Fungos do gênero Trichoderma apresentam potencial para o controle de fitopatógenos e para a promoção do crescimento vegetal. Pesquisas com diferentes culturas comprovam essa capacidade e agregam informações sobre os mecanismos de ação desses bioagentes, contudo, ainda são pouco conhecidos os mecanismos de ação na promoção do crescimento em ausência de fitopatógenos. Além disso, o controle químico de doenças de plantas não é totalmente eficiente, uma vez que o patógeno penetra no tecido vascular da planta. Diante disso, este trabalho teve como objetivos, nos três capítulos apresentados, avaliar a fungitoxicidade dos herbicidas Glifosato e Sulfentrazone sobre o crescimento micelial e a esporulação de Trichoderma isolados do solo no Tocantins; avaliar o efeito da inoculação de isolados de Trichoderma em mudas de mamão em casa de vegetação e avaliar a contagem de esporos e viabilidade de conídios de Trichoderma de diferentes espécies utilizando dois substratos, arroz comum (Oryza sativa) e milheto (Pennisetum glaucum). O herbicida glifosato não afetou o crescimento micelial radial dos isolados UFT 204 e UFT 202, para os demais isolados os herbicidas promoveram uma pequena redução no número de esporos de Trichoderma. Para a inculação em mamão, todos os isolados propicionaram crescimento das plantas em todas as variáveis analisadas, com e sem fosfato natural, comparando com a testemunha. O isolado UFT 201 foi superior para massa seca da parte aérea, o isolado UFT 202 para massa seca da raiz e MIX para massa seca total com fosfato natural. Sem fosfato natural o tatamento MIX foi superior aos demais em todas as variáveis. As avaliações em substratos após o período de incubação de sete dias, nota-se que os isolados UFT 25, UFT 63, UFT 313 e UFT 14 foram os que obtiveram a maior esporulação com médias variando de 2,3 x 109 (UFT 14) e 2,7 x 109 (UFT 25) esporos g-1 em arroz integral e 3,9 x 109 (UFT 79) esporos g-1, em milheto. Os isolados UFT 313, UFT 14, UFT 37, UFT 79, UFT 205, UFT 201 e UFT 314, demonstrou excelente esporulação e viabilidade entre os substratos, com porcentagens de 98 a 100% de germinação dos conídios ml-1, e 94 a 100% para os UFT 313, UFT 79, UFT 205, UFT 201 UFT 25 e UFT 37 em milheto. Para os teste de compatibilidade os isolados UFT 25 x UFT14, UFT25 x UFT313, UFT 63 viiix UFT37 demostraram interação significativa pelo teste quando comparado por cultura mista entre micélio. / Fungi of the genus Trichoderma present potential for the control of phytopathogens and to promote plant growth. Different research cultures prove this ability and aggregate information about the mechanisms of action of these bioagentes, however, are still little known mechanisms of action in promoting growth in the absence of plant pathogens. In addition, the chemical control of plant diseases is not fully effective, since the pathogen penetrates the vascular tissue of the plant. Given this, this work had as objectives in three chapters presented, evaluating the fungitoxicidade of the herbicides Glyphosate and Sulfentrazone on the mycelial growth and sporulation of Trichoderma isolated from the soil in Tocantins; determine the effect of inoculation of Trichoderma in papaya seedlings in the greenhouse and assess spore count and viability of conidia of Trichoderma in different species using two substrates, rice (Oryza sativa) and pearl millet (Pennisetum glaucum). The herbicide glyphosate did not affect mycelial radial growth of the isolates UFT 202 and UFT 204, for other isolated herbicides promoted a small reduction in the number of spores of Trichoderma. For the inculação in all the isolates papaya provided plant growth in all the analyzed variables, with and without natural phosphate, comparing with the witness. The isolated UFT 201 was superior to the dry mass, the isolated UFT 202 to root dry mass and MIX to total dry mass with phosphate. Without natural phosphate isolate MIX was superior to others in all variables. The reviews on substrates after an incubation period of seven days, note that the isolates UFT 25, UFT 63, UFT 313 and UFT 14 were those who obtained the highest sporulation with averages ranging from 2.3 x 109 (UFT 14) and 2.7 x 109 (UFT 25) spores g-1 in brown rice and 3.9 x 109 (UFT 79) spores g-1, in millet. The isolates UFT 313, UFT 14, UFT 37, UFT 79, UFT 201, UFT 205 and UFT 314, demonstrated excellent sporulation and viability among the substrates, with percentages of 98 to 100% germination of the conidia mL-1, and 94 to 100% UFT 313, UFT 79, UFT 205, UFT 25, UFT 201 and UFT 37 in millet. For the compatibility test the isolates UFT 25 x UFT14, UFT25 x UFT313, UFT 63 x UFT37 demonstrated interaction UFT significant by comparison test by mixed culture between mycelium.

Apesar da eficácia dos antimicrobianos como melhoradores no desempenho animal, questões relativas à seleção de microorganismos resistentes e transferência desses para o consumo humano de carne vêem trazendo uma crescente preocupação que tem provocado diminuição do seu uso. Assim, há necessidade da busca de alternativas, destacando-se as ervas medicinais, as quais apresentam ações, antimicrobiana, antioxidante, imunomodulatória e ainda, estimulante da secreção de enzimas digestivas. O objetivo do estudo foi avaliar a ação de um fito composto, produzido pela adição de partes aéreas secas e trituradas de plantas medicinais (Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Lippia sidoides e Lychnophora pinaster), em leitões, desde a creche até o abate, sobre parâmetros de desempenho, freqüência de diarréia, eliminação fecal de salmonelas, lesões histopatológicas intestinais e oxidação lipídica da carcaça. Os animais foram submetidos a duas situações: uma de desafio experimental (D, com inoculação de Salmonella typhimurium aos 35 dias de idade) e outra sem desafio (SD), permanecendo ambos grupos em salas isoladas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com arranjo fatorial 3x2, sendo um fator o desafio, e outro, a suplementação de aditivos na ração (fito composto FITO; antibióticos ATB; e controle negativo, sem adição de promotores CTRL). Foram alojados 120 leitões recém-desmamados aos 21 dias de idade, na unidade de creche do Laboratório de Pesquisa em Suínos. Os animais foram pesados aos 21, 35, 49, 63 dias (creche) aos 96 e 106 dias (crescimento) e 131 dias de idade (terminação), e verificado o consumo de ração. Foi avaliada a freqüência de dias com diarréia (FDD) na creche, além da eliminação fecal de S. typhimurium, observando-se lesões histopatológicas causadas pela bactéria no trato entérico, e oxidação lipídica da carcaça aos 131 dias de idade. Não houve interação entre aditivos e desafio para nenhuma variável estudada. O peso médio (PM) do grupo ATB foi mais elevado durante todos os períodos em relação a FITO e CTRL, e estes não diferiram entre si; no entanto, aos 96 e 106 dias, o PM dos animais CTRL foi maior que FITO. De 21 a 35 dias de idade, a conversão alimentar (CA) do grupo ATB foi significativamente menor que CTRL; no entanto, FITO promoveu valor intermediário, não diferindo estatisticamente de ambos. O desafio experimental levou à queda no consumo diário de ração (CDR) de 35 a 48 dias. No entanto, no período final de crescimento, houve um efeito compensatório sobre as variáveis de desempenho, sendo PM, ganho diário de peso (GDP), CDR e CA significativamente melhores na sala D. Ainda, nesse período, na sala D, todas essas variáveis foram melhores para FITO, apesar da diferença ser meramente numérica, sugerindo efeito compensatório desse aditivo. O ATB promoveu menor FDD dos 21 aos 48 dias; no entanto, dos 35 aos 48 dias, FITO promoveu uma melhora mais rápida no quadro que CTRL. Não houve influência dos aditivos sobre a eliminação fecal de salmonelas, lesões histopatológicas no trato entérico ou sobre a oxidação lipídica na carcaça. Assim, a melhor CA na creche, e o efeito compensatório no final da fase de crescimento justificam futuras pesquisas sobre a ação do produto. / Despite the proven efficiency of antibiotics as growth promoters, issues associated to selection of microbial resistance and its impact over human health are rising concern between consumers and decreasing their use. Therefore, alternatives must be found, and medical herbs, with antimicrobial, antioxidant, immunomodulatory and stimulatory of digestives enzymes properties, seem promising. This study was carried out in order to evaluate the action of a phyogenic compound of medical herbs (Rosmarinus officinalis, Mentha piperita, Lippia sidoides and Lychnophora pinaster) towards piglets from weaning to slaughter, on performance parameters (body weight BW; average daily gain ADG; average daily feed intake ADFI; and feed conversion FC), frequency of diarrhea, fecal shedding of salmonellas, gut hystopatological lesions and lipid oxidation of meat, either under a challenged condition (C) or a non-challenged condition (NC). Experimental challenge consisted of oral administration of Salmonella typhimurium to piglets, at 35 days of age. Both groups were kept in isolated rooms. Experimental design was at random, and the treatments distributed in a 3x2 factorial arrangement. Factors were: challenge (C and NC) and additives (phytogenic compound PHYTO; antibiotic ATB; and control CTRL). 120 weaned piglets (21 days years old) were housed at nursery unit of Laboratory of Researche in Swine (LPS), and weighted at 21, 35, 49, 63 (nursery), 96, 105 (growing) and 131 (finishing) days of age. There was not interaction between factors. BW of ATB group was higher througout the experimental period. From 21 to 35 days of age, FC of ATB group was significantly lower than CTRL; however, PHYTO showed intermediary value, which did not statistically differ from both ATB and CTRL. Challenge caused lower ADFI from day 35 to 48. Nevertheless, at the final of growing period (96 to 105 days of age), there was a compensatory effect on performance, and animals out of C room had showed better values of BW, ADG, ADFI, FC than NC. At C room, such parameters were better for animals out of PHYTO group (although the differences were merely numerical), suggesting thus a compensatory effect of this compound. ATB has lead to lower FDD from day 21 to 48; however, from day 35 to 48, FDD of PHYTO group was lower than CTRL. There was not effect of additives on fecal shedding of salmonellas and on lipd oxidation of carcass. Further studies on the effect of the phyto compound must be carried out, especially during the growing and finishing periods.

Este trabalho objetivou avaliar como a expressão de WNK4 (With No Lysine Kinase 4) é modulada por NFAT através da modulação por AngII (Angiotensina II) e Ciclosporina A (CsA). WNK4 é uma cinase que tem papel fundamental na regulação do transporte iônico ao longo do néfron distal, pois fosforila outras cinases (SPAK Proline Alanine-Rich Kinase e OSR1 Oxidative Stress Responsive 1) que fosforilam, e assim ativam, o co-transportador sódio-cloreto sensível aos tiazídicos (NCC), o que acarreta no aumento da reabsorção de sódio, cloreto e água, transporte esse sabidamente regulado pelo hormônio Angiotensina II. O estudo genético que revelou que mutações no gene de WNK geravam um quadro de hipertensão, hipercalemia e hipercalcemia, denominado de pseudohipoaldosteronismo tipo II (PHAII) ou Sídrome de Gordon, foi crucial para a descoberta da importância das WNKs. Este quadro é revertido quando se utiliza diuréticos tiazídicos, mostrando a relação com o NCC. Interessantemente, um quadro similar ocorre quando pacientes transplantados recebem tratamento com CsA. Estudos comprovam que AngII interfere agudamente no conteúdo da proteína de WNK4, por ativação da PKC e fosforilação da Kelchl3 (Kelh-like 3), culminando com inibição do complexo Ubiquitina-Ligase-E3, importante no processo de degradação da WNK4. Ainda não se sabe qual o papel do NFAT sobre a regulação de WNK4 e como AngII e CsA modulação a transcrição gênica de WNK4. Através dos métodos de westernblotting verificamos que CsA aumenta o conteúdo de WNK4. Por RT-PCR observamos também que AngII e CsA são capazes de aumentar significativamente o mRNA-WNK4 após 24h de incubação. Por ensaio da atividade da luciferase utilizando um vetor que apresenta o gene da luciferase sob o controle de promotor contendo elementos para ligação com NFAT, observamos que AngII parece aumentar atividade de NFAT. Observamos que CsA inibe significativamente a atividade da calcineurina através de ensaio enzimático e AngII não teve efeito significativo. Além disso, amplificamos o promotor do gene de WNK4 por PCR do DNA genômico e seguimos com a clonagem deste fragmento no vetor pGL4.10 (que apresenta o gene de luciferase como gene repórter). Neste constructo, vimos que tanto AngII como CsA são capazes de estimular o promotor do gene de WNK4. Após mutações pontuais para elementos NFAT no promotor de WNK4, observamos que o NFAT pode se ligar em diferentes elementos e essa diversidade gera efeitos estimulatórios e inibitórios na síntese proteica de WNK4, pois os elementos apresentam comportamentos diferentes na regulação da transcrição do gene repórter regulado pelo promotor do gene de WNK4. Assim, concluímos que AngII é capaz de estimular a síntese proteica de WNK4 por via dependente de NFAT. / This work aimed to understand how WNK4 expression is modulated by NFAT through AngII and CsA. Wnk4 is a kinase which plays a significant role in ionic transport regulation in distal nephron by inducing phosphorylation of other kinases such SPAK and OSR1, which ultimately lead to NCC phosphorylation. WNK4 activation increases sodium, water and chloride reabsorption in this segment and it´s already know that AngII can modulate this pathway. Genetic mapping studies showed that mutations in WNK gene lead to a hypertension, hyperkalemia and hypercalcemia condition, called Pseudohypoaldosteronism type II (PAH II) or Gordons Syndrome. This finding was crucial for WNKs discovery. Interestingly, this disease is controlled with thiazide diuretics treatment, showing that NCC participates in its pathogenesis. Curiously, a similar condition occurs when transplant recipient are treated with cyclosporine A. AngII changes the WNK4 protein content, thought PKC activation and KLHL3 phosphorylation, leading to an inhibition of ubiquitin-ligase E3 complex, which is important to WNK4 degradation. It is still unclear how NFAT may modulate WNK4 gene expression. We show, by western blotting technique, that CsA increased WNK4 expression, but AngII had not significant effect. After 24h, AngII and CsA increased mRNA-WNK4 by RT-PCR. Using luciferase assay, we observed that AngII increases NFAT activity and CsA decreases NFAT activity, both significantly. AngII did not show effect on calcineurin activity but CsA was able to decrease it, after incubation during 4h. WNK4 gene promoter was amplified by PCR using genomic DNA as a template, and the sequence obtained was cloned in a recombinant vector which has a luciferase gene reporter. Using this recombinant vector cloned with WNK4 gene promoter, we observed that both AngII and CsA increase WNK4 expression. We made a mapping of genome sites for NFAT binding at WNK4 promoter and we identified four elements for NFAT binding. Point mutations in these sites were engineered in order to evaluate the NFAT action in WNK4 promoter activity. We could see that NFAT had an ambiguous behavior and this effect is dependent on which element NFAT is bounded. In summary, we conclude that AngII may increase WNK4 expression through activation of NFAT.

O desenvolvimento de sistemas de expressão através da modificação de fortes promotores conhecidos vem sendo amplamente utilizado para a produção de proteínas com potencial utilização biotecnológica em diversos hospedeiros como S. cerevisiae. O objetivo do trabalho foi construir um promotor quimérico através de modificações do promotor cbh1 de T. reesei e inserção de elementos de resposta a metais provenientes do promotor ZRT1 de S. cerevisiae. O promotor desenhado foi utilizado na construção de um sistema de expressão, que foi inserido na levedura e teve sua atividade analisada pelo teste de ONPG. Foi possível observar que, conforme a concentração de zinco aumenta, a atividade do promotor diminui. O promotor teve maior atividade no meio sem zinco e menor no meio com 1000 μM de zinco. Esses resultados confirmam que o sistema funciona de forma eficiente em S. cerevisiae. Também foi possível observar que os mutantes crescidos em meio com limitação de zinco e, consequentemente com maior atividade do promotor, tiveram sua taxa de crescimento alterada. O que é esperado devido ao fenômeno conhecido como estresse metabólico, comum durante a produção de proteínas recombinantes em leveduras, na qual a cultura apresenta uma diminuição significativa do crescimento. / The development the expression systems by modifying strong promoters has been widely used for the production of proteins with potential biotechnological use in various hosts such as S. cerevisiae. This study aimed to construct an expression system constituted of the chimeric promoter built with cbh1 promoter modified by inserting metal responsive elements from the promoter of ZRT1 gene of S. cerevisiae. The S. cerevisiae was transformed and the system was induced with different concentrations of zinc and was tested using ONPG as substrate. It was observed that under high zinc concentrations promoter activity is low. At low zinc concentrations the opposite effect is observed, and the promoter reaches its highest activities. These results confirm that the system functions efficiently in S. cerevisiae. It was also observed that the mutant grown in environment with zinc limitation, hence with higher activity of the promoter, showed reduced growth rate. Indeed, this is expected due to the phenomenon known as metabolic burden, characterized by a joint stress during the production of recombinant proteins in yeast, under conditions which the culture has a significant growth reduction.

O objetivo desse experimento foi verificar diferentes planos nutricionais através da utilização de diferentes tipos de levedura na alimentação de frangos de corte no período de 1 a 42 dias. Foram utilizadas leveduras autolizada, hidrolizada e levedura íntegra e sua influência sobre parâmetros de desempenho (ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar) e características de carcaça (rendimento de carcaça, rendimento de peito e rendimento de pernas). Foram utilizados 1.080 pintinhos de corte, machos de um dia de idade, da linhagem Cobb, distribuídos em delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema fatorial 3 x 3: 3 formas de suplementação de levedura no período de 1 a 14 dias (sem levedura, levedura autolisada e levedura hidrolisada) e 3 formas de suplementação no período de 15 a 42 dias (sem suplementação, levedura autolisada e levedura íntegra) mais um tratamento controle positivo, com a adição de um antibiótico promotor de crescimento (APC), totalizando 10 tratamentos, 9 repetições e 12 aves por unidade experimental. As dietas utilizadas foram formuladas a base de milho e farelo de soja, sendo utilizado como APC a bacitracina de zinco na inclusão de 0,5 kg/ton em todas as dietas. No período de 1 a 14 dias foi utilizado o nível de inclusão de 10kg/ton das leveduras autolisada e hidrolisada e no período de 15 a 42 dias, 5kg/ton das leveduras autolisada e íntegra. As análises estatísticas dos dados foram realizadas pelo método da análise de variância com o auxílio do procedimento GLM do SAS (2002) e em caso de significância estatística, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, no nível de 5% de probabilidade. No período de 1 a 14 dias a levedura hidrolisada apresentou melhor viabilidade de uso na dieta. Para a utilização de um programa contínuo, a combinação do uso da levedura hidrolisada no período de 1 a 14 dias e de levedura autolizada no período de 15 a 42 dias, apresenta-se como melhor resposta pelas aves. / The objective of this experiment was to evaluate different nutritional plans using various types of yeasts in broiler chicken feed during a 42-day period. We used autolyzed, hydrolyzed, and whole yeasts and evaluated their influence on performance parameters (weight gain, feed intake, and food conversion) and carcass features (whole chicken yield, breast yield, and leg yield). A total of 1080 1-day-old male Cobb lineage chicks were used and distributed across a completely randomized 3 x 3 factorial experimental design. The treatments were comprised of 3 yeast supplement types during days 1 to 14 (i.e., without yeast, autolyzed yeast, and hydrolyzed yeast), 3 supplement types during days 15 to 42 (as above), and growth-promoting antibiotic (GPA) as positive control for a total of 10 treatments, 9 replications, and 12 birds per experimental unit. The diets were formulated based on corn and soybean meal, and 0.5 Kg/ton of zinc bacitracin was included as the GPA in the control diets. We used 10 Kg/ton of autolyzed and hydrolyzed yeast in days 1 to 14, and 5 Kg/ton of autolyzed and whole yeast during days 15 to 42. Statistical data analyses were conducted using an analysis of variance and the SAS GLM procedure (2002), and statistically significant means were compared using Tukey´s test at the 5% probability level. In days 1 - 14, the hydrolyzed yeast presented the best viability of use in the chicken diet. As an ongoing program, the birds responded best to the combination of hydrolyzed yeast in days 1 to 14 and autolyzed yeast in days 15 to 42.

Duas linhagens filogenéticas principais (LI e L2) foram definidas em Trypanosoma cruzi, com base em sequências de genes de rDNA e mini-exon e análise por RAPD (Souto et al. 1996). Neste trabalho investigamos a estrutura e atividade dos promotores do cistron ribossômico das duas linhagens de T. cruzi. O promotor da cepa Dm28 (L2) foi clonado e sua seqüência foi comparada com seqüências publicadas da região homóloga de CL (L1) e La Cruz (L2). A identidade entre os dois promotores de L2 foi de 98%, e entre estes e o de L1 foi de 82%. O ponto de início de transcrição foi mapeado, apresentando a mesma localização nas duas linhagens. A atividade dos promotores de L1 e L2 foi determinada em construções plasmidiais contendo o gene reporter da cloranfenicol acetil transferase (CAT). Experimentos de expressão transitória mostraram que o promotor de L1 foi funcional apenas em isolados de L1, enquanto que o promotor de L2 foi funcional em ambas as linhagens. A expressão do promotor de L2 em isolados de L1 foi maior do que a do promotor homólogo. Analisamos ainda a atividade dos dois promotores em um grupo de isolados que apresentam dois tipos de cistrons ribossômicos (grupo 1/2). Neste grupo de cepas observamos que ambos os promotores presentes nas construções são funcionais, embora o promotor de L2 induza maior expressão de CAT. Por outro lado, demonstramos que nestes isolados apenas o cistron ribossômico de tipo 2 é expresso in vivo. Neste trabalho analisamos ainda a eficiência de entrada das construções plasmidiais nas cepas de T. cruzi; caracterizamos a atividade de regiões do promotor de L2 e a eficiência do processo de \"trans-splicing\" para gerar mRNA de CAT contendo a seqüência de mini-exon na extremidade 5\'. / Two major phylogenetic lineages (L1 and L2) have been defined in Trypanosoma cruzi based on rDNA and mini-exon sequences and RAPD analysis (Souto et al., 1996). In the present work we have investigated the structure and activity of ribosomal RNA promoters from the two T. cruzi lineages. The promoter region of Dm28 strain (L2) was cloned and its sequence was compared with the homologous regions from the CL (L1) and La Cruz (L2) strains, whose sequences were previously published. The identity found between promoters of the two L2 strains was 98%, while the identity between L2 and L1 promoters was 82%. The transcription start point mapped in the two Lineages showed the same localization. The activity of L1 and L2 promoters was investigated through the use of plasmid constructs bearing bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) as reporter gene. Experiments of transient expression showed that the L1 promoter drove high CAT activity in L1 isolates, but essentially no activity in L2 strains. On the other hand, L2 promoter was functional in both Lineages. The expression driven by L2 promoter in L1 isolates was higher than that driven by the homologous promoter. We have also analysed the activity of both L1 and L2 promoters in a particular group of T. cruzi isolates (group 1/2) which contains two types of rRNA cistrons. It was observed that both promoters were functional in this group of strains, although L2 promoter drove higher CAT activity. This is an interesting result since we have shown that in group 1/2 isolates only the type 2 rRNA cistron is expressed in vivo. In the present study, we have also analysed the transfection efficiency of the plasmid constructs in T. cruzi strains; the activity of segments of the L2 promoter; and the efficiency of the \"trans-splicing\" process involved in the generation of mature CAT mRNA containing the mini-exon sequence at the 5\' end.

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FA); Ttm 3 - group inoculated orally with 0.5 mL of buffered saline 0.85%, containing approximately 5.0X105 CFU/0.5mL Salmonella enterica serovars Enteritidis (Contr. positive SE); Ttm 4 - group inoculated orally with 0,5 mL of buffered saline 0.85%, containing approximately 5.0X105 CFU/0.5mL of SE and received as antimicrobial growth promoter (AGP) bacitracin methylene disalicylate at a dosage of 55 ppm in the feed until 35 days of age (SE + AGP); Ttm 5 - group inoculated orally with 0.5 mL of buffered saline 0.85%, containing approximately 5.0X105 CFU/0.5 mL SE received phytogenic additives in the feed at a dosage of 0.10 kg/ton of feed of 1 to 35 days old (SE + FA). Performance was evaluated and six birds for treatment were weighed, sacrificed and the pH of the gastrointestinal tract was measured. Fragments were collected duodenum and jejunum to histomorphometric analysis, morphometric lymphocyte count. There was significant difference in the period 1-35 of the experiment the average weight and weight gain of groups without microbial challenge, and feed conversion in the group feed with phytogenic. We observed greater higher villus height to 14 days in the duodenum and greater villus:crypt to the group that received phytogenic The pH was influenced by the AGP in the colon and caecum. There was no significant effect of treatment on biometry of organs and Salmonella groups. There was lymphoid depletion in spleen, bursa and caecal tonsils was variable, with a predominance of mild and moderate depletion. It is concluded that the additives phytogenic control the effects of SE in broilers as expressed in the performance, especially in the feed conversion, and histomorphometric of the intestine, although it has not prevented the migration of the SE for the lymphoid organs, as well as not stimulate the proliferation of lymphoid cells in broilers. / No presente estudo, foram utilizados 300 pintos com um dia de idade, machos, linhagem Cobb, com o objetivo de avaliar os efeitos dos aditivos fitogênicos sobre desempenho, a integridade intestinal e o sistema imunológico de frangos de corte inoculados experimentalmente com Salmonella enterica sorovar Enteritidis (SE). As aves foram divididas em cinco tratamentos com seis repetições cada. Tratamento (Ttm) 1 - grupo inoculado por via oral, com 0,1 mL de solução salina tamponada e esterilizada a 0,85% (Placebo); Ttm 2 - recebeu os aditivos fitogênicos na ração na dosagem de 0,10 kg/ tonelada de ração da fase inicial aos 35 dias de idade (Contr. AF); Ttm 3 - grupo inoculado via oral, com 0,5 mL de solução salina tamponada a 0,85%, contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/0,5 mL de Salmonella enterica sorovar Enteritidis (Contr. positivo SE); Ttm - 4 - grupo inoculado por via oral, com 0,5 mL de solução salina tamponada a 0,85%, contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/0,5 mL de SE e que recebeu como antimicrobiano promotor de crescimento (APC) a bacitracina metil dissilicato na dosagem de 55 ppm na ração até os 35 dias de idade (SE + APC); Ttm 5 - grupo inoculado por via oral, com 0,5 mL de solução salina tamponada a 0,85%, contendo aproximadamente 5,0 X 105 UFC/0,5 mL de SE que recebeu os aditivos fitogênicos na ração na dosagem de 0,10 kg/ tonelada de ração do 1º aos 35 dias de idade (SE + AF). Foram realizadas análises de desempenho e seis aves por tratamento foram pesadas, sacrificadas e o pH do trato gastrintestinal foi aferido . Coletou-se fragmentos de duodeno e jejuno para análises histomorfométricas, morfometrias e contagem de linfócitos. Observou-se diferença significativa, durante o período de 1-35 final do experimento no peso médio e no ganho de peso dos grupos sem desafio microbiano, além de melhor conversão alimentar no grupo alimentado com aditivos fitogênicos. Observou-se maior altura dos vilos aos 14 dias no duodeno e maior relação vilo:cripta para o grupo que recebeu fitogênicos O pH foi influenciado pelo APC no cólon e ceco. Não houve efeito significativo dos tratamentos sobre a biometria dos órgãos e Salmonella nos grupos. Observou-se a depleção linfóide nos baços, bursas e tonsilas cecais foi variável, com predominância de depleção discreta e moderada. Conclui-se que os aditivos fitogênicos controlam os efeitos da SE em frangos de corte como expresso nos dados de desempenho, especialmente na conversão alimentar, e dados histomorfométricos do intestino, embora não tenha impedido a migração da SE para os órgãos linfóides, bem como não estimulam a proliferação de células linfóide nos frangos de corte.

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Through the cleavage process with restriction enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately 1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06, when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology, characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx, polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction, probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02 plasmid expression/regulation system. / A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp- Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle. Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.

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Die 11beta-HSD1 reguliert intrazellulär die Cortisolkonzentration durch Regeneration von Cortison z.B. aus dem Blutkreislauf, zu Cortisol. Daher stellt diese ein wichtiges Element in der Glucocorticoid-vermittelten Genregulation dar. Die 11beta-HSD1 wird ubiquitär exprimiert, auf hohem Niveau besonders in Leber, Fettgewebe und glatten Muskelzellen. Insbesondere die Bedeutung der 11beta-HSD1 in Leber und Fettgewebe konnte mehrfach nachgewiesen werden. In der Leber führte eine erhöhte Aktivität aufgrund einer Überexpression in Mäusen zu einer verstärkten Gluconeogeneserate. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression und erhöhte Enzymaktivität der 11beta-HSD1 im subkutanen und viszeralen Fettgewebe assoziiert ist mit Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie. Über die Regulation ist jedoch noch wenig bekannt. Zur Untersuchung der Promotoraktivität wurde der Promotorbereich von -3034 bis +188, vor und nach dem Translations- und Transkriptionsstart, der 11beta-HSD1 kloniert. 8 Promotorfragmente wurden mittels Dual-Luciferase-Assay in humanen HepG2-Zellen sowie undifferenzierten und differenzierten murinen 3T3-L1-Zellen untersucht. Anschließend wurde mittels nicht-radioaktiven EMSA die Bindung des TATA-Binding Proteins (TBP) sowie von CCAAT/Enhancer-Binding-Proteinen (C/EBP) an ausgewählte Promotorregionen analysiert. Nach der Charakterisierung des Promotors wurden spezifische endogene und exogene Regulatoren untersucht. Fettsäuren modifizieren die Entstehung von Adipositas und Insulinresistenz. Ihre Wirkung wird u.a. PPARgamma-abhängig vermittelt und kann durch das Inkretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP modifiziert werden. So wurden die Effekte von unterschiedlichen Fettsäuren, vom PPARgamma Agonisten Rosiglitazon sowie dem Inkretin GIP auf die Expression und Enzymaktivität der 11beta-HSD1 untersucht. Dies wurde in-vitro-, tierexperimentell und in humanen in-vivo-Studien realisiert. Zuletzt wurden 2 Single Nucleotide Polymorphismen (SNP) im Promotorbereich der 11beta-HSD1 in der Zellkultur im Hinblick auf potentielle Funktionalität analysiert sowie die Assoziation mit Diabetes mellitus Typ 2 und Körpergewicht in der MeSyBePo-Kohorte bei rund 1.800 Personen untersucht. Die Luciferase-Assays zeigten basal eine zell-spezifische Regulation der 11beta-HSD1, wobei in allen 3 untersuchten Zelltypen die Bindung eines Repressors nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte eine mögliche Bindung des TBPs sowie von C/EBP-Proteinen an verschiedene Positionen gezeigt werden. Die Transaktivierungsassays mit den C/EBP-Proteinen -alpha, -beta und -delta zeigten eben-falls eine zellspezifische Regulation des 11beta-HSD1-Promotors. Die Aktivität und Expression der 11beta-HSD1 wurde durch die hier untersuchten endogenen und exogenen Faktoren spezifisch modifiziert, was sowohl in-vitro als auch in-vivo in unterschiedlichen Modellsystemen dargestellt werden konnte. Die Charakterisierung der MeSyBePo-Kohorte ergab keine direkten Assoziationen zwischen Polymorphismus und klinischem Phänotyp, jedoch Tendenzen für eine erhöhtes Körper-gewicht und Typ 2 Diabetes mellitus in Abhängigkeit des Genotyps. Der Promotor der 11beta-HSD1 konnte aufgrund der Daten aus den Luciferaseassays sowie den Daten aus den EMSA-Analysen näher charakterisiert werden. Dieser zeigt eine variable und zell-spezifische Regulation. Ein wichtiger Regulator stellen insbesondere in den HepG2-Zellen die C/EBP-Proteine -alpha, -beta und -delta dar. Aus den in-vivo-Studien ergab sich eine Regulation der 11beta-HSD1 durch endogene, exogene und pharmakologische Substanzen, die durch die Zellkulturversuche bestätigt und näher charakterisiert werden konnten. / The enzyme 11beta-HSD1 regulates intracellular the cortisol concentration by regeneration of cortisone to cortisol. Hence, 11beta-HSD1 is an important factor in glucocorticoid-mediated gene expression. It is ubiquitously expressed, but high levels have been specifically described in liver, adipose tissue and smooth muscle cells. A pivotal role for 11beta-HSD1 has been demonstrated with respect to metabolism in liver and adipose tissue. Thus, a liver-specific overexpression results in an elevated gluconeogenesis and hepatic glucose output. Furthermore, a fat-specific overexpression was associated with obesity, insulin resistance and dyslipidemia. Despite these intriguing data, the regulation of the human 11beta-HSD1 gene is still in its infancies. 8 promoter fragments from -3034 to +188 of 11beta-HSD1-gene were cloned to analyze promoter activity. Dual-Luciferase-Assay was used in humane HepG2 cells and in undifferentiated and differentiated 3T3-L1 cells. Furthermore, the region close to the transcription start was studied with a non-radioactive EMSA for binding of TATA-binding protein (TBP) and CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). The role of the endogenous and exogenous regulators fatty acids, PPARgamma and the incretin (Glucose-dependent insulinotropic Peptide) GIP was investigated in-vitro and in-vivo. Finally, the functional consequences of 2 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) within the promoter region were studied in cell culture and the MeSyBePo-cohorts for association with diabetes mellitus type 2 and body weight. The Luciferase-assay revealed a cell-specific regulation of 11beta-HSD1 and a repressor, which was active in all 3 cell models. Accordingly, a cell-specific regulation was observed in transactivation-assays with C/EBP-proteins -alpha, -beta and -delta. The 11beta-HSD1 enzyme expression and activity was specifically modified by the here investigated endogenous and exogenous factors, which was demonstrated in-vitro but also in-vivo in various experimental settings. The characterisation of the MeSyBePo-cohorte revealed no association between genotype and clinical phenotype, although a trend for an increased body weight and diabetes mellitus type 2 was detected. This work demonstrated a cell-specific regulation of the 11beta-HSD1 promoter. Furthermore, a binding site for TATA-binding proteins was detected in HepG2 and undifferentiated 3T3-L1 cells. A pivotal role in regulation of 11beta-HSD1 promoter activity was demonstrated for the C/EBP-proteins, especially in liver cells. The in-vivo-Studies revealed a regulation of enzyme expression and activity by endogenous, exogenous and pharmacological substances, which was confirmed and analyzed in more detail in cell culture experiments.