Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401649-Texto+Completo-0.pdf: 937750 bytes, checksum: 1be2b50a72c9a07775715c1800439014 (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is a cytokine that belongs to a group of glycoprotein that regulates the proliferation and differentiation of hematopoietic cells, more specifically granulocytes and macrophages. The human GM-CSF is a 14. 4 kDa protein consisting of 127 amino acid polypeptide chain and shares 52% of similarities with murine protein. The human protein has 4 cysteine residues that forms two disulphide bonds; only the Cysteine 54 and 96 are required for the biologic activity of it. This biopharmaceutical has been widely used in neutropenic patients who receive high-dose chemotherapy or were transplanted. Therefore, GM-CSF is used to restore hematopoietic dysfunctions, to stimulate the hyper-production of functionally primed effectors cells and to augment host defense against infection and malignant diseases. Its use is associated with significant decreases in chemotherapy-associated infections, antibiotic use, length of hospital day and mortality. The international patent of the biopharmaceutical Molgramostim (generic name) expired in 2006, and thus became an interesting product to pharmaceutical industries, including those settled in Brazil. Presently, Molgramostim is sold in Brazil as an imported biopharmaceutical, which, in turn becomes very costly to the Brazilian government. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Molgramostim. In this work the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene was assembled by PCR. It was cloned into pET30a(+) expression vector and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain from Escherichia coli. To the isolation of inclusion bodies an efficient protocol was developed using multi step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic and then an anionic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhGM-CSF. The result of the biological activity assay, in vitro, showed that the rhGM-CSF produced has an equivalent biological potential to the standard reference. The protein rhGM-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process and is extremely important to the industrial procedure and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) é uma citocina pertencente a um grupo de glicoproteínas que regula a proliferação e a diferenciação de células hematopoiéticas, mais especificamente macrófagos e granulócitos. O GM-CSF humano é uma proteína de 14,5 kDa constituída de 127 aminoácidos e possui 52% de similaridade com a proteína de rato. A proteína humana possui 4 resíduos de cisteína formando duas pontes dissulfeto, porém apenas as cisteínas 54 e 96 são requeridas para a atividade biológica da mesma. Este biofármaco tem sido usado em pacientes neutropênicos que receberam altas doses de quimioterapia ou transplantados. Além disso, GM-CSF é usado para restabelecer disfunções hematopoiéticas, estimular a hiper-produção de células efetoras pré-induzidas (“primed”) funcionalmente e promover a defesa do hospedeiro contra doenças infecciosas e malignas. O uso dos mesmos está relacionado à redução no número de infecções associadas à quimioterapia, no uso de antibióticos e no tempo total de internação do paciente bem como no número de mortes. A patente internacional do biofármaco Molgramostima (nome genérico) expirou em 2006 e, além disso, tornou-se um interessante produto para indústrias farmacêuticas, inclusive para aquelas estabelecidas no Brasil. Molgramostima é vendida no Brasil como um biofármaco importado, o qual, desta forma, torna-se muito custoso para o governo brasileiro. Contudo, o objetivo deste trabalho é desenvolver uma metodologia para a posterior produção industrial de uma molgramostima a nível nacional. Neste trabalho, o gene para o hGM-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET30a(+) e expresso na cepa BL21(DE3) de Escherichia coli na sua forma insolúvel. Para o isolamento e solubilização dos corpos de inclusão um eficiente protocolo foi desenvolvido utilizando múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente duas colunas cromatográficas de troca catiônica e aniônica, respectivamente. O teste de atividade biológica in vitro demonstrou que o rhGM-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi obtida por meio de um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em procedimento industrial e para saúde da população.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000423837-Texto+Completo-0.pdf: 3323767 bytes, checksum: 8540f43fe0c310d46371629da67c4e9a (MD5) Previous issue date: 2010 / Originally, the concept of myelin considered it an evolutionary innovation exclusive to jawed vertebrates, but that dogma has been challenged by the identification of structures morphologically similar to myelin in invertebrates’ independent groups, including annelids and crustaceans. Until the present moment, the descriptions of invertebrate myelin are mainly based in morphological data and shows sheaths with varied compaction and cellular origin wrapped, both spirally or concentrically, axons with different calibers in appendages and nerve cords. To establish the myelin evolutionary origins and intergroup relationships, very important elements are missing, and that work had as objective study shrimps’ myelin from a molecular perspective. Aiming to identify the proteins components Litopenaeus vannamei myelin sheaths, a myelin enriched fraction was isolated from adult animals’ nerve cords and submitted to Multidimensional Protein Identification Technology (MudPit) proteomic analysis. MudPit was chosen to sidestep the bias of 2D-PAGE against either highly charged or transmembrane proteins. From the 23668 peptides detected, 311 proteins were identified, using the algorithms Mascot and Blast, among which several are nervous system constituents previously reported in vertebrates’ myelin fractions, and many immunoglobulin peptides. When vertebrate myelin typical proteins were pursued, however, only peptides related to proteolipid protein (PLP) were identified. Further search for PLP was performed in the L. vannamei genome sequence incomplete database and resulted in the identification of additional sequences. These findings demonstrates that shrimp myelin have a proteic profile similar to vertebrates’ myelin fractions, also was identified, for the first time in that specie, amino acid sequences related to PLP, one of the most abundant protein in tetrapods’ myelin. Based on the identification of multiple peptides corresponding to immunoglobulin domains typical from adhesion proteins, was used an antibody that recognizes both mammalians’ myelin associated glycoprotein (MAG) isoforms in L. vannamei nerve cords’ frozen section. The results showed a specific binding that needs to be explored with complementary strategies to confirm the identity of shrimp’s myelin antigen. This result suggests the presence, in L. vannamei myelin, of proteins with similar characteristics to those described in vertebrate myelin. These findings, summed to complementary strategies, can contribute to know better myelin’s advent in evolution and the relationship among myelinated animals groups. / Originalmente conceituava-se a mielina como uma inovação evolutiva exclusiva dos vertebrados com mandíbulas, capaz de permitir o aumento na velocidade de transmissão de impulsos nervosos graças à transmissão saltatória. Este conceito tem sido desafiado pela identificação de estruturas morfologicamente equivalentes à mielina em grupos independentes de invertebrados, incluindo anelídeos e crustáceos capazes de garantir propagação de impulsos nervosos em velocidades superiores à de vertebrados. Até o presente momento, a maioria das descrições da mielina dos invertebrados é baseada em dados morfológicos e mostram lamelas com variados graus de compactação e origem celular, envolvendo espiralmente ou concentricamente axônios de diversos calibres nos apêndices corporais ou cordões nervosos destes animais. Para estabelecer as origens evolutivas da mielina e a relação intergrupo, elementos importantíssimos, como a descrição das proteínas componentes, estão faltando. Este trabalho teve como objetivo realizar uma análise do conteúdo protéico da mielina do camarão Litopenaeus vannamei. Para identificar as proteínas componentes das lamelas da mielina uma sub-fração enriquecida em mielina preparada a partir do cordão nervoso ventral de animais adultos foi submetida à análise proteômica pela técnica de identificação multidimensional de proteínas (MudPit). MudPit foi escolhido para otimizar a chance de detecção de proteínas carregadas ou transