Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude des récepteurs CXCR4 et ACKR3, deux récepteurs aux chimiokines. Ceux-ci jouent des rôles majeurs dans différentes fonctions physiologiques notamment le chimiotactisme des cellules immunitaires. Le dérèglement de leur activité est souvent associé à différents pathologies, notamment des cancers. Outre le fait que ces récepteurs lient tous les deux la même chimiokine, CXCL12, il a été montré qu’ils étaient capables d’exercer l’un sur l’autre des régulations croisées. Les mécanismes sous-tendant celles-ci sont très mal connus. Ils pourraient être liés à une compétition entre les récepteurs pour lier le même ligand CXCL12 ou à des régulations au niveau des voies de signalisation activées lors de la liaison d’une chimiokine. Ces régulations croisées pourraient également résulter de la formation de complexes de récepteurs appelés oligomères, complexes qui disposeraient de propriétés pharmacologiques particulières. De tels complexes ont été décrits dès les années 1990 dans des systèmes d’expression hétérologues mais leur existence et leurs rôles dans des systèmes natifs reste très largement débattus. Une des raisons est la difficulté à élaborer des outils moléculaires permettant l’étude de ces oligomères dans les tissus natifs.Le premier objectif de ma thèse a été l’élaboration d’outils permettant d’étudier l’existence de ces oligomères dans les systèmes natifs. En collaboration avec des laboratoires d’Amsterdam, j’ai développé des nanobodies fluorescents, petits anticorps produits par le lama, afin de marquer spécifiquement les récepteurs endogènes exprimés à la surface des cellules. Pour rendre fluorescent ces nanobodies, nous avons utilisé une technique originale permettant de greffer un fluorophore sur l’extrémité C-terminale de la molécule. Ces nanobodies conservent des propriétés pharmacologiques remarquables puisqu’ils conservent de hautes affinité et spécificité pour leur cible. J’ai ainsi pu utiliser ces molécules et démontrer l’existence des oligomères CXCR4 dans des lignées cellulaires exprimant de façon endogène le récepteur CXCR4. Des analyses similaires sont en cours sur le récepteur ACKR3.Le second objectif de ma thèse a été de définir les rôles potentiels de ces oligomères. J’ai pu montrer que les hétéro-oligomères CXCR4 /ACKR3, complexes associant les deux types de récepteurs, possèdent des propriétés de liaison particulière. Ceux-ci semblent ne lier la chimiokine CXCL12 que sur le récepteur ACKR3 au sein du complexe. Cette asymétrie de liaison est très étonnante car le récepteur CXCR4 est capable de lier CXCL12 avec une cinétique bien supérieure à celle de ACKR3 pour ce même ligand. J’ai étudié les conséquences d’une telle asymétrie de liaison sur les propriétés de signalisation de ces récepteurs. Une analyse des différentes voies de couplage activées lors de la liaison de CXCL12 a été réalisée sur les récepteurs exprimés de façon isolée ou co-exprimés au sein d’une même cellule. Les résultats ne montrent pas de modifications majeures de leur propriété de couplage.Nous avons par ailleurs analysé la capacité de ces récepteurs à internaliser en absence ou en présence de ligand CXCL12. J’ai pu observer que les hétéro-oligomères CXCR4 / ACKR3 restaient vraisemblablement bloquer à la surface des cellules.Ces travaux ouvrent des perspectives intéressantes dans la mesure où elles constituent la première démonstration de l’existence d’oligomères CXCR4 dans des systèmes natifs.Par ailleurs l’observation d’une régulation différente de l’internalisation des hétéro-oligomères constitue une première piste conférant à ces complexes un rôle particulier dans les régulations croisées de l’activité que ces récepteurs exercent l’un sur l’autre. / During my PhD, I focused on two chemokine receptors, CXCR4 and ACKR3. They have several important physiological functions, such as chemotaxis of immune cells. However, on the other hand, when their function is disturbed, they are involved in different immunological pathologies and cancer. Both receptors recognise the same chemokine, CXCL12 and many studies have reported a crosstalk between CXCR4 and ACKR3. However, the mechanisms behind this crosstalk are still poorly understood. This crosstalk can occur because both receptors are competing for CXCL12, at the level of signalling pathways or due to the formation of complexes between CXCR4 and ACKR3 receptors, called oligomers. The oligomers might have specific pharmacological properties different from the receptor monomers. Oligomeric complexes have been described since the nineties. Most of the studies on these oligomers were performed on heterologous expression systems, but still a lot of debate exists about their existence and their role in native tissues. One of the reasons behind this controversy is that studying oligomers in a native context is complicated, especially because we often lack the molecular tools for these studies.The first objective of my PhD was to generate efficient tools to study the existence of CXCR4 and ACKR3 oligomers in native systems. In collaboration with laboratories from Amsterdam and Ghent, we have developed fluorescent nanobodies, small antibodies produced by llamas. These specific tools allow the detection of receptors endogenously expressed at the cell surface. In order to fluorescently label these nanobodies, we have used an original strategy that can specifically attach the fluorophore to the C-terminus of the nanobody. Interestingly, the fluorescent nanobodies retain high affinity and specificity for their target. With these nanobodies, I have demonstrated the existence of CXCR4 oligomers in cell lines that endogenously express CXCR4. We are currently investigating the existence of ACKR3 oligomers.The second objective of my PhD consists of defining the functional roles of these oligomers. I have shown that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers have specific binding characteristics. It seems that CXCL12 is binding only to ACKR3 within this hetero-oligomer and that ACKR3 impairs the CXCL12 binding to CXCR4 within the hetero-oligomer. This is interesting, since we also have demonstrated that CXCL12 is binding much faster on CXCR4 than on ACKR3.In addition, I have studied the consequences of this negative cooperativity within the CXCR4/ACKR3 hetero-oligomer on different signalling pathways. We have compared conditions where the receptor was expressed alone or when receptors were co-expressed. No major modifications have been found on their signalling properties. However, when investigating the internalisation of CXCR4 and ACKR3, it seems that CXCR4/ACKR3 hetero-oligomers remain blocked on the cellular surface.This opens interesting perspectives, since it is the first time CXCR4 oligomers have been detected at an endogenous level. Moreover, the observation of a different internalisation pattern of the hetero-oligomer is a first step to further investigate the specific roles of these oligomers in the crosstalk between the receptors.

Les canaux ioniques sont exprimés dans tous les types cellulaires, des plantes à l’Homme, où ils sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques. Parmi ces canaux, les canaux potassiques à deux domaines pore ou K2P forment des dimères qui produisent des courants de fond, contrôlant le potentiel de repos de la membrane et ainsi l’excitabilité cellulaire. De ce fait, ils jouent un rôle dans de nombreuses fonctions physiologiques et pathophysiologiques telles que la respiration, la nociception ou la dépression et sont de plus en plus considérés comme des cibles thérapeutiques intéressantes pour le traitement de ces pathologies. La structure de ces canaux est une caractéristique importante à considérer pour le développement de nouveaux médicaments mais les mécanismes et les régulations qui contrôlent leur activité sont peu connus.Durant mon doctorat, nous avons démontré que les canaux K2P, en particulier les sous-familles THIK et TREK, peuvent s’assembler avec un autre canal de la même sous-famille pour former un hétérodimère fonctionnel. Nous avons tout d’abord prouvé que les canaux interagissent physiquement en combinant biochimie, immunocytochimie, FRET ainsi que l’électrophysiologie. De manière intéressante, les hétérodimères ont des conductances, des régulations et une sensibilité aux agents pharmacologiques différentes de celles des canaux homodimères.Ces études montrent que la famille des canaux K2P est plus étendue et diversifiée que ce qu’il avait été attendu. La combinaison de ces canaux au sein de la même sous-famille permet de créer de nouveaux canaux fonctionnels aux propriétés originales et donc de nouvelles cibles thérapeutiques / Potassium channels are highly conserved among organisms, from plants to humans, where they are involved in several functions. Among them, the two pore domain potassium channels or K2P channels are dimers that produce background channels to control membrane resting potential and thus cell excitability. They are involved in physiological functions and diseases such as breathing, nociception or depression. They are now more and more considered as important therapeutic targets for the development of new drugs targeting these diseases. Structure-function relationship of ion channels is an important feature for the drug design but we only know little about mechanisms and regulations that control the activity of K2P channels.During my PhD, we showed that K2P channels and particularly subunits of THIK and TREK subfamilies channels can also form functional heterodimers with other subunits of the same subfamily. We first proved that subunits physically interact combining biochemistry, immunocytochemistry, FRET and electrophysiology. Interestingly, heterodimers display specific conductances, regulations and pharmacology compared to homodimers.These studies showed that the diversity and number of K2P channel conductances are larger than expected. In conclusion, mixing among subunits from the same subfamily form new channels with unique properties and so new therapeutic targets

La mambaquarétine-1 (MQ-1), une toxine du mamba vert, est le tout premier peptide Kunitz à bloquer sélectivement l’activité du récepteur de type 2 à la vasopressine (V2R). Celui-ci contrôle la concentration finale des urines dans le rein. Impliqué dans plusieurs pathologies, son inhibition est actuellement considérée comme la meilleure stratégie thérapeutique dans le traitement de la polykystose rénale, une maladie génétique héréditaire. L’étude pharmacodynamique de MQ-1 sur des rats sains a confirmé son activité in vivo qui se traduit par un effet aquarétique dépendant de la dose. L’effet maximum est atteint 2 heures après injection intrapéritonéale et disparait avec un temps de demi-vie biologique variant de 1 à 4 heures selon la dose. L’administration quotidienne d’une faible dose a montré une accumulation de l’effet les trois premiers jours, avant un plateau, suggérant une activité résiduelle au-delà de 24 heures. Le criblage des trois autres venins de mambas ainsi qu’une analyse comparée des séquences peptidiques les plus proches dans les bases de données ont révélé l’existence d’un groupe phylogénétique de onze toxines Kunitz antagonistes de V2R. Une approche innovante, combinant tests de liaison de variants de MQ-1 et modélisation du complexe MQ-1-V2R, a permis de décrypter une partie du pharmacophore de la toxine. Les deux partenaires partagent une importante complémentarité ionique impliquant plusieurs boucles extracellulaires du récepteur, et une région hydrophobe de MQ-1 interagit au cœur de V2R à proximité de son site orthostérique supposé. Enfin, une première collaboration avec une industrie pharmaceutique a mis en évidence les points critiques à approfondir pour aboutir au développement thérapeutique de MQ-1. / Mambaquaretin-1 (MQ-1), a green mamba toxin, is the very first Kunitz peptide to selectively hinder the vasopressin type 2 receptor (V2R) activation. This receptor controls the final concentration of urine in kidneys. Involved in a number of pathologies, its inhibition is currently considered as the best therapeutic strategy in the treatment of polycystic kidney disease, a hereditary genetic disease. Pharmacodynamic study of MQ-1 carried out on healthy rats confirmed its in vivo activity which consists in inducing a dose-dependent aquaretic effect. Maximum effect is reached 2 hours after an intraperitoneal injection and disappears in a biological half-life ranging from 1 to 4 hours according to the dose. The daily injection of small quantities pointed to a cumulative effect over the first three days, leading to a plateau, which suggests a residual activity exceeding 24 hours. The screening of the three other mamba venoms along with a comparative analysis of the closest peptide sequences reported in databases revealed the existence of a phylogenetic group of eleven V2R antagonist Kunitz toxins. An innovative approach combining binding assays on MQ-1 variants and the modelling of the MQ-1-V2R complex has led to a partial deciphering of the pharmacophore of the toxin. The two partners share a significant ionic complementarity involving a number of extracellular loops of the receptor, and a hydrophobic region of MQ-1 interacts within V2R in the vicinity of its supposed orthosteric site. Lastly, a collaboration initiated with a pharmaceutical company brought out the need for the closer scrutiny of some crucial points to succeed in a therapeutic development of MQ-1.

RÉSUMÉ en françaisLes systèmes de délivrance de médicaments sont fortement investigués dans le but d’obtenir la meilleure efficacité thérapeutique et la plus faible toxicité possible. De nombreux systèmes existent à l’heure actuelle qu’ils soient mécaniques ou chimiques. Dans ce travail, nous nous sommes tout d’abord intéressés à une nouvelle approche basée sur la macropinocytose pour augmenter l’internalisation d’agents thérapeutiques aussi bien dans des cellules cibles de médicaments que dans des cellules souches mésenchymateuses d’origine musculaire (mdMSCs) actuellement de plus en plus étudiées comme nouveaux systèmes de délivrance. La macropinocytose est en effet une voie d’endocytose clathrine-indépendante permettant l’internalisation non sélective de fluide extracellulaire. Ce processus semble contribuer à l’agressivité des cancers en favorisant leur apport en nutriments, le recyclage de la membrane plasmatique et de ses récepteurs ainsi que l’internalisation d’exosomes. La macropinocytose est déclenchée notamment par l’activation des récepteurs epidermal growth factor receptor (EGFR) et platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) qui sont des marqueurs connus d’agressivité des gliomes. Au cours de ce travail, nous nous sommes demandé si la macropinocytose ne pourrait pas être utilisée pour améliorer l’internalisation d’agents chimiothérapeutiques dans les cellules de glioblastomes. Nous avons tout d’abord montré que l’expression des acteurs clés de la macropinocytose au niveau de leur ARNm est