Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'amylose réticulé (AR), obtenu suite à la reticulation de l'ami don à haute teneur en amylose par traitement à l'épichlorhydrine, a été introduit au début des années 1990 comme excipient pour la libération contrôlée de médicaments. Divers taux de reticulation de l'amylose peuvent être obtenus en variant le rapport épichlorhydrine / amylose. Les cinétiques de libération de médicaments à partir de comprimés d'AR, en fonction du taux de reticulation du polymère, de la force de compression et de la charge en principe actif ont été étudiés. L'analyse cinétique de la liberation ainsi que l'absence d'une transition polymérique de l'état vitreux à caoutchouteux suggéraient l'implication d'un mécanisme de libération autre que la seule diffusion du principe actif. Une hypothèse d'un mécanisme de libération reposant sur la pénétration de l'eau dans le comprimé provoquant le remplacement des liens amylose-amylose par de nouveaux liens eau-amylose capables de freiner la pénétration de l'eau et la diffusion du principe actif avait été émise. Ce travail constitue la suite logique du développement et de la caractérisation physico-chimique de l'AR utilisé comme excipient pour la préparation de formes à liberation contrôlée de médicaments. La libération de principes actifs peu solubles en milieu aqueux à partir d'une matrice d'AR peut parfois être trop lente et s'effectuer sur plusieurs jours. Pour ces médicaments, la vitesse de libération peut être accélérée en ajoutant une quantité déterminée d'a-amylase dans le mélange pulvérulent d'AR et de principe actif, avant d'effectuer la compression. Une augmentation du contenu en a-amylase dans les comprimés provoque une augmentation marquée de la vitesse de libération et une augmentation de la linéarité des profils de libération, alors que de fortes modifications de la concentration d'a-amylase dans le milieu de dissolution présentent moins d'effet. Pour des concentrations élevées d'a-amylase, l'hydrolyse enzymatique devient le processus prédominant du contrôle de la libération du principe actif. Les profils de libération témoignent de l'influence de deux mécanismes qui régissent le contrôle de libération: i) un gonflement du comprimé accompagné par une diffusion du principe actif et ii) une hydrolyse enzymatique provoquant une érosion du comprimé et une accélération du taux de libération. En-dehors de ses aptitudes pour contrôler la libération de principes actifs, l'AR possède des propriétés liantes et peut aussi devenir un agent de désagrégation. La dureté augmente avec le degré de reticulation jusqu'à un maximum de dureté pour le degré AR-15. Une plus grande proportion d'AR ainsi qu'une augmentation de la force de compression ont pour conséquence d'augmenter la dureté et de diminuer la friabilité des comprimés. La présence de 0.2 % de stéarate de magnésium dans les comprimés contenant de l'AR ne semble pas avoir d'effet sur la dureté et la friabilité. Une étude comparative des propriétés liantes de l'amylose réticulé (AR-8) et de l'amylopectine réticulée à 8 % semble démontrer qu'une augmentation de la teneur en amylose conduit directement à une augmentation de la dureté des comprimés. Les résultats des tests de désagrégation se sont révélés satisfaisants lorsque l'AR 15 est comparé à l'Avicel PH-102®. La vitesse d'absorption d'eau des comprimés augmente lorsque le taux de reticulation de l'amylose augmente suggérant que les propriétés de désagrégation de l'AR (taux de reticulation supérieur à 15 %) soient reliées à une pénétration rapide de l'eau dans les comprimés. La caractérisation de l'AR par analyse d'image a permis de démontrer qu'un gel se forme à la surface des comprimés à base d'amylose réticulé en moins de 10 minutes suivant l'immersion des comprimés dans l'eau. La formation du réseau de gel de la surface vers le centre du comprimé s'effectue progressivement pendant plusieurs heures jusqu'à ce qu'un équilibre de gonflement soit atteint (environ 72 heures). Quelque soit le taux de reticulation, les spectres RMN des comprimés d'amylose réticulé s'apparentent au spectre Va de l'amidon. Suivant l'immersion dans l'eau des comprimés à base d'amylose ayant un faible taux de reticulation, on assiste à la naissance progressive d'un spectre décrivant la forme cristalline de type B de l'amylose caractérisée par la formation de doubles hélices. La gélatinisation, la reticulation et le traitement de l'amidon à haute teneiu- en amylose modifient profondément l'organisation granulaire de l'amidon natif, comme en témoignent les profils de rayons X. Cette modification s'accentue avec l'augmentation du degré de reticulation suggérant que l'hélice simple de l'amylose subit une déformation tant et si bien que la structure devient complètement déformée pour des taux de reticulation très élevés. Les résultats obtenus en FT-IR sont en accord avec les résultats de diffraction de rayons X démontrant que pour les degrés faibles de reticulation, l'association intra- et inter-chaînes d'amylose est favorisée. L'ensemble des études de caractérisation par gonflement, par analyse d'image, par diffraction de rayons X, par FT-IR et par RMN démontrent que la propriété d'excipient pour la libération contrôlée vient, vraisemblablement,de l'habileté de l'amylose de former des gels compacts qui ne s'érodent pas. La gélification s'effectue suite à l'immersion des comprimés dans l'eau et à la transformation de la partie amorphe de l'amylose en une structure thermodynamiquement plus stable constituée d'hélices d'amylose aimelées et arrangées dans une superstructure de type B. La reticulation modérée de l'amidon à haute teneur en amylose implique aussi le greffage des molécules d'amylopectine au sein des longues sections de chaînes d'amylose permettant ainsi l'obtention d'un gel plus souple et élastique, tout en demeurant relativement résistant aux enzymes amylolytiques. L'augmentation excessive du taux de reticulation conduit à la déformation des hélices d'amylose, ce qui a comme conséquence l'inhibition de la réassociation de l'amylose se traduisant par l'augmentation des vitesses de libération des principes actifs. Les temps de libération sont maximaux pour les produits ayant un taux de reticulation modéré ; dans ce cas, les forces de réassociation des chaînes d'amylose seraient parfaitement équilibrées par la souplesse et élasticité du gel résultant de la reticulation impliquant les chaînes d'amylose et d'amylopectine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Le vieillissement de la population fait en sorte que la mortalité liée aux maladies cardiovasculaires et en particulier à la défaillance cardiaque est de plus en plus élevée. Bien que l'atteinte de la perfusion coronarienne soit reconnue comme un facteur favorisant l'apparition des déficits contractiles de la défaillance cardiaque, les mécanismes impliqués dans les dysfonctions coronariennes ont été peu étudiés. La connaissance de ces mécanismes est primordiale pour l'élaboration d'une thérapeutique adéquate permettant de traiter la maladie et d'améliorer la qualité de vie de ces patients. Des controverses existent quant à la contribution de la voie de l'endothéline-1 (ET-1) dans la défaillance cardiaque et son implication dans les déficits coronariens n'a pas été établie. Nous avons donc étudié l'action de l'ET-1 au niveau de la réactivité coronarienne et de la contractilité cardiaque dans un modèle d'insuffisance cardiaque chronique. Des cœurs de hamsters cardiomyopathiques (UM-X7.1) et des cœurs provenant de hamsters syriens normaux âgés de plus de 200 jours ont été utilisés. Les cœurs ont été isolés et perfusés à débit constant (5-10 ml/min) selon la méthode de Langendorff. La pression de perfusion coronarienne (PPC), la pression ventriculaire gauche développée et la fréquence cardiaque furent évaluées. Des courbes dose-réponse de la réactivité coronarienne à l'ET-1 ont été construites pour les cœurs normaux et défaillants. La sensibilité coronarienne à l'ET-1 est similaire pour les deux groupes (EC50) et la réponse maximale était identique. L'infusion du phosphoramidon, du BQ 788 (antagoniste des récepteurs ETB) ou du BQ 123 (antagoniste des récepteurs ETA) ne modifie pas la PPC. Ces observations suggèrent que l'ET-1 n'est pas impliquée dans l'expression des dysfonctions coronariennes observables dans ce modèle de défaillance cardiaque. L'infusion du BQ 788 ne modifie pas la réponse à l'ET-1 exogène, suggérant une implication peu importante des récepteurs ETB dans l'action vasoconstrictrice de l'ET-1. Par contre, la réponse vasoconstrictrice à l'ET-1 est complètement abolie par l'infusion du BQ 123 dans les cœurs normaux tandis que l'addition du BQ 788 est nécessaire pour abolir cette réponse dans les cœurs défaillants. Ces observations suggèrent une implication de l'activation des récepteurs ETB en présence d'un antagoniste des récepteurs ETA ou encore un déséquilibre entre l'activation des récepteurs ETB endothéliaux et musculaires lisses dans les cœurs défaillants. La diminution significative de la contractilité cardiaque observée avec l'utilisation du phosphoramidon et du BQ 123 révèle que l'ET-1 endogène participe au maintien de la contractilité cardiaque. Les récepteurs ETA seraient impliqués dans l'action inotrope de l'ET-1 alors que les récepteurs ETB ne semblent pas importants puisque l'infusion du BQ 788 n'a pas d'effet significatif sur la contractilité cardiaque. Nous suggérons que l'utilisation d'un inhibiteur de la synthèse de l'ET-1 ou d'un antagoniste des récepteurs ETA pourrait comporter un risque pour des patients dont la fonction cardiaque est altérée. Il semble impératif de développer de nouveaux antagonistes de l'ET-1 qui soient vasosélectifs et de la sorte garantir un usage sécuritaire chez ces patients.

En inhibant la formation de caillots dans le sang, les médicaments antiplaquettaires diminuent de façon importante le risque d’événements ischémiques aigus. Cependant, une sous-population de patients souffrant de maladie coronarienne présente une inhibition inadéquate de la fonction plaquettaire malgré la prise quotidienne d’acide acétylsalicylique (AAS). Le premier volet de cette thèse démontre qu’une régénération plaquettaire accélérée pourrait expliquer en partie la variabilité dans la persistance de l’effet antiplaquettaire de l’AAS chez certains sujets souffrant de maladie coronarienne. Ces données suggèrent qu’une augmentation de la fréquence d’administration d’AAS d’une à deux fois par jour pourrait être bénéfique chez ces sujets. Des méta-analyses ont suggéré qu’une réponse plaquettaire inadéquate à l’AAS pourrait augmenter le risque d’événements ischémiques récurrents. La nature rétrospective de ces analyses ne permet pas d’établir la causalité. Dans le deuxième volet de cette thèse, les résultats d’une étude prospective visant à comparer la pertinence clinique de 6 tests de fonction plaquettaire fréquemment utilisés pour évaluer la réponse plaquettaire à l’AAS est présentée. Les résultats démontrent qu’aucun des tests de fonction plaquettaire couramment employés ne prédit la survenue d’événements ischémiques aigus chez des patients souffrant de maladie coronarienne stable. Toutefois, la cessation de la prise d’AAS est un prédicteur important d’événements thrombotiques. La cessation de médicaments antiplaquettaires a souvent été associée à la survenue d’événements thrombotiques dans les jours suivant l’interruption. À savoir si la survenue de ces événements est attribuable uniquement au retrait d’un médicament protecteur ou plutôt à une sensibilisation plaquettaire, constitue un débat d’actualité. Dans le troisième volet de cette thèse, des données sont présentées démontrant que la cessation de clopidogrel après la période recommandée par les lignes directrices actuelles provoque une sensibilisation des plaquettes nouvellement formées aux stimuli plaquettaires physiologiques. Ces résultats encouragent la recherche sur différentes modalités pour atténuer le risque thrombotique accru chez ces patients souffrant de maladie coronarienne. En conclusion, cet ouvrage présente des études visant à identifier les sous-populations de patients qui sont plus à risque de complications cardiovasculaires récurrentes. Dans