afeta principalmente ovinos e caprinos, e que ocasionalmente pode acometer o homem. O seu agente etiológico é o vírus da orf (ORFV). O ORFV produz lesões proliferativas, geralmente na comissura labial e no plano naso-labial de cordeiros, e também na pele do úbere, nos tetos e no rodete coronário dos cascos de animais adultos. A patogenia da infecção pelo ORFV é pouco conhecida, embora a doença já tenha sido reproduzida em ovinos, caprinos e coelhos. Essa dissertação relata os achados clínicos, virológicos e histopatológicos da infecção experimental de coelhos e camundongos pelo ORFV. Para isso, coelhos, camundongos e cordeiros foram inoculados pela via intradérmica (ID), após escarificação da pele com agulha hipodérmica. A inoculação dos cordeiros serviu como controle positivo. Uma suspensão viral da cepa IA-82 do ORFV (108,5DICC50/mL) foi inoculada na face interna da orelha, na pele do dorso e na comissura labial dos coelhos; na face interna da orelha dos camundongos; e na comissura labial e face interna do membro pélvico dos cordeiros. Os animais foram monitorados por 21 dias nos aspectos clínicos, virológicos e patológicos. Todos os coelhos inoculados apresentaram lesões semelhantes nos locais de inoculação, iniciando com hiperemia, evoluindo para máculas, pápulas, vesículas, pústulas e crostas. Os sinais surgiram 3 a 4 dias pós inoculação (pi) e duraram por 3 a 10 dias. Excreção viral foi detectada entre os dias 2 e 14pi. A análise histológica das lesões revelou dermatite focal proliferativa, com degeneração balonosa e corpúsculos de inclusão intracitoplasmáticos eosinofílicos nos queratinócitos, semelhante às alterações histológicas observadas nos cordeiros. Lesões similares, mas de menor intensidade foram observadas em 5 de 10 camundongos. Os cordeiros, utilizados como controles positivos, apresentaram lesões clínicas e histopatológicas características de ectima contagioso entre os dias 3 e 18pi, sendo que o vírus foi recuperado das lesões entre os dias 2 e 19dpi. No dia 28pi, pelo teste de soroneutralização (SN), não foram detectados anticorpos neutralizantes no soro dos animais inoculados. Esses resultados demonstram que a inoculação de ORFV resulta em replicação viral e produção de lesões em coelhos e camundongos, porém a doença é reproduzida de forma mais consistente em coelhos. Portanto, sugere-se que coelhos possam ser utilizados como modelos para estudos in vivo com o ORFV.