Orientador: Renée Laufer Amorim / Banca: Veridiana Maria Brianezi Dignani de Moura / Banca: Marcela Marcondes Pintos Rodrigues / Resumo: A próstata canina pode utilizada como modelo para estudo comparativo de afecções desta glândula no homem, constituindo as únicas espécies em que o carcinoma de próstata (CaP) se desenvolve espontaneamente. A próstata canina é sede de diversos processos patológicos que comumente acometem cães adultos e idosos. O papel do oncogene c-MYC e supressores tumorais NKX3.1 e E-caderina são bem estabelecidos no processo de carcinogênese da próstata humana, no entanto, não há pesquisas que relatem a expressão proteica dessas proteínas na progressão do CaP canino. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar a expressão proteica de c-MYC, NKX3.1 e Ecaderina na próstata normal, com Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), Atrofia Inflamatória Proliferativa (PIA) e CaP e avaliar o papel dessas proteínas no processo de gênese tumoral. O presente estudo foi realizado em uma plataforma de Microarranjo de Tecido (TMA) contendo diferentes lesões prostáticas. Foi realizada Imuno-histoquímica com os anticorpos c-MYC, NKX3.1 e E-caderina pelo método da peroxidase e DAB. A análise estatística foi realizada pelo teste de Qui-quadrado ou teste de Fischer para determinar associação entre as variáveis. A proteína c-MYC apresentou maior expressão no CaP e na PIA quando comparada com a próstata normal e com HPB (p= 0,0068). Observou-se maior número de amostras com ausência da expressão do NKX3.1 no CaP (94.75% ) e PIA (100%) quando comparando com a próstata normal e HPB (p=0,0022). Em relação a E-caderina houve maior número de amostras positivas na HPB e próstata normal quando comparado CaP e a PIA, no entanto sem diferença estatística. O processo de gênese tumoral na próstata canina esta associado com o aumento de expressão proteica do c-MYC e a perda da expressão proteica do NKX3.1 / Abstract: The dog is the only species besides humans that develop spontaneous and naturally prostatic carcinoma (PCa) with high frequency. The canine model is primarily used for studies of molecular mechanisms of PCa and provides a natural animal model for studies of potential therapies. PCa in men presents CMYC oncogene mutation and reduced E-cadherin and NKX3.1 protein expression. In this context our objective was to evaluate NKX3.1, C-MYC and E-cadherin expression in benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatic inflammatory atrophy (PIA) and PCa in dogs and verify the role of these proteins in the progression to prostate cancer. A tissue microarray (TMA) slide was constructed and immunohistochemistry with antibodies C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin was performed with peroxidase method and DAB. Chi-square or Fisher exact test was used to determine the association between the categorical variables. The evaluation of the C-MYC oncogene protein showed higher cytoplasmic positivity in canine PCa and PIA compared to BPH (p= 0.0068). We observed a decrease of NKX3.1 expression in 94.75% of PCa, 100% of PIA in comparison to BPH (p=0.0022). E-cadherin expression was higher in BPH and PIA in comparison to PCa, with no statistical difference. The carcinogenesis process of canine prostatic lesion may be related to gain of CMYC and loss of NKX3.1 / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-15Bitstream added on 2014-06-13T19:51:04Z : No. of bitstreams: 1 000735057.pdf: 1377720 bytes, checksum: 27a124629e14b0c3deac7a29c3f1f0e7 (MD5) / A próstata canina pode utilizada como modelo para estudo comparativo de afecções desta glândula no homem, constituindo as únicas espécies em que o carcinoma de próstata (CaP) se desenvolve espontaneamente. A próstata canina é sede de diversos processos patológicos que comumente acometem cães adultos e idosos. O papel do oncogene c-MYC e supressores tumorais NKX3.1 e E-caderina são bem estabelecidos no processo de carcinogênese da próstata humana, no entanto, não há pesquisas que relatem a expressão proteica dessas proteínas na progressão do CaP canino. Neste contexto, este estudo teve por objetivo avaliar a expressão proteica de c-MYC, NKX3.1 e Ecaderina na próstata normal, com Hiperplasia Prostática Benigna (HPB), Atrofia Inflamatória Proliferativa (PIA) e CaP e avaliar o papel dessas proteínas no processo de gênese tumoral. O presente estudo foi realizado em uma plataforma de Microarranjo de Tecido (TMA) contendo diferentes lesões prostáticas. Foi realizada Imuno-histoquímica com os anticorpos c-MYC, NKX3.1 e E-caderina pelo método da peroxidase e DAB. A análise estatística foi realizada pelo teste de Qui-quadrado ou teste de Fischer para determinar associação entre as variáveis. A proteína c-MYC apresentou maior expressão no CaP e na PIA quando comparada com a próstata normal e com HPB (p= 0,0068). Observou-se maior número de amostras com ausência da expressão do NKX3.1 no CaP (94.75% ) e PIA (100%) quando comparando com a próstata normal e HPB (p=0,0022). Em relação a E-caderina houve maior número de amostras positivas na HPB e próstata normal quando comparado CaP e a PIA, no entanto sem diferença estatística. O processo de gênese tumoral na próstata canina esta associado com o aumento de expressão proteica do c-MYC e a perda da expressão proteica do NKX3.1 / The dog is the only species besides humans that develop spontaneous and naturally prostatic carcinoma (PCa) with high frequency. The canine model is primarily used for studies of molecular mechanisms of PCa and provides a natural animal model for studies of potential therapies. PCa in men presents CMYC oncogene mutation and reduced E-cadherin and NKX3.1 protein expression. In this context our objective was to evaluate NKX3.1, C-MYC and E-cadherin expression in benign prostatic hyperplasia (BPH), prostatic inflammatory atrophy (PIA) and PCa in dogs and verify the role of these proteins in the progression to prostate cancer. A tissue microarray (TMA) slide was constructed and immunohistochemistry with antibodies C-MYC, NKX3.1 and E-cadherin was performed with peroxidase method and DAB. Chi-square or Fisher exact test was used to determine the association between the categorical variables. The evaluation of the C-MYC oncogene protein showed higher cytoplasmic positivity in canine PCa and PIA compared to BPH (p= 0.0068). We observed a decrease of NKX3.1 expression in 94.75% of PCa, 100% of PIA in comparison to BPH (p=0.0022). E-cadherin expression was higher in BPH and PIA in comparison to PCa, with no statistical difference. The carcinogenesis process of canine prostatic lesion may be related to gain of CMYC and loss of NKX3.1

Made available in DSpace on 2016-09-27T13:40:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-14. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:47Z : No. of bitstreams: 1 000868427.pdf: 2229753 bytes, checksum: 9e6c100a68b4e114a933894c9bd961ed (MD5) / A próstata é uma glândula anexa do sistema genital masculino, encontrada apenas em mamíferos, cuja principal função é produzir parte do fluido seminal. As lesões prostáticas surgem mais comumente em homens de meia idade e o câncer prostático (CaP) é o mais diagnosticado e a segunda causa de mortes por câncer entre os homens na América e nos países da Europa Ocidental. O microambiente extracelular trata-se de uma complexa rede que compreende a matriz extracelular (MEC) e moléculas reguladoras. A MEC possui papel fundamental na regulação de numerosos eventos celulares, tais como adesão, proliferação, diferenciação, entre outros. Um fino equilíbrio é mantido entre a síntese e degeneração de seus componentes, e quando desregulado pode causar dano tecidual e câncer. Na próstata, as interações entre o tecido epitelial e seu estroma são responsáveis em manter a função fisiológica normal, por meio de restrições proliferativas e migratórias. Quando o câncer se desenvolve, células transformadas perdem essas restrições, enquanto o estroma se adapta para sustentar a função do tumor. Sabe-se que as células tumorais com potencial invasivo adquirem fenótipo migratório associado ao aumento na expressão de genes envolvidos na motilidade celular, permitindo a essas células responder a sinais oriundos do microambiente tumoral. Assim, o nosso estudo teve como objetivo estudar a ação da fibronectina, uma molécula de adesão da MEC, sobre a migração de células tumorais prostáticas e a expressão de moléculas envolvidas nesse processo. Para isso, realizamos a exposição das células LNCaP e PC-3 à fibronectina na concentração de 25 μg/mL e analisamos viabilidade celular, morfologia, número total de nucléolos, atividade e localização das metaloproteinases de matriz -2 e -9 e o processo de migração celular. A exposição à fibronectina não alterou viabilidade celular e morfologia, mas aumentou... / The prostate is a gland attached to the male genital system, found only in mammals, whose main function is to produce part of the seminal fluid. Prostatic lesions appear most commonly in middle-aged men and prostate cancer (PCa) is the most commonly cancer diagnosed and the second leading cause of cancer deaths among men in America and in Western European countries. The extracellular microenvironment is a complex network comprising extracellular matrix (ECM) and regulatory molecules. The ECM has a fundamental role in the regulation of many cellular events, such as adhesion, proliferation, differentiation, among others. A fine balance is maintained between the synthesis and degeneration of its components, and when unregulated can cause tissue damage and cancer. In the prostate, the interactions between the epithelial tissue and its stroma are responsible for maintaining normal physiological function through proliferative and migratory restrictions. When cancer develops, transformed cells lose these restrictions, while the stroma is adapted to support the function of the tumor. It is known that tumor cells with invasive potential acquire migratory phenotype associated with increased expression of genes involved in cell motility, allowing these cells to respond to signals from the tumor microenvironment. Thus, our study aimed to study the action of fibronectin, an ECM adhesion molecule, on migration of prostate cancer cells and the expression of molecules involved in this process. To achieve this goal, we performed the exposure of LNCaP and PC-3 cells to fibronectin in the concentration of 25 mg / mL and analyzed cell viability, morphology, total number of nucleoli, location and activity of matrix metalloproteinases -2 and -9 and the process of cell migration. Exposure to fibronectin did not alter cell viability and morphology, but increased the amount of nucleoli, as well as marking and the activity of MMP -2 and -9 and decreased migration...

