Organic hydroperoxide resistance (Ohr) proteins are highly efficient thiol-based peroxidases that play central roles in bacterial response towards organic hydroperoxides. In Fungi, Ohr frequently presents a N-terminal extension, which is predicted to target them to mitochondria. The catalytic triad of Ohr comprises the peroxidatic Cys (Cp), the catalytic Arg (Rc) and a Glu (Ec) are fully conserved and interact among themselves by a salt bridge network in a reduced form of the enzyme (the so-called closed state). After getting oxidized to sulfenic acid (Cys-SOH), Cp condenses with the sulfhydryl group of resolution Cys (Cr) in a disulfide bond. The absence of negativity of the thiolate (RS-) in Cp facilitates the opening of the Arg-loop (containing the Rc) away from the active site, generating the so-called open state. However, the molecular events associated with the high reactivity of Ohr enzymes towards hydroperoxides and its specific reducibility by the dihydrolipoamide (DHL) or by lipoylated proteins were still elusive before this work. Additionally, several factors support the idea of Ohr as a target for drug development: (i) Ohr displays unique physicochemical properties; (ii) bacteria mutant for Ohr (Δ ohr) are highly sensitive to oxidative stress; (iii) the indications that Ohr might be involved in bacterial virulence; and (iv) its absence in mammals and vascularized plants. In this thesis, several aspects of Ohr enzymes were evaluated. In chapter 2, we biochemically characterized the Ohr homologs from the ascomycete fungus Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), the causative agent of Black Sigatoka disease in banana plants, which presented extraordinary reactivity towards linoleic acid hydroperoxides (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Furthermore, through subcellular fractionation of M fijiensis protoplast cells followed by western blot analysis, we confirmed the in silico prediction that MfOhr is a mitochondrial protein. In chapter 3 and 4, we described seven new crystallographic structures from two opportunistic pathogen, one from Xylella fastidiosa and six from Chromobacterium violaceum (including the first representative of the complex between Ohr and its biological reductant, DHL). Taken together these structures might represent new snapshots along the catalysis. Furthermore, several molecular modelling approaches, such as classical mechanics (MM), steered molecular dynamics (SMD), hybrid quantum mechanics (QM-MM) and together with enzymatic assays of point mutations, indicated that Ohr underwent unique structural switches to allow an intermittent opening (oxidized state) and returning to a more stable closed form (reduced state) of an Arg-loop along catalysis. Remarkably, dihydrolipoamide directly assisted the closing the Arg-loop and thereby the turnover of the enzyme. In chapter 5, we describe the identification of two compounds (C-31 & C-42) that could represent a framework for further studies attempting to find specific Ohr inhibitors, either through ab initio design of chemical compounds and virtual screening using pharmacophoric models. The IC50 calculated for C-31 and C-42 were 124.4-248.5 µM and 243.3-321.7 µM, respectively. Finally, this thesis highlights several new aspects related to Ohr function: 1 - evidence that eukaryotic Ohr are preferentially located in mitochondria and share several biochemical properties with the prokaryotic ones; 2 - the network of polar interactions among residues of the catalytic triad (Cp, Rc and E) strongly contributed to stabilize Ohr in the closed state, in an optimum configuration for hydroperoxide reduction; 3 - evidence that disulfide bond formation and the product release (alcohol derived from hydroperoxide reduction) facilitate the opening of the Rc loop to an intermediate state (probably not to the excessively open state presented in crystallographic structures); 4 - mapping the interactions between the biological reductant (DHL) and the Ohr active site; 5 - strong indications that DHL is not able to fit and react with Ohr in the close conformation; 6 - the first trials for search of molecules to specifically target Ohr proteins, although further assays must be performed to verify the specificity of the selected compounds to target Ohr. Therefore, we describe relevant new information for an antioxidant protein that displays highly efficient catalysis, comparable to other very important hydroperoxide removing enzymes, such as GSH peroxidase and peroxiredoxin / As proteínas Ohr (Organic hydroperoxide resistance) são peroxidases dependente de tiól extremamente eficientes e têm um papel central na resposta das bactérias contra peróxidos orgânicos. Em fungos, as proteínas Ohr apresentam uma extensão N-terminal, cujo predições in silico apontam estar associada ao direcionamento da proteína para a mitocôndria. A tríade catalítica é composta pela cisteína peroxidatic (Cp), a arginina (Rc) e o glutamato (Ec) catalíticos que são totalmente conservados e interagem entre eles por uma rede de interações de ponte salina, na forma reduzida da proteína (conformação fechada). Após se tornarem oxidadas em ácido sulfênico (Cis-SOH), a Cp condensa com o grupo sulfidrila da cisteína de resolução (Cr) numa ligação disulfeto. A ausência da carga negativa do tiolato (RS-) da Cp facilita a abertura da alça que contem a Rc para longe do centro ativo, gerando a conformação aberta. No entanto, os eventos moleculares associados a alta reatividade das enzimas Ohr contra hidroperóxidos e a sua redução pela dihydrolipoamida (presente em proteínas lipoiladas), ainda está descrita de forma bem superficial. Adicionalmente, vários fatores suportam a ideia de que a Ohr seria um potencial alvo para o desenvolvimento de drogas: (i) a Ohr exibe propriedade físico-químicas únicas; (ii) as bactérias mutantes para Ohr (Δohr) são fortemente sensíveis ao stress oxidativo; (iii) indicações de que a Ohr poderá está envolvida na virulência de várias bactérias; e (iv) a ausência de Ohr em mamíferos e plantas vascularizadas. Nesta tese, vários aspetos relacionados com as enzimas Ohr foram avaliados. No Capitulo 2, foi caracterizada bioquimicamente a proteína Ohr homologa de fungo ascomiceto, Mycosphaerella fijiensis Mf_1 (MfOhr), o agente causador da doença de bananas, Sigatoka-negra. A enzima apresentou eficiente atividade contra peroxido de ácido linoleico (kobs = 3.18 (± 2.13) ×108 M-1.s-1). Além disso, através do fracionamento sub celular de protoblasto de M fijiensis seguido de western blot, foram confirmadas as predições in silico de que a MfOhr é uma proteína mitocondrial. No capítulo 3 e 4, foram descritas sete estruturas cristalográficas oriundas de dois patógenos oportunistas, uma de Xylella fastidiosa e seis de Chromobacterium violaceum (incluindo o primeiro representante do complexo entre a Ohr e o seu redutor biológico, DHL). Estas estruturas poderão representar diferentes conformações ao longo do ciclo catalítico. Adicionalmente, várias abordagens de modelagem molecular, tais como mecânica clássica (MM), mecânica molecular direcionada (SMM) e mecânica quântica híbrida (QM-MM), juntamente com ensaios experimentais com mutações pontuais, indicaram que a Ohr sofre várias mudanças conformacionais para permitir uma abertura intermitente (estado oxidado) e o retorno para uma conformação fechada mais estável (estado reduzido) da alça da arginina ao longo da catálise. Notavelmente, a dihydrolipoamide assistiu diretamente o fechamento da alça da arginina e por consequência o turnover da enzima. No capítulo 5, foi descrita a identificação de dois compostos (C-31 e C-42) que representam estudos iniciais com a finalidade de encontrar inibidores específicos para a enzima Ohr. Estes compostos foram encontrados por ab initio design e por varrimento virtual com o uso de modelos farmacofóricos. Os IC50 calculados para o C-31 e C-42 foram de 124.4-248.5 µM e 243.3-321.7 µM, respectivamente. Finalmente, esta tese descreve vários aspetos relacionados com a função da Ohr: 1 - evidências que as Ohr de eucariotos estão preferencialmente localizadas na mitocôndria e partilham várias propriedades bioquímicas com as Ohr de bactéria; 2 - a rede de interações polares entre os resíduos da tríade catalítica (Cp, Rc e Ec) contribuem fortemente para a estabilização do estado fechado, a configuração ótima para a redução de hydroperoxidos; 3 - evidências de que a formação da ligação disulfeto e a liberação do produto (álcool derivado da redução do hydroperoxido) facilitam a abertura da alça da arginina até um estado intermediários (provavelmente não o estado totalmente exposto apresentado nas estruturas cristalográficas) 4 - o mapeamento das interações entre o redutor biológico no centro ativo da Ohr; 5 - fortes indicações de que a DHL não é capaz de interagir e reagir com a Ohr na conformação fechada; 6 - os primeiros ensaios para a procura por moléculas que especificamente interajam com a Ohr, apesar de que futuros ensaios terão de ser executados para verificar a especificidade dos compostos selecionados. Assim, nós descrevemos nova informação relevante sobre uma proteína antioxidante que exibe uma alta eficiência catalítica, comparável com outras importantes enzimas removedores de hydroperoxidos, tais como glutationa peroxidases e peroxiredoxinas

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:29:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Geisa Barbosa.pdf: 1077715 bytes, checksum: 67df48b716e73523f8fbdca95d4ff28e (MD5) Previous issue date: 2008-09-03 / Coffee is one of the most valuable agricultural commodities, ranking second on international trade exchanges. There is much agronomic research on coffee, but molecular knowledge of its fruit development and ripening is limited. The Brazilian Coffee Genome Project provides the genomic resources required to study the proteomics of Coffea arabica, to add to results derived from DNA microarray and EST studies. This work reports a comparative proteomic investigation of immature coffee fruit in two developmental stages: stage 1, intense cell division, and stage 2, intense cell expansion. Proteins were extracted using a modified SDSPhenol method and two-dimensional electrophoresis gels stained with Coomassie blue revealed about 300 well-resolved polypeptide spots in the pH range 3-10 and 500 wellresolved polypeptide spots in the pH range 4-7. Nineteen variable polypeptides were excised, trypsin-digested and analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. Peptide MS data were searched against the coffee EST database and six protein spots were identified, according to their putative and assigned functions in known biosynthetic pathways: Fructose bifosfato aldolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and malate dehydrogenase enzymes are part of glycolytic pathway, 11S storage globulin protein has the reserve function, the thaumatin-like protein signals a response to stress, and chloroplast precursor is involved in pathway photosynthesis. These proteins, except taumatina-like, had increased their expression at the stage of expansion of the fruit indicating that they are more required with the fruit development. / O café é um dos mais importantes produtos agrícolas, ocupando o segundo lugar no mercado internacional de ‘commodities’. Existem muitas pesquisas em café, mas o conhecimento molecular sobre desenvolvimento e amadurecimento de fruto ainda é limitado. O Projeto Genoma Café fornece recursos requeridos para o estudo proteômico de café, para adicionar resultados derivados do estudo de microarranjos de DNA e ESTs. Este trabalho relata uma investigação proteômica comparativa do fruto imaturo de Coffea arabica em dois estádios de desenvolvimento: chumbinho, intensa divisão celular, e expansão do fruto, intensa expansão celular. As proteínas foram extraídas usando o método SDS-Fenol modificado e separadas por eletroforese bidimensional. Os géis corados com Coomassie blue revelaram aproximadamente 300 spots bem resolvidos na faixa de pH entre 3-10 e 500 spots na faixa de pH 4-7. O método de identificação de proteínas por padrão de massas peptídicas foi aplicado nos 16 spots que apresentaram maior diferença de expressão na faixa de pH 3-10, utilizando-se um espectrômetro de massa (MS) do tipo MALDI-TOF e comparando os espectros de digestão tríptica contra bancos de dados baseados em ESTs de Coffea. Foram identificadas seis prováveis proteínas que foram classificadas de acordo com sua função e vias biossintéticas conhecidas: as enzimas frutose bifosfato aldolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e malato desidrogenase fazem parte da via glicolítica; a proteína 11S possui função de reserva, a taumatina-like sinaliza resposta a um estresse, e precursor de cloroplasto, encontra-se envolvida na via fotossintetizante. Essas proteínas, exceto a taumatina-like, tiveram sua expressão aumentada no estádio de expansão do fruto indicando que são mais requeridas à medida que o fruto se desenvolve.

Submitted by Nara Lays Domingues Viana Oliveira (naradv) on 2015-07-15T12:20:50Z No. of bitstreams: 1 joaoluis.pdf: 570265 bytes, checksum: 551007f1cdfcb2c78b839277563f66bb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-15T12:20:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaoluis.pdf: 570265 bytes, checksum: 551007f1cdfcb2c78b839277563f66bb (MD5) Previous issue date: 2014-08-29 / Nenhuma / O estudo teve como objetivo apresentar uma revisão da literatura na área da suplementação protéica para praticantes de atividades físicas, treinados ou não. Os suplementos alimentares vêm requerendo, já há algum tempo, uma especial atenção, visto que eles estão inseridos em uma vasta recomendação de uso tanto para atletas quanto não atletas. As razões para esse avanço na fabricação e consumo de suplementos são multifatoriais, como exemplo disso, pode-se citar a busca do corpo perfeito, influenciada principalmente pela mídia, e a restrição da alimentação evitando o alto teor energético, mas, principalmente, associada à impossibilidade de seguir uma dieta natural e saudável, seja por falta de tempo, por indisponibilidade de comprar alimentos ou qualquer outro fator que traga dificuldades na manutenção e regularidade desta dieta. A busca foi realizada em bases de dados eletrônicas e lista de referência dos artigos identificados. Os seguintes descritores, nas línguas portuguesa e inglesa, foram utilizados: “exercício”, “resistência”, “força”, “suplemento proteico”, “adultos”, “whey protein”, “creatina”, “BCAAs”. A busca eletrônica inicial resultou em 181 artigos entre whey protein, creatina e aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA). Dos 38 artigos encontrados com BCAA, nenhum deles atendeu aos critérios de inclusão adotados nesta revisão, portanto, foram todos excluídos do processo de revisão. O processo de análise dos estudos indica que as duas suplementações estudadas, (whey protein e creatina) realmente são eficazes, no que tange à resistência, à força e ao ganho de massa muscular, principal foco do presente estudo. / The aim of this study is to present a literature review in the area of protein supplementation for practitioners of physical activities, trained or not. Food supplements are requesting, for some time, special attention, since they are embedded in a broad recommendation to use for both, athletes and untrained. The reasons for this increase in the manufacturing and consumption of supplements are multifactorial, as an example, we can mention the pursuit of the perfect body, greatly influenced by the media, and the restriction of supply by avoiding the high energy content, but mainly associated with the impossibility to follow a natural and healthy diet, either for lack of time, unwillingness to buy food or any other factor that brings difficulties in maintaining this diet and regularity. The search was performed in electronic databases and reference lists of identified articles. The following descriptors, in Portuguese and English, were used: "exercise", "strength", "protein supplement", "adults", “whey protein”, “creatine”, “BCAAs”. The initial electronic search yielded 181 articles between proteinuria whey, creatine and branched chain amino acids (BCAA). Of the 38 articles found with BCAA, none of them met the inclusion criteria in this review, so they were all excluded from the review process. The process of analysis of the two studies indicate that supplementation studied (whey protein and creatine) are really effective, in terms of strength, endurance and strength gain, main concern of this study.

Evidências sugerem que o transtorno bipolar esteja associado a uma toxicidade sistêmica, representada por alterações periféricas em marcadores de inflamação, estresse oxidativo e neurotrofinas, a qual parece estar associada aos episódios de humor e à progressão da doença levando a prejuízos sistêmicos e na neuroplasticidade. Os trabalhos apresentados nesta tese tiveram como objetivo revisar estas alterações e explorar possíveis mecanismos responsáveis por estes achados, com enfoque em uma desregulação transcricional no transtorno bipolar. No primeiro capítulo, revisamos os biomarcadores periféricos associados aos episódios de humor, a relação destes com a toxicidade sistêmica e os possíveis mecanismos subjacentes a esta toxicidade. Seguimos ilustrando, no capítulo 2, um exemplo de alterações estruturais cerebrais em um paciente bipolar com experiência de múltiplos episódios, como um possível exemplo da neuroprogressão no transtorno bipolar. Em seguida, buscamos por vias de regulação transcricional disfuncionais no córtex pré-frontal de pacientes que poderiam estar associadas a essas alterações e neuroplasticidade prejudicada. A partir de abordagem inovadora de bioinformática, no capítulo 3, identificamos algumas unidades regulatórias (regulons) associadas com as duas assinaturas gênicas do transtorno bipolar avaliadas, obtidas a partir de bancos de dados de microarranjo de pré-frontal postmortem. Em uma análise mais rigorosa, identificamos apenas o regulon do gene early growth response 3 (EGR3) enriquecido nas duas assinaturas da doença em duas redes transcricionais do pré-frontal, estando reprimido no fenótipo bipolar. Nossos resultados sugerem o regulon do EGR3 como um alvo importante no transtorno bipolar. Considerando seu papel fundamental na resposta ao estresse e na translação de estímulos ambientas em mudanças na expressão gênica neuronal, propomos que uma disfunção em vias biológicas envolvendo EGR3 poderia levar a uma resposta prejudicada ao estresse e influenciar no risco para o transtorno bipolar. No quarto capítulo, então, caracterizamos o perfil de expressão gênica do modelo de células SH-SY5Y diferenciadas e avaliamos o comportamento do regulon do EGR3 de acordo com o protocolo de diferenciação. Além disso, identificamos moléculas com potencial de modular os regulons enriquecidos no transtorno bipolar visando testar o efeito destas drogas no referido modelo celular. Nossos resultados reforçam o fenótipo neuronal deste modelo in vitro e demonstram que o regulon do EGR3 está enriquecido nas células diferenciadas, sugerindo que ele é importante nesse processo e que este modelo experimental é adequado para estudar este regulon e as moléculas selecionadas pela análise de mapa de conectividade. Nós ainda avaliamos nas células SH-SY5Y o efeito do soro de pacientes bipolares, para investigar o papel da toxicidade sistêmica em células neuronais. O soro de pacientes, especialmente em estágio tardio da doença, causou toxicidade às células, reduzindo a densidade de neuritos e a viabilidade celular. Esses achados representam uma forma de desafio celular relacionado à toxicidade sistêmica do transtorno bipolar, propondo as células SH-SY5Y diferenciadas como um modelo in vitro para estudo desta doença. Em suma, os resultados desta tese sugerem que a toxicidade sistêmica relacionada aos episódios recorrentes de humor pode influenciar nas alterações anatômicas cerebrais associadas com a progressão do transtorno bipolar, e a disfunção no regulon do EGR3 poderia estar envolvida com aspectos desta neuroprogressão considerando o papel de EGR3 na resposta ao estresse e na neuroplasticidade. Estas hipóteses, que também sugerem alvos interessantes para o desenvolvimento de novos tratamentos, devem ser apropriadamente validadas em modelos experimentais, como o modelo de células SH-SY5Y diferenciadas estudado neste trabalho. / Evidence suggests that bipolar disorder is associated with a systemic toxicity, represented by peripheral changes in markers of inflammation, oxidative stress and neurotrophins, which appears to be associated with mood episodes and illness progression leading to systemic damage and impaired neuroplasticity. The work presented in this thesis aimed to review these changes and explore possible mechanisms responsible for these findings, focusing on transcriptional regulation in bipolar disorder. In the first chapter, we review the peripheral biomarkers associated with mood episodes, their relationship with systemic toxicity and the possible mechanisms underlying this toxicity. We have shown, in Chapter 2, an example of structural brain changes in a bipolar patient with multiple episodes experience, as a possible example of ‘neuroprogression’ in bipolar disorder. Then we investigated dysfunctional transcriptional regulatory pathways in the prefrontal cortex of patients that could be associated with these changes and impaired neuroplasticity. Using innovative bioinformatics approaches, in Chapter 3, we identified some regulatory units (regulons) associated with the two gene signatures of bipolar disorder evaluated, obtained from microarray data sets from prefrontal postmortem studies. With a more rigorous analysis, we only identified the regulon of early growth response 3 gene (EGR3) enriched in the two bipolar signatures in the two transcriptional prefrontal networks evaluated, being EGR3 repressed in bipolar phenotype. Our results suggest the EGR3 regulon as an important target in bipolar disorder. Considering its key role in response to stress and translation of environmental stimuli into long-term changes in neuronal gene expression, we propose that a dysfunction in biological pathways involving EGR3 could lead to an impaired response to stress and influence on the risk for bipolar disorder. Then, in Chapter 4, we characterized the gene expression profile of differentiated SHSY5Y cells and evaluated the EGR3 regulon according to the differentiation protocol. Furthermore, we have identified molecules with potential to modulate the regulons enriched in bipolar disorder, using connectivity map analysis, in order to test the effect of these drugs on this cellular model in future studies. Our results consolidated the neuronal phenotype of this in vitro model and demonstrated that the EGR3 regulon is enriched in differentiated cells, suggesting that it is important in this process and that this experimental model is suitable for studying this regulon and molecules selected by connectivity map analysis. Moreover, in Chapter 5, we evaluated the effect of serum of bipolar patients on differentiated SH-SY5Y cells to investigate the role of systemic toxicity in neuronal cells. The serum of patients, especially at late stages of illness, caused toxicity to cells, reducing neurite density and cell viability. These findings represent a strategy of challenging cells related to the systemic toxicity of bipolar disorder, proposing differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model to study this disorder. Therefore, the results of this thesis suggest that systemic toxicity related to recurrent mood episodes may influence on the brain anatomical changes associated with the bipolar disorder progression, and dysfunction in EGR3 regulon could be involved with aspects of ‘neuroprogression’ considering the role of EGR3 in response to stress and neuroplasticity. These hypotheses, which also suggest interesting targets for the development of new treatments, should be further properly validated in experimental models such as the differentiated SH-SY5Y cells model studied in this work.

O soro de leite é o coproduto da produção de queijos e contém proteínas com excelentes propriedades nutricionais e tecnológicas. Dentre essas proteínas, as majoritárias são a β-lactoglobulina (BLG) e a α-lactalbumina (ALA). Embora o soro do leite já seja aproveitado pelas indústrias para a produção de isolados e concentrados proteicos, esses produtos consistem em uma mistura de diversas proteínas e atualmente há um grande interesse em realizar o seu fracionamento a fim de aproveitar melhor as suas propriedades individuais. Entretanto, fracionar essas proteínas é um grande desafio devido às suas massas molares próximas, e uma combinação de diferentes abordagens baseadas nas suas características se torna necessária para possibilitar uma boa separação. A ALA apresenta uma capacidade de formar agregados proteicos em meio ácido e ausência de cálcio, sendo uma estratégia interessante para combinar com processos de separação por membranas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi realizar o fracionamento da BLG e da ALA a partir da agregação proteica combinada com processos de separação por membranas. O ajuste do pH para 4 e adição de citrato de sódio como agente complexante do íon cálcio possibilitou a formação de agregados proteicos da solução de isolado proteico do soro de leite 6 %, porém ao determinar a pressão de operação dessa solução utilizando membranas cerâmicas de microfiltração (MF) de 0,8 e 0,05 μm para reter os agregados proteicos, o fluxo de permeado foi baixo. O mesmo procedimento foi utilizado para a solução de soro do leite em pó 6 % e membrana de 0,8 μm, resultando, também, em um fluxo de permeado baixo durante a determinação da pressão de operação. Ao combinar a centrifugação com a ultrafiltração (UF), o sobrenadante, contendo a fração que não formou agregados proteicos, apresentou maiores fluxos de permeado em pH 7 e 10, e baixos fluxos em pH 3 e 4. A purificação do sobrenadante em pH 10 com membrana cerâmica de 5 kDa apresentou fluxo de permeado elevado e, quando a diafiltração foi realizada, o fluxo de permeado apresentou um comportamento ascendente e menor tendência ao fouling, variando entre 56,5 e 64,6 %. O sedimentado ressolubilizado em pH 10 também apresentou um fluxo de permeado elevado, porém com comportamento mais estável durante a diafiltração, e tendência ao fouling entre 81,4 e 84,6 %. Contudo, a agregação proteica precisa ser mais bem avaliada para separar as proteínas, bem como a retenção da membrana de 5 kDa, x a qual permitiu a passagem de parte das proteínas tanto do sobrenadante como do sedimentado ressolubilizado, sendo, ainda, verificado um pH mais elevado nos concentrados do que nos permeados e livre passagem dos demais íons mediante análise de condutividade elétrica. Os resultados demonstraram que o ajuste do pH para 10 possibilitou melhorar a performance do fluxo de permeado, provavelmente devido à menor interação proteína-proteína e proteína-membrana, além de ser uma estratégia interessante para minimizar os fatores limitantes em processos de separação por membranas. / Whey is the co-product of cheese production and contains proteins with excellent nutritional and technological properties. Among these proteins, β-lactoglobulin (BLG) and α-lactalbumin (ALA) are the main ones. Although whey is already used by industries to produce protein isolates and concentrates, these products consist of a mixture of several proteins and currently there is a great interest in their fractionation in order to take better advantage of their individual properties. However, fractionating whey proteins is a great challenge because of their similar molecular weight. Due to this, a combination of different approaches based on characteristics of each of these proteins becomes necessary to enable a good separation. ALA has the ability to form protein aggregates in an acidic media and absence of calcium, providing an interesting condition to combine with membrane separation processes. In view of this, the aim of this work was to fractionate BLG and ALA using a combination of protein aggregation procedure and membrane separation processes. Adjustment of pH to 4 and addition of sodium citrate as complexing agent of calcium ion allowed the formation of protein aggregates in whey protein isolate solution, but when microfiltration was carried out with ceramic membranes of 0.8 and 0.05 μm to retain the protein aggregates formed, permeate flux was low during the determination of the operating pressure of the process. The same procedure was used with whey powder solution and 0.8 μm membrane, also resulting in a low permeate flux when determining the operating pressure. By combining centrifugation with ultrafiltration, the supernatant containing the fraction that did not form protein aggregates showed higher permeate flux at pH 7 and 10, and lower permeate flux at pH 3 and 4. Purification of the supernatant at pH 10 with 5 kDa ceramic membrane showed high permeate flux and, when the diafiltration was performed, the permeate flux presented an upward behavior and lower fouling tendency, varying between 56.5 and 64.6 %. The resolubilized sediment at pH 10 also showed a higher permeate flux, but with a more stable behavior during diafiltration and fouling tendency between 81.4 and 84.6 %. Nevertheless, protein aggregation procedure needs to be better evaluated to separate the proteins as well as the retention of the 5 kDa membrane, which allowed passage of part of the proteins of the supernatant and the resolubilized sediment solutions and showed a higher pH in the xii concentrates than in the final permeate and free passage of the other ions evaluated by electrical conductivity analysis. The results showed that adjusting the pH to 10 allowed to improve the perfomance of permeate flux, probably due to the lower protein-protein and protein-membrane interactions, besides being an interesting strategy to minimize the limiting factors in PSM.

A organização do sistema nervoso que controla as funções digestórias dos moluscos gastrópodes tem sido estudada quanto à constituição dos circuitos neurais subjacentes ao ritmo de deglutição alimentar. Existe, entretanto, uma lacuna no conhecimento da organização do sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP) que regulam o segmento médio e posterior do trato digestório. A posição filogenética intermediária, atribuída ao sistema nervoso (SN) do caracol Megalobulimus abbreviatus, entre as espécies de Helicidae e os basomatófaros pode constituir uma via para o entendimento do controle da atividade do trato gastrointestinal (tGI) de gastrópodes. Assim sendo, o caracol pulmonado M. abbreviatus foi utilizado em um estudo morfológico e neuroquímico que buscou descrever o padrão da inervação central e periférica em um modelo experimental amplamente utilizado na pesquisa neurobiológica. A anatomia macroscópica revelou que o intestino médio constituiu-se pelo estômago, dividido em pró-ventrículo e moela, e intestino, dividido em pró-intestino ou tiflossolear, médio e pós-intestino, enquanto que o intestino posterior constituiu-se pelo reto e ânus. A análise da organização da parede, empregando microscopia óptica, revelou a presença de quatro túnicas constituindo a parede destes órgãos: (i) mucosa, que se constituía por um epitélio colunar intermitente ciliado e lâmina própria; (ii) submucosa, representada pelo tecido conjuntivo frouxo, contendo muitos espaços hemais; (iii) muscular, dividida em camadas circular interna e longitudinal externa, contudo a moela apresentou uma camada disposta obliquamente e as regiões cárdica e pilórica apresentaram esfíncteres muito organizados (iv) serosa, constituída por tecido conjuntivo frouxo delimitado por um mesotélio. O intestino médio recebe inervação central por meio do ramo gastro-intestinal (rG) do nervo visceral comum (nV), enquanto que o intestino posterior foi inervado pelo nervo reto-anal (nR). A aplicação de marcações retrógradas com cloreto de cobalto acrescido de albumina sérica bovina, biocitina e Horseradish peroxidase no rG e no nR revelou que a maioria dos neurônios envolvidos no controle destes órgãos estão localizados no complexo ganglionar víscero-parietal. Ainda foi observada a presença de uma rede constituída por quatro gânglios (estomatogástrico, cárdico, gástrico e pilórico) interconectados por nervos e localizados sobre a parede do estômago, sendo denominado sistema nervoso estomatogástrico (SNEG). O traçamento anterógrado com Lúcifer Yellow revelou que fibras oriundas do SNEG se projetam para os plexos entéricos, submucoso (PS) e mioentérico (PM), localizados entre as túnicas do tGI. A organização do sistema nervoso entérico (SNE) foi estudada com a aplicação das técnicas de impregnação argentafínica e coloração com azul de metileno. Os plexos entéricos mostraram-se formados por uma extensa rede de axônios e muitos somas neuronais, dispostos em pequenos grupos ou isoladamente. As fibras axonais que inervavam as células da camada muscular longitudinal no estômago eram organizadas em feixes e acompanhavam o comprimento das fibras musculares. O MP distribuía-se por toda a camada muscular circular e longitudinal. No estômago, a região cárdica apresentou um plexo mais denso do que a pilórica, contudo as fibras nervosas dispunham-se entre e ao redor das fibras musculares de ambas as camadas O plexo entérico no intestino apresentou o mesmo arranjo observado na região pilórica, sendo uniforme até o ânus. As duas tiflossoles intestinais, no pró-intestino, apresentaram grande quantidade de fibras nervosas, no entanto não foram observados somas neuronais. Dentre os constituintes do SNE foram observados células nervosas intra-epiteliais (neuron like-intraepithelial cells), que possuem dois tipos morfológicos: aberto (que projeta um cílio para o lúmen intestinal) e fechado (localizado na base do epitélio digestório) e células fusiformes, cuja morfologia e posição lembram as células intersticiais de Cajal. A neuroanatomia química do SNEG e do SNE foi analisada mediante a aplicação de técnicas de histoquímica e imunohistoquímica para diferentes mediadores e transmissores. No intestino médio e posterior foi observado um rico plexo com atividade acetilcolinesterásica (AChE), constituído por fibras oriundas do SNC, via nervos periféricos, e do SNEG. Neurônios e fibras nervosas entéricas mostraram-se esparsos na submucosa e entre as camadas musculares, circular e longitudinal, do estômago, intestino e reto. A atividade de diaforase da nicotinamida adenina dinucleotódeo fosfato (NADPHd) revelou neurônios e fibras nervosas com maior atividade em toda a túnica muscular do que na submucosa. A fluorescência induzida pelo ácido glioxílico (AG) revelou a maior presença de fibras nervosas e varicosidades catecolaminérgicas na submucosa do reto, pós-intestino e moela do que nas outras porções do tGI. A imunorreatividade à serotonina (5HT-ir) foi observada em somas e fibras nervosas distribuídas predominantemente na submucosa do reto e intestino, sendo encontrados poucos neurônios e fibras 5HT-ir no pró-ventrículo e moela Os elementos nervosos FMRF-amida imunorreativos (FMRFa-ir) estavam presentes na mucosa, submucosa e muscular por toda extensão do intestino médio e posterior. As células nervosas intraepiteliais foram mais marcadas pela AChE, 5HT-ir e FMRFa-ir do que pela NADPHd e seus processos se anastomosam formando um extenso e organizado plexo subepitelial. As células fusiformes tiveram os corpos e prolongamentos marcados pelos métodos aplicados, à exceção do AG. Uma intensa imunorreatividade a proteína fibrilar acídica glial (GFAP-ir) por todos os plexos do intestino médio e posterior e nos gânglios do SNEG, sugerindo uma importante função para as células gliais no SNP do tGI de gastrópodes. Assim, pode-se concluir que o controle do tGI no caracol M. abbreviatus possui um controle nervoso extrínseco direto, por meio dos gânglios subesofageais, via rG e nR, e indireto, pelo SNEG para o intestino médio, e uma inervação intrínseca, representada pelos plexos PS e PM, associados às células nervosas intra-epiteliais, que formam o plexo subepitelial tanto no intestino médio como no posterior. A neuroanatomia química permite inferir que, os diferentes transmissores analisados, podem exercer controle sobre a motilidade ou sobre as funções sensoriais e secretomotoras no tGI. Finalizando, a reação ao GFAP é uma evidência da presença de células enterogliais permitindo inferir que exista uma interação entre os constituintes dos plexos neurais com a glia, tal qual ocorre no SNC de gastrópodes e outros invertebrados. / The organization of the nervous system that controls digestive functions of gastropods mollusks has been studied relative to the constitution of the neuronal circuit underlying the deglutition rhythm. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the peripheral nervous system regulating the medium and posterior segments of the digestive tract. However, there is a lacuna in the knowledge about the organization of the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS) that regulates the medium and posterior segments of the digestive tract. The intermediate phylogenetic position attributed to the nervous system (NS) of the snail Megalobulimus abbreviatus, between Helicidae and basommatophoran species may constitute a via for understanding the control of the activity of the gastrointestinal (GI) tract of gastropods. Thus, the pulmonate snail M. abbreviatus was used in a morphological and neurochemical study that sought to describe the pattern of the central and peripheral innervation in an experimental model widely used in neurobiological research. Macroscopic anatomy revealed that the midgut was formed by the stomach, divided into pro-ventricle and gizzard, and intestine, divided into pro-intestine or tiflossolear, medium- and post-intestine, while the hindgut was formed by the rectum and anus. The light microscopy revealed that the GIt wall was constituted by four tunics: (i) the mucosa was constituted by a intermittent ciliated columnar epithelium and lamina propria; (ii) the submucosa was a loose connective tissue, containing a system of haemocoelic spaces; (iii) the muscular was formed by the internal circular and external longitudinal layers, while in the gizzard there was a third muscular layer disposed obliquely and the cardia and pylorus regions contained two sphincters (iv) the serosa display a loose connective tissue covered by a mesothelium. The midgut is innervated by the common visceral nerve, through gastrointestinal branch (Gb), while the hindgut is innervated by the rectum-anal nerve (Rn). Retrogradely backfilling with CoCl2 added with 0.1% bovine albumin, byocitin and horseradish peroxidase from the Gb and Rn is employed to reveal the neurons innervating these digestive regions which are located in all ganglia within the viscera-parietal ganglia complex. Although we observed the presence of a network of four ganglia: stomatogastric, gastric, cardic and pyloric, interconnected by nerves and located outer the surface of the stomach, which in the present study was referred to as the stomatogastric nervous system (STNS). Anterogradely labelin with Lucifer yellow which fibers of the STNS project to the submucous (SP) and myenteric plexuses (MP). The morphology of the enteric nervous system (ENS) was described using silver diammine impregnation and methylene blue staining. These plexuses were formed by extensive axonal networks and by several neuronal somata which are arranged in small clusters or as isolated cells. The axonal fibers innervating the longitudinal muscle cells in the stomach wall are organized in small bundles along the muscle length. The MP is distributed throughout the circular and longitudinal muscular layer. In the stomach, the cardic area plexus is denser than the pyloric plexus, while the nervous fibers of both are located between and around the muscular bundles The enteric plexus in the intestine is a continuity of the pyloric arrangement, staying uniform until the anus. In both typhlosoles of the pro-intestine nerve bundles are found in large numbers but none neuron is observed. In addition to the plexus were observed were observed neuron-like intraepithelial cells, which possess two types: open (a cilium projecting into the intestinal lumen) and closed (located at the base of the digestive epithelium) and fusiform cells whose morphology and position resembling interstitial cells of Cajal. The chemical neuroanatomy of the STNS and SNE was analyzed by histochemistry and immunohistochemistry methodos for different mediators and transmitters. In the midgut and hindgut, the plexus have a very intense AChE activity and it was constituted by fibers originated from the STNS or from the subesophageal complex through peripheral nerves. The enteric neurons and fibers with AChE activity were scattered in the submucosa and between the circular and longitudinal muscle layers of the stomach, intestine and rectum. Neuronal bodies and fibers with NADPHd activity are more abundant in the entire mass of smooth muscle elements than the submucosal layer. Fluorescent induced by GA revealed the presence of catecholaminergic nerve fibers and varicosities in the submucosal layer of the rectum, gizzard and post-intestine than in others organs of the GIt. The immunoreactivity to serotonin (5HTir) elements was predominantly distributed in the submucosal layer of the intestine and rectum. Few 5HTir fibers was verify in the proventricle and gizzard The FMRFa-immunoreactive elements were present in the mucosal, submucosal and muscular layers throughout the mid and hindgut. The neuron-like intraepithelial cells were more labeled by AChE, 5HT and FMRFa than for NADPHd and their processes were organized forming a subepithelial plexus. The bodies and processes of the fusiform cells were labeled by the methods applied extensions, except for the GA. It was found an intense glial fibrilary acidic protein immunorreaction (GFAP-ir) were visualized, throughout the midgut and hindgut plexuses and in the ganglia of the STNS. This intense immunoreaction to GFAP in intramural plexuses suggests important roles to glial cells in the peripheral nervous system of digestive tract of this pulmonate snail. Therefore, the gastrointestinal tract is controlled directly by extrinsic innervation from the subesophageal ganglia or indirectly via STNS (for the midgut) and by an intrinsic innervation, represented by the MP and SP for both mid and hindgut. The data obtained from the neurochemical approaches utilized in the GIt we infer that these different transmitter systems could exert putative roles in the motility or the secretomotor or sensorial functions of GIt. Finally, as an evidence of the enteric glial cells, the neural constituents of the snail GIt wall have a interaction with glia similar to have been described to invertebrate CNS represent a new approach to study of the ENS in gastropod and other invertebrates.

A cafeína é o psicoestimulante mais consumido em todo o mundo, cujos efeitos benéficos nas funções cognitivas têm sido observados em diferentes condições e modelos animais. O consumo de cafeína é difundido entre adultos, idosos, gestantes e mais recentemente, entre crianças e adolescentes. Alguns estudos clínicos e pré-clínicos sugerem que a exposição pré-natal à cafeína apresenta efeitos prejudiciais, como prematuridade, malformações congênitas, baixo peso ao nascer e mesmo teratogenicidade, enquanto outros estudos não demonstraram efeitos deletérios a longo prazo da cafeína. Além disso, poucos estudos têm abordado os efeitos da cafeína nas diferenças de sexo durante a puberdade e/ou adolescência. Devido ao alto consumo de bebidas contendo cafeína por crianças e adolescentes, existe uma grande preocupação a respeito dos seus potenciais efeitos nocivos nessas subpopulações. Assim, considerando que o consumo de cafeína tem crescido nesta população, no primeiro capítulo desta tese investigamos as alterações comportamentais e de proteínas sinápticas em ratos machos e fêmeas púberes expostos à cafeína pelo consumo materno durante a gestação, lactação e na água de beber até o início da puberdade. Ratas Wistar adultas receberam cafeína na água de beber (0.1 e 0.3 g/L) durante o seu ciclo ativo, em dias úteis, duas semanas antes do acasalamento até o desmame, quando então os filhotes passaram a consumir a cafeína até o início da sua puberdade (30-34 dias de idade) A análise comportamental e os níveis de proteínas sinápticas (pró-BDNF, BDNF, GFAP e SNAP-25) foram analisados no hipocampo e córtex cerebral. As fêmeas púberes apresentaram uma atividade locomotora maior e comportamento menos ansioso que os machos. Em ambos os sexos, a cafeína causou hiperlocomoção no campo aberto. Enquanto a cafeína em doses moderadas causou um prejuízo na memória de reconhecimento em fêmeas, foi observado uma melhora na memória de longo prazo em ambas as doses em ratos machos. O comportamento relacionado à ansiedade foi atenuado pela cafeína (0,3 g/L) apenas em fêmeas. Paralelamente com a melhora da memória nos machos, a cafeína aumentou os níveis de pró-BDNF e BDNF no hipocampo e córtex. As fêmeas apresentaram um aumento do pró-BDNF em ambas as regiões avaliadas em comparação aos machos. Embora a proteina GFAP não tenha sido alterada pelas diferenças de sexo e pelo tratamento com cafeína, a cafeína em doses moderadas aumentou o imunoconteúdo de SNAP-25 no córtex das fêmeas. Os resultados demonstram que o consumo de cafeína altera de forma distinta a memória de reconhecimento e o comortamento do tipo ansioso em ratos machos e fêmeas púberes. Além disso, o BDNF e proteínas relacionadas também foram modificados de uma forma dependente do sexo, sugerindo que alterações sinápticas ou de plasticidade podem estar associadas aos efeitos comportamentais Além dos efeitos da cafeína durante a gravidez e a puberdade, têm sido observados efeitos benéficos da cafeína sobre a memória no envelhecimento normal e no prejuízo observado em em modelos animais de doenças neurodegenerativas. Tendo em vista que os mecanismos subjacentes a estes efeitos da cafeína ainda permanecem desconhecidos, no segundo capítulo investigamos se a administração crônica de cafeína poderia melhorar o desempenho na tarefa de memória avaliada pelo teste da esquiva inibitória em ratos adultos e de meia-idade. Como o BDNF está associado com a formação da memória e as ações do BDNF são moduladas pelos receptores de adenosina, os alvos moleculares para as ações psicoestimulantes da cafeína, neste estudo avaliamos os efeitos da administração crônica de cafeína (1 g/L na água de beber durante 30 dias) na memória de curta e longa duração e nos níveis de pró- BDNF, BDNF maduro,o receptor TrkB e o fator de transcrição CREB no hipocampo de ratos machos adultos (3 meses de idade) e de meia-idade (12 meses) Ambos os gruposforam submetidos a tarefa de campo aberto e esquiva inibitória. Os ratos de meia-idade apresentaram diminuição da atividade locomotora em relação aos adultos e a cafeína não teve efeitos sobre a locomoção em ambas idades Na tarefa de esquiva inibitória, avaliou-se a memória de curta e longa duração. Ratos de meia-idade apresentaram um comprometimento total da memória de curta duração, e parcial da memória de longa duração em comparação com ratos adultos. O consumo de cafeína foi capaz de reverter o prejuízo decorrente da idade tanto para a memória de curta quanto de longa duração. O aumento do BDNF hippocampal causado pelo envelhecimento foi prevenido pelo consumo de cafeína, juntamente com um aumento no imunoconteúdo de pró-BDNF e CREB em ambas as idades. Além disso, os níveis de CREB aumentaram com o envelhecimento. Houve uma diminuição no imunoconteúdo de TrkB no hipocampo de ratos de meia-idade quando comparados aos adultos, e a cafeína diminuiu a densidade de TrkB em ambas as idades. Os dados encontrados indicam uma estreita associação entre a modificação do desempenho da memória e imunoconteúdo BDNF. Em conjunto, esses resultados apresentam novos indícios de que o consumo de cafeína promove desfechos comportamentais sexo-específicos em ratos púberes, além de ser capaz de normalizar o desempenho em tarefas de memória e alterações na sinalização do BDNF causadas pelo envelhecimento. / Caffeine is the most consumed psychostimulant worldwide, and the beneficial effects of chronic caffeine administration on cognitive function have been observed in different conditions and animal models. Caffeine consumption is widespread among adults, eldery, pregnant women and more recently, children and adolescents. Some clinical and preclinical studies suggest that prenatal exposure to caffeine presents harmful effects, such as prematurity, congenital malformations, low birth weight and even teratogenicity, whereas others studies demonstrated no long-term harmfull effects of caffeine. Besides that, few studies have addressed the effects of caffeine in a sex dependent manner during puberty and/or adolescence. Also, due to the increase in the consumption of caffeine containing drinks by children and adolescents, the potential harmful effects of caffeine in these subpopulations need to be investigated. Considering that caffeine intake has grown in this population, in the first chapter of the this thesis we investigated the behavioral and synaptic proteins changes in pubescent male and female rats after maternal consumption of caffeine. Adult female Wistar rats started to receive caffeine in drinking water (0.1 and 0.3 g/L; low and moderate dose, respectively) during the active cycle in weekdays, two weeks before mating. The treatment lasted up to weaning (21 days) and offspring continued receiving caffeine until the onset of puberty (30-34 days old). Behavioral analysis and synaptic proteins levels (proBDNF, BDNF, GFAP and SNAP-25) were immunodetected in the hippocampus and cerebral cortex. Pubescent females showed hyperlocomotion and less anxiety behavior as compared to males. In both sexes caffeine caused hyperlocomotion in the open field. While moderate caffeine worsened recognition memory in females, an improvement for long-term memory in both doses was observed in male rats Anxiety-related behavior was attenuated by caffeine (0.3 g/L) only in females. Also, in parallel with memory improvement in males, caffeine increased pro- and BDNF in the hippocampus and cortex. Females presented increased proBDNF in both brain regions as compared to males. While GFAP was not different according to sex or altered by caffeine consumption, moderate caffeine increased SNAP-25 in the cortex of female rats. Our findings revealed that caffeine differently affects recognition memory and anxietyrelated behaviors in pubescent male and female rats. In addition, BDNF and related proteins have also changed in a sex dependent manner, suggesting an association with behavioral outcomes. Beyond caffeine effects during pregnancy and puberty, beneficial effects of caffeine on memory processes have been observed in animal models relevant to neurodegenerative diseases and aging, although the underlying mechanisms remain unknown. In the second chapter we investigated whether chronic caffeine consumption could improve the performance in inhibitory avoidance memory task in adult and middle-aged rats. Because brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is associated with memory formation and BDNF’s actions are modulated by adenosine receptors, the molecular targets for the psychostimulant actions of caffeine, we here compare the effects of chronic caffeine (1 mg/mL drinking solution for 30 days) on short- and long term memory and on levels of hippocampal proBDNF, mature BDNF, TrkB and CREB in young (3 month old) and middle-aged (12 month old) male rats. Both groups were submitted to open field and inhibitory avoidance tasks. Middle-aged rats presented decreased locomotor activity as compared to adults and caffeine was devoid of effect at any age. In the inhibitory avoidance task, short- and long-term memory was evaluated Middle-aged rats presented impaired performance compared to adult ones for short-term memory. When long-term memory was evaluated, middle-aged rats showed a decreased in their perfomances compared to adult rats, and caffeine treatment was able to improveit. Western blot analysis showed that BDNF and CREB imunocontent increased in the hippocampus of aged rats and caffeine consumption was able to prevent the changes in BDNF levels. In addition, caffeine treatment increased the pro-BDNF and CREB immunocontent in both ages. Furthermore, CREB densities increased with aging. TrkB immunocontent was decreased in the hippocampus from middle-aged rats when compared to adult ones, and caffeine decreased the density of TrkB in both ages. The present findings indicate a close association between the modification of memory performance and BDNF immunocontent. Therefore, our data suggest caffeine normalyze memory performance upon aging and may be related to the ability of caffeine to normalyze the levels of BDNF. Taken together, these results present new evidence that caffeine consumption promotes sex-specific behavioral outcomes in addition to being able to normalize memory performance during aging and that changes could be related to a modification in BDNF signaling.

O núcleo medial (Me) é parte superficial do complexo amigdaliano e ainda muito pouco se conhece de seus constituintes celulares em seres humanos. Neste estudo desenvolveu-se uma adaptação do método de Golgi do tipo “single-section” para tecido nervoso humano fixado e conservado em formalina por tempo variável. Além disso, descreveu-se a densidade de neurônios e células da glia no Me, sua morfologia geral, incluindo detalhes de espinhos dendríticos e terminações axonais, a imunorreatividade à proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a ultraestrutura sináptica local. Como resultados demonstrou-se que as células da glia são maioria neste núcleo (cerca de 72% do total de células) e que há significativamente mais neurônios no Me do hemisfério esquerdo (1.53 X 105 neurônios/mm3). Os somas neuronais impregnados pelo método de Golgi demonstraram-se redondos/ovais, fusiformes ou poligonais (diâmetros entre 10-30 μm), os dendritos estenderam-se por distâncias variadas e contiveram espinhos pleomórficos, caracterizando neurônios com menos e mais espinhos dendríticos (densidades de 1,5 até 5,2 espinhos/μm), e os axônios revelaram terminações desde simples até muito complexas. Os neurônios multipolares foram classificados em Tipos 1, 2 ou 3 de acordo com trabalhos prévios, ou ainda em tipos morfológicos ainda não classificados Observaram-se astrócitos protoplasmáticos com muitos prolongamentos reativos à GFAP, isolados ou em grupos. Esses, no estudo ultra-estrutural, compuseram sinapses “tripartites” e “tetrapartites”, considerando-se o quarto elemento o da matriz extracelular situada entre os elementos pré- e pós-sinápticos. As sinapses axodendríticas apresentaram-se tanto assimétricas (com vesículas redondas pequenas e elétron-lúcidas) como simétricas (com vesículas pleomórficas pequenas e claras e, adicionalmente, com vesículas redondas grandes ou pequenas de centro escuro). Terminais axonais estabelecendo múltiplas sinapses assimétricas, classificados como de tipo “glomérulo”, também foram observados. A presente tese contribui com dados descritivos e quantitativos inéditos sobre a morfologia das células do Me, o que pode servir de base para o entendimento e novas investigações sobre o funcionamento desse núcleo em situações normais ou patológicas em seres humanos. / The medial nucleus (Me) is a superficial component of the amygdaloid complex. Little is currently known about its cellular composition in humans. Here is reported an adaptation of the “single-section” Golgi method for formalin fixed and stored human brain for diversified periods. Furthermore, the density of neurons and glial cells in the Me, their general morphology including dendritic spines and axonal terminals details, the glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity, and features of local cells under electron microscopy are described. Our results show that Me had an estimated mean neuronal density around 1.53 X 105 neurons/mm3 (higher in the left hemisphere), more glia (72% of all cells) than neurons, and a nonneuronal/neuronal ratio of 2.7. Golgi-impregnated neurons had cell bodies with a round/ovoid, fusiform or polygonal shape (diameters ranging from 10 to 30 μm), dendrites with varying lengths and pleomorphic spines that characterized neurons more or less spiny (density varying from1.5 to 5.2 spines/μm), and ranging from simple to very complexes terminal axons. Neurons appeared as “bitufted” or stellate multipolar cells, or classified in “Types 1 to 3” according to previous immunohistochemical observations, or other still unclassified morphologies. Protoplasmic astrocytes, either isolated or forming small clusters, were observed and showed multiple branches immunoreactive for GFAP, being equally distributed between right and left hemispheres They were found composing tripartite synapses or, together with an evident extracellular matrix between pre- and postsynaptic elements, tetrapartite ones. Axo-dendritic synapses were both asymmetrical (with various small, round electron-lucent vesicles) and symmetrical (with small pleomorphic vesicles and, occasionally, few intermingled large dense-core vesicles). Terminal axons with a glomerular-like structure were also found forming various asymmetric contacts. The present thesis add novel descriptive and qualitative information about neuronal and glial population of the human Me, which provide a basic contribution to our understanding, and to further research, of the functional implications of the Me in the brain organization both in normal and pathological conditions .

O diabetes mellitus tipo I é uma enfermidade autoimune relacionada com anormalidades genéticas, influenciada por fatores ambientais, que resultam na destruição de células β-pancreáticas, mediadas por células T. O diabetes durante a gravidez aumenta o risco a alterações no sistema nervoso central. O processo de gliogênese é importante para o desenvolvimento e funcionamento do SNC e começa na segunda semana de gestação, em ratos. A glia é composta por astrócitos, oligodendrócitos, células ependimais e microglia. Os astrócitos são as células mais abundantes e responsáveis pela integração do cérebro com o sistema vascular e imunológico, estando relacionados com as funções cognitivas, além de uma importância física e estrutural na barreira hemato-encefálica. Duas proteínas astrocíticas foram estudadas aqui: a proteína glial fibrilar acida e a S100B, uma proteína ligante de cálcio, produzida e secretada por astrócitos. A S100B está envolvida na comunicação neurônio-glia, possuindo propriedades neurotróficas ou neurotóxicas de acordo com a concentração extracelular. A expressão da proteína glial fibrilar ácida é essencial para a estrutura encefálica e para a integridade da barreira hemato-encefálica. Assim avaliamos essas proteínas gliais na prole oriunda de mães diabéticas (PoD) no desenvolvimento corporal e do sistema nervoso central. Foram utilizadas ratas Wistar-Kyoto diabéticas induzidas por estreptozotocina para obtenção da prole. As fêmeas diabéticas induzidas apresentaram ninhadas menores do que o controle, e os filhotes apresentam menor peso ao nascer A hiperglicemia materna induz aumento da produção insulínica no feto, que leva a um quadro de hipoglicemia pós-natal. Os níveis glicêmicos do PoD foram superiores ao controle (PoC) com 1 dia, e inferiores com 21 dias. A mensuração da proteína S100B no soro de animais PoD14 apresentou diminuição em relação ao controle. A S100B no líquor mostrou valores foram maiores no PoD7. Já a S100B no hipocampo mostrou um crescimento progressivo, com diminuição no PoD14 e um aumento no PoD28. Na quantificação da proteína glial fibrilar acida os animais do grupo PoD7 e PoD14 apresentaram valores menores, em seguida os níveis começaram a subir. No teste de campo aberto os animais PoD apresentaram comportamento ansioso. Já no reconhecimento de objetos os ratos PoD exploraram menos o objeto novo, tanto na memória de curta como de longa duração. As mudanças astrogliais observadas nos animais do grupo PoD estão muito provavelmente relacionadas a alterações da plasticidade neuroglial e ao déficit cognitivo observado. / The type I diabetes mellitus is an autoimmune disease associated with genetic abnormalities, influenced by environmental factors which result in the destruction of pancreatic β-cells, mediated by T cells. Diabetes during pregnancy increases the risk of changes in the central nervous system. The gliogenesis process is important to the development and functioning of the central nervous system and starts the second week of rat gestation. The glia is composed of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells and microglia. The astrocytes are more abundant cells and responsible for the integration of the brain with vascular and immune systems, being connected with the cognitive functions, as well as a physical and structural importance of the blood-brain barrier. Two astrocity proteins were studied: glial acidic fribrilar protein and S100B, a binding protein of calcium produced and secreted by astrocytes. S100B is involved in neuron-glia communication, having neurotoxic or neurotrophic properties according to the extracellular concentration. Expression of glial acidic fribrilar protein is essential for brain structure and integrity of the blood-brain barrier. So we evaluated this glial proteins the offspring derived from diabetic mothers (PoD) on body development and central nervous system. Wistar-Kyoto rats with diabetes induced by streptozotocin to obtain offspring. Induced diabetic females had smaller litters then the control, and the offsprig have a lower birth weigth Maternal hyperglycemia induces increased insulin production in the fetus. Blood glucose levels were higher in PoD than the control (PoC) with 1 day and less than 21 days. The measurement of S100B protein in PoD14 animal serum showed a decrease compared to the control. The S100B in cerebrospinal fluid showed values were higher in PoD7. Since S100B in the hippocampus showed a progressive increase with decrease in PoD14 and increase in PoD28. Glial acidic fribrilar protein quantification in animals of PoD7 and PoD14 group showed lower values, and then levels began to rise. In the open field test the PoD animals showed anxious behavior. Since the object recognition (RO) least rats explored the new object in both short and long term memory. Induced diabetic females had smaller litters than the control, and the chicks have a lower birth weight. Maternal hyperglycaemia induces increased insulin production in the fetus, which leads to a postnatal hypoglycemia. The variations observed in the animals of group PoD caused biochemical changes related to astroglial plasticity, which caused cognitive impairment.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.