ce contexte, la personnalisation de traitement est une avenue thérapeutique prometteuse, où chaque patient pourra recevoir un traitement ciblé en fonction de ses besoins et de ses contre-indications. Ce changement de paradigme d’une thérapie empirique issue d’études de grande envergure sur des données populationnelles à une thérapie ajustée aux besoins individuels représente un vaste champ de recherche, où la majorité des découvertes sont à faire. / By inhibiting the formation of blood clots, antiplatelet drugs significantly reduce the risk of acute ischemic events. However, a subpopulation of patients suffering from coronary artery disease presents with an inadequate inhibition of platelet function despite taking acetylsalicylic acid (ASA) daily. The first part of this thesis demonstrates that accelerated platelet turnover could partly explain the variability in the persistence of the antiplatelet effect of ASA in some coronary artery disease patients. These results suggest that increasing the frequency of administration of ASA from once to twice daily may be beneficial in selected patients. Meta-analyses have suggested that an inadequate platelet response to ASA may increase the risk of recurrent ischemic events. The retrospective nature of these analyses forbids the inference of causality. In the second part of this thesis, the results of a prospective study comparing the clinical relevance of 6 platelet function tests commonly used to assess platelet response to ASA are presented. The results show that none of the commonly used platelet function tests predict the occurrence of acute ischemic events in stable coronary artery disease patients. However, discontinuation of ASA is an important predictor of thrombotic events. Discontinuation of antiplatelet drugs has often been associated with thrombotic events in the days following cessation. If the occurrence of these events is due solely to the withdrawal of a protective drug or rather platelet sensitization is a topic of some debate. In the third part of this thesis, data are presented demonstrating that clopidogrel discontinuation, after the period recommended by current guidelines, leads to sensitization of newly formed platelets to physiological platelet stimuli. These results encourage research on different ways to mitigate the increased risk of thrombosis in coronary artery disease patients scheduled to discontinue clopidogrel therapy. In conclusion, this dissertation presents studies aiming to identify subpopulations of patients who are at increased risk of recurrent cardiovascular events. In this context, the personalization of treatment is a promising therapeutic avenue, where each patient can receive a targeted therapy according to his needs and contraindications. This shift in paradigm from empirical therapy based on population data retrieved from large clinical studies to therapy tailored to individual needs opens a vast field of research, where the majority of discoveries remain to be made.

Les patients admis aux soins intensifs (SI) souffrent de comorbidités qui affectent leur pronostic. Deux problèmes sont potentiellement associés aux sédatifs et compliquent le séjour de 35 à 50% des malades : le délirium, un état confusionnel aigu; et le coma ‘iatrogénique’, une altération de la conscience induite pharmacologiquement. L’importance de l’association entre clinique et médicaments a un intérêt pour prévenir ces syndromes cliniques morbides. Nous voulions étudier le délirium et le coma iatrogénique, les doses administrées de midazolam et de fentanyl, leurs niveaux plasmatiques, les variantes génétiques de métabolisme et de transport et les facteurs inflammatoires et ce, chez 100 patients admis aux soins intensifs. Nos données soulignent l’importance des interactions médicamenteuses dans l’incidence du coma iatrogénique, et réfutent l’association entre les benzodiazépines et le délirium. Ces résultats clarifient la pathophysiologie du délirium, corroborent le manque d’association délirium-benzodiazépines avec un marqueur biologique, c.-à-d. les niveaux sériques, et ouvrent le débat quant aux agents les plus utiles pour traiter l’anxiété et le délirium. Finalement, plusieurs caractéristiques pharmacocinétiques des benzodiazépines administrées aux soins intensifs publiées récemment complètent les données de notre étude quant à la sédation en soins critiques. Un chapitre sur l’importance de la pharmacogénomique en soins intensifs et un débat publié quant au pro et con de l'utilisation des benzodiazépines aux SI, sont soumis en complément de l’étude clinique décrite ci-haut effectuée dans le cadre de cette maîtrise. / Critically ill patients suffer from co-morbid conditions that impact on their prognosis. Two problems complicate Intensive Care Unit (ICU) stay in 35-50% of patients and are potentially associated with sedatives: delirium, an acute confusional state, and 'iatrogenic' coma, when consciousness is altered pharmacologically. Establishing the association between these clinical syndromes and administering sedatives is key in planning effective prevention of these morbid complications. We studied iatrogenic delirium and coma in 100 ICU patients given midazolam and/or fentanyl, and tallied drug doses, measured plasma levels, genetic variations in metabolism and transport and inflammatory factors. Our data highlight the role drug-drug interactions play in iatrogenic coma, and refute the association between benzodiazepines and delirium. These results clarify the pathophysiology of delirium, corroborate the lack of delirium-benzodiazepine association with a benzodiazepine biological marker, i.e. serum levels, and open the debate as to which agents are useful for treating anxiety and delirium. Recent publications addressing benzodiazepine pharmacokinetics in critical care complement our data in the field of critical care sedation. A chapter on the importance of pharmacogenomics in intensive care, and a published pro-con debate as to benzodiazepine use in critical care are submitted in addition to the clinical study mentioned above as part of this master’s thesis.

En inhibant la formation de caillots dans le sang, les médicaments antiplaquettaires diminuent de façon importante le risque d’événements ischémiques aigus. Cependant, une sous-population de patients souffrant de maladie coronarienne présente une inhibition inadéquate de la fonction plaquettaire malgré la prise quotidienne d’acide acétylsalicylique (AAS). Le premier volet de cette thèse démontre qu’une régénération plaquettaire accélérée pourrait expliquer en partie la variabilité dans la persistance de l’effet antiplaquettaire de l’AAS chez certains sujets souffrant de maladie coronarienne. Ces données suggèrent qu’une augmentation de la fréquence d’administration d’AAS d’une à deux fois par jour pourrait être bénéfique chez ces sujets. Des méta-analyses ont suggéré qu’une réponse plaquettaire inadéquate à l’AAS pourrait augmenter le risque d’événements ischémiques récurrents. La nature rétrospective de ces analyses ne permet pas d’établir la causalité. Dans le deuxième volet de cette thèse, les résultats d’une étude prospective visant à comparer la pertinence clinique de 6 tests de fonction plaquettaire fréquemment utilisés pour évaluer la réponse plaquettaire à l’AAS est présentée. Les résultats démontrent qu’aucun des tests de fonction plaquettaire couramment employés ne prédit la survenue d’événements ischémiques aigus chez des patients souffrant de maladie coronarienne stable. Toutefois, la cessation de la prise d’AAS est un prédicteur important d’événements thrombotiques. La cessation de médicaments antiplaquettaires a souvent été associée à la survenue d’événements thrombotiques dans les jours suivant l’interruption. À savoir si la survenue de ces événements est attribuable uniquement au retrait d’un médicament protecteur ou plutôt à une sensibilisation plaquettaire, constitue un débat d’actualité. Dans le troisième volet de cette thèse, des données sont présentées démontrant que la cessation de clopidogrel après la période recommandée par les lignes directrices actuelles provoque une sensibilisation des plaquettes nouvellement formées aux stimuli plaquettaires physiologiques. Ces résultats encouragent la recherche sur différentes modalités pour atténuer le risque thrombotique accru chez ces patients souffrant de maladie coronarienne. En conclusion, cet ouvrage présente des études visant à identifier les sous-populations de patients qui sont plus à risque de complications cardiovasculaires récurrentes. Dans ce contexte, la personnalisation de traitement est une avenue thérapeutique prometteuse, où chaque patient pourra recevoir un traitement ciblé en fonction de ses besoins et de ses contre-indications. Ce changement de paradigme d’une thérapie empirique issue d’études de grande envergure sur des données populationnelles à une thérapie ajustée aux besoins individuels représente un vaste champ de recherche, où la majorité des découvertes sont à faire. / By inhibiting the formation of blood clots, antiplatelet drugs significantly reduce the risk of acute ischemic events. However, a subpopulation of patients suffering from coronary artery disease presents with an inadequate inhibition of platelet function despite taking acetylsalicylic acid (ASA) daily. The first part of this thesis demonstrates that accelerated platelet turnover could partly explain the variability in the persistence of the antiplatelet effect of ASA in some coronary artery disease patients. These results suggest that increasing the frequency of administration of ASA from once to twice daily may be beneficial in selected patients. Meta-analyses have suggested that an inadequate platelet response to ASA may increase the risk of recurrent ischemic events. The retrospective nature of these analyses forbids the inference of causality. In the second part of this thesis, the results of a prospective study comparing the clinical relevance of 6 platelet function tests commonly used to assess platelet response to ASA are presented. The results show that none of the commonly used platelet function tests predict the occurrence of acute ischemic events in stable coronary artery disease patients. However, discontinuation of ASA is an important predictor of thrombotic events. Discontinuation of antiplatelet drugs has often been associated with thrombotic events in the days following cessation. If the occurrence of these events is due solely to the withdrawal of a protective drug or rather platelet sensitization is a topic of some debate. In the third part of this thesis, data are presented demonstrating that clopidogrel discontinuation, after the period recommended by current guidelines, leads to sensitization of newly formed platelets to physiological platelet stimuli. These results encourage research on different ways to mitigate the increased risk of thrombosis in coronary artery disease patients scheduled to discontinue clopidogrel therapy. In conclusion, this dissertation presents studies aiming to identify subpopulations of patients who are at increased risk of recurrent cardiovascular events. In this context, the personalization of treatment is a promising therapeutic avenue, where each patient can receive a targeted therapy according to his needs and contraindications. This shift in paradigm from empirical therapy based on population data retrieved from large clinical studies to therapy tailored to individual needs opens a vast field of research, where the majority of discoveries remain to be made.

La digoxine est un cardiotonique largement employé pour contrôler les symptômes de l'insuffisance cardiaque et de la fibrillation auriculaire. Il est connu depuis les années 1980 que le métabolite principal de la digoxine, la dihydrodigoxine, est produit exclusivement par le microbiome intestinal (métabolisme de premier passage) et plus précisément la bactérie Eggerthella lenta. Aux États-Unis, c'est 14% des participants à une étude qui excrétaient 40% et plus de la dose sous la forme de ce métabolite rapidement éliminable et ayant perdu son affinité pour sa cible. De plus, chaque année, la digoxine est le médicament qui engendre le plus d'hospitalisations pour effets secondaires toxiques. Les effets secondaires très problématiques de la digoxine sont souvent déclenchés par l'ajout d'antibiotiques (surtout les macrolides) à la prescription de digoxine. La théorie explorée ici explique les évènements de toxicité chez les patients métabolisateurs. Ces derniers ont une dose quotidienne de maintien de digoxine plus élevée pour compenser l'action de la bactérie et, lorsque ces patients reçoivent un antibiotique pour une infection non reliée à leur condition cardiaque, l'arrêt du métabolisme par le microbiome engendre une augmentation de la biodisponibilité de la digoxine. Si la concentration plasmatique du médicament augmente trop, les effets secondaires peuvent aller jusqu'à causer la mort. Dans le présent projet, nous avons vérifié la sensibilité de E. lenta à deux antibiotiques de la famille des céphalosporines de seconde génération, in vivo et in vitro. Pour les 18 volontaires qui ont été exposés à 2x500mg de céfprozil durant une semaine, il y a une tendance à la baisse de l'abondance de la bactérie d'intérêt (par 58,3% par rapport au niveau initial), mais pas de significativité au niveau des tests statistiques. Pour les échantillons complets de microbiome fécal, mis en culture avec et sans antibiotiques, il y a une différence statistiquement significative avec une valeur-p de 0,0457, alors que la croissance de E. lenta a été impactée négativement par l'ajout de céfprozil au milieu de culture. Les résultats valident une prémisse importante pour la démonstration du rôle du microbiome dans la pharmacocinétique de la digoxine et la gestion clinique du médicament cardiotonique. / Digoxin is a widely used cardiotonic drug in the management of heart failure and atrial fibrillation. It has been known since the early 1980's that the main metabolite of digoxin, dihydrodigoxin, is synthesized by the gut microbiome during first pass metabolism and is exclusively produced by the bacteria Eggerthella lenta. In a clinical study done in the U.S.A., there were 14% of high metabolizers, for whom over 40% of the oral digoxin dose is transformed to the inactive metabolite and rapidly eliminated. Digoxin toxicity is the leading cause of hospitalization from medication's secondary effects. The toxicity events are often associated with the addition of an antibiotic (mostly from the macrolides class) to the patient's drugs regiments. The theory explored in this project could help explain the toxicity events in metabolizers. These patients have a higher daily digoxin maintenance dose to counteract the effects of the microbiome and are then prescribed antibiotics for an infection unrelated to their heart condition. The antibiotic alters E. lenta negatively, which cannot metabolize digoxin anymore and therefore augments the bioavailability of the cardiotonic. If the plasmatic concentration reaches dangerous levels (over 2ng/ml of plasma), the patients face adverse effects that include death. In the present project, we evaluated the susceptibility of E. lenta to two second generation cephalosporins, in vivo and in vitro. With the 18 healthy volunteers that were exposed to 2x500mg of cefprozil daily for 7 days, we observed a diminution of the abundance of the bacteria of interest by 58,3% from the initial levels. This change did not however produce statistically significant tests results. For the complete fecal microbiome that were cultivated in vitro, with or without cefprozil, the difference between the two conditions resulted in a statistically significant p-value of 0.0457, confirming the sensitivity of E. lenta to this cephalosporin. These results validate an important premise for the demonstration of the importance of the gut microbiome in the pharmacokinetics of digoxin and the clinical management of the drug to avoid toxicity events in clinical practice.

La découverte de médicaments en oncologie repose encore majoritairement sur les criblages pharmacologiques à haut débit. Cependant, les modèles traditionnels de culture cellulaire en deux dimensions (2D) ne reflètent pas les conditions physiopathologiques des tumeurs solides in situ. Au laboratoire, notre hypothèse est que le manque de représentativité des cellules en culture 2D par rapport aux tumeurs in situ lors des essais de criblage pharmacologique in vitro est responsable du faible taux de succès des petites molécules lors d’essais cliniques. Pour pallier ce problème, nous avons développé une méthode de culture à long-terme en trois dimensions (3D) avec des cellules d’adénocarcinome du poumon qui permet le maintien des cellules en sphéroïdes jusqu’à 38 jours. Les cellules s’adaptent rapidement à la culture 3D en diminuant leur taille et en ralentissant significativement leur métabolisme. Au niveau épigénétique, l’expression du complexe KAT3A/KAT3B et de BRG1 est significativement diminuée, et ce de manière temps-dépendante. À l’inverse, l’expression de HDAC6 est augmentée lors du passage en 3D. Finalement, nous avons vérifié si les changements épigénétiques induits par la culture 3D influençaient significativement la réponse aux médicaments. Ainsi, nous avons traité les cellules en 2D et après 10 ou 24 jours en 3D avec une pharmacothèque de 154 médicaments épigénétiques. 60% des médicaments ont démontré une activité anticancéreuse significative sur les cellules en 2D, contrairement à 9% sur les sphéroïdes de 10 jours. Avec les sphéroïdes de 24 jours, uniquement 1 médicament, le MS023, un inhibiteur des arginines méthyltransférases (PRMT) de type I, a été efficace. L’augmentation de la sensibilité au MS023 concorde avec une augmentation de la méthylation des arginines dans les sphéroïdes. En conclusion, mon projet démontre que la culture 3D modifie l’épigénome des cellules cancéreuses du poumon de manière temps-dépendant et que ces changements sensibilisent les cellules à une inhibition des PRMT de type I. L’étude des sphéroïdes nous permet d’améliorer notre compréhension de la biologie tumorale et des processus de découverte de médicaments ce qui pourrait pallier le faible taux de succès associé aux modèles 2D classique. / Small molecule development in oncology mainly involves high-throughput drug screenings and preclinical validation studies using cancer cells grown in two-dimension (2D). However, classical cell culture methods poorly reflect tumor biology and cell epigenome. Here, our objective is to develop a 3D model that displays key epigenetic features of solid tumors in order to identify new actionable targets. First, we determined culture conditions for long-term expansion of adenocarcinoma spheroids to allow cell adaptation and the occurrence of specific epigenetic features triggered by 3D condition. Our results demonstrate that cells cultivated in 3D spheroids exhibit significant phenotypic and epigenetic changes as compared to 2D monolayers. Notably, we observed numerous expression changes of key epigenetic regulators, all taken place at a different time-point of the 3D cell culture. We observed a decrease in the expression of the KAT3A/KAT3B complex as well as BRG1. HDAC6 expression also increased in 3D. Then, we asked whether epigenetic changes triggered by 3D culture would modify drug sensitivity. We performed a screening of 154 epigenetic drugs on cancer cells cultivated in 2D and in 3D at two different time points. 60% of epigenetic drugs showed significant anticancer activity against 2D monolayers. Interestingly, A549 cells in 3D spheroids became gradually resistant over time. Against 3D spheroids cultivated for 10 days, only 9% of epigenetic drugs in the drug library showed anticancer activity. Against 3D spheroids cultivated for 24 days, only a single epigenetic compound called MS023, a selective agent against type I PRMTs, reduced cell viability significantly. This sensitivity is correlated with an increase of arginine methylation observed within spheroids. Taken together, we show that 3D spheroids trigger a time-dependent epigenetic context that increases lung cancer cells sensitivity to type I PRMT inhibition. 3D spheroids of well-characterized cancer cell lines will improve our understanding of tumor biology and drug discovery and can overcome the high false discovery rate associated with 2D classical models.

Le neuroblastome pédiatrique à haut risque est incurable malgré l’intensification des traitements. Chez le patient, les cellules de neuroblastome échappent à l’activité anticancéreuse des cellules immunitaires Natural Killer (NK). Or, lorsque cultivées in vitro en monocouche (2D), les cellules de neuroblastomes redeviennent sensibles à l’activité cytotoxique des cellules NK ce qui ne reflètent pas leur résistance dans les tumeurs in situ. Nous faisons l'hypothèse que lorsque cultivées en 3D sous forme de sphéroïdes, les cellules de neuroblastome pourraient retrouver certaines caractéristiques qui les rendraient plus représentatives des tumeurs in situ au niveau immunologique. Ainsi, un tel modèle préclinique pourrait mieux refléter la résistance aux cellules NK et servir de modèle de criblage pour la découverte de médicaments potentialisant la cytotoxicité des cellules NK. Pour répondre à cette question, nous avons développé un système de culture cellulaire 3D utilisant plusieurs lignées cellulaires de neuroblastome. À ce système, une co-culture en 3D avec une lignée de cellules Natural Killer (NK92) a été mise en place. Nous avons mis en évidence que les sphéroïdes de neuroblastome présentent des changements d’expression de certains gènes qui sont retrouvées chez les patients ainsi qu’une plus grande résistance à l’activité cytotoxique des cellules NK92 en comparaison avec les lignées en monocouche. Les co cultures de sphéroïdes ont été exposées à des inhibiteurs de protéines impliquées à différents niveaux de l’épigénome afin de découvrir des médicaments qui sensibiliseraient les cellules de neuroblastome à l’activité cytotoxique des NK92. Une différence dans la sensibilité aux médicaments entre les sphéroïdes et les cellules en 2D ainsi qu’en monoculture ou en co-culture a été observée et certains composés ont été identifiés en vue de potentialiser l’activité des cellules NK92. Ainsi, nos études ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la résistance des cellules du neuroblastome à l’activité cytotoxique des cellules NK dans un modèle plus représentatif de la tumeur in situ. / High-risk pediatric neuroblastoma remains incurable despite intensified treatments. In patients, neuroblastoma cells evade the anti-cancer activity of Natural Killer (NK) immune cells. However, when cultured in vitro in a monolayer (2D), neuroblastoma cells become sensitive to the cytotoxic activity of NK cells, which does not reflect their resistance in tumors in situ. We hypothesize that when cultured in 3D in the form of spheroids, neuroblastoma cells could regain certain characteristics that would make them representative of tumors in situ at the immunological level. Thus, such a preclinical model could better reflect NK cell resistance and serve as a screening model for drug discovery to discover a treatment that can potentiate NK cell cytotoxicity. To answer this question, we developed a 3D cell culture system using several neuroblastoma cell lines. To this system, a 3D coculture model with a Natural Killer (NK92) cell line was set up. We have shown that neuroblastoma spheroids develop changes in the expression of certain genes that are found in patients as well as greater resistance to NK92 cells compared to monolayer cell lines. Spheroid cocultures were exposed to inhibitors of proteins involved at different levels of the epigenome to discover drugs that would sensitize neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK92. A difference in drug sensitivity between spheroids and cells in 2D as well as in monoculture or coculture was observed and some compounds were identified to potentiate the activity of NK92 cells. Thus, our studies have provided a better understanding of the mechanisms involved in the resistance of neuroblastoma cells to the cytotoxic activity of NK cells in a more representative model of the tumor in situ.

La dopamine est un neurotransmetteur important dans le fonctionnement des ganglions de la base, région du cerveau impliquée dans la fonction motrice et l’apprentissage. Un dérèglement de la dynamique de la dopamine peut être à l’origine de différentes pathologies neurologiques, telles que la maladie de Parkinson et le trouble de déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH). La lévodopa, un précurseur de la dopamine, est utilisée pour réduire les symptômes associés à la maladie de Parkinson, sans action directe sur ses causes. La lévodopa est très efficace au début de la maladie, mais la durée de son effet ainsi que son index thérapeutique diminuent avec la progression de la dénervation induite par la maladie. Ces changements compliquent considérablement l’optimisation des régimes posologiques. Le méthylphénidate, quant à lui, est administré pour réduire les symptômes du TDAH et agit entre autres en bloquant la recapture de la dopamine. Bien que les données confirment une certaine implication de la dopamine dans le TDAH, son étiologie exacte demeure inconnue. Peu d’études ont cerné l’effet de la lévodopa sur le système dopaminergique des ganglions de la base et son évolution avec la progression de la maladie. Aussi, bien que le TDAH ait suscité beaucoup d’intérêt, rares sont les études quantitatives de nature mécanistiques sur le sujet. L’approche de modélisation mathématique utilisée dans cette thèse s’inscrit dans un effort global visant l’optimisation de la lévodopa et du méthylphénidate, appuyé par l’élucidation des mécanismes impliqués dans la maladie de Parkinson et dans le TDAH. En adoptant une approche de pharmacologie quantitative des systèmes (QSP), nous avons développé un modèle intégratif du système dopaminergique des ganglions de la base, avec l’objectif d’élucider les mécanismes impliqués, d’évaluer l’impact de la dopamine chez dessujets souffrant de Parkinson ou de TDAH, et recevant ou non un traitement, et enfin de guider objectivement l’exercice d’optimisation des régimes posologiques. À notre connaissance, c’est le premier cadre unificateur de modélisation qui s’adresse à ces deux pathologies. Le modèle développé dans cette thèse est composé de trois sous-modèles : le premier décrit la pharmacocinétique du médicament concerné, soit la lévodopa ou le méthylphénidate ; le deuxième exprime mathématiquement les différents mécanismes impliqués dans la dynamique de la dopamine ; le troisième représente la complexité de la neurotransmission dans les ganglions de la base. Avec des adaptations appropriées, nous avons appliqué ce même modèle au contexte de la maladie de Parkinson et au TDAH, ainsi qu’à leurs thérapies respectives. Pour représenter physiologiquement la maladie de Parkinson, nous avons intégré dans le modèle l’évolution de la perte neuronale ainsi que les différents mécanismes de compensation qui en résultent. La fréquence de tapotement des doigts est utilisée comme mesure clinique de la bradykinésie, définie comme le ralentissement des mouvements chez les patients parkinsoniens. Le modèle développé se base sur les connaissances actuelles de la pathophysiologie et pharmacologie du Parkinson, assurant ainsi sa validité en comparaison à des observations expérimentales et cliniques. Ensuite, à l’aide de ce modèle, les relations non-linéaires entre la concentration plasmatique de lévodopa, la concentration en dopamine dans le cerveau et la réponse à une tâche motrice sont étudiées. Le rétrécissement de l’index thérapeutique de la lévodopa au cours de la progression de la maladie dû à ces non-linéarités est investigué. Enfin, pour assurer l’aspect translationnel de notre approche, nous avons développé une application web à laquelle ce modèle a été intégré. Cette application sert de preuve de concept à un outil facilitant l’optimisation et l’individualisation des régimes posologiques. Pour l’étude du TDAH, nous avons adapté le modèle du système dopaminergique en y intégrant la libération tonique et phasique de la dopamine, cette dernière se produisant durant une tâche d’apprentissage par renforcement. Des individus virtuels ont été créés avec et sans déséquilibre du ratio tonique/phasique de la dopamine. En simulant une tâche de réponse à des stimuli dans un contexte de déséquilibre de la dopamine, le modèle nous a permis d’observer des symptômes similiaires à ceux de patients réels souffrant de TDAH. Finalement, la réponse au méthylphénidate résultant de l’inhibition de la recapture de la dopamine, à travers différents scénarios d’apprentissage a aussi été étudiée. Le développement d’une métrique nous a permis de différencier les répondants des non-répondants, et ainsi de mettre en évidence l’implication possible d’un apprentissage excessif chez les nonrépondants. Une meilleure compréhension de la réponse au méthylphénidate permettrait d’éviter la surmédication chez les non-répondants et d’aider les cliniciens dans leur pratique. Malgré la complexité du système dopaminergique et des traitements associés, cette thèse est un pas en avant dans la compréhension des mécanismes sous-jacents et de leur implication dans la thérapie. Ces avancées ont été réalisées en adoptant une approche de pharmacologie quantitative des systèmes, associée à une modélisation neurocomputationnelle du domaine du génie électrique, et complétée par un aspect de transfert au chevet du patient. Ce n’est qu’en transcendant ainsi les frontières disciplinaires qu’une visée aussi globale et intégrative est possible, afin de faire face aux défis multidimensionnels du système de la santé. / Dopamine is an important neurotransmitter of the basal ganglia, a region of the brain involved in motor function and learning. Disruption of dopamine dynamics can cause various neurological conditions, such as Parkinson’s disease and attention deficit hyperactivity disorder (ADHD). Levodopa, a dopamine precursor, is used to reduce the symptoms associated with Parkinson’s disease, without directly alleviating its causes. Levodopa is very effective in the early stages of the disease, but its effect duration along with its therapeutic index decrease with disease-induced denervation. These modifications further challenge determination of optimal dosing regimens of levodopa. In the case of ADHD, methylphenidate is administered to reduce its symptoms by, among other things, blocking dopamine recapture. Although evidence supports involvement of dopamine in ADHD, its exact etiology remains unknown. Few studies have investigated the effect of levodopa on the basal ganglia dopaminergic system and how it evolves with disease progression. Also, although ADHD has received a lot of interest, few quantitative studies of a mechanistic nature have been conducted on the subject. The mathematical modeling approach used in this thesis is part of an overall effort to optimize levodopa and methylphenidate, supported by the elucidation of the mechanisms involved in Parkinson’s disease and ADHD. Using a quantitative systems pharmacology (QSP) approach, we have developed an integrative model of the basal ganglia dopaminergic system, with the objective of elucidating the mechanisms involved, assessing the impact of dopamine in subjects with Parkinson’s or ADHD, with and without treatment, and objectively guiding the dosing regimens optimization. To the best of our knowledge, this is the first unifying modeling framework that addresses at the same time these two pathologies and their therapies. The model developed in this thesis includes three sub-models: the first one describes the drug pharmacokinetics, either levodopa or methylphenidate; the second one translates mathematically the different mechanisms involved in the dopamine dynamics; the third one is a computational representation of the complexity of neurotransmission in the basal ganglia. With appropriate adaptations, we have applied this same model to the context of Parkinson’s disease and ADHD, as well as to their respective pharmacotherapies. In order to physiologically represent Parkinson’s disease, we have integrated the denervation process in the model as well as the resulting compensation mechanisms. The finger tapping frequency is used as a clinical endpoint of bradykinesia, defined as the slowing of movements. The developed model is based on up-to-date knowledge of the pathophysiology and pharmacology of Parkinson’s disease, thus ensuring its validity in comparison with experimental and clinical observations. Using this model, the non-linear relationships between plasma levodopa concentration, dopamine concentration in the brain and response to a motor task were studied. The narrowing of levodopa therapeutic index during the progression of the disease due to these non-linearities was investigated. Finally, to ensure the translational aspect of our approach, we developed a web application in which this model was integrated. This application serves as a proof of concept for a tool aimed to facilitate the optimization and individualization of dosing regimens. For the study of ADHD, we adapted the developed model by integrating tonic and phasic dopamine release, the latter occurring during a reinforcement learning task. Virtual individuals were created with and without dopamine imbalance in the tonic/phasic ratio. By simulating a stimulus-response task, we observe ADHD-like symptoms among virtual patients with dopamine imbalance. Finally, the response to methylphenidate resulting from dopamine recapture inhibition, through different learning scenarios, was also studied. The development of a metric allowed us to differentiate responders from non-responders, and thus to highlight the possible implication of excessive learning in non-responders. A better understanding of methylphenidate response would help avoid overmedication in non-responders and assist clinicians in their practice. Despite the complexity of the dopaminergic system and its associated therapies, this thesis is a step forward in understanding the underlying mechanisms and their involvement in pharmacotherapy. These advances were achieved by adopting a quantitative systems pharmacology approach, combined with neurocomputational modeling borrowed from the electrical engineering field, and complemented by a translational bedside aspect. It is only by transcending disciplinary boundaries and adopting such an integrative approach that this ultimate goal of having a real impact on the multifaceted health system is possible.

L’approche Module X a été créée dans le but de concevoir de petits peptides modulateurs ayant des propriétés allostériques. Module X reproduit de petites parties des portions extracellulaires flexibles des récepteurs. Ces petits peptides vont interagir en s’interposant entre deux sous unités ou entre deux régions de la même sous-unité qui interagissent par des liens hydrogènes, des ponts salins ou des liens disulfure. Ces régions sont spécialement choisies à l’extérieur du domaine de liaison du ligand orthostérique et sont situées dans les régions inter domaines, la portion juxta membranaire ou dans les boucles. Étant donné que les boucles sont exposées durant les changements de conformation, une séquence peptidique reproduisant certaines régions de ces boucles pourrait s’insérer à un endroit approprié dans la structure où se lier à son partenaire de signalisation dans le complexe protéique, ce qui aurait comme effet de déplacer l’équilibre de l’ensemble vers un état particulier et modulerait ainsi la signalisation. De cette façon, certaines voies de signalisation pourraient être partiellement inhibées tandis que d’autres voies ne seraient pas touchées puisque le ligand orthostérique pourrait toujours se lier au récepteur. Dans une première étude, nous avons conçu des peptides inhibiteurs du récepteur de l’interleukine 1 (IL-1R/IL-1RAcP) plus précisément en reproduisant des régions flexibles de la protéine accessoire, sous-unité signalisatrice du récepteur. IL-1 est un médiateur majeur de l’inflammation, mais le seul antagoniste disponible est l’analogue naturel de IL-1, IL-1Ra qui compétitionne avec IL-1 pour le site de liaison sur le récepteur. Nous avons conçu plusieurs peptides à partir des boucles de la protéine accessoire. Un de ces peptides, rytvela (101.10) a démontré des propriétés de non-compétitivité et de sélectivité fonctionnelle caractéristiques des modulateurs allostériques. 101.10 bloque la prolifération des thymocytes et la synthèse de PGE2 avec un IC50 de 1 nM mais une efficacité de 100 % et 45 % respectivement et ne déplace pas IL-1 radioactif dans des essais de radioliaisons. De plus, 101.10 n’a qu’un effet minime sur l’affinité de IL-1 pour son récepteur. 101.10 démontre, de plus, une activité inhibitrice in vivo dans des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat (efficacité supérieure aux corticostéroïdes et à IL-1Ra) et de dermatite chez la souris de même que dans un modèle d’hyperthermie induite par IL-1. La deuxième étude démontre que Module X peut être utilisé pour concevoir des inhibiteurs pour une autre grande famille de récepteurs : les récepteurs couplés aux protéines G. La vasopressine joue un rôle important dans l’équilibre hydro-osmotique et un moindre rôle dans la vasomotricité. Six peptides ont été conçus à partir de régions juxta membranaires du récepteur de la vasopressine V2R. Le peptide le plus actif, VRQ397 (IC50 = 0,69 nM dans un modèle de vasorelaxation du crémastère), a démontré de la sélectivité fonctionnelle en inhibant la synthèse de prostacycline mais sans inhiber l’activation de la protéine Gs et la génération d’ AMP cyclique. Le peptide VRQ397 ne pouvait déplacer le ligand naturel AVP marqué radioactivement; de même VRQ397 radioactif ne se liait que sur V2R et non pas sur d’autres récepteurs de la même famille tel que V1R (récepteur de la vasopressine de type I). Ces études décrivent la caractérisation de petits peptides modulateurs de la signalisation de IL-1R et V2R et présentant des propriétés de modulateurs allostériques. / The Module X approach was conceived to generate small allosteric peptides that do not (by definition) compete with the natural ligand to inhibit or modulate signalling. Orthosteric inhibition blocks the entire signalling pathways while allosteric modulators will bind to another site on the target and show functional selectivity. By reproducing parts of the flexible regions (loops) of two receptors, the IL-1 and vasopressin receptors, we generated small peptides that showed allosteric properties. To prove our concept we started with a pro-inflammatory target: IL-1 receptor. Interleukin (IL)-1 is a major pro-inflammatory cytokine which interacts with the IL-1 receptor I (IL-1RI) complex, composed of IL-1RI and IL-1R accessory protein (IL-1RacP) subunits. Presently, there are no small antagonists of the IL-1RI complex. Given this void, we derived 15 peptides from loops of IL-1RacP, which are putative interactive sites with the IL-1RI subunit. Here we substantiate the merits of one of these peptides, rytvela (we termed, 101.10), as an inhibitor of IL-1R and describe its properties consistent with those of an allosteric negative modulator. 101.10 (IC50  1 nM) blocked human thymocyte proliferation in vitro, and demonstrated robust in vivo effects in models of hyperthermia and inflammatory bowel disease as well as topically in contact dermatitis, superior to corticosteroids and IL-1ra; 101.10 did not bind to IL-1RI deficient cells and was ineffective in vivo in IL-1RI knockout mice. Importantly, characterization of 101.10, revealed non-competitive antagonist actions and functional selectivity by blocking certain IL-1R pathways while not affecting others. The second study involved a representative of the biggest family of membrane proteins: G-protein coupled receptors. Vasopressin type 2 receptor (V2R) exhibits mostly important properties for hydro-osmotic equilibrium and to a lesser extent on vasomotricity. Drugs currently acting on this receptor are analogs of the natural neuropeptide, vasopressin (AVP), and hence are competitive ligands. Six peptides reproducing juxtamembranous regions of V2R were designed and screened; the most effective peptide, CRAVKY (labelled VRQ397), was characterized. VRQ397 was potent (IC50 = 0.69 ± 0.25 nM) and fully effective in inhibiting V2R-dependent physiological function (specifically DDAVP-induced cremasteric vasorelaxation; this physiological functional assay was utilized to avoid overlooking interference of specific signaling events). Dose-response profile revealed non-competitive property of VRQ397; correspondingly, VRQ397 bound specifically to V2R-expressing cells, could not displace its natural ligand, AVP, but modulated AVP binding kinetics (dissociation rate). VRQ397 exhibited pharmacological permissiveness on V2R-induced signals as it inhibited DDAVP-induced PGI2 generation, but not that of cAMP or recruitment of — arrestin2. Consistent with in vitro and ex vivo effects as a V2R antagonist, VRQ397 displayed anticipated in vivo aquaretic efficacy. Findings describe the discovery of potent and specific small (peptide) antagonists of IL-1RI and V2R with properties in line with an allosteric negative modulator.