fortement altérée en fonction du grade de la tumeur en utilisant des bases de données publiques d’échantillons de tumeurs gliales humaines. Une « signature » basée sur l’expression de 38 gènes liés à la macropinocytose permet la discrimination des échantillons de glioblastomes, c’est-à-dire des tumeurs les plus agressives. Nous avons ensuite comparé les effets induits par le MOMIPP et le Vacquinol-1, deux inducteurs connus de macropinocytose, à ceux de l’Honokiol qui induit également une vacuolisation sévère au sein de cellules de gliomes. Malgré de fortes similarités morphologiques, l’Honokiol se distingue par l’induction de vacuoles provenant à la fois d’endocytose mais aussi du réticulum endoplasmique. Chacun des trois composés induit néanmoins une nette augmentation de l’internalisation de dextrans de 10 kDa. Le marquage à l’acridine orange suggère pourtant des différences dans le devenir des vacuoles induites par ces trois molécules. Il a récemment été démontré que le MOMIPP agit en empêchant la maturation des macropinosomes ce qui concorde avec notre observation d’une fusion avec les lysosomes qui serait très limitée. Si les trois molécules permettent bien d’augmenter également la concentration de témozolomide (traitement de référence) au sein des cellules de gliomes, leur impact sur l’internalisation de la doxorubicine est plus faible. L’augmentation de l’internalisation des médicaments par l’induction de macropinocytose ne semble donc pas toujours efficace et pourrait dépendre de leurs propriétés physico-chimiques ainsi que de leur voie d’internalisation basale. Étant donné que l’induction soutenue de macropinocytose peut également déclencher la mort cellulaire tant de cellules de glioblastome chimio-sensibles que chimio-résistantes, nous proposons d’envisager la macropinocytose dans des approches combinées pour bénéficier d’une augmentation de l’internalisation de médicaments et d’effets additifs/ synergiques. Comme les cellules souches mésenchymateuses sont intensément étudiées pour leur utilisation en tant que transporteur de médicaments en plus de leur potentiel intrinsèque pour la médecine régénérative, les effets de ces inducteurs de vacuolisation ont également été étudiés sur des mdMSCs. Ces dernières sont caractérisées par un niveau basal de macropinocytose plus élevé que les modèles de gliomes utilisés et elles semblent mieux répondre au Vacquinol-1 qui permet d’ailleurs d’augmenter plus efficacement la concentration intracellulaire en doxorubicine que le MOMIPP, avec une internalisation environ 2 fois plus importante qu’en absence de stimulation. Ces cellules pouvant être utilisées comme véhicule pour le transport de molécules ayant une faible biodisponibilité afin d’améliorer leur usage en clinique, nous avons ensuite évalué l’impact du chargement de mdMSCs avec de la curcumine, un polyphénol naturel bien connu pour ses propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires dont le potentiel clinique reste limité notamment par sa faible solubilité. Pour cette raison, l’utilisation du NDS27, un complexe de lysinate de curcumine et d’hydroxy-propyl-bêta-cyclodextrine qui présente une bien meilleure solubilité dans l’eau, a été préférée. Nous avons observé que l’internalisation de la curcumine, provenant du NDS27, dans les mdMSCs est concentration-dépendante et non temps-dépendante. De plus, elle ne peut pas être augmentée par l’utilisation d’inducteurs de macropinocytose. De plus amples investigations des effets de l’internalisation de la curcumine à partir du NDS27 en fonction de la concentration sur leur viabilité, prolifération, propriétés mésenchymateuses et leur fonction mitochondriale nous ont permis de montrer qu’un chargement de 2 h avec 7 µM de NDS27 était acceptable en vue de préserver la possibilité de bénéficier des mdMSCs en tant qu’agent de thérapie cellulaire régénérative en sus de leur aspect de délivrance. L’investigation du potentiel thérapeutique de telles mdMSCs chargées en curcumine pour traiter l’arthrose chez le cheval est toujours en cours. / SUMMARYDrug delivery systems are highly investigated with the aim to promote the best therapeutic efficacy and the lowest possible toxicity. Nowadays, several systems either mechanical or chemical exist. In this work, we were first interested in studying a new approach based on macropinocytosis to increase the internalisation of therapeutic agents in both target cells of drugs and skeletal muscle-derived mesenchymal stem cells (mdMSCs) currently more and more studied as new deliverance systems. Macropinocytosis is indeed a clathrin-independent endocytosis pathway allowing the nonselective internalisation of extracellular fluid. This process seems to contribute to cancer aggressiveness by favouriting nutrient supply, recycling of plasma membrane and its receptors, and exosome internalisation. Macropinocytosis may notably be triggered by epidermal growth factor receptor (EGFR) and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR), two well-known markers of glioma aggressiveness. During this work, we wondered whether macropinocytosis could be used to improve the internalisation of chemotherapeutic agents into glioblastoma cells. We first showed that the mRNA expression levels of key actors of macropinocytosis are strongly altered according to the grade of the tumour using public datasets of human glioma tumour samples. A “signature” based on the expression of 38 macropinocytosis-related gene allows the discrimination of the glioblastoma samples, i.e. the most aggressive tumours. We next compared the effects induced by MOMIPP and Vacquinol-1, two well-known macropinocytosis inducers to those of Honokiol which also induces a severe vacuolisation within glioma cells. Despite high phase-contrast morphological similarities, Honokiol appeared different from the others by the induction of vacuoles from both endocytosis and endoplasmic reticulum origins. Each of the three compounds nevertheless induces a marked increase in 10 kDa dextran internalisation. Acridine orange staining however suggested differences in the fate of vacuoles induced by those three molecules. MOMIPP has recently been shown to prevent the macropinosomes maturation which is consistent with our observation ofthe lack of acridine orange staining of the vacuoles that may be attributed to a limited fusion with lysosomes. Although each of the three compounds allows nevertheless a marked increase of temozolomide (i.e. first-line treatment) concentration into glioma cells, their impact on the internalisation of doxorubicin is poor. The increased internalisation of drugs by inducing macropinocytosis does not seem to be always efficient and could depend on their physicochemical properties and their basal way of internalisation. Considering that sustained macropinocytosis induction may also trigger cell death of both chemo-sensitive and chemo-resistant glioblastoma cells, we proposefor future perspectives to consider macropinocytosis in combination approaches to benefit from an increased drug uptake and additive/synergistic effects. As mesenchymal stromal / stem cells are increasingly studied for their use as drug-carrier in addition to their intrinsic potential for regenerative medicine, the effects of these vacuolisation inducers were also studied on mdMSCs. These lasts are characterised by a higher basal level of macropinocytosis than the glioma models used in this work. They seem to better respond to Vacquinol-1 which allows to increase more efficiently the intracellular concentration of doxorubicin than MOMIPP, with an uptake approximatively 2-fold higher than without stimulation. Given that these cells can be used as vehicle to transport molecules with a poor bioavailability in order to improve their clinical usage, we evaluated the impact of the loading of mdMSCs with curcumin, a natural polyphenol well-known for its antioxidant and anti-inflammatory properties whose clinical potential remains limited notably by reason of its poor solubility. Therefore, the use of NDS27, a complex of curcumin lysinate and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin displaying an increased solubility in aqueous solution, was preferred. We observed that the uptake of curcumin from NDS27 into mdMSCs is concentration-dependent and not time-dependent. Moreover, it cannot be improve using macropinocytosis inducers. Further investigations of the effects of curcumin internalisation from NDS27 depending on the concentration used on their viability, proliferation, mesenchymal properties and their mitochondrial function allowed us to show that a loading of 2 h with NDS27 at 7 µM seems acceptable to preserve the possibility to benefit from mdMSCs as a cellular therapy agent in addition to the delivery aspect. The investigation of the double potential therapeutic benefits of such curcumin-loaded mdMSCs to treat osteoarthritis in horses is still ongoing. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’athérosclérose est un important facteur de risque des maladies cardiovasculaires ischémiques. Cette pathologie est caractérisée par la formation de plaques lipidiques dans l’intima des vaisseaux sanguins. Le récepteur éboueur cluster de differentiation-36 (CD36) est impliqué dans l’internalisation et l’accumulation de lipoprotéines au sein des macrophages qui vont devenir des cellules spumeuses, ce qui est à l’origine de la formation de lésions athérosclérotiques. Notre hypothèse est que les azapeptides, dérivés du peptide de relâche de l’hormone de croissance 6 (GHRP-6), vont interférer avec l’internalisation des lipoprotéines par les macrophages et ainsi réduire la progression des lésions. Nous avons utilisé des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoe-/-) qui ont été traitées quotidiennement par une injection sous-cutanée de 300 nmol/kg de MPE-001 ou de MPE-003. Les effets des azapeptides ont été étudiés sous deux régimes alimentaires, soit le maintien d’une diète enrichie en lipides et en cholestérol (HFHC) pendant la durée de l’étude, ou par une diète HFHC suivie d’une diète normale pendant la période de traitement. Nos résultats montrent que les azapeptides ont réduit la progression des lésions à différents sites aortiques et artériels et induit leur régression au niveau des sinus aortiques du coeur. Ces effets ont été associés à une diminution de médiateurs pro-inflammatoires au niveau plasmatique et à une augmentation des marqueurs caractéristiques des macrophages anti-inflammatoires (M2). Nos travaux ont montré que l’effet athéroprotecteur des azapeptides dépend de la présence du récepteur CD36. Ces résultats appuient le développement de ligands sélectifs du récepteur CD36 dans le traitement de l’athérosclérose. / Atherosclerosis is an important risk factor for the development of ischemic heart disease. This pathology is characterized by the formation of lipid plaques in the intima of the blood vessels. The receptor cluster of differentiation 36 (CD36) is involved in the internalization and retention of lipoproteins within macrophages that will become foam cells, which induce the formation of atherosclerotic lesions. Our hypothesis is that azapeptides, derived from growth hormone release peptide-6 (GHRP-6), will interfere with the internalization of lipoproteins by macrophages and thereby reduce the progression of lesions. We used apolipoprotein E-deficient mice (apoe-/-) which were treated daily with a subcutaneous injection of 300 nmol / kg of MPE-001 or MPE-003. The effects of azapeptides were studied under two diets regimen, the mice were either maintained under a diet enriched in fat and cholesterol (HFHC) for the duration of the study or were given a HFHC diet followed by a normal diet during the treatment period. Our results show that azapeptides reduced the progression of lesions at different aortic and arterial sites and induced their regression in the aortic sinuses of the heart. These effects have been associated with a decrease in pro-inflammatory mediators in plasma and an increase in markers characteristic of anti-inflammatory macrophages (M2). Our work has shown that the atheroprotective effect of azapeptides depends on the presence of the CD36 receptor. These results support the development of selective ligands for the CD36 receptor in the treatment of atherosclerosis.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) represents approximately 25% of all pediatric cancers diagnosed every year. In about 80% of cases, pediatric patients will attain a 5-year event-free survival. Unfortunately, patients who are resistant to treatment or who relapse have a poor prognosis. Hence, novel therapeutic approaches are necessary to increase survival rates. Epigenetic alterations, such as DNA methylation and histone modifications, are involved in disease development, progression, and in particular, resistance to treatment. These reversible alterations represent novel targets in ALL. We recently discovered candidate epigenetic drugs in FDA-approved drug libraries. We performed a secondary screen to test the activity of these drugs in a panel of cancer cell lines. We found that a cardiac glycoside, called proscillaridin A, had anticancer specificity against pediatric leukemia cell lines. Thus, we hypothesize that proscillaridin A has some drug repositioning potential in pediatric ALL. To characterize its epigenetic mechanism of action, we treated two ALL cell lines Nalm-6 (pre-B ALL) and Molt-4 (T-ALL) in vitro for different time points (2-96h) with clinically relevant concentrations of proscillaridin A and analyzed cell growth, cell cycle, gene expression and chromatin modifications. We observed dose-dependent growth inhibition in both cell lines, where 50% of growth inhibition (IC50) was obtained at 3.0 and 2.3 nM in Nalm-6 and Molt-4, respectively. Our results using BrdU staining indicate a cell cycle block in the G2/M phase. By western blot, we detected significant decreases in histone 3 acetylation levels (H3K14ac, H3K9ac, and H3K27ac). Decreases in histone acetylation were associated with a significant reduction in histone acetyltransferase expression (CBP, P300 and TIP60) as well as the CMYC oncogene. By RNA sequencing and gene set enrichment analysis, we observed an upregulation of apoptosis and cell differentiation genes, as well as a decrease in cell proliferation and C-MYC target genes. These promising results illustrate the potential of using the cardiac glycoside proscillaridin A as a novel drug in treatment of relapsed or refractory ALL.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

This thesis represents the culmination of the main project I have undertaken during my master's program. It is important to note that additional data collection and analysis were conducted by intern students under my supervision, which will be integrated into a forthcoming manuscript where I will be credited as the first co-author. Due to space and focus limitations of this thesis, these additional findings have not been included here. / La famille des canaux potassiques à rectification entrante (Kir), exprimée de manière ubiquitaire, repolarise et maintient le gradient de tension à travers les membranes des cellules excitables et non-excitables. Les canaux Kir sont fortement régulés par divers lipides membranaires, tels que les phosphoinositides, les phospholipides anioniques secondaires, le cholestérol, le Coenzyme A (CoA) à longue chaîne et l'acide arachidonique. Kir2.1 est fortement exprimé dans le tissu musculaire strié des cellules cardiaques auriculaires et ventriculaires. Il joue un rôle essentiel dans la régulation du potentiel de membrane au repos et de la contraction des cellules musculaires cardiaques et lisses en générant le courant K+ à rectification entrante (IK1). (IK1). Les mutations de Kir2.1 avec perte de fonction sont à l'origine du syndrome d'Andersen-Tawil (ATS). Par conséquent, l'altération de la fonction de Kir2.1 est un déterminant essentiel au bon fonctionnement du cœur. Les endocannabinoïdes sont une classe spéciale de lipides naturellement exprimés dans une variété de cellules, y compris les cellules cardiaques, neuronales et immunitaires. Le système endocannabinoïde, y compris les récepteurs cannabinoïdes (CBR), agit comme un système de réponse au stress qui s'active. Des études menées chez l'animal et chez l'homme suggèrent que la modulation pharmacologique de ce système pourrait représenter une nouvelle approche thérapeutique. Cependant, ces dernières années, il est devenu clair que si les endocannabinoïdes peuvent déclencher des changements de signalisation en aval par l'intermédiaire des CBR, ils peuvent également interagir directement avec les canaux ioniques indépendamment des CBR pour moduler la fonction cellulaire. Dans cette étude, nous avons utilisé la technique de double électrode en voltage imposé pour examiner les effets d'un panel d'endocannabinoïdes sur la fonction de Kir2.1. Nous avons montré qu'un sous-ensemble d'endocannabinoïdes, mais pas tous, peut réguler la fonction de Kir2.1 à des degrés divers, indépendamment des CBR. Nous avons également démontré que les endocannabinoïdes peuvent également réguler les protéines mutées menant à l'ATS (G144S et V302M). Nous avons également observé que l'effet des endocannabinoïdes n'est pas conservé parmi les membres de la famille Kir, avec des différences observées entre les canaux Kir2.1, Kir4.1 et Kir7.1. Ces résultats pourraient avoir des implications plus larges pour les fonctions des cellules cardiaques, neuronales et immunitaires. Mots clés : Kir2.1, Endocannabinoïdes, LQT7, Rectification entrante, G144S, Kir7.1, Kir4.1 / The ubiquitously expressed family of inward rectifier potassium (Kir) channels repolarizes and maintains the voltage gradient across excitable and non-excitable cell membranes. Kir channels are highly regulated by various membrane lipids, such as phosphoinositides, secondary anionic phospholipids, cholesterol, long chain acyl- Coenzyme A (CoA), and arachidonic acid. Kir2.1 is highly expressed in striated muscle tissue of atrial and ventricular heart cells. It is critically involved in regulating the resting membrane potential and contraction of cardiac and smooth muscle cells through the generation of the current IK1. Loss-of-function mutations in Kir2.1 cause Andersen-Tawil syndrome (ATS). Therefore, altered Kir2.1 function is a critical determinant of proper heart function. Endocannabinoids are a special class of lipids that are naturally expressed in a variety of cells, including cardiac, neuronal, and immune cells. The endocannabinoid system, including cannabinoid receptors (CBRs), acts as a stress response system that is activated. Studies in both animals and humans suggest that pharmacological modulation of this system might represent a novel approach to treatment. However, in recent years, it is becoming clear that while endocannabinoids can trigger downstream signaling changes through CBRs, they can also directly interact with ion channels independently of CBRs to modulate cellular function. In this study, we used the electrophysiology technique called two-electrode-voltage-clamp (TEVC) in combination with mutagenesis studies to examine the effects of a panel of endocannabinoids on the function of Kir2.1. We showed that a subset of endocannabinoids, but not all, can regulate the Kir2.1 function to varying degrees, independent of CBRs. We also demonstrated that endocannabinoids can also regulate mutants linked with ATS (G144S and V302M). We also observed that the effect of endocannabinoids is not conserved among Kir family members, with differences observed between Kir2.1, Kir4.1 and Kir7.1 channels. These findings could have broader implications for cardiac, neuronal, and immune cell functions. Key words: Kir2.1, Endocannabinoids, LQT7, Inward rectification, G144S, Kir7.1, Kir4.1

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Il est important de connaître le métabolisme stéréosélectif du R,S-propranolol car le pouvoir b-bloquant de l'énantiomère S(-) est environ 100 fois plus puissant que celui de l'énantiomère R(+). La stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol semble dépendante de la voie d'administration. Ainsi, les surfaces sous la courbe des concentrations plasmatiques (SSCp) de l'énantiomère S(-) suivant l'administration orale et l'injection intraveineuse sont 1,48 et 1,17 fois supérieures à celles de l'énantiomère R(+). Deux hypothèses sont proposées dans le but de connaître les facteurs responsables des différences stéréosélectives dans le métabolisme des énantiomères du propranolol. La première hypothèse est basée sur la capacité des organes extrahépatiques à métaboliser les médicaments. Il a été démontré que les poumons, les reins et les cellules épithéliales de l'intestin contiennent des isoenzymes du cytochrome P-450. Suivant une administration orale, la contribution intestinale au premier passage du propranolol est de 43%, alors que son extraction systémique est de 23%. Nous postulons que le métabolisme préférentiel de l'énantiomère R(+) dans la paroi intestinale est, en grande partie, responsable de la stéréosélectivité suivant l'administration orale. La deuxième hypothèse repose sur le fait que la dose atteignant le foie influence la stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol. En effet, lorsque 0,1 mg/kg ou 5 mg de propranolol sont injectés par la voie intraveineuse, une quantité maximale de 2 à 3 mg atteint le foie. Par contre, lorsque 40 mg ou plus sont administrés par voie orale, le propranolol traverse les cellules épithéliales de l'intestin et, même en tenant compte de la capacité d'extraction de l'intestin, au moins 25 mg atteindront le foie. Afin de déterminer l'effet de la voie d'administration et de la dose sur la stéréosélectivité du métabolisme des énantiomères du propranolol, des lapins conscients ont reçu des doses variables de R,S-propranolol par voie orale (40, 80 et 120 mg/kg) et intraveineuse (0,5 et 10 mg/kg). Des expériences in vitro ont permis de déterminer la capacité des cellules épithéliales de l'intestin, du foie, des poumons et des reins à métaboliser le R,S-propranolol. L'incubation de chaque énantiomère individuellement a permis de déterminer si l'interaction entre les énantiomères ou la saturation du métabolisme d'un énantiomère pourrait influencer la stéréosélectivité du métabolisme. Suivant l'administration orale de 40 mg/kg et l'injection intraveineuse de 0,5 mg/kg, le métabolisme des énantiomères du propranolol n'est pas stéréosélectif. Les doses orales de 80 et 120 mg/kg génèrent une augmentation non-linéaire des SSCp des deux énantiomères et la SSCp du S(-)-propranolol augmente plus rapidement que celle du R(+)-propranolol, signifiant qu'une stéréosélectivité dans le métabolisme des énantiomères du propranolol apparaît lorsque la dose augmente. Suivant l'administration orale de 120 mg/kg, on observe des concentrations plasmatiques de S(-)-propranolol nettement supérieures à celles de son antipode (p < 0,05). L'injection intraveineuse de 10 mg/kg génère également une cinétique d'ordre zéro, mais dans ce cas, les SSCp du S(-)-propranolol sont inférieures à celles du R(+)-propranolol (p < 0,05). In vitro, seuls le foie et la muqueuse intestinale métabolisent le propranolol. Suivant l'incubation de 5,8 et 58 mM de R,S-propranolol dans les cellules épithéliales de l'intestin, les vitesses d'élimination du R(+)-propranolol sont plus rapides que celles du S(-)-propranolol. Aux concentrations de 5,8 mM dans les cellules hépatiques, un métabolisme rapide sans stéréosélectivité est observé. Par contre, suivant l'incubation de 58 mM de R,S-propranolol, une diminution des vitesses d'élimination des deux énantiomères du propranolol et l'apparition d'un métabolisme préférentiel de l'énantiomère R(+) sont notées. Ces résultats suggèrent que la stéréosélectivité de la cinétique des énantiomères du propranolol est dépendante de la dose dans les cellules hépatiques. Par rapport à ces derniers résultats, l'incubation de 2,9 et 29 mM de chaque énantiomère individuellement dans les cellules épithéliales de l'intestin montre que le métabolisme du S(-)-propranolol est saturé. À une concentration de 2,9 mM dans les cellules hépatiques, les vitesses d'élimination de chaque énantiomère sont le double par rapport au mélange racémique, ce qui signifie que les énantiomères d'un mélange racémique inhibent l'élimination de leur antipode. À une concentration de 29 mM, la saturation de l'élimination de l'énantiomère S(-) et l'apparition d'un métabolisme stéréosélectif sont observées. Nous concluons que l'intestin et le foie sont responsables du métabolisme stéréosélectif des énantiomères du propranolol. La stéréosélectivité dose-dépendante dans les cellules hépatiques est principalement responsable de l'élimination préférentielle du R(+)-propranolol observée in vivo chez le lapin. Finalement, ces résultats démontrent que la stéréosélectivité ne dépend pas d'une différence de clairance intrinsèque pour les deux énantiomères, mais de la saturation du métabolisme du S(-)-propranolol.