Orientador: Cleslei Fernando Zanelli / Co-orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Otavio Henrique Thiemann / Banca: Rafael Victorio Carvalho Guido / Banca: Mario Henrique Bengtson / Resumo: eIF5A é uma proteína altamente conservada entre arqueas e eucariotos e apresenta uma modificação pós-­‐traducional única e essencial para sua função, chamada de hipusinação. eIF5A foi inicialmente identificado como um fator de início de tradução (eukaryotic translation Initiation Factor 5A) porém foi demonstrado que eIF5A atua na elongação da tradução. Recentemente foi demonstrado que eIF5A seja mais importante na tradução específica de proteínas contendo resíduos consecutivos de prolina. No intuito de aprofundar o conhecimento da participação de eIF5A no processo de tradução, o presente trabalho de doutorado estudou a relação funcional entre eIF5A e o tRNA de alanina (tRNAAla), revelada como uma interação genética em Saccharomyces cerevisiae, assim como avaliou a relação de eIF5A com eventos da síntese proteica como Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF), misincorporation e readthrough, utilizando repórteres de duas luciferases. Primeiramente, foi analisada a especificidade alélica da supressão em alto número de cópias ocasionada por tRNAAla e a capacidade de tRNAs para outros aminoácidos suprimirem o fenótipo de crescimento de mutantes de eIF5A, e os resultados mostraram que esta supressão não se dá de maneira alelo específica e curiosamente, dentre os outros tRNAs testados, apenas o tRNAiMet é capaz de suprimir o fenótipo de crescimento do mutante tif51AK56A de eIF5A. A supressão observada por estes tRNAs não reflete na melhora do defeito no perfil polissomal, para ambos os casos. Foi testada também a interação física direta entre eIF5A e o tRNAAla, utilizando o sistema de triplo-­‐híbrido, no entanto, nenhuma interação foi detectada, sugerindo que a interação observada entre eIF5A e o tRNA em complexo com 80S seja dependente do ribossomo. Os experimentos de Programmed Ribosomal Frameshifting (PRF) revelaram um aumento na taxa de PRF para... / Abstract: eIF5A is highly conserved between archaea and eukaryotes and has a unique and essential postranslational modification, called hypusination. eIF5A was initially described as a translation initiation factor (eukaryotic Initiation Factor 5A) but it was shown that eIF5A engaged in translation elongation. Recently findings demonstrated that eIF5A is most important for specific translation of proteins containing consecutive proline residues. In order to deepen the knowledge of function of eIF5A during the translation process, this research studied the functional correlation between eIF5A and the alanine tRNA (tRNAAla), revealed as a genetic interaction in Saccharomyces cerevisiae, and also evaluated the effect of eIF5A in events of protein synthesis as Programmed Ribosomal frameshifting (PRF), misincorporation and readthrough using dual luciferase reporters. First, the allele specificity of the high copy suppression caused by tRNAAla and the ability of tRNAs for other amino acids to suppress the growth of eIF5A mutants were analyzed, and the results showed that this deletion does not occur in an allele specific manner and interestingly, among other tRNAs tested, only tRNAiMet is able to suppress the growth phenotype of the eIF5A mutant tif51AK56A. The suppression induced by these tRNAs does not reflect in improvement of the mutant defect in polysomal profile, for both cases. It was also tested direct physical interaction between eIF5A and tRNAAla using three-­‐hybrid system, however, no interaction was detected, suggesting that the interaction observed between eIF5A and tRNA in the 80S complex is dependent on the ribosome. The Programmed Ribosomal frameshifting (PRF) experiments showed an increase in PRF numbers for the signals of the virus LA and HIV-­‐1 in eIF5A mutant strains, demonstrating that eIF5A function interferes with mRNA recoding events. Furthermore, the same mutants showed an increase... / Doutor

El conocimiento de la estructura de las proteínas constituye una de las principales aproximaciones hacia el entendimiento de las bases moleculares de las enfermedades humanas; en particular, puede ser usada para racionalizar los efectos de muchas mutaciones causantes de enfermedades, que a menudo son asociadas con cambios en la estabilidad de las proteínas. En este trabajo, se estudia el Dominio BRCT, módulo evolutivo de aproximadamente 95 aminoácidos, con plegamiento autónomo, conservado a través de la mayoría de taxas y encontrado en muchas proteínas relacionadas a la reparación del DNA, recombinación y control del ciclo celular. Una de las características conservadas del plegamiento del dominio BRCT es la estructura formada por dos alfa hélices en una región de la molécula, haciendo frente a la hoja plegada ß central, que contiene dos de las mas conocidas mutaciones relacionadas a cáncer de mama, y que resultan en la introducción de un residuo cargado que desestabiliza la interfase del complejo BRCT-BRCT en la proteína BRCA1. Para este trabajo, elegimos probar la estabilidad del BRCT presente en la enzima DNLJ ligasa de una bacteria