Orientador: Sérgio Luis Felisbino / Coorientador: Elenice Deffune / Banca: Sylvia Stuchi Maria-Engler / Banca: Rosana Rossi-Ferreira / Banca: Patrícia Pintor dos Reis / Banca: Wagner José Favaro / Banca: José Andrés Yunes / Banca: José Roberto Bosqueiro / Banca: José Carlos Souza Trindade Filho / Resumo: O câncer de próstata (CaP) é importante causa de morte no mundo. Além do óbvio impacto na vida pessoal do paciente e na sua família, no Brasil esta doença gera custos altíssimos para o Sistema Único de Saúde (SUS), desde o diagnóstico até o óbito. As terapias disponíveis, além de causarem complicações e efeitos colaterais indesejáveis, não proporcionam sobrevida alta ao paciente. Além disso, os casos de cura são restritos aos diagnosticados precocemente, e com intervenção rápida, antes que o tumor se torne resistente à castração química. Neste sentido, estratégias preventivas são desejáveis para a diminuição da incidência e óbitos e, dentre elas, o uso da finasterida, um fármaco inibitório da enzima 5-α-redutase, foi proposto como potencial agente quimiopreventivo após estudo conduzido pelo Prostate Cancer Prevention Trial, que demonstrou significante diminuição na incidência de CaP no grupo de pacientes tratados, em comparação ao grupo controle. No entanto, mesmo com resultados promissores, foi detectado aumento, também significante, do número de casos de cânceres mais agressivos (alto grau) no grupo de pacientes que recebeu finasterida, em comparação aos pacientes do grupo controle. Após intenso debate entre urologistas, biologistas e cancerologistas, ainda não há consenso sobre a natureza artefatual ou de real indução de cânceres mais agressivos pela finasterida. O órgão regulatório americano Food and Drugs Administration (FDA) declarou que o aumento dos casos agressivos pela finasterida não deve ser negligenciado, e recentemente proibiu o uso deste fármaco como quimiopreventivo para o CaP. Uma vez que casos agressivos de câncer estão comumente relacionados à superexpressão de enzimas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Prostate cancer (PCa) is an important death cause in Brazil and other countries. Besides the obvious impact at patient's life, and their relatives, this disease consumes exorbitant resources from the Sistema Único de Saúde (SUS), from diagnosis to death. The available therapies not only cause undesirable complications and side effects, but also are inefficient at providing good survival expectancies for those affected. Moreover, the cure is only possible when the tumors are readily found and when the intervention is fast enough to prevent that the tumor become castration-resistant. In this sense, preventive strategies are desirable in order to lower incidence and death, and amongst them, finasteride (Fin) treatment, an inhibitor of the 5-alpha reductase enzyme, was proposed as a potential chemopreventive agent after the study conducted by the Prostate Cancer Prevention Trial reported a significant lower incidence of PCa cases on Fin-treated patients, when compared to control patients. However, even though these results were promising, this study also reported a significant increase on more aggressive, high-grade PCa, amongst Fin-treated patients, compared to those not exposed to Fin. After an intense debate about factual or artifactual Fin-induced high-grade PCa cases, between urologists, biologists and oncologists, there are still no decisive conclusions on this matter. The regulatory USA organ, Food and Drugs Administration (FDA), has recently declared that the higher incidence of a more serious form of PCa at the Fin-treated patients must not be neglected, and prohibited its use as a chemopreventive agent. Given that the aggressive cancer cases are commonly associated with the super-expression of matrix metalloproteinases (MMPs) enzymes, with consequently higher invasion and migration potential of tumor... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Flávia Karina Delella / Banca: Elenice Deffune / Banca: Sérgio Luis Felisbino / Resumo: A próstata é uma glândula anexa do sistema genital masculino, encontrada apenas em mamíferos, cuja principal função é produzir parte do fluido seminal. As lesões prostáticas surgem mais comumente em homens de meia idade e o câncer prostático (CaP) é o mais diagnosticado e a segunda causa de mortes por câncer entre os homens na América e nos países da Europa Ocidental. O microambiente extracelular trata-se de uma complexa rede que compreende a matriz extracelular (MEC) e moléculas reguladoras. A MEC possui papel fundamental na regulação de numerosos eventos celulares, tais como adesão, proliferação, diferenciação, entre outros. Um fino equilíbrio é mantido entre a síntese e degeneração de seus componentes, e quando desregulado pode causar dano tecidual e câncer. Na próstata, as interações entre o tecido epitelial e seu estroma são responsáveis em manter a função fisiológica normal, por meio de restrições proliferativas e migratórias. Quando o câncer se desenvolve, células transformadas perdem essas restrições, enquanto o estroma se adapta para sustentar a "função" do tumor. Sabe-se que as células tumorais com potencial invasivo adquirem fenótipo migratório associado ao aumento na expressão de genes envolvidos na motilidade celular, permitindo a essas células responder a sinais oriundos do microambiente tumoral. Assim, o nosso estudo teve como objetivo estudar a ação da fibronectina, uma molécula de adesão da MEC, sobre a migração de células tumorais prostáticas e a expressão de moléculas envolvidas nesse processo. Para isso, realizamos a exposição das células LNCaP e PC-3 à fibronectina na concentração de 25 μg/mL e analisamos viabilidade celular, morfologia, número total de nucléolos, atividade e localização das metaloproteinases