Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-11-06Bitstream added on 2014-06-13T19:12:06Z : No. of bitstreams: 1 cunha_rm_me_botib.pdf: 829808 bytes, checksum: 0d58883f9479527d834af5abe27ce09a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os acidentes botrópicos representam cerca de 87% dos envenenamentos ofídicos registrados no Brasil e se destacam pelas graves seqüelas que limitam a vida do acidentado. O principal efeito tóxico local destes é a mionecrose, que pode levar à perda tecidual permanente e à amputação. A mionecrose pode ser decorrente da isquemia do tecido muscular, causada por fatores hemorrágicos presentes nestes venenos (metaloproteases), ou da presença de miotoxinas (PLA2s) que afetam diretamente o tecido muscular. O método mais eficaz para o tratamento dos envenenamentos ofídicos é a soroterapia passiva. No entanto, esta é limitada devido à relativa ineficácia do soro em neutralizar a mionecrose dos venenos botrópicos, além de muitas comunidades não terem acesso à soroterapia. Estes fatores conduzem a busca de métodos alternativos, como o uso de extratos vegetais. Evidências mostram que o extrato aquoso da Casearia sylvestris, conhecida popularmente como “guaçatonga, é capaz de neutralizar efeitos tóxicos de venenos brutos e de suas miotoxinas isoladas. A Casearia sylvestris apresenta diversos outros efeitos terapêuticos como: anti-séptico, antiinflamatório, anestésico local, anti-tumoral, anti-úlcera e cicatrizante. Devido à escassez de estudos experimentais para avaliar a eficácia de extratos vegetais na redução dos danos locais ocasionados pelo envenenamento botrópico, torna-se importante avaliar a potencial atividade antiofídica da Casearia sylvestris. O presente estudo teve por objetivo investigar o uso do extrato aquoso da Casearia sylvestris, como terapêutica tópica dos efeitos locais do envenenamento botrópico experimental em camundongos. Foi avaliada a capacidade do extrato bruto da planta em neutralizar a mionecrose induzida pelo veneno da Bothrops jararacussu e/ou acelerar o processo de regeneração... / Bothrops accidents represent about 87% of snakebites recorded in Brazil and account for serious the consequences that affect the life of the victim with social and economic repercussions. Its main toxic effect is myonecrosis, which can lead to permanent tissue loss and amputation. Myonecrosis may result from muscle tissue ischemia, hemorrhage caused by factors present in these venoms (metalloproteases), or the presence of myotoxins (PLA2s) that directly affect muscle tissue. The most effective treatment is passive serotherapy. However, this is limited due the relative ineffectiveness of the serum to neutralize the myonecrosis of Bothrops venoms and the lack of access to serotherapy by many communities. These factors lead to alternative methods such as the use of plant extracts. Evidence shows that the aqueous extract of Casearia sylvestris, known popularly as guaçatonga, is able to neutralize the toxic effects of venom and their crude myotoxins isolated. Casearia sylvestris presents several other therapeutic effects such as, antiseptic, antiinflammatory, local anesthetic, anti-tumor, anti-ulcer and wound healing. Due to the scarcity of experimental studies to evaluate the efficacy of plant extracts in reducing the harm caused by Bothrops envenomation, it is important to evaluate the potential activity of antiophidic Casearia sylvestris as a complement to conventional serum therapy. The present study aimed to investigate the use of aqueous extract of Casearia sylvestris, topical therapy as complementary to local effects of Bothrops envenomation in experimental mice. We evaluated the ability of the crude extract of the plant to neutralize myonecrosis induced by the venom of Bothrops jararacussu and / or accelerate the process of muscle regeneration. The onset of myonecrosis and the regenerative process... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-01-26T13:30:40Z : No. of bitstreams: 1 000793388.pdf: 1066055 bytes, checksum: 044f31f69403fcf74fb56af93e6c86b7 (MD5) / A leishmaniose visceral americana, causada pelo parasita intracelular Leishmania (L) infantum chagasi, é transmitida pela picada do mosquito Lutzomyia longipalpis. O tratamento é realizado à base de quimioterápicos clássicos, que desenvolvem importantes efeitos colaterais no hospedeiro. A prospecção de novas drogas é o grande desafio mundial do momento. Assim, este estudo realizado in vitro teve por objetivos avaliar o efeito anti-leishmania de frações do veneno de Crotalus durissus terrificus sobre as formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi. Do veneno total foram extraídas e purificadas duas frações denominadas respectivamente de fosfolipase A2 (PLA2) e peptídica. Além disso, formas promastigotas e macrófagos infectados por amastigotas foram expostos a uma diluição seriada de PLA2 e da fração peptídica em intervalos que variaram entre 1,5625 μg/mL e 200 μg/mL. Ambas demonstraram atividade contra as formas promastigotas de Leishmania (L.) infantum chagasi variando de acordo com as doses testadas e o tempo de incubação. O ensaio MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) das frações contra as formas promastigotas mostrou IC50 de 52,07 μg /mL para a PLA2, e uma IC50 de 16,98 μg/mL para a fração peptídica. O ensaio MTT para se avaliar a citotoxicidade nos macrófagos peritoneais mostrou uma IC50 de 98 μg/mL para PLA2 e uma IC50 16,98 μg/mL para a fração peptídica. Nos macrófagos peritoneais infectados pelas formas amastigotas de Leishmania (L) infantum chagasi a PLA2 estimulou o crescimento dos parasitas; em doses mais elevadas foi capaz de controlar em 23% o seu crescimento. A fração peptídica controlou 43% do crescimento do parasita intracelular na dose de 16,98 μg/mL., mostrando-se tóxica acima desta doe para os macrófagos. Ambas as frações estimularam a produção de H2O2 pelos macrófagos, mas apenas PLA2 foi capaz de estimular a produção ... / American visceral leishmaniasis is caused by the intracellular parasite Leishmania ( L ) infantum chagasi , and transmitted by sand fly Lutzomyia longipalpis. Treatment is based on classical chemotherapeutics with significant side effects and the search for new drugs is the greatest global challenge. Thus , this in vitro study aimed to evaluate the anti - leishmanicidal effect of Crotalus durissus terrificus venom’s fractions on promastigotes and amastigotes of Leishmania (L) infantum chagasi. The whole venom were purified two fractions called respectively phospholipase A2 (PLA2) and peptide. Furthermore, promastigotes and macrophage infected per amastigotes were exposed to serial dilutions of the peptide fraction and PLA2 at intervals varying between 1.5625 μg/mL and 200 μg/mL. Both showed activity against promastigotes and varies according to the tested doses and the time of incubation. The MTT assay (3-(4,5-Dimethyl-1,3- thiazol-2-yl)-3,5-diphenyl-2H-tetrazol-3-ium bromide) against promastigotes showed IC50 of 52.07 μg/mL to PLA2, and 16.98 μg/mL for peptide venom’s fraction. The MTT assay to evaluate the cytotoxicity in peritoneal macrophages showed an IC50 of 98 μg/mL for PLA2 and 16.98 μg/ml for peptide. In peritoneal macrophages infected by Leishmania (L) infantum chagasi amastigotes the PLA2 stimulated growth of parasites, at higher doses was able to control 23 % growth. The peptide fraction controlled 43 % of the intracellular parasite growth at a dose of 16.98 μg/mL, showing up this dose toxic to macrophages . Both fractions stimulated H2O2 production by macrophages but only PLA2 was able to stimulate NO production . The results encourage further studies to describe the metabolic pathways involved in cell death , as well as the prospect of molecules with antiparasitic activity present in the peptide fraction of Crotalus durissus terrificus

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-28Bitstream added on 2014-06-13T19:51:39Z : No. of bitstreams: 1 lourencojunior_a_me_botfm.pdf: 1329256 bytes, checksum: 4e8b2e54b89603c559c64dfee4a7c8a2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) é constituído pelas toxinas: Crotoxina, Crotamina, Giroxina e Convulxina. A crotamina possui ação miotóxica, sendo que esta toxina pode ser expressa ou não por animais de uma mesma região. Variações bioquímicas, enzimáticas e farmacológicas dos venenos, podem estar associadas a fatores geográficos, clima, sexo, idade, dieta, bem como tempo decorrido de cativeiro e entre extrações. Esta pesquisa teve como objetivo caracterizar o veneno de C.d.t, da micro-região de Botucatu (São Paulo) pela determinação de suas propriedades bioquímicas, farmacológicas e enzimáticas. Para isto, foi realizada a comparação de venenos de serpentes recém capturadas da natureza com o de cativeiro, para verificar a influência da variação sexual, ambiental (tempo de cativeiro) e ontogenética na sua composição. Foram utilizadas técnicas de dosagem protéica, eletroforese (SDS-PAGE), perfil cromatográfico (HPLC-RP), atividade coagulante e índice de coagulação, atividade proteolítica sobre a caseína, tóxica(DL50) e atividade da crotamina. As atividades das 93 amostras de veneno foram comparadas com as do Veneno Referência Nacional. A dosagem protéica não evidenciou variação entre os grupos formados por adultos (75%), mas mostrou diferença quando comparada a do grupo de filhotes (60%). A análise eletroforética (SDS-PAGE 15%) evidenciou que a variação da presença da crotamina não teve relação com a distribuição dos grupos, sendo que 65% das amostras foram crotaminanegativa. O perfil cromatográfico corroborou os resultados da eletroforese, a respeito da variação da crotamina, mostrando grandes variações nas concentrações das proteínas, além de evidenciar grande quantidade de isoformas de crotoxina. Na caracterização coagulante dos venenos, não houve variação entre os grupos formados por adultos... / Crotalus durissus terrificus (C.d.t.) venom is composed by the following toxins: crotoxin, crotamine, gyroxin and convulxin. Crotamine possess a myotoxic action that can be expressed or not by snakes from the same region. Biochemical, enzymatic and pharmacological variations of venoms may be associated with geographic factors, climate, gender, age, and diet as well as length of captivity and venom extractions. The present study was carried out in order to characterize the C.d.t. venom of Botucatu micro-region, São Paulo State, by defining its biochemical, pharmacological and enzymatic properties. A comparative characterization of venoms from newly captured snakes and already-captured animals was performed to verify the sexual, environmental (length of captivity) and ontogenetic variations that influence the venom composition. Protein concentration, electrophoresis (SDS-PAGE), chromatographic profile (RPHPLC), coagulant activity and coagulation index, proteolytic activity upon casein, toxic (LD50) and crotamine activity were employed. The venom activities of 93 samples were compared with the National Reference Venom. Protein concentrations did not evidence a variation among the groups of adults (75%), but revealed some difference when compared with newborn groups (60%). The electrophoresis analysis (SDS-PAGE 15%) presented a crotamine variation that had no relation with the distribution of groups, which showed that 65% of the samples were crotamine negative. The chromatographic profile confirmed the results of electrophoresis regarding crotamine variation, and also showed great variation in the protein concentration, besides revealing a high quantity of crotoxin isoforms. Concerning coagulant characterization, there was no variation among adult groups; however, the National Reference Venom and newborn groups presented higher coagulant activities. Toxic (LD 50) and proteolytic activicties... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-24T19:42:50Z No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-25T12:18:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-25T12:18:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_DanielOliveiraFreire.pdf: 1843339 bytes, checksum: 0c23e13ac289983a2324f079c4c1aab6 (MD5) / Nas últimas décadas, a busca por novos antimicrobianos tem despertado o interesse dos pesquisadores pelos Peptídeos Antimicrobianos (AMPs). Os AMPs apresentam em media de 10 a 100 resíduos de aminoácidos e, em geral, fazem parte do sistema de defesa inato dos organismos vertebrados e invertebrados ou de secreções, promovendo uma proteção contra uma variedade de microrganismos. Os AMPs por sua característica catiônica são atraídos pela superfície aniônica das membranas bacterianas, e após a interação, estes peptídeos sofrem mudanças conformacionais, causando uma pertubação na estrutura da bicamada lipídica. Atualmente, um número expressivo de estudos tem identificado da peçonha de vespas diversos peptídeos bioativos classificados por suas estruturas químicas e por suas atividades biológicas, em especial, as ações antimicrobianas. Synoeca surinama é uma vespa social que compõe um pequeno gênero com cinco espécies descritas: S. chalibea, S. virginea, S. surinama, S. septentrionalis e S. cyanea. Frente ao desafio do crescente número de cepas resitentes e à potencialidade dos peptídeos como precursores para a descoberta de novos fármacos antimicrobianos, este trabalho visou buscar novas alternativas para o tratamento de infecções bacterianas. Os ninhos da vespa S. surinama foram coletados na área de mata do Centro Olímpico da UnB (Universidade de Brasília). Para a separação dos constituintes da peçonha por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), a peçonha foi liofilizada e resssuspendida em água deionizada com 5% de acetonitrila e 0,1% de ácido trifluoracético. A avaliação da ação antimicrobiana foi realizada pela técnica de microdiluição em placas para determinação do MIC (Concentração Inibitória Mínima). Um peptídeo da classe dos mastoparanos foi isolado apresentando uma massa molecular de 1594,8 Da. O peptídeo foi sequenciado em por MALDI/TOF no modo linear refletido. A sequencia foi determinada como I/L-N-W-I/L-K-I/L-G-K-K-I/L-I/L-A-S-I/L-NH2. Trata-se de peptídeo inédito, pois não foi encontrado nos bancos de dados referências desta sequencia. O peptídeo foi, então, denominado Synoeca-MP e foi sintetizada pela AminoTech Pesquisa e Desenvolvimeto Ltda. O peptídeo Synoeca-MP foi testado contra 10 cepas ATCC nas doses: 62,5; 31,5; 15,6, 6,25; 3,12; 1,5 e 0,62 μM. O Synoeca-MP apresentou uma exelente ação antimicrobiana, para as doses testadas o MIC50 variou de 1,97 μM a 10,8 μM e o MIC90 variou de 1,24 μM a 17,8 μM. Os valores dos MICs foram calculados estatisticamente por regressões não-lineares sigmoidais. O EC50 calculado para a atividade hemolítica do peptídeo foi de 185μM, que representa 17 vezes a dose antimicrobiana efetiva mais alta realizada nos ensaios. Sendo assim, o Synoeca-MP pode ser considerado um promissor fármaco antimicrobiano. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In recent decades , the search for new antimicrobials has piqued the interest of researchers for Antimicrobial peptides ( AMPs ) . The AMPs have on average 10 to 100 amino acid residues and usually are part of the innate defense of vertebrate and invertebrate organisms or secretion system , providing a protection against a variety of microorganisms. The MPAs by its cationic character are attracted to the anionic surface of bacterial membranes , and after the interaction , these peptides undergo conformational changes , causing a disturbance in the structure of the lipid bilayer . Currently , a significant number of studies have identified the wasp venom of many bioactive peptides ranked by their chemical structures and their biological activities , in particular , the antimicrobial actions . Synoeca surinama is a social wasp which makes up a small genus with five species are described: S. chalibea , virginea , S. surinama , S. septentrionalis and S. cyanea . Forward to the challenge of the increasing number of seem quite resistant strains and potential of peptides as precursors for the discovery of new antimicrobial drugs , this work aims to seek new alternatives for the treatment of bacterial infections . Wasp Nests S. surinama were collected in the forested area of the Olympic Centre at UNB ( University of Brasilia ) . For the separation of the constituents of the venom by high performance liquid chromatography (HPLC ), the venom is lyophilized and resssuspendida in deionized water with 5% acetonitrile and 0.1% trifluoroacetic acid. The evaluation of the antimicrobial activity was performed by microdilution plates for determination of MIC ( Minimum Inhibitory Concentration ) . A class of peptide was isolated mastoparanos having a molecular mass of 1594.8 Da The peptide was sequenced by MALDI / TOF reflected in the linear mode. The sequence was determined as I/LNWI/LKI/LGKKI/LI/LASI/L-NH2 . This is unheard of peptide because it was not found in the data banks of references this sequence . The peptide was then called Synoeca - MP and was synthesized by Aminotech Research and Desenvolvimeto Ltda . The Synoeca - MP peptide was tested against 10 strains ATCC doses : 62.5 ; 31.5 ; 15.6, 6.25; 3.12; 1.5 and 0.62 mM . The Synoeca - MP presented an excellent antimicrobial activity for the MIC50 doses tested ranged from 1.97 mM to 10.8 mM and MIC90 ranged from 1.24 mM to 17.8 mM . The MIC values were calculated statistically by a sigmoidal non- linear regression. The EC50 calculated for the hemolytic activity of the peptide was 185μM , which is 17 times the highest effective dose antimicrobial held in rehearsals. Thus, the Synoeca -MP could be considered a promising antimicrobial drug .

A administração sistêmica da peçonha bruta da cascavel Sul-Americana (Crotalus durissus terrificus, Cdt) induz prejuízos de memória espacial em ratos, sugerindo a ocorrência de dano hipocampal. No presente estudo, foram utilizadas técnicas In vivo e In vitro, a fim de testar os potenciais efeitos centrais do veneno de Cdt e da crotoxina (CTX), principal neurotoxina componente da peçonha bruta da serpente. Foram investigados (1) efeitos comportamentais da administração sistêmica e intrahipocampal do veneno de Cdt e da CTX envolvendo diferentes versões do labirinto aquático de Morris; (2) a morte neuronal, o curso temporal e a ação protetora do soro anticrotálico à exposição de culturas organotípicas de hipocampo a doses crescentes (0,05-1 μg/mL) do veneno bruto de Cdt e de CTX, por meio da coloração fluorescente por Iodeto de propídeo (PI) (que reflete a morte neuronal); e (3) alguns dos possíveis mecanismos fisiopatológicos do envenenamento experimental em culturas de hipocampo utilizando o antagonista de receptores AMPA de glutamato, NBQX, à administração de 0,05 μg/mL do veneno bruto de Cdt, para avaliar a possível participação do glutamato e seus receptores na morte neuronal. A administração sistêmica e intrahipocampal do veneno bruto de cascavel em ratos promoveu marcados prejuízos de memória espacial de referência e operacional. Diferentemente, a CTX promoveu prejuízos comportamentais apenas quando a administração foi intrahipocampal. As culturas expostas ao veneno bruto apresentaram dano sobretudo nas células piramidais de CA1, enquanto as culturas incubadas com CTX não apresentaram danos. Essa seletividade em relação ao CA1 foi mais proeminente nas doses baixas. O soro anticrotálico preveniu a morte neuronal quando administrado até uma hora após a exposição do veneno. O NBQX preveniu parcialmente o dano em CA1 indicando a participação de receptores AMPA de glutamato na cascata de eventos que subjazem os danos a estas células causados pela peçonha bruta de Cdt. Estes achados podem contribuir para a tanto para elucidação dos mecanismos quanto para a conduta utilizada durante o envenenamento crotálico / Systemic administration of the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus, Cdt) venom in rats permanently disrupts performance in hippocampus-dependent spatial memory tasks, thus indicating the occurrence of damage to this brain area. In vivo and In vitro approaches were employed in the present study to investigate the effects of the venom and its main compound, crotoxin (CTX). We investigated (1) behavioral effects after both systemic and intrahipocampal administration of either venom or CTX in rats on performance in different versions of the Morris\' water maze task; (2) neuronal death, evaluated by the intensity of propidium iodide (PI) fluorescence (neurotoxicity of the venom and of CTX, and the protection by the antivenom, on organotypic hippocampal slice cultures, were evaluated by comparing slices exposed to venom and (1) slices treated only with vehicle - negative control - and (2) slices incubated with 1 mM glutamate - positive control for maximal neuronal death), and the time course of neurotoxic effects of 0.05-1 μg/mL of crude Cdt venom and CTX, and the Brazilian anticrotalid serum on organotypic hippocampal slice cultures; and (3) provide an initial screening of the mechanisms underlying the venom action on cultured hippocampal slices, using the AMPA receptor antagonist NBQX and the crude venom at 0.5 μg/mL dose, to test whether the neuronal damage is mediated by glutamate following the experimental envenomation. Both systemic and intrahippocampal administration of Cdt venom induces permanent disruption of spatial reference memory and spatial working memory in rats. In contrast, CTX only promoted behavioral effects when administered intrahippocampally. Slices exposed to Cdt venom, but not to CTX, exhibited substantial neuronal damage. This effect was particularly prominent in the CA1 sub-field at lower concentrations of the venom. The antivenom prevented damage when applied until 1 hour after the exposure of the venom. The NBQX partially prevented damage to CA1, thus indicating that AMPA receptors play a role in the damage caused by the Cdt venom. These findings may be helpful in the elucidation and management of rattlesnake envenomation

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5001.pdf: 2740278 bytes, checksum: 9d646e9df12b2864a43bac973517db51 (MD5) Previous issue date: 2013-02-25 / Universidade Federal de Sao Carlos / A serpente Lachesis muta rhombeata (Viperidae), popularmente conhecida como surucucu pico-de-jaca, é uma subespécie de Lachesis muta endêmica na Mata Atlântica brasileira, podendo ser encontrada do Ceará até o Rio de Janeiro. O gênero Lachesis apresenta uma peçonha complexa que engloba diferentes proteínas que possuem uma ampla variedade de atividades biológicas, como por exemplo, aquelas que afetam os fatores da coagulação sanguínea, agem na fibrinólise, provocam uma ação inflamatória no local da picada, e induzem um choque hipotensivo. Com o auxílio de técnicas proteômicas e de Bioinformática, este projeto teve como objetivo principal analisar o proteoma da peçonha de L. m. rhombeata, identificando as principais famílias proteicas presentes. Para isso, 200μg da peçonha desta serpente foram aplicados em géis bidimensionais-2D. As proteínas obtidas foram extraídas dos géis, tratadas, e posteriormente identificadas e analisadas por meio de espectrometria de massas (MALDI-TOF/TOF). Os arquivos brutos provenientes dessas análises foram aplicados no programa MASCOT utilizando para a identificação proteica o banco de dados SwissProt e como especificação taxonômica o banco de dados SNAKES contido no site do NCBI. Foram identificadas 11 famílias proteicas: PLA2s (37,93%), inibidores de proteases (22,41%), proteínas de sinalização intracelular (13,79%), NGFs (5,17%), metaloproteases (3,45%), fatores associados à DDB1 e CUL4 (3,45%), oxidorredutases (3,45%), proteínas de transdução de sinal (1,72%), componentes do complemento (1,72%), proteínas NipSnap (1,72%) e proteínas lin-7 (1,72%), das quais a grande maioria é de função metabólica e ajuda na difusão/entrada dos componentes tóxicos no organismo da vítima/presa. Cerca de 1-5mg da mesma peçonha também foram analisados por meio de FPLC e sequenciamento proteico e as proteínas obtidas foram identificadas por meio de busca no banco de dados nr (nonredundant protein sequences) do NCBI utilizando a ferramenta blast-p. As seguintes famílias proteicas foram encontradas: serinoproteases (30,03%), metaloproteases (24,17%), BPPs (19,64%), PLA2s (14,95%), lectinas tipo C (1,94%), LAAOs (1,40%) e metaloendopeptidases (0,73%), ressaltando a toxicidade da peçonha. Os dois resultados obtidos foram comparados com proteomas de outras serpentes do gênero Lachesis encontrados na literatura. Observou-se que há uma grande similaridade entre os proteomas das peçonhas deste gênero, mas que alguns componentes proteicos são diferenciais e assim, podem ajudar na taxonomia destas serpentes, mantendo-as em suas respectivas espécies e subespécies. Além disso, a peçonha também foi analisada por eletroforese unidimensional (SDS-PAGE) para avaliar se o espécime em estudo era um neonato, um juvenil ou um adulto. A presença de uma proteína similar à mutalisina II (metaloprotease) confirmou que a L. m. rhombeata utilizada neste estudo era uma adulta. O conhecimento do proteoma da peçonha de L. m. rhombeata auxiliará (1) os estudos envolvendo a Sistemática do gênero e (2) a produção de novos fármacos que poderão ser desenvolvidos para o tratamento de diversas doenças.

A resistência bacteriana à antibióticos tem se tornado um grave problema em saúde pública. Os mecanismos de resistência estão emergindo e sendo disseminados globalmente, devido às deficiências nas condições sanitárias e uso indiscriminado de antibióticos em humanos e animais. Escherichia coli e Staphylococcus aureus estão entre as bactérias mais presentes quando se trata de resistência a antimicrobianos. Infecções causadas por Leptospira interrogans possuem limitadas opções de tratamento e pouco se progrediu a cerca desta situação nos últimos anos. O Brasil possui uma fauna rica em espécies de serpente. Dentre as serpentes peçonhentas que causam a maior parte dos acidentes ofídicos no país encontram-se os gêneros Bothrops e Crotalus. As peçonhas desses animais possuem uma diversidade de bioativos com funções biológicas, bioquímicas e farmacológicas. Por isso, diversos estudos têm sido realizados com essas substâncias a fim de se desenvolver novos fármacos. Em meio às diversas funções já descobertas sobre os bioativos das peçonhas, o potencial antimicrobiano tem sido alvo de importantes pesquisas visto o cenário mundial de resistência bacteriana. / Bacterial resistance to antibiotics has become a serious problem in public health. Resistance mechanisms are emerging and being disseminated globally due to deficiencies in health conditions and the indiscriminate use of antibiotics in humans and animals. Escherichia coli and Staphylococcus aureus are among the most present bacteria when it comes to antimicrobial resistance. Leptospira interrogans infections have limited treatment options and little progress has been made about this in last years. Brazil has an rich ecosystem in snake species. Among the venomous snakes that cause most of the ophidian accidents in the country are the genera Bothrops and Crotalus. The venom of these animals has a diversity of bioactives with biological, biochemical and pharmacological functions. Therefore, several studies have been done with these substances to develop new drugs. Regarding the several functions already discovered about venom bioactives, the antimicrobial potential has been the object of important researchs, considering the world scenario of bacterial resistance. / Dissertação (Mestrado)

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Chapter II: In the present study, a metalloproteinase named BpMPI was isolated from Bothropoides pauloensis snake venom and its biochemical, enzymatic and immunochemical characteristics were determined. BpMPI was purified in two chromatography steps on ion exchange resins CM-Sepharose Fast flow and Sephacryl S-300. This protease was homogeneous on SDS-PAGE and showed a single chain polypeptide of 23 kDa under reducing conditions. The primary structure of the enzyme showed high similarity with other SVMPs enzymes from snake venoms. BpMPI showed proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at high temperatures. BpMPI was able to hidrolyse glandular and tecidual kallikrein substrates, but was unable to act upon factor Xa and plasmin substrates. The enzyme did not able to induce local hemorrhage in the dorsal region of mice even at high doses. Immunochemistry studies showed that BpMPI was high immunogenic and the antibodies anti-BpMP-I were very efficient to neutralize the hemorrhagic activity and systemic alterations induced by Bothropoides pauloensis snake venom. / Capítulo II: No presente estudo, uma metaloproteinase denominada BpMPI foi isolada da peçonha da serpente Bothropoides pauloensis e suas características bioquímicas, enzimáticas e imunoquímicas foram determinadas. BpMPI foi purificada utilizando dois passos cromatográficos em resinas de troca iônica CM-Sepharose Fast Flow e Sephacryl S-300. Esta protease mostrou-se homogênea em SDS-PAGE apresentando uma única cadeia polipeptídica de 23 kDa sob condições redutoras. A estrutura primária da enzima mostrou alta similaridade com outras enzimas SVMPs de venenos de serpentes. BpMPI mostrou atividade proteolítica sobre azocaseina e fibrinogênio bovino e foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina e β- mercaptoetanol. Além disso, esta enzima apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas. BpMPI também foi capaz de hidrolisar os substratos da calicreína glandular e tecidual, mas foi incapaz de hidrolisar os substratos do fator Xa e plasmina. A enzima não foi capaz de induzir hemorragia local na região dorsal de camundongos mesmo em altas doses. Estudos imunoquímicos demostraram que os anticorpos anti-BpMP-I foram eficientes em neutralizar a atividade hemorrágica e as alterações sistêmicas induzidas pela peçonha de Bothropoides pauloensis. / Mestre em Genética e Bioquímica

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: The snake venom is composed by a diversity of biomolecules with many actions on physiological processes. The serine peptidases are a group of proteases present in the constitution of the venom, capable of interfering on several points of hemostasis. Some serine peptidases has thrombin-like activity, what makes them targets on the development of therapeutics agentes on the treatment of many hemostatic disorders. In this study, a recombinant thrombin-like serine peptidase called rBpSP-II was obtained from the cDNA of the venom gland of the snake Bothrops pauloensis and biochemically characterized. The cDNA correspondent to rBpSP-II was cloned on the pPICZαA vector and inserted on the methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H for the heterologous expression. This enzyme showed single band when analised on SDS-PAGE with approximated molecular mass of 44,5 kDa under reducing conditions. The enzyme rBpSP-II showed clotting activity on bovine plasma and proteolytic activity on fibrinogen, cleaving exclusively the Aα chain. The evaluation of rBpSP-II activity on chromogenic substrates showed that the enzyme has thrombin-like activity due to its capacity to hydrolyze the thrombin substrate. / CAPÍTULO II: A peçonha de serpente é composta por uma diversidade de biomoléculas com inúmeras ações sobre os processos fisiológicos. As serinoproteases são um grupo de proteases presentes na constituição da peçonha, capazes de interferir em diversos pontos da hemostasia. Algumas serinoproteases possuem atividade semelhante à trombina, o que as tornam alvos de interesse no desenvolvimento de agentes terapêuticos no tratamento de desordens hemostáticas. Neste estudo, uma serinoprotease thrombin-like recombinante denominada rBpSP-II foi obtida a partir do cDNA da glândula da peçonha da serpente Bothrops pauloensis e caracterizada bioquimicamente. O cDNA correspondente à rBpSP-II foi clonado no vetor pPICZαA e inserido na levedura metilotrófica Pichia pastoris KM71H para a realização da expressão heteróloga. Esta enzima apresentou banda única quando analisada em SDS-PAGE com massa molecular aproximada de 44.5 kDa sob condições redutoras. A rBpSP-II apresentou atividade coagulante sobre plasma bovino e atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, clivando preferencialmente a cadeia Aα. A avaliação da atividade da rBpSP-II sobre substratos cromogênicos demonstrou que a enzima possui atividade thrombin-like devido a sua capacidade de hidrolisar o substrato da trombina. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica