Orientadores: João Santana da Silva, Antonio Campos Neto / Resumo: As duas lectinas presentes em sementes de A. intergrifolia foram obtidas por cromatografia de afinidade. Uma é a lectina não mitogênica Jacalina, ligante de D galactose; e a outra é a lectina mitogênica Artocarpina que possue especificidade para resíduos manosídeos. Essas duas lectinas foram utilizadas para se estudar o perfil de citocinas produzidas por células esplênicas murinas quando estimuladas por lectinas com distintas especificidade para carboidratos. Os resultados mostraram que a F. Arto é capaz de estimular a síntese de IL-2, IL-4, TNF e IFN-?. Esta lectina não foi no entanto capaz de induzir a síntese de TGF-ß. Em contraste a Jacalina induziu altos níveis de TGF-ß, baixos níveis de TNF mas não induziu a secreção de IL-2, IL-4 e IFN-?. As citocinas IL-3/GM-CSF e IL-6 foram estimuladas igualmente por ambas lectinas. Estes resultados sugerem por conseguinte que: as sínteses de TNF, IL-3/GM-CSF e IL-6 estão associadas aos resíduos glicídicos de D manose ou D-galactose; as sínteses de IL-2, IL-4, IFN-? estão associados ao resíduo de D-manose e a síntese de TGF- ß está associada ao resíduo de D-galactose / Abstract: In the present thesis we investigated the pattem of cytokine secretion by murine spleen cells after the stimulation with two lectins specific for distinct carbohydrates. The lectins Jacalin and Artocarpin, specific for D-galactose and D-mannose respectively were obtained from the seeds of Artocarpus integrifolia by affnity chromatography and were used in these studies. Both lectins bind to murine spleen cells but the fate of this binding is different. The binding to the D-mannose containing cell surface molecules caused the spleen cells to proliferate. In contrast the cell activation via D-galactose containing cell surface molecules did not induce the spleen cells to proliferate. Consistent with these results was the pattern of cytokine secreted by the spleen cells. Thus, the activation of the spleen cells with F. Artocarpin caused the secretion of IL 2, IL 4, IFN-? and TNF. However the binding of F.Artocarpin to the spleen cells did not induce the secretion of TGF-ß. In contrast the activation of the spleen cells via the D-galactose cell surface molecules, induced by Jacalin, resulted in large production of TGF-ß, little production of TNF and no secretion of IL 2, IL 4 and IFN-?. The secretion of IL3/GM-CSF and IL 6 was equally induced by the binding of the lectins to either D-mannose or D-galactose containing cell surface molecules / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biolgia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:42:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Delgado_Maristela_M.pdf: 2676142 bytes, checksum: 8c382e538652cd9b31d0d9a814dc35b7 (MD5) Previous issue date: 1993 / Mestrado / Mestre em Imunologia

Orientador: Pedro L. O. Volpe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-20T05:05:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilvaFilho_EloiAlvesda_D.pdf: 2324435 bytes, checksum: cff02643fe1c231fb562af4fe6d9df31 (MD5) Previous issue date: 1995 / Doutorado

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Carlos Frederico Martins Menck / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Resumo: A expressão gênica pode ser regulada em eucariotos em diversas etapas dometabolismo de mRNA, como transcrição, processamento, tradução e degradação. A estabilidade de mRNA é modulada por elementos presentes no transcrito e por proteínas ligantes de RNA associadas a esses elementos. Pub1 de S. cerevisiae é uma proteína citoplasmática capaz de estabilizar transcritos contendo elementos ricos em AU (ARE e ARE-like) ou elementos estabilizadores (STE). O presente trabalho identificou num rastreamento de duplo-híbrido a proteína Nab2 como ligante de Pub1. Nab2 é uma proteína nucleocitoplasmática essencial que regula o comprimento da cauda poli(A) e a exportação nuclear de mRNA. A interação entre Pub1 e Nab2 foi confirmada por co-purificação e ensaio de interação in vitro. Foi demonstrado também que essa interação é mediada pelo domínio de dedos de zinco presente na região C-terminal de Nab2. A análise da relação funcional entre essas duas proteínas revelou que Nab2, assim como Pub1, é capaz de modular a estabilidade de mRNA. A estabilidade do transcrito de RPS16B, mensageiro contendo sequência ARE-like e regulado por Pub1, é diminuída nos mutantes nab2- 1 e nab2-67. No entanto, a estabilidade do transcrito de GCN4, mensageiro contendo STE e também regulado por Pub1, não é afetada nos mesmos mutantes. Resultados semelhantes foram observados para outros transcritos contendo sequências ARE-like ou STE. Ainda, dados obtidos com um mutante da via NMD (?upf1) mostraram que esta via de decaimento não está envolvida com o mecanismo de estabilização de RPS16B mediada por Pub1 e Nab2. Uma análise mais profunda mostrou que a sequência ARE-like presente no mensageiro de RPS16B é necessária para a estabilização mediada por Nab2. A proteína Pub1 e seus domínios isolados foram produzidos e purificados, mas não foi possível a obtenção de cristais para...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Regulation of gene expression can occur at different levels of mRNA life cycle, including transcription, processing, translation and degradation. mRNA stability is modulated by elements in the mRNA transcript and their cognate RNA-binding proteins. Poly(U)-binding protein 1 (Pub1) is a cytoplasmic S. cerevisiae mRNA binding protein that stabilizes transcripts containing AU-Rich Elements (ARE and ARE-like) or Stabilizer Elements (STE). In a yeast two-hybrid screen, we identified Nuclear poly(A)-binding protein 2 (Nab2) as a Pub1-interacting protein. Nab2 is an essential nucleocytoplasmic shuttling mRNA binding protein that regulates poly(A) tail length and mRNA export. The interaction between Pub1 and Nab2 was confirmed by co-purification and in vitro binding assays. The interaction is mediated by the Nab2 zinc finger domain. Analysis of the functional link between these proteins reveals that Nab2, like Pub1, can modulate the stability of specific target mRNA transcripts. We find that the half-life of the RPS16B transcript, an ARE-likecontaining Pub1 target, is decreased in both nab2-1 and nab2-67 mutants. In contrast, GCN4, an STE-containing Pub1 target, is not affected. Similar results were obtained with other ARE- and STE-containing Pub1 target transcripts. Additionally, results obtained with a mutant of the NMD pathway (?upf1) showed that this pathway is not involved in the mechanism of RPS16B stabilization mediated by Pub1 and Nab2. Further analysis reveals that the ARE-like sequence is necessary for Nab2- mediated transcript stabilization. Full-length Pub1 and isolated domains were produced and purified, however, it was not possible to obtain protein crystals for tertiary structure determination. Taken together, these results suggest that Nab2 acts together with Pub1 to modulate mRNA stability and strengthen a model where nuclear events involved in mRNA biogenesis...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

La Gliadina es una proteína presente en el trigo, avena, centeno y cebada, que no es completamente degradada durante el proceso de la digestión, produciendo varios péptidos, entre ellos el 33-mer. Este péptido se conoce por ser el principal inmuno-modulador de la patología celíaca, provocando un desbalance entre la tolerancia y auto-inmunidad. En esta tesis se presenta el estudio estructural y la elucidación de la auto-organización de la proteína gliadina y de su péptido 33-mer en medio acuoso y sobre superficies, mimetizando condiciones fisiológicas in vitro. En primer lugar, se determinó que la proteína gliadina se auto-organiza espontáneamente formando agregados solubles a pH 3.0. Cuando se cambió el pH a 7.0, se observó una separación de fases, con disminución de la concentración y cambio en la composición aunque permanecieron ciertas nano-estructuras y agregados amorfos en solución. Si bien no se observaron modificaciones en la estructura secundaria a ambos pHs, se detectó una exposición diferencial de los residuos aromáticos como Tirosina y Triptófano, lo cual puede deberse a un cambio en la estructura terciaria. Por técnicas bioinformáticas, se determinaron probables sitios hidrofóbicos, residuos expuestos al solvente y regiones con capacidad de agregarse, los cuales podrían explicar los hallazgos experimentales observados. Por otro lado, el fluoróforo Rojo Nilo presentó una unión en el orden micromolar solo a pH 3.0, lo cual sugiere la presencia de sitios hidrofóbicos accesibles en los agregados solo a este pH. Estos resultaron sugieren que a pH 3.0 el sistema se organiza en nano- estructuras tipo micelares, mientras que a pH 7.0, las estructuras presentaron una disminución de la carga neta de la superficie (desde + 13 a pH 3.0, a + 4 mV a pH 7), llevando a la formación de nano- partículas coloidales que no interactúan con el Rojo Nilo. En segundo lugar, se evaluaron las características estructurales del péptido 33-mer mediante dicroísmo circular y espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier -reflectancia total atenuada, se ha demostrado que el 33-mer se encuentra en un equilibrio conformacional random coil/PPII y PPII/β paralela, dependiente de la concentración. Mediante dinámica molecular y distribución de cargas parciales fue posible observar que el péptido se comporta como una molécula anfifílica y es capaz de asociarse formando al menos un dímero estable. En agua a pH 7.0 se observaron oligómeros manométricos y estructuras fibrilares por microscopia electrónica. La presencia de oligómeros en solución del péptido 33-mer fue confirmado mediante anisotropía y fluorescencia resuelta en el tiempo del residuo Tirosina y DLS-Correlación 3D, detectando que 33-mer es un sistema polidisperso dinámico con partículas de tamaños entre los nano y micrómetros en todo el rango de concentraciones analizado (125-610 μM). La microscopia de fuerza atómica del péptido 33-mer en función de la concentración sobre mica confirmó la capacidad de 33-mer de formar nano y micro-estructuras con diferentes morfologías. Se observó a bajas concentraciones clusters de nanoesferas. A concentraciones intermedias oligómeros esféricos asociándose en arreglos lineales, anulares y estructuras similares a placas. A altas concentraciones, se observaron filamentos y placas rodeadas por nanoesferas, con una disposición del tipo fractal. Este tipo de organización se produce mediante un mecanismo de Agregación Limitada por la Difusión. Por otro lado, se evaluaron los oligómeros del péptido 33-mer sobre dos superficies hidrofóbicas miméticas al intestino, como el HOPG y el dióxido de silicio. En el HOPG se detectaron estructuras de morfología similar a las obtenidas en mica. En la superficie de dióxido de silicio, el auto-ensamblado del 33-mer fue dinámico y dependiente de las condiciones de preparación de la muestra, obteniéndose agregados a través de un mecanismo de percolación. Finalmente, la morfología de las nano-estructuras presentes a 600 μM se resolvió mejor utilizando un microscopio de ion Helio, detectando además de las estructuras mencionadas anteriormente, de nano-cilindros, los cuales se proponen como intermediarios en la formación de las fibras detectadas. La capacidad de formación de nano-estructuras de variadas morfologías de la gliadina y de su péptido 33-mer in vitro y el hecho que estas posean una estructura secundaria característica podría ser un conocimiento fundamental en el estudio de las patologías relacionadas con el gluten / Gliadin is a protein present in wheat, rye, and barley that undergoes an incomplete degradation during digestion, producing several peptides, including 33-mer. This peptide is known to be the most important immunomodulator peptide of celiac disease, producing an imbalance between tolerance and auto-immunity. In this PhD Thesis it is presented a structural and auto-organization elucidation of gliadin and its 33-mer peptide in aqueous medium and on surfaces, in physiological conditions in vitro. Firstly, it was determined that gliadin self-assemble spontaneously at pH 3.0 forming spherical aggregates. When the pH was changed to 7.0 a phase separation, concentration diminution and a change on the composition was observed. However, soluble amorphous aggregates remained in solution. Although no difference in the secondary structure at both pHs were detected, differential exposition of Tyrosine and Tryptophan was observed, which could be caused by a tertiary structure change. By applying bioinformatics' tools, possible hydrophobic sites, residues exposed to the solvent and regions with capability to auto-aggregate were evaluated, they could explain the experimental results observed. In the other hand, Nile Red only bound to gliadin nanostructures in the micromolar order at pH 3.0, suggesting that hydrophobic sites were accessible at this pH. These results indicated that a pH 3.0, the system auto-organized as micelar nano-structures, meanwhile at pH 7.0 the nano-structures presented a diminution of the surface charge (from + 13 at pH 3.0 to + 4 mV a pH 7), inducing the formation of colloidal nano-particles that did not interact with Nile Red. Secondly, the structural characteristics of 33-mer peptide were studied by Circular Dichroism and Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infra Red Spectroscopy, showed a conformational equilibrium between coil/PPII y PPII/β paralell structures depending on concentration. By Molecular Dynamic Simulation and Partial Charge Distribution, it was observed that the peptide was an amphiphilic molecule and it is capable of associate at least as a stable dimmer. By Electron Microcopy the tendency to self-assemble of the peptide was detected. In water at pH 7.0, oligomers and fibrilar structures were observed. By Time Resolved Fluorescence of Tyrosine, Dynamic Light Scattering-Correlation 3D in aqueous medium have determined that 33-mer peptide is a dynamic polydisperse system with particles of size between nano-micrometers in the range of concentration analyzed (125-610 μM). Studies done by Atomic Force Microscopy of 33-mer peptide depending on concentration on mica demonstrated that it could form nano and micro structures with different morphologies. It was observed at low concentration clusters of nano-spheres. At Intermediate concentrations spheric oligomers, annular and sheet like structures were observed. A high concentration, filaments and sheets surrounded by nanospheres, with a fractal disposition were detected. This kind of organization was produced by a Diffusion Limited Aggregation. In the other hand, the auto-organization of 33-mer peptide on two hydrophobic surfaces that are mimetic to the gut surface as HOPG and Silicon dioxide were evaluated. On HOPG similar structures as the ones detected on mica were observed. On Silicon Dioxide the auto-organization of 33-mer was dynamic and dependent on the conditions in which samples were prepared, detecting aggregates that were formed by a percolation mechanism. Finally, the morphology of the aggregates at 600 μM where observed using a Helium Microscope, detecting the formation of nano-rods, which are proposed as the intermediaries in the Fibril formation phenomena. Finally, the morphology of the aggregates at 600 μM where better resolved by an ion Helium Microscope, detecting the formation of nano-rods, which are proposed as the intermediaries in the fibril formation phenomena. .The capability of Gliadin and its 33-mer peptide to generate nano-structures of different morphologies in vitro and the fact that they have a characteristic secondary structure may be a fundamental knowledge in the study of gluten related diseases.

El conocimiento de la estructura de las proteínas constituye una de las principales aproximaciones hacia el entendimiento de las bases moleculares de las enfermedades humanas; en particular, puede ser usada para racionalizar los efectos de muchas mutaciones causantes de enfermedades, que a menudo son asociadas con cambios en la estabilidad de las proteínas. En este trabajo, se estudia el Dominio BRCT, módulo evolutivo de aproximadamente 95 aminoácidos, con plegamiento autónomo, conservado a través de la mayoría de taxas y encontrado en muchas proteínas relacionadas a la reparación del DNA, recombinación y control del ciclo celular. Una de las características conservadas del plegamiento del dominio BRCT es la estructura formada por dos alfa hélices en una región de la molécula, haciendo frente a la hoja plegada ß central, que contiene dos de las mas conocidas mutaciones relacionadas a cáncer de mama, y que resultan en la introducción de un residuo cargado que desestabiliza la interfase del complejo BRCT-BRCT en la proteína BRCA1. Para este trabajo, elegimos probar la estabilidad del BRCT presente en la enzima DNLJ ligasa de una bacteria termófila mediante la remoción de la carga de superficie, “R21”, de esta estructura. Este es un primer paso para evaluar si la carga de superficie contribuye significativamente a la estabilidad de este dominio termofílico, para profundizar en el posible rol de la estabilidad del BRCT en el desarrollo del cáncer de mama, y por encima de todo, para determinar las bases de la estabilidad de este dominio que dada su frecuencia, se constituye en un hecho biológicamente relevante. Los resultados preliminares sugieren que la estabilidad del dominio BRCT de la DNLJ ligasa de Thermus thermophilus, es tolerante a la remoción de cargas en su superficie, pero es afectado por las variaciones en la hidrofobicidad. Aunque estas mutaciones no muestran variaciones significativas en la estructura y la estabilidad del dominio, si podrían estar afectando la habilidad de interactuar con otras proteínas. / The knowledge of protein structure constitutes one of the main approaches towards understanding the molecular basis of human disease, in particular, protein structure can be used to rationalize the effects of many disease-causing mutations, which often are associated with changes of protein stability. In this work, the BRCT domain is studied, an evolutionary protein module with autonomous folding, of approximately 95 aminoacids, found in numerous proteins involved in DNA repair, recombination and cell cycle control. One of the conserved features of the BRCT fold is a two helical bundle located against one side of the central four-stranded ß sheet, which features two of the best known mutations in breast cancer resulting from introducing a distabilizing charge within the interface of the BRCT-BRCT complex in BRCA1. We have chosen to probe the stability of the BRCT of DNLJ ligase in a thermophilic bacteria by removing the surface charge "R21" from this bundle. This is a first step to test whether this surface charge contributes significantly to the stability of this thermophilic domain, to gain insight about the possible role of BRCT stability on the breast cancer disease, and most of all, to determine the basis for the stability of this frequently found and biologically relevant structural domain. Our preliminar results suggest that the stability of the BRCT of the DNLJ ligasa of Thermus thermophilus BRCT domain is tolerant to the surface charge removal, but is affected by hydrophobicity. Although these mutations do not show significant variations in the structure and stability of the domain itself, they may affect their ability to interact with other protein modules.

Orientador: Antonio Carlos Busoli / Banca: Marcos Doniseti Michelotto / Banca: Raphael de Campos Castilho / Banca: José Roberto Scarpellini / Banca: Arlindo Leal Boiça Junior / Resumo: O cenário agrícola no Centro Oeste conta com os chamados sistemas de produção, nos quais os cultivos ocorrem de forma constante e sucessiva durante um mesmo ano agrícola. No entanto, isso tem propiciado problemas cada vez mais frequentes relacionados a alguns grupos de pragas, dentre eles os lepidópteros. Espécies como Chrysodeixis includens e o complexo de Spodoptera vem crescendo de importância, causando prejuízos, principalmente em culturas como a soja e o algodoeiro. Dentre os métodos mais utilizados para o controle de insetos-praga no Brasil, destaca-se o uso de OGM, a partir da inserção de genes da bactéria Bacillus thuringiensis (Bt), com expressão de proteínas com ações inseticidas. Entretanto, um dos grandes problemas é a seleção de populações de pragas resistentes aos cultivos Bt devido ao uso contínuo e inadequado da tecnologia. Diante disso, os objetivos do presente estudo foram avaliar os efeitos de cultivares Bt de soja e algodoeiro, que expressam proteínas inseticidas Cry, sobre os aspectos biológicos de C. includens em laboratório, como também avaliar a dinâmica populacional e a infestação natural de lagartas de C. includens e de Spodoptera spp. em condições de campo, no estado do Mato Grosso. Para o estudo dos aspectos biológicos, utilizou-se lagartas neonatas que foram alimentadas com folhas das cultivares de soja e algodoeiro não Bt e Bt de diferentes tecnologias. Os experimentos de campo foram realizados em área experimental do IMAmt na safra 2016/2017, ut... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The agricultural scenario in the brazilian midwest counts on the socalled production systems, in which crops occur constantly and successively during the same agricultural year. However, this has caused increasingly frequent problems related to some groups of pests, among them the Lepidoptera. Species such as Chrysodeixis includens and the Spodoptera complex have been increasing in importance, causing damage, especially in crops such as soybean and cotton. Among the most used methods for the control of insect pests in Brazil, the use of GMOs, from the insertion of genes of the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), with expression of proteins with insecticidal actions, stands out. However, one of the major problems is the selection of populations of pests resistant to Bt crops due to the continuous and inadequate use of the technology. The objectives of the present study were to evaluate the effects of Bt cultivars of soybean and cotton, which express insecticidal Cry proteins, on the biological aspects of C. includens in the laboratory, as well as to evaluate the population dynamics and the natural infestation of caterpillars C. includens and Spodoptera spp. under field conditions, in the state of Mato Grosso. For the study of the biological aspects, we used caterpillars that were fed with leaves of the cultivars of soybean and non-Bt and Bt cotton of different technologies. Field experiments were carried out in the experimental area of the IMAmt in the 2016/2017 season, usi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-09-14Bitstream added on 2014-06-13T21:01:33Z : No. of bitstreams: 1 martins_al_dr_sjrp_parcial.pdf: 169834 bytes, checksum: f95bbfe4b3ea069b9bc61e9a309bbee1 (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:04Z: martins_al_dr_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:07Z : No. of bitstreams: 1 000707231.pdf: 1624095 bytes, checksum: e89222e48298ae5ccc2e0464958b408b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O enovelamento de proteínas é um problema fundamental em Biofísica Molecular. Propõe8se neste trabalho um método de crescimento de estruturas proteicas utilizando uma rede denominada cubo8octaédrica. Neste processo de crescimento a partir da estrutura primária utiliza8se um potencial estatístico de interação entre pares de resíduos a fim de determinarmos a estrutura terciária da sequência. Para o ensemble estrutural analisam8se propriedades estruturais como o raio de giro das cadeias e o desvio médio quadrático das distâncias. Além deste estudo de previsão de estruturas, analisamos parâmetros energéticos termodinâmicos no estado de transição da proteína CI2 (cujo código PDB é 1 coa) bem como o cálculo dos valores de φ-values para os resíduos que fazem contatos no estado de transição / Protein folding is a fundamental problem in Molecular Biophysics. We present a method of chain growth algorithm to lattice generation of protein structure. The interaction between pairs of residues in this process is a statistical potential proposed by THOMAS and DILL. We examine properties as radius of gyration and root mean square deviation of ensemble protein structure. Finally, we verify the themodynamics energetic parameter in the transition state of protein folding 1 coa

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-21Bitstream added on 2014-06-13T20:21:23Z : No. of bitstreams: 1 ullah_a_dr_sjrp.pdf: 8822371 bytes, checksum: 27ee15e9c877124a634e8bf6e77c40bb (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Um certo número de proteínas do veneno foram purificadas, caracterizadas e as suas estruturas foram determinadas para delinear as suas especialidades. (a) A LAAO de Bothrops jararacussu indicou uma maior especialidade para os resíduos hidrófobos, devido a uma substituição de Trp430por lle. O FAD ligado estava em uma conformação diferente do relatado em outros estudos. (b) O domínio rico em cisteína da metaloproteinase (MP III) de Bothrops moojeni pode adotar diferentes orientações relativas. (c) O local de distribuição de carga de serino proteinases é fundamental para determinar a especificidade da enzima. (d) A conformação tetramérica da Lys49 PLA2 de Bothrops brazili indica coexistência de dois estados diméricas. (e) A adição de uma segunda ponte dissulfeto estabiliza o loop catalítico e Trp 230 adota uma conformação diferente na ligação do substrato. Estes resultados contribuem para melhorar a nossa compreensão do modo de ação e função dessas proteínas / A number of venom proteins were purified, characterized and their structures were determined to delineate their specificities. (a) The LAAO from Bothrops jararacussu indicated a higher specifity for hydrophobic residues due to a substitution of Trp430 by lle. The bound FAD was in a diferente conformation to that reported in other studies. (b) The cysteine rich domain of the metalloproteinase (MP III) from Bothrops moojeni can adopt different relative orientations. (c) The local charge distribution of serine proteinases is instrumental in determining enzyme specificity. (d) The tetrameric conformation of the Lys49 PLA2 from Bothrops brazili indicates coexistence of two dimeric states. (e) The addition of a second disulphide bridge stabilizes the catalytic loop and Trp 230 adopts a different conformation on substrate binding. These results contribute to improve our understanding of the mode of action and function of these proteins

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Banca: Agnes Alessandra Sekijima Takeda / Banca: Lisandra Marques Gava / Resumo: A leishmaniose é um espectro de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania, afligindo mais de 15 milhões de pessoas e expondo outras 350 milhões que vivem em regiões de risco. Para manter a integridade de seu genoma, os parasitas dispõem de diversos mecanismos, dentre os quais estão a manutenção dos telômeros. As proteínas da família TRF ("TTAGGG telomere repeat-binding factor") fazem parte de complexos multiproteicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos, incluindo os tripanossomatídeos. Elas apresentam um domínio de interação com DNA telomérico na forma de dupla fita, um domínio de homodimerização e possíveis regiões de interação com outras proteínas teloméricas ou da maquinaria de reparo. O intuito deste projeto foi confirmar a existência nos telômeros de Leishmania amazonensis de possíveis proteínas parceiras da proteína LaTRF, já que resultados preliminares de nosso grupo revelaram uma possível interação entre a LaTRF e as proteínas LaRPA-1 e LaRbp38. No intuito de se obter a proteína telomérica LaTRF recombinante pura e em quantidade desejável, foi solicitada a síntese com códons otimizados, do gene que codifica a LaTRF e a subclonagem do mesmo na mesma fase de leitura do vetor de expressão pQE-2 (QIAGEN). A proteína recombinante gerada a partir desta construção foi expressa de forma solúvel, e em baixíssima concentração e a análise de sua estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular confirmou que a proteína foi expressa de forma enovelada. A LaTRF recombinante foi utilizada em ensaios in vitro de interação proteína:proteína com suas possíveis parceiras: LaRbp38 e LaRPA-1. Ensaios de imunoprecipitação, imunofluorescência e pull-down revelaram que LaTRF interage com LaRbp38 e que esta interação se dá via um motivo TRFH-docking like, presente na LaRbp38. Parece que a LaRbp38 atua como ... / Abstract: Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites of the genus Leishmania, affecting about 15 million people and exposing other 350 million that live in risk areas. Parasites have various mechanisms to maintain the integrity of its genome, among which is the maintenance of telomeres. Proteins belonging to the TRF ("TTAGGG telomere repeat-binding factor") family form part of a multiprotein complex responsible for telomere maintenance in eukaryotes, including trypanosomatids. TRFs present a DNA binding domain, a homodimerization domain and regions that allow the protein to interact with other proteins. The aim of this project was to confirm the existence in Leishmania amazonensis telomeres of LaTRF protein partners, since preliminary results from our group revealed a possible complex formed with LaTRF, LaRPA-1 and LaRbp38. In order to obtain the LaTRF recombinant protein, we ordered the optimized gene sequence and its subcloning in the bacterial expression vector pQE-2 (QIAGEN). Recombinant LaTRF was expressed in low amount, but in soluble form. Circular dichroism spectroscopy analysis showed that the recombinant LaTRF was in its folded state and able to be used in vitro protein:protein interaction assays with its potential partners: LaRbp38 and LaRPA-1. Immunoprecipitation, indirect immunofluorescence and pull-down assays revealed that LaTRF physically interacts with LaRbp38 using a TRFH-docking like motif present in proteins that interact with the TRFs, such as TIN2 (TRF interacting factor 2). This suggests that LaRbp38, similarly to TIN2, may play a role of stabilizing LaTRF in double strand and promote the interaction of this complex with for example LaRPA-1, previously described as a protein that binds to the single stranded telomeric DNA. This possibly explains why LaTRF physically interact with LaRbp38 but not with LaRPA-1, although they all co-immunoprecipitated in the same complex. Here we describe ... / Mestre

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Jack Spencer / Banca: Adélia Cristina Oliveira Cintra / Banca: Jose Ramon Abrego / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: Um certo número de proteínas do veneno foram purificadas, caracterizadas e as suas estruturas foram determinadas para delinear as suas especialidades. (a) A LAAO de Bothrops jararacussu indicou uma maior especialidade para os resíduos hidrófobos, devido a uma substituição de Trp430por lle. O FAD ligado estava em uma conformação diferente do relatado em outros estudos. (b) O domínio rico em cisteína da metaloproteinase (MP III) de Bothrops moojeni pode adotar diferentes orientações relativas. (c) O local de distribuição de carga de serino proteinases é fundamental para determinar a especificidade da enzima. (d) A conformação tetramérica da Lys49 PLA2 de Bothrops brazili indica coexistência de dois estados diméricas. (e) A adição de uma segunda ponte dissulfeto estabiliza o loop catalítico e Trp 230 adota uma conformação diferente na ligação do substrato. Estes resultados contribuem para melhorar a nossa compreensão do modo de ação e função dessas proteínas / Abstract: A number of venom proteins were purified, characterized and their structures were determined to delineate their specificities. (a) The LAAO from Bothrops jararacussu indicated a higher specifity for hydrophobic residues due to a substitution of Trp430 by lle. The bound FAD was in a diferente conformation to that reported in other studies. (b) The cysteine rich domain of the metalloproteinase (MP III) from Bothrops moojeni can adopt different relative orientations. (c) The local charge distribution of serine proteinases is instrumental in determining enzyme specificity. (d) The tetrameric conformation of the Lys49 PLA2 from Bothrops brazili indicates coexistence of two dimeric states. (e) The addition of a second disulphide bridge stabilizes the catalytic loop and Trp 230 adopts a different conformation on substrate binding. These results contribute to improve our understanding of the mode of action and function of these proteins / Doutor