de matriz -2 e -9 e o processo de migração celular. A exposição à fibronectina não alterou viabilidade celular e morfologia, mas aumentou... / Abstract: The prostate is a gland attached to the male genital system, found only in mammals, whose main function is to produce part of the seminal fluid. Prostatic lesions appear most commonly in middle-aged men and prostate cancer (PCa) is the most commonly cancer diagnosed and the second leading cause of cancer deaths among men in America and in Western European countries. The extracellular microenvironment is a complex network comprising extracellular matrix (ECM) and regulatory molecules. The ECM has a fundamental role in the regulation of many cellular events, such as adhesion, proliferation, differentiation, among others. A fine balance is maintained between the synthesis and degeneration of its components, and when unregulated can cause tissue damage and cancer. In the prostate, the interactions between the epithelial tissue and its stroma are responsible for maintaining normal physiological function through proliferative and migratory restrictions. When cancer develops, transformed cells lose these restrictions, while the stroma is adapted to support the "function" of the tumor. It is known that tumor cells with invasive potential acquire migratory phenotype associated with increased expression of genes involved in cell motility, allowing these cells to respond to signals from the tumor microenvironment. Thus, our study aimed to study the action of fibronectin, an ECM adhesion molecule, on migration of prostate cancer cells and the expression of molecules involved in this process. To achieve this goal, we performed the exposure of LNCaP and PC-3 cells to fibronectin in the concentration of 25 mg / mL and analyzed cell viability, morphology, total number of nucleoli, location and activity of matrix metalloproteinases -2 and -9 and the process of cell migration. Exposure to fibronectin did not alter cell viability and morphology, but increased the amount of nucleoli, as well as marking and the activity of MMP -2 and -9 and decreased migration... / Mestre

Orientador: Wellerson Rodrigo Scarano / Resumo: The mono-n-butyl phthalate (MBP) is the active metabolite of di-n-butyl phthalate (DBP), a plasticizer commonly used for industrial products, including medical devices, flexible plastics and cosmetics, has been described as an endocrine disruptor with estrogenic and anti-androgenic function, depending on the dose and the exposure period, particularly by interfering with the development of the male reproductive system. It is believed that some of the effects of endocrine disruptors are mediated by the non-classical estrogen G protein-coupled receptor - GPER1 (GPR30). In view of the worldwide problems regarding to degradation of plastics and their dispersion in the environment, and earlier evidences showed that phthalates have effects on the development and maturation of the prostate increasing the incidence of inflammatory and dysplastic lesions in rodents, this study aimed to evaluate the effect of MBP on androgen dependent prostate cancer cells (LNCaP) by modulating the activity of GPER1 (through its antagonist, G15). The LNCaP cells, maintained in RPMI culture, were expanded and treated in an incubator with 5% CO2 humid atmosphere at 37 ° C. The MBP dose to be used was 10 uM, selected from the following MTT cytotoxicity test (3- [4.5-dimethylthiazol-2yl] -2,5-diphenyl tetrazolina bromide). Thus were established the following treatment protocols: control: RPMI + 0.03% DMSO; MBP: 10 uM of MBP diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; G15: 8 uM of G15 diluted in DMSO (0.03%) + RPMI; M+G... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: O mono-n-butil-ftalato (MBP), metabólito ativo do di-n-butil-ftalato (DBP), plastificante usualmente utilizado em produtos industrializados, incluindo dispositivos médicos, plásticos flexíveis e cosméticos, tem sido descrito como um desregulador endócrino com função estrogênica e anti-androgênica dependendo da dose e do período de exposição, interferindo principalmente com o desenvolvimento do sistema genital masculino. Acredita-se que os efeitos de alguns desreguladores endócrinos sejam mediados pelo receptor estrogênico não clássico acoplado à proteína G - GPER1 (GPR30). Tendo em vista a problemática mundial com relação à degradação dos materiais plásticos e sua dispersão no meio ambiente e diante de evidências que mostraram que os ftalatos exercem efeitos sobre o desenvolvimento e maturação da próstata aumentando a incidência de lesões inflamatórias e displásicas em roedores, este estudo teve por objetivo avaliar a ação do MBP sobre células cancerígenas prostáticas dependentes de andrógeno (LNCaP), modulando a atividade do GPER1 (através de seu antagonista, G15). As células da linhagem LNCaP, mantidas em meio de cultura RPMI, foram expandidas e tratadas em estufa com 5% de CO2 e atmosfera úmida a 37ºC. A dose de MBP a ser utilizada foi de 10 µM, selecionada após o teste de citotoxicidade do MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2yl]-2,5-difenil brometo de tetrazolina). Dessa forma foram constituídos os seguintes protocolos de tratamento: Controle: RPMI + DMSO 0,03%; MBP: 10 µM de M... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

The prostate cancer in initial stages is completely asymptomatic. It is detected in routine exams by digital rectal exam. The diagnosis by PSA must be followed by a rectal ultrasonography being necessary the development of diagnostic platforms that may generate fast results with specificity, sensibility and low costs, features found on biological sensors. Among these biosensors, there are those based on DNA. Polymers as poly(aminophenols) are support matrices and can be used for the immobilization of biomolecules due to their features such as excellent permeability, selectivity, reproducibility and fast response. It was possible the electropolymerization of 2-aminophenol and 3-aminophenol. This polymer presents a self-limited growth and non-conducting behavior, confirmed in solution containing the redox pair Fe2+/Fe3+ while that polymer presents a polymeric film with conducting properties. These data are corroborated by EIS through analysis of resistance values, low for poly(2-aminophenol) and high for poly(3-aminophenol). Measurements of mass made by MECQ points a greater amount of polymeric film for poly(3-aminophenol) than for poly(2-aminophenol). Increasing the pH values results in a shift on the potential of the monomer oxidation to more cathodic potentials and a decreasing on the current values. SEMs and AFMs show rough films with different thickness, thinner to poly(3-aminophenol). FTIR results suggest possible polymerization through NH2 with the presence of free OH bands, due to the possibility of C-N-C bounds of secondary aromatic amines. The detection of purinic and pyrimidinic bases, isolated and in a mix, was possible showing that the interactions between them and the polymeric films occur by a similar mechanism. Experiments of immobilization of prostate cancer specific PCR products, with 277 base pairs were performed, denatured and hybridizated with ferrocenecarboxyaldheyde as mediator for the detection process. It is possible the construction of modified electrodes with polymeric films derived from 2-aminophenol and 3-aminophenol, presenting distinct spectroscopic and electrochemical properties. The polymers can be used as DNA nitrogenated bases detection matrices and they have the possibility of being used for biosensor construction. / O câncer de próstata em estágio inicial é completamente assintomático, só sendo detectado em exames de rotina pelo exame de toque retal. Os diagnósticos pelo PSA ainda devem ser seguidos de uma ultrasonografia retal, sendo necessário o desenvolvimento de plataformas diagnósticas que possam gerar resultados com rapidez, especificidade, sensibilidade e baixo custo, características encontradas nos sensores biológicos. Dentre esses biossensores, existem aqueles baseados em DNA. Polímeros, tais como poli(aminofenóis) são matrizes suporte e podem ser utilizadas para a imobilização de biomoléculas devido às características que apresentam, tais como, excelente permeabilidade, seletividade, reprodutibilidade e tempo de resposta rápida. Foi possível a eletropolimerização de 2-aminofenol e 3-aminofenol. O polímero deste apresenta um crescimento auto-limitado e características não-condutoras, confirmadas em solução contendo o par redox Fe2+/Fe3+ enquanto que o polímero daquele apresenta um filme polimérico com características condutoras. Esses dados são corroborados por EIE, através de análise dos valores de resistência, baixos para o poli(2-aminofenol) e altos para o poli(3-aminofenol). Medidas de massa realizadas por MECQ indicam uma maior quantidade de filme polimérico formado para o poli(3-aminofenol) do que para o poli(2-aminofenol). Aumentando o pH das soluções ocorre um deslocamento no potencial de oxidação do monômero para potenciais mais catódicos e uma diminuição nos valores de corrente. MEVs e MFAs mostram filmes com características rugosas e espessuras diferentes, mais finos para o poli(3-aminofenol). Os resultados por FTIR sugerem possível polimerização via NH2 com presença de bandas de -OH livres, pela possibilidade de ligações tipo C-N-C de bandas de aminas aromáticas secundárias. A detecção das bases purínicas e pirimidínicas isoladas e em uma mistura única foi possível mostrando que as interações entre elas e os filmes poliméricos ocorrem por um mecanismo similar. Foram realizados experimentos de imobilização dos produtos de PCR específicos para câncer de próstata, com 277 pares de base, desnaturados e hibridizados, com a utilização do ferrocenocarboxialdeído como mediador do processo de detecção. É possível a construção de eletrodos modificados com filmes poliméricos derivados de 2-aminofenol e 3-aminofenol, apresentando características espectroscópicas e eletroquímicas distintas. Os polímeros podem ser usados como matrizes de detecções de bases nitrogenadas de DNA e para construção de biossensores. / Mestre em Química

Atualmente tem se discutido uma possível relação entre obesidade e câncer de próstata. No entanto, a obesidade está associada a desordens multifatoriais (hiperglicemia, hiperinsulinemia, dislipidemia, inflamação) e avaliar o impacto delas em células normais e tumorais é de grande relevância para a elaboração de estratégias terapêuticas. A metformina é uma droga antidiabética que apresenta efeitos antiproliferativos e tem sido apontada como tratamento para o câncer. Entretanto, sua eficiência em condições de intenso estímulo proliferativo ainda é desconhecida. Assim, este estudo objetivou analisar o efeito de altas concentrações de ácido graxo e/ou insulina, com ou sem metformina,em células normais e tumorais de próstata, com ênfase no perfil de proliferação e migração destas células. Foram utilizadas duas linhagens de células epiteliais humanas de próstata, sendo elas normais (PNT1A) e tumorais (PC3). Estas células foram tratadas com altas concentrações de ácido graxo saturado (100 gM palmitato, HF), e/ou insulina (50gU), na presença ou ausência de metformina (100 gM), por 24hrs ou 48hrs. Posteriormente, estas células foram submetidas às análises de apoptose, viabilidade/proliferação celular (MTT), migração e imunofluorescência para vimentina. Os resultados mostram que, de maneira geral, os tratamentos nas concentrações usadas não causaram morte celular nas células estudadas. O MTT revelou que as células PNT1A e PC3 proliferaram em maior quantidade quando tratadas com altas concentrações de ácido graxos (HF) e de insulina (HI) após as primeiras horas de tratamento. O mesmo resultado não foi observado para o grupo HFI. A metformina por si só estimulou a proliferação celular, mas em associação à HF foi capaz de reduzi-la em ambas as linhagens. Contudo, ela não inibiu a proliferação celular desencadeada por HI nas células normais.As análises de migração mostraram que PNT1A foram estimuladas a migrar para todos os tratamentos, enquanto PC3 foi influenciada somente por HF. A metformina inibiu a migração estimulada por todos eles. Em paralelo à migração, foi observado que os tratamentos HF e HI para PNT1A e HF para PC3 estimularam a maior expressão de vimentina, demonstrando maior transição epitélio mesenquima nessas células, e, consequentemente, estimulando a migração celular. A metformina inibiu a expressão de vimentina estimulada pelos meios tanto nas células normais como nas tumorais. Assim, conclui-se que as altas concentrações de ácido graxo saturado e insulina interferem nas células prostáticas estimulando atividades celulares que sabidamente influenciam na carcinogênese, tais como proliferação e migração celular.A metformina foi capaz de reverter boa parte das alterações estimuladas por esses meios, se mostrando uma boa ferramenta no controle da proliferação e migração celular em situações de hiperlipidemia e hiperinsulinemia. Assim, o potencial dessa droga para a terapia de pacientes obesos que sabidamente apresentam maior risco para câncer de próstata deverá ser investigado. / A potential association between obesity and prostate cancer has been proposed by several studies. Obesity is related with multifactorial disorders, such as hyperglycemia, hyperinsulinaemia, dyslipidemia, and inflammation. Regarding the impact of such disorders on normal and tumor cells is of great relevance for the development of therapeutic strategies. Metformin, an antidiabetic drug, has antiproliferative effects, being proposed as a cancer treatment. However, under intense proliferative stimulation conditions, its efficiency is still uncertain. The main objective of the present study was to analyze the effects of fatty acid and/or insulin under high concentrations, in the presence or not of metformin, on normal and prostate tumor cells, regarding their proliferation and migration profile. Two human prostate epithelial cell lines were used: non cancer (PNT1A) and tumor (PC3). These cells were treated with high concentrations of saturated fatty acid (100 gM palmitate, HF), and/or insulin (50 gU) in the presence or absence of metformin (100 gM) for 24 or 48 hours. After treatments we performed analyzes for caspase, cell viability/proliferation (MTT), migration and immunofluorescence for vimentin. The results showed that the concentration of all treatments was not cytotoxic. MTT revealed that PNT1A and PC3 cells had higher proliferation when treated with HF and HI after the first few hours of treatment. Similar results were not found for the HFI group. Metformin alone has stimulated cell proliferation, but in association with HF, has reduced it in both cell lines. However it did not inhibit the proliferative action of HI in PNT1A cells. Migration analyzes showed that PNT1A were stimulated to migrate after all treatments, whilst PC3 was influenced only by HF and that metformin inhibited the migration stimulated by all of them. Both HF and HI treatments in PNT1A and HF in PC3 stimulated greater vimentin expression, resulting in a larger epithelium-mesenchymal transition in these cells, which, in turns, has stimulated cell migration. Metformin inhibited vimentin expression in both normal and tumor cells. It is possible to conclude that higher concentrations of saturated fatty acid and insulin influence prostatic cells, stimulating cellular activities that could trigger carcinogenesis and/or sustain cancer progression, such as cell proliferation and migration. Most of these stimuli were inhibited by using Metformin, being efficient in the control of cell proliferation and migration in conditions of hyperlipidemia and hyperinsulinemia. Thus, the efficiency of this drug for obese patients therapy, which is a potential group for prostrate cancer risk, should be investigated. / Dissertação (Mestrado)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-05T19:34:28Z No. of bitstreams: 1 2014_SarahCaixêtaCardoso.pdf: 1606140 bytes, checksum: 8b76d403152c961113043d6b912e3933 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-06T18:36:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_SarahCaixêtaCardoso.pdf: 1606140 bytes, checksum: 8b76d403152c961113043d6b912e3933 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-06T18:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_SarahCaixêtaCardoso.pdf: 1606140 bytes, checksum: 8b76d403152c961113043d6b912e3933 (MD5) / O câncer de próstata é o tumor mais comum diagnosticado em homens. As opções terapêuticas incluem a prostatectomia, radioterapia e até mesmo a vigilância ativa, em estágio inicias. Para doença em estágio avançado é indicada terapia local definitiva combinada com radioterapia adjuvante e/ou terapia hormonal de privação androgênica, porém sua eficácia é limitada. Assim os produtos naturais têm um papel importante como fonte na busca de novos agentes antitumorais. A biodiversidade brasileira, destacando o bioma Cerrado por sua enorme variedade de espécies, vem se tornando alvo importante na busca de novas biomoléculas com potencial terapêutico. O presente estudo tem como objetivo investigar a existência de atividade citotóxica de extratos de plantas e extratos de fluido de cultivo de fungos em linhagens de células de adenocarcinoma de próstata humano. Sob