termófila mediante la remoción de la carga de superficie, “R21”, de esta estructura. Este es un primer paso para evaluar si la carga de superficie contribuye significativamente a la estabilidad de este dominio termofílico, para profundizar en el posible rol de la estabilidad del BRCT en el desarrollo del cáncer de mama, y por encima de todo, para determinar las bases de la estabilidad de este dominio que dada su frecuencia, se constituye en un hecho biológicamente relevante. Los resultados preliminares sugieren que la estabilidad del dominio BRCT de la DNLJ ligasa de Thermus thermophilus, es tolerante a la remoción de cargas en su superficie, pero es afectado por las variaciones en la hidrofobicidad. Aunque estas mutaciones no muestran variaciones significativas en la estructura y la estabilidad del dominio, si podrían estar afectando la habilidad de interactuar con otras proteínas. / The knowledge of protein structure constitutes one of the main approaches towards understanding the molecular basis of human disease, in particular, protein structure can be used to rationalize the effects of many disease-causing mutations, which often are associated with changes of protein stability. In this work, the BRCT domain is studied, an evolutionary protein module with autonomous folding, of approximately 95 aminoacids, found in numerous proteins involved in DNA repair, recombination and cell cycle control. One of the conserved features of the BRCT fold is a two helical bundle located against one side of the central four-stranded ß sheet, which features two of the best known mutations in breast cancer resulting from introducing a distabilizing charge within the interface of the BRCT-BRCT complex in BRCA1. We have chosen to probe the stability of the BRCT of DNLJ ligase in a thermophilic bacteria by removing the surface charge "R21" from this bundle. This is a first step to test whether this surface charge contributes significantly to the stability of this thermophilic domain, to gain insight about the possible role of BRCT stability on the breast cancer disease, and most of all, to determine the basis for the stability of this frequently found and biologically relevant structural domain. Our preliminar results suggest that the stability of the BRCT of the DNLJ ligasa of Thermus thermophilus BRCT domain is tolerant to the surface charge removal, but is affected by hydrophobicity. Although these mutations do not show significant variations in the structure and stability of the domain itself, they may affect their ability to interact with other protein modules.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-05-03Bitstream added on 2014-08-13T18:00:52Z : No. of bitstreams: 1 000752946.pdf: 2447677 bytes, checksum: f962e39879f7351ff2d9671cc54e0e43 (MD5) / A leishmaniose é um espectro de doenças causadas por parasitas do gênero Leishmania, afligindo mais de 15 milhões de pessoas e expondo outras 350 milhões que vivem em regiões de risco. Para manter a integridade de seu genoma, os parasitas dispõem de diversos mecanismos, dentre os quais estão a manutenção dos telômeros. As proteínas da família TRF (“TTAGGG telomere repeat-binding factor”) fazem parte de complexos multiproteicos responsáveis pela manutenção dos telômeros de alguns eucariotos, incluindo os tripanossomatídeos. Elas apresentam um domínio de interação com DNA telomérico na forma de dupla fita, um domínio de homodimerização e possíveis regiões de interação com outras proteínas teloméricas ou da maquinaria de reparo. O intuito deste projeto foi confirmar a existência nos telômeros de Leishmania amazonensis de possíveis proteínas parceiras da proteína LaTRF, já que resultados preliminares de nosso grupo revelaram uma possível interação entre a LaTRF e as proteínas LaRPA-1 e LaRbp38. No intuito de se obter a proteína telomérica LaTRF recombinante pura e em quantidade desejável, foi solicitada a síntese com códons otimizados, do gene que codifica a LaTRF e a subclonagem do mesmo na mesma fase de leitura do vetor de expressão pQE-2 (QIAGEN). A proteína recombinante gerada a partir desta construção foi expressa de forma solúvel, e em baixíssima concentração e a análise de sua estrutura secundária por espectroscopia de dicroísmo circular confirmou que a proteína foi expressa de forma enovelada. A LaTRF recombinante foi utilizada em ensaios in vitro de interação proteína:proteína com suas possíveis parceiras: LaRbp38 e LaRPA-1. Ensaios de imunoprecipitação, imunofluorescência e pull-down revelaram que LaTRF interage com LaRbp38 e que esta interação se dá via um motivo TRFH-docking like, presente na LaRbp38. Parece que a LaRbp38 atua como ... / Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites of the genus Leishmania, affecting about 15 million people and exposing other 350 million that live in risk areas. Parasites have various mechanisms to maintain the integrity of its genome, among which is the maintenance of telomeres. Proteins belonging to the TRF (TTAGGG telomere repeat-binding factor) family form part of a multiprotein complex responsible for telomere maintenance in eukaryotes, including trypanosomatids. TRFs present a DNA binding domain, a homodimerization domain and regions that allow the protein to interact with other proteins. The aim of this project was to confirm the existence in Leishmania amazonensis telomeres of LaTRF protein partners, since preliminary results from our group revealed a possible complex formed with LaTRF, LaRPA-1 and LaRbp38. In order to obtain the LaTRF recombinant protein, we ordered the optimized gene sequence and its subcloning in the bacterial expression vector pQE-2 (QIAGEN). Recombinant LaTRF was expressed in low amount, but in soluble form. Circular dichroism spectroscopy analysis showed that the recombinant LaTRF was in its folded state and able to be used in vitro protein:protein interaction assays with its potential partners: LaRbp38 and LaRPA-1. Immunoprecipitation, indirect immunofluorescence and pull-down assays revealed that LaTRF physically interacts with LaRbp38 using a TRFH-docking like motif present in proteins that interact with the TRFs, such as TIN2 (TRF interacting factor 2). This suggests that LaRbp38, similarly to TIN2, may play a role of stabilizing LaTRF in double strand and promote the interaction of this complex with for example LaRPA-1, previously described as a protein that binds to the single stranded telomeric DNA. This possibly explains why LaTRF physically interact with LaRbp38 but not with LaRPA-1, although they all co-immunoprecipitated in the same complex. Here we describe ...

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 / Inclui referências : f. 155-165 / Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), altamente expressa em células neuronais, cujo papel biológico não está bem elucidado. Sabe-se que a ADAM23 está envolvida no processo de adesão celular em neuroblastomas através da interação com integrinas. Mecanismos de adesão celular envolvendo a ADAM23 humana, informações sobre o seu processamento intracelular e as propriedades do seu ectodomínio podem servir para a compreensão do papel estrutural e biológico dessa proteína. O presente estudo visou o desenvolvimento de vetores de expressão para a produção de quimeras protéicas constituídas pelo ectodomínio de ADAM23 e a região Fc de IgG humana (domínios CH2 e CH3). As quimeras serão utilizadas como bioferramentas no estudo do processamento de ADAM23 e da sua função na adesão e proliferação celular. Os fragmentos de nucleotídeos que codificam os resíduos 60-792 (ADAM23C1) e 287-792 (ADAM23C2) da ADAM23 humana foram clonados no vetor pINFUSE-hIgG1-Fc2 (secreção através do peptídeo sinal da IL-2) enquanto a sequência 1-792 foi clonada no vetor pcDNA3.1-hIgG1-Fc2 (secreção utilizando o peptídeo sinal da ADAM23). As três construções foram transfectadas nas linhagens N2A (neuroblastoma de camundongo), HEK-293T (rim humano) e CHO-K1 (ovário de hamster) e tanto os extratos celulares como os sobrenadantes de cultura foram analisados para a expressão das quimeras. A linhagem N2A apresentou a mais eficiente secreção das três proteínas quiméricas. As quimeras ADAM23C1 e ADAM23C2, foram adequadamente expressas e recuperadas dos sobrenadantes das culturas de células N2A e HEK-293T. A quimera ADAM23C3 (full-length do ecdomínio) foi identificada sempre na forma processada, indicando que seu peptídeo sinal foi reconhecido pelas maquinarias de secreção e processamento das células utilizadas. Diferentes métodos de purificação das quimeras foram comparados, sendo que a precipitação por sulfato de amônio mostrou-se ser o mais adequado, por aliar economicidade de recursos e retenção da estrutura da proteína. Paralelamente foi avaliada a expressão de ADAM23 em diferentes linhagens e tecidos, além do estabelecimento da localização celular das formas imatura e processada da ADAM23. Com a ajuda do anticorpo monoclonal DL11C8 foi possível determinar que a forma processada de ADAM23 (70 kDa) é a mais abundante no encéfalo de camundongos e é expressa na face externa da membrana plasmática da linhagem N2A. Estes dados mostram pela primeira vez que há uma baixa expressão da forma de 100 kDa (não-processada) no sistema nervoso, ao contrário do que foi observado em linhagens tumorais. A relevância da razão de expressão entre as formas imatura e processada para a função da ADAM23 no sistema nervoso, como a sua relevância na progressão do fenótipo tumoral merecem mais investigação. Palavras-chave: ADAM23. Ectodomínio. Desintegrina. Metaloprotease. Proteínas Fc quiméricas. / Abstract: ADAM23 is a transmembrane protein, member of ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family, highly expressed in neuronal cells, whose biological role is not yet totally elucidated. It is known that ADAM23 is involved in the cellular adhesion process in neuroblastoma. ADAM23 interacts with integrins promoting cell adhesion. However, ADAM23 full-involvement in cellular adhesion mechanisms remains to be established. The present study aimed for the development of biological tools, particularly the production of expression vectors that code for chimeric proteins containing human ADAM23 ectodomain fused to a human IgG Fc region. Nucleotide fragments coding for the residues 60-792 (ADAM23C1) and 287-792 (ADAM23C2) were cloned in the vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 while the sequence 1-792 (ADAM23C3) was inserted onto modified plasmid pcDNA3.1-hIgG1-Fc2. Three different cell lineages (N2A, HEK-293T and CHO-K1) were transfected with the expression plasmids and the chimeric proteins detected in both cell extracts and culture supernatants by monoclonal antibody DL11C8. N2A cell lineage presented the most efficient expression/secretion of the three chimeric proteins. CHO-K1 showed chimeric ADAM23C1 and ADAM23C2 secretion, although ADAM23C3 was not observed in supernatants. The full-length construction (C3) was always detected as a processed protein, indicating that endogenous ADAM23 signal peptide and processing signals were correctly translated by cellular host machinery. Several protocols were compared for purification of chimeric proteins from culture supernatant, being ammonium sulfate salting-out the most practical and convenient. Besides, it was established that mature ADAM23 (70 kDa) is the abundant form in the mouse brain and the processed protein is located at N2A cell surface. In addition it was showed, for the first time, that non-processed ADAM23 (100 kDa) has low expression in the central nervous system when compared with the processed 70 kDa form. Interestingly, tumoral cell lines (MDA-MB-435 and N2A) presented the opposite behavior. If the non-processed/mature ratio profile is specific for each cell line or has a role in the tumoral phenotype will be further investigated in future. Key words: ADAM23. Ectodomain. Disintegrin. Metalloprotease. Fc chimeric proteins.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T10:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) Previous issue date: 2002-08-05 / O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima. / The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luis_ponce_ioc_dout_2014.pdf: 1486134 bytes, checksum: 9dd0c29de095c29028394b797fd2d769 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A análise de grandes quantidades de dados aproveitando o poder computacional de ferramentas \2015open source\2016 que estão disponíveis na internet é o que veio a conhecer-se como quarto paradigma da investigação científica. Em muitas áreas do conhecimento como a Astronomia, a Física e Geologia, a experimentação, o desenvolvimento teórico e o poder computacional (os três primeiros paradigmas) têm dado lugar à análise rotineira de grandes quantidades de dados e o desenvolvimento de novos métodos, conceitos e teorias que permitam interpretar a informação gerada por novas tecnologias. No campo da biologia, esta mudança nos paradigmas da investigação científica supõe um desafio na hora de encarar uma questão biológica; mas, em contrapartida, ela oferece a oportunidade de validar teorias clássicas e/ou testar hipóteses novas. Precisamente neste contexto, a presente tese aborda duas questões pertinentes ao campo da biologia evolutiva: Quais são os fatores que determinam a evolução de uma proteína? e Qual é a natureza da seleção cinética traducional?. Estas perguntas são, em principio, relevantes no âmbito teórico; por outro lado, sua compreensão, implicações e perspectivas têm também espaço importante na área experimental A tese está estruturada da seguinte forma: No Capitulo um se descreve uma combinação de análise de texto com outras técnicas de mineração de dados para identificar, classificar, integrar e modelar associações existentes entre caracteres genômicos que favorecem ou impedem a acumulação de substituções nucleotídicas ao nível das regiões codificadoras. Nossa metodologia permitiu identificar características genômicas como a eficiência traduçional, a instabilidade estrutural e as regiões de baixa complexidade que em principio poderiam constituir determinantes da evolução das proteínas. Construtos latentes como esquema de integração de dados biológicos mostraram que, em vez de considerar o nível de mRNA como o maior determinante da evolução das proteínas, outras variáveis relacionadas com a expressão de um gene podem ser igualmente importantes Finalmente, graças a um modelo de fatores Bayesiano, foi possível estimar os componentes de um sistema de tradução de proteínas identificado com a eficiência e adaptação da maquinaria celular. No Capitulo dois, o controle cinético exercido pelos códons raros durante a tradução das proteínas é abordado com a ajuda de uma análise de custo-benefício que tenta identificar a natureza do que veio a denominar-se como seleção cinética traducional. Diferenças entre proteínas estáveis e instáveis apóiam permitiram identificar a ação da regulação cinética traducional sobre determinado grupos de genes. Os padrões de substituções sinônimas encontrados nas proteínas instáveis permitiram estender nossa discussão apontando à existência de combinações de códons num espaço genotípico determinado que assegure a conservação da estrutura terciária de uma proteína, mas, ao mesmo tempo procure a otimização da cinética da sua tradução / In scientific discovery, three acknowledged paradigms are experimental, theoretical and computational. In the last ten years however, scientists have been over whelmed with large amounts of data coming from high - throughput technologies that are analyzed tak ing advantage of computational power, the internet and open source data - analysis tools. Late researcher of Microsoft, Dr. James Gray (1944 - 2012 in absentia ) ca lled this ―the fourth paradigm of scientific research‖ and urged the need to acknowledge that making sense of data will turn routine in most areas of science. For biologists and others involved in life sciences, this paradigm shift may address daunting cha llenges, however; in return, it offers the oppo rtunity to examine old theories and test new hypothesis. It is within this context that the thesis presented here tackles two fundamental problems of evolutionary biology: What are the constraints of protein e volution? and what is the underlying nature of the kinetic - translational selection?. Although at first glance these questions might appear exclusively relevant for the theoretical field of evolutionary biology, we consider their implications for other area s such as biotechnology and clinical applications. The thesis is organized as following: In Chapter one , we present a combination of text analysis with other data mining techniques to identify, classify, integrate and model existing associations between g enomic c haracters that favor o r hinder the rate at which proteins evolve Our methodology allowed us to identify genomic features such as translational efficiency, structural instability and low - complexity regions that appear to constitute constraints of p rotein evolution. Latent constructs were used as an alternative to integrate biological data and they showed that instead of using mRNA levels as primary determinants of protein evolution, other expression - related factors should be considered. We devised a Bayesian factor model to estimate the components of a protein translation system identified with the efficiency and adaptation of the cellular machinery. In Chapter two , we aboard the fine - tuning kinetic control of rare codons during protein translation i n the context of a cost - benefit analysis devised to identify the action o f recently proposed ki netic translational selective force. The pattern of synonymous substitutions found in proteins classified as structurally unstable led us to extend our discussio n to the existence of a determined genotypic space in which combinations of codons are ―tested‖ in order to optimize the protein synthesis kinetics maintaining the tridimensional structure.

Dissertação composta por 03 artigos científicos. / A microencapsulação é uma tecnologia de revestimento de partículas, pela qual são obtidas pequenas cápsulas. Dentre os métodos de microencapsulação, o spray drying destaca-se por ser uma técnica simples e barata, que tem sido estudada com o objetivo de melhorar a sobrevivência de microrganismos probióticos incorporados em alimentos. Entretanto, a proteção oferecida pelo método de spray drying às células probióticas depende, dentre outros fatores, do material empregado na formação das microcápsulas, que deve manter o microrganismo ativo até o momento do consumo, protegendo-o de condições hostis de produção e estocagem do alimento, bem como durante sua passagem pelo trato digestório. As proteínas vegetais, em especial soja, ervilha, milho, trigo e girassol tem ganhado destaque por serem materiais renováveis e de baixo custo, além de possuírem diversas propriedades funcionais, sendo consideradas potencialmente adequadas para o uso como material de parede na microencapsulação de componentes ativos. As proteínas de soja têm se destacado na indústria de alimentos como o melhor substituto para proteínas de origem animal, devido às suas propriedades funcionais e ao seu alto valor nutricional. O extrato de soja é composto em maior proporção por proteínas e carboidratos, contendo também oligossacarídeos que podem atuar como prebióticos no estímulo do crescimento de microrganismos. Além da composição do material de parede, as condições de processo nas quais ocorre a microencapsulação exercem importante influência sobre a viabilidade da bactéria encapsulada. Diante disso, o estudo objetivou a otimização da microencapsulação por spray drying de L. acidophilus La-5, utilizando extrato de soja e maltodextrina como agentes encapsulantes, por meio da seleção das condições ótimas de temperatura de entrada do ar de secagem, razão maltodextrina/extrato de soja na composição do material de parede e vazão de alimentação do sistema, a fim de maximizar a sobrevivência do microrganismo à microencapsulação, bem como caracterizar as microcápsulas obtidas e acompanhar a viabilidade celular durante armazenamento refrigerado. Os efeitos das variáveis sobre a sobrevivência do microrganismo foram estudados por meio da aplicação de planejamento experimental do tipo Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR). As microcápsulas foram submetidas às análises de tamanho e morfologia, umidade, atividade de água, higroscopicidade e Espectrometria na Região do Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). O comportamento térmico das partículas foi avaliado por Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC) e Termogravimetria (TG). O estudo da estabilidade das microcápsulas compreendeu a enumeração de células viáveis de L. acidophilus e a determinação da atividade de água das amostras durante 45 dias de armazenamento a 4ºC. O rendimento máximo da microencapsulação foi de 83% e as condições de processo que permitiram maior viabilidade celular corresponderam à temperatura de entrada de ar de 87ºC, razão maltodextrina/extrato de soja de 2:3 (m:m) e vazão de alimentação de 0,54 L.h-1. O modelo obtido com aplicação do DCCR foi validado experimentalmente. As variáveis empregadas no planejamento experimental tiveram efeito significativo sobre o rendimento da microencapsulação e sobre as características físicas do pó obtido. Proporções de extrato de soja superiores às de maltodextrina na composição do material de parede foram favoráveis à sobrevivência da cultura. Por outro lado, temperaturas de entrada de ar e vazões de alimentação elevadas diminuíram o rendimento da microencapsulação. A temperatura do ar de secagem e a vazão também reduziram a atividade de água e a umidade das microcápsulas, enquanto a maltodextrina melhorou as propriedades higroscópicas das partículas. As microcápsulas apresentaram diâmetro médio entre 4,97 μm e 8,82 μm, formato arredondado e superfície irregular com presença de concavidades e achatamentos, caraterísticas comuns a produtos secos por spray drying. Por meio das análises de DSC, TG e FTIR verificou-se uma possível interação entre os agentes encapsulantes e as células de L. acidophilus. As partículas foram termicamente estáveis em temperaturas abaixo de 100ºC e os resultados sugeriram que as microcápsulas podem proteger os microrganismos frente ao calor e a desidratação. Durante o período de armazenamento, a redução da viabilidade celular de L. acidophilus foi menor nas microcápsulas que continham maior proporção de extrato de soja na composição do material de parede. A atividade de água manteve-se dentro dos valores recomendados em todos os tratamentos até o trigésimo dia de estocagem. Ao final do período de estocagem, as microcápsulas produzidas nas condições ótimas apontadas pelo planejamento experimental apresentaram atividade de água apropriada e viabilidade celular elevada, indicando que o extrato de soja, associado à maltodextrina, é um material de parede eficiente na manutenção da viabilidade de L. acidophilus e um potencial agente encapsulante para o desenvolvimento de microcápsulas de probióticos com alta estabilidade. / Microencapsulation is a particle coating technology, whereby smaller capsules are obtained. Among the microencapsulation methods, the spray drying is distinguished by being simple and inexpensive technique, that has been studied with the aim of improving the survival of probiotic microorganisms incorporated into foods. However, the protection offered by spray drying to the probiotic cells depends, among other factors, on the material used in the formation of microcapsules, which should keep the active microorganism until the time of consumption, protecting it from hostile conditions of production and storage of food, and during their passage through the digestive tract. Vegetable proteins, especially soy, pea, maize, wheat and sunflower has gained prominence because they are low-cost and renewable materials, in addition to having different functional properties are considered potentially suitable for use as wall material in the microencapsulation of active compounds . Soy proteins have been prominent in the food industry as the best substitute for animal protein due to its functional properties and its high nutritional value. The soybean extract powder is composed in major proportion of protein and carbohydrates, also containing oligosaccharides that may act as prebiotic stimulation of the growth of microorganisms. Besides the wall material composition, process conditions under which the microencapsulation happens have an important influence on the viability of encapsulated bacteria. Thus, the study aimed to optimize the microencapsulation by spray drying of L. acidophilus La-5, using soybean extract powder and maltodextrin as encapsulating agents, by selecting the optimal conditions of drying air inlet temperature, maltodextrin/soybean extract powder ratio in the composition of the wall material and system feed flow, in order to maximize the microorganism survival to the microencapsulation, as well as characterize the microcapsules and monitor cell viability during storage. The effects of the variables on the survival of the microorganism were studied through the application of experimental design, Central Composite Rotatable Design (CCRD). The microcapsules were submitted to analysis of size and morphology, moisture content, water activity, hygroscopicity and Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). The thermal behavior of the particles was evaluated by Differential Scanning Calorimetry (DSC) and Thermogravimetry (TG). The study of the microcapsules stability included the enumeration of viable cells of L. acidophilus and determining the water activity of the samples for 45 days storage at 4 ° C.The maximum yield of the microencapsulation was 83% and the process conditions that allow higher cell viability corresponded to 87ºC air inlet temperature, maltodextrin/soy extract powder ratio 0.67 (w.w-1) and feed flow rate of 0.54 L.hr-1. The adequacy of the model obtained through the CCRD was validated experimentally. The variables used in the experimental design had a significant effect on the yield microencapsulation and on the physical characteristics of powder obtained. Soy extract ratios superior to maltodextrin in the wall material composition were favorable to the survival of the culture. On the other hand, high air inlet temperatures and feed flow rate decreased the yield of microencapsulation. The drying air temperature and the feed flow rate also reduced water activity and moisture of the microcapsules, while the maltodextrin improved the hygroscopic properties of the particles. The microcapsules had a mean diameter of 4.97 μm and 8.82 μm, rounded shape and irregular surface with presence of concavities and flattening, common characteristics of dried products by spray drying. Through the DSC, TG and FTIR analyzes it was observed a possible interaction between the agents encapsulating and the cells of L. acidophilus. The particles are thermally stable at temperatures below 100ºC and the results suggested that microcapsules can protect microorganisms against heat and dehydration. During the storage period, the reduction in cellular viability of L. acidophilus was lower in microcapsules containing a higher proportion of soybean extract in the composition of the wall material. The water activity was within the recommended values in all treatments until the thirtieth day of storage. At the end of the storage period, the microcapsules produced in optimal conditions indicated by the experimental design showed appropriate water activity and high cell viability, indicating that soybean extract, combined with maltodextrin is an effective wall material in keeping the viability of L. acidophilus and a potential encapsulating agent for the development of probiotics microcapsules with high stability. / 5000-01-01

Las proteínas ribosomales S13 y L33 pertenecen respectivamente a las subunidades 30S y 50S del ribosoma bacteriano. S13 se posiciona en cercanía a los factores de iniciación (IF1 e IF3). L33 se encuentra opuesta a S13 en la subunidad mayor. El presente estudio, busca evaluar las proteínas S13 y L33 marcadas fluorescentemente durante la iniciación de la síntesis proteica, para generar un sistema experimental que permita analizar cambios estructurales en las subunidades ribosomales, especialmente durante la iniciación de la traducción y en función de la unión de antibióticos. Mediante técnicas recombinantes y cromatografía de intercambio iónico, se expresaron y purificaron ambas proteínas ribosomales. Se obtuvieron rendimientos de la producción de proteína L33 en el rango de miligramos por g de Escherichia coli, e índices de pureza sobre el 98%. S13 fue producido de manera similar y se obtuvieron proteínas puras en el rango de miligramos por g de Escherichia coli con una pureza de 99%. Ambas proteínas ribosomales fueron modificadas con compuestos fluorescentes compatibles con mediciones de FRET (De sus siglas en inglés, Föester Resonance Energy Transfer). En condiciones controladas S13 logró insertarse en la subunidad 30S, mientras que experimentos de sedimentación indicaron que L33 fluorescente no se unía a la subunidad 50S. Se realizaron mediciones FRET entre la subunidad 30S modificada con S13 fluorescente y los factores de iniciación IF1 e IF3. La medición FRET entre S13(Atto-540Q) e IF3-CTD(Atto-488) se utilizó para medir la interacción de estreptomicina, espectinomicina y GE81112, antibióticos que se unen a la subunidad menor del ribosoma. Estreptomicina se une rápidamente a la subunidad 30S y ocasiona un acercamiento de S13(Atto-540Q) al IF3-CTD(Atto-488) mientras que GE81112, y en menor medida espectinomicina, promueven un alejamiento de la proteína ribosomal del factor de iniciación. Ambos movimientos son compatibles con rotaciones de la cabeza de la subunidad 30S, previamente descritos como fundamentales para el funcionamiento del ribosoma. El presente estudio de investigación brinda un sistema experimental novedoso para estudiar cambios estructurales en la subunidad menor en función de la unión de antibióticos al ribosoma. / The ribosomal proteins S13 and L33 belong respectively to the 30S and 50S subunits of the bacterial ribosome. S13 is positioned close to the initiation factors (IF1 and IF3). L33 is opposite and near to S13 in the major subunit. The present study, the aim is to evaluate the fluorescently labeled S13 and L33 proteins during the initiation of protein synthesis, aiming to build an experimental system that allows the analysis of structural changes in the ribosomal subunits, especially during the initiation of translation and with the binding of antibiotics. Using recombinant techniques and ion exchange chromatography, both ribosomal proteins were expressed and purified. Production yields of pure proteins of L33 were obtained in the range of milligrams per g of Escherichia coli, in addition, of 98% purity indices. S13 was produced in a similar manner, obtaining milligrams of pure protein per g of Escherichia coli with a purity of 99%. Both ribosomal proteins were modified with fluorescent compounds compatible with measurements of FRET (Föester Resonance Energy Transfer). Under controlled conditions S13 was able to insert into the 30S subunit, while sedimentation experiments indicated that fluorescent L33 did not bind to the 50S subunit. The 30S subunit modified with fluorescent S13 showed various FRET signals in combination with the initiation factors IF1 and IF3. These signals were used to measure the interaction of streptomycin, spectinomycin and GE81112, antibiotics that bind to the minor subunit of the ribosome. Streptomycin binds rapidly to the 30S subunit and causes an approximation of S13(Atto-540Q) to IF3-CTD(Atto-488) while GE81112, and to a lesser extent spectinomycin, promote a distancing of the ribosomal protein from the initiation factor. Both movements can account for rotations of the head of the 30S subunit, previously described as fundamental for the functioning of the ribosome. The present research provides a novel approach to study structural changes in the minor subunit according to the binding of antibiotics to the ribosome.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una enfermedad de etiología desconocida, que afecta a niños y adolescentes, caracterizándose por un aumento de volumen y sensibilidad, uni o bilateral de las glándulas parótidas, asociada generalmente a una sialectasia no obstructiva, sin signos de infección aguda. Usualmente se acompaña de fiebre leve y malestar general, lo que compromete la calidad de vida del paciente, quienes son tratados por distintos especialistas sintomáticamente; ya que sin causa aparente tiende a remitir. En este estudio, se propuso analizar saliva parotídea de 33 pacientes entre 4 y 14 años, con presentación clínica uni o bilateral de PCRI, en periodo de latencia de la enfermedad. Se utilizó la técnica de inmuno-western-blot con anticuerpo anti-metaloproteasa-9 (anti-MMP-9), para identificar formas moleculares de MMP-9 tanto en glándulas afectadas y no afectadas clínicamente por PCRI, en condiciones desnaturalizantes y desnaturalizantes/reductoras. Se utilizó como agente reductor βmercaptoetanol para reducir las muestras salivales y dilucidar de esta forma la separación de formas acomplejadas de MMP-9. La muestra de saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó un total de 11 bandas de distinto peso molecular (>250, 250, 141, 100, 75, 60, 50, 47, 37, 29 y 25 kDa). Las formas moleculares de >250, 250, 141, 100, 50 y 47 kDa, corresponden a complejos moleculares de MMP-9 que son susceptibles de ser disociados en condiciones desnaturalizantes/reductoras. En presencia del agente reductor, se produce un aumento de las formas de MMP-9 de tamaños moleculares correspondientes a 75, 60, 29 y 25 kDa. La saliva parotídea proveniente de glándulas afectadas clínicamente por PCRI, presenta mayoritariamente el complejo molecular de MMP-9 de 141 kDa, lo que sugiere que se encuentra involucrado en la patogénesis de la enfermedad. La saliva parotídea proveniente de glándulas no afectadas clínicamente por PCRI, también presenta formas de MMP-9 de distintos tamaños moleculares, lo que sugiere que están afectadas subclínicamente por la enfermedad.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Generalmente, se inicia alrededor de los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia. Estudios anteriores han demostrado, mediante zimografía, la presencia de metaloproteasas 2 y 9 en la saliva parotídea de pacientes con PCRI. En este estudio se propuso analizar, mediante zimografía, la actividad gelatinasa en saliva parotídea de dichos pacientes e identificar, mediante inmuno-western-blot, las formas moleculares de metaloproteasa 9. En 34 pacientes con PCRI de 4 a 13 años de edad, se recolectó saliva parotídea bilateral, se midió concentración de proteínas mediante el método de Bramhall, para posteriormente determinar la actividad gelatinasa mediante zimografía. Se registró el compromiso clínico-sialográfico de ambas glándulas parótidas y se les correlacionó con la actividad enzimática de las gelatinasas en cuestión. Además se realizó inmuno-western-blot con anticuerpo antiMMP-9 y se comparó la frecuencia de las distintas formas moleculares de metaloproteasa 9 en saliva proveniente de parótidas clínicamente afectadas y clínicamente sanas. La saliva parotídea de pacientes con PCRI presentó actividad gelatinasa en ambas glándulas, independiente de si están o no afectadas clínicamente. Sólo se observó diferencia estadísticamente significativa en la actividad enzimática de la metaloproteasa de 141kDa, donde hubo una mayor actividad en glándulas clínicamente afectadas. La saliva de individuos con PCRI no presento un patrón uniforme de formas moleculares de MMP-9. La frecuencia de las formas moleculares de las MMP-9 analizadas en saliva parotídea de pacientes PCRI, no presentó diferencias estadísticamente significativas entre aquellas muestras tomadas de glándulas clínicamente sanas y clínicamente afectadas, salvo en las formas moleculares de 169kDa y 139kDa, que fueron más frecuentes en saliva proveniente de glándulas comprometidas clínicamente.