cultivo de duas linhagens de adenocarcinoma de próstata humano LNCaP clone FGC (sensível a androgênios), e PC3 (resistente a androgênios), e de uma linhagem controle de queratinócitos humanos normais (HaCat), foram investigados 31 extratos obtidos de plantas e 11 extratos de fluido de cultivo de fungos. O ensaio de viabilidade celular foi utilizado para avaliar a citotoxicidade e a curva dose-resposta. Foi analisado o perfil de morte celular e alterações no ciclo celular por meio de citometria de fluxo, utilizando kit comercial de anexina V e iodeto de propídeo. Foi realizada microscopia eletrônica de transmissão (MET) com o intuito de confirmar morfologicamente o perfil de morte celular. A fim de identificar compostos presentes nos extratos utilizou-se cromatografia em camada delgada. Entre os 31 extratos analisados, 12 extratos de plantas e 3 extratos de fluido de cultivo de fungos apresentaram atividade citotóxica maior que 50% em linhagem de adenocarcinoma de próstata andrógeno sensível (LNCaP). Sete extratos de plantas e 2 de fluido de cultivo de fungos apresentaram resposta dose dependente e índice de seletividade maior para a célula LNCaP. Estes apresentaram tendência a apoptose inicial e tardia e 4 extratos apresentaram parada do ciclo celular na fase G0/G1 estatisticamente significativa. Na análise global do efeito citotóxico em LNCaP, considerando também os índices de seletividade, destacaram-se os extratos de: Pouteria ramiflora caule etanólico (E), Pouteria torta fruto E, Bauhinia rufa folha E, Sapindus saponaria fruto E e Alamanda blanchetii folha E. Na linhagem PC3, 10 extratos de plantas apresentaram inicialmente resposta citotóxica maior que 50%, porém apenas 3 apresentaram resposta dose dependente. Destacaram-se extratos de B. rufa e P. caimito, com repressão significativa do ciclo celular e indução expressiva de apoptose tardia. Foi possível obter imagens de MET apenas de células LNCaP tratadas com A. blanchetii fruto E e de células PC3 tratadas com A. blanchetti folha hexânico (H), que confirmaram os achados pela citometria. Os compostos acetato de lupeíla, friedelenol e acetato de α amirina foram identificados nos extratos Pouteria ramiflora caule E e Pouteria torta fruto E. Todos os extratos com atividade citotóxica identificados foram etanólicos ou hexânicos. Os extratos citotóxicos identificados possuem potencial como fonte natural de compostos ativos e estudos futuros são necessários para caracterização de sua atividade farmacológica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Prostate cancer is the most common cancer diagnosed in men. Therapeutic options include prostatectomy, radiation therapy and active surveillance for initial stage tumors. For advanced disease, definitive local therapy combined with adjuvant radiotherapy and / or androgen deprivation hormone therapy are indicated, but their effectiveness is limited, with high mortality. Due to limited therapeutic options, natural products have an important role as a source for discovery of new antineoplastic agents. Brazilian biodiversity, particularly the Cerrado biome and its huge variety of species, is becoming an increasingly important target for the search of new biomolecules with therapeutic potential. The present study aimed to investigate the existence of anti-proliferative activity of plant and fungi extracts in cell lineages of human prostate adenocarcinoma. Under cultivation of two human prostate adenocarcinoma cell lineages, LNCaP clone FGC (androgen-sensitive) and PC3 (androgen-resistant), and a control cell lineage of human keratinocytes (HaCaT), 31 extracts of plants and 11 extracts of culture fluid of fungi were investigated. Cell viability assay was used to assess the cytotoxicity and to determine the dose-response curves. Cell death profile and changes in cell cycle were analyzed by flow cytometry, using propidium iodide and annexin V commercial kits. Transmission electron microscopy was performed to confirm the morphological profile of cell death. Thin layer chromatography was used to identify compounds in selected extracts, which presented significant time- and dose-dependent activity. Among 31 analyzed extracts, 12 extracts of plants and three extracts of culture fluid of fungi showed cytotoxicity greater than 50% in LNCaP cell lineage. Seven plant extracts and 2 extracts of culture fluid of fungi were shown to have a dose-dependent cytotoxic effect, with higher selectivity for cancer cell lineage LNCaP. These extracts showed a tendency to induce early and late cellular apoptosis and 4 extracts exerted a statistically significant inhibitory effect on cell cycle. Upon global analysis of the cytotoxic effect on LNCaP, including the selectivity index, the following extracts showed the most featured effects: Pouteria ramiflora stem ethanolic (E), Pouteria torta fruit E, Bauhinia rufa sheet E, Sapindus saponaria fruit E and Alamanda blanchetii leaf E. In the androgen-resistant PC3 cell lineage, plant extracts showed a cytotoxic effect initially greater than 50%, but for only 3 extracts 10 this effect was dose-dependent. The most prominent effects were observed for extracts from B. rufa and P. caimito, which induced significant cell cycle arrest and late apoptosis. It was possible to obtain images of LNCaP cells treated only with A. blanchetii E, and PC3 cells treated with A. blanchetti sheet H, which confirmed the findings by flow cytometry. The compounds lupeyl acetate, friedelenol and α amyrin acetate were identified in extracts Pouteria ramiflora stem and Pouteria torta fruit E. All cytotoxic extracts identified were E or H. The cytotoxic plant extracts identified herein represent a potential natural source of active compounds. Future studies are needed to characterize their pharmacological activity.

Orientadores: Christine Hackel, Juergen K. V. Reichardt, Maricilda P. Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T00:27:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_LucioFabioCaldas_D.pdf: 2604031 bytes, checksum: c313be68a5b9599e035866a8ee12ef8c (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O hormônio androgênico di-hidrotestosterona (DHT) possui fundamental importância na diferenciação sexual masculina e no desenvolvimento e manutenção da próstata. Duas enzimas atuam diretamente na concentração deste andrógeno nas células: 1) com uma função anabólica, a enzima 5α-redutase tipo 2 (gene SRD5A2) é responsável pela síntese de DHT ao converter testosterona (T) em 5α-di-hidrotestosterona e 2) com uma função catabólica, a enzima 3β- hidroxi desydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase de esteróides tipo 2 (gene HSD3B2) é responsável pela degradação do DHT, além de contribuir para síntese indireta de testosterona por uma via anabólica. Isto exposto, cenários distintos se apresentam considerando as atividades deficientes dessas enzimas: i) a deficiência congênita da enzima 5a-redutase tipo 2 conduz a uma forma específica de pseudohermafroditismo masculino (PHM) no qual a conversão de T em DHT está nula ou defeituosa, inviabilizando a virilização normal da genitália externa em indivíduos com cariótipo 46,XY e ii) em razão das propriedades bifuncionais da enzima 3β-HSD2, tanto na via de síntese quanto de degradação de andrógenos, sua deficiência congênita pode conduzir a quadros clínicos distintos de ambigüidade genital. No adulto, mutações somáticas que afetem sua atividade enzimática podem contribuir para a manifestação do câncer de próstata, pelo acúmulo do DHT. O presente trabalho aborda as duas enzimas esteroidogênicas envolvidas com o metabolismo da DHT, buscando caracterizar mutações germinativas e/ou somáticas que conduzem a deficiências enzimáticas relacionadas a diferentes condições clínicas. Com relação à deficiência em 5a-redutase tipo 2, investigou-se a presença de mutações germinativas no gene SRD5A2 em amostras de DNA 20 pacientes de sexo genético masculino com suspeita de deficiência em 5α-redutase tipo 2, pertencentes a 18 famílias brasileiras, por meio de sequenciamento direto dos produtos de PCR dos cinco exons do gene e de suas regiões flanqueadoras. Foram identificadas alterações moleculares em 18 desses pacientes, compreendendo tanto mutações não anteriormente referidas na literatura (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A), como mutações recorrentes já descritas em outros grupos étnicos ou em indivíduos de outras regiões geográficas. Os resultados detalhados, bem como a discussão, acham-se apresentados no Capítulo III.1, sob a forma de artigo publicado. (...continua) / Abstract: The androgenic hormone dihydrotestosterone (DHT) has fundamental relevance in normal male sexual differentiation and in prostate development and maintenance. Two enzymes act directly on the regulation of DHT concentration at cellular level: 1) with an anabolic function the steroid 5α-reductase type 2 enzyme (SRD5A2 gene) leads to DHT synthesis by converting testosterone (T) in 5α-dihydrotestosterone and 2) with a catabolic pathway the 3β-hydroxysteroid dehydrogenase/Δ5-Δ4-isomerase type 2 enzyme (HSD3B2 gene) is responsible for DHT degradation, besides contributing to indirect synthesis of testosterone in an anabolic pathway. Thus, different scenarios can be considered regarding the deficiencies in the activities of these enzymes: i) congenital steroid 5α-reductase type 2 enzyme deficiency leads to a specific form of male pseudohermaphroditism (MPH), where the conversion of T into DHT is defective or inexistent, preventing normal virilization of the external genitalia in individuals with a 46,XY karyotype; and ii) due to the bi-functional properties of the 3β-HSD2 enzyme, either at synthetic or degradation androgen pathways, its congenital deficiency can lead to distinct manifestations of genital ambiguity. Furthermore, in the adult, somatic mutations that affect 3β-HSD2 enzymatic activities could contribute to prostate cancer manifestation, due to DHT accumulation. The present work approaches these two steroidogenic enzymes involved with the DHT metabolism, aiming to characterize germinal and/or somatic mutations leading to enzymatic deficiencies related to different clinical conditions. Concerning the steroid 5α- reductase type 2 deficiency, we screened for germinal mutations on SRD5A2 gene in DNA samples of 20 patients from 18 Brazilian families with suspected SRD5A2 deficiency, by directly sequencing of the PCR products from the five exons and flanking regions of the gene. Molecular alterations were detected in 18 of these patients, comprising either mutations not previously reported in the literature (G158R, del642T, 217_218insC e IVS3+1G>A) as well as recurring mutations already described in other ethnical groups or in individuals from other geographical regions. The detailed results and corresponding discussion are presented at Chapter III.1, as a published paper. (¿to be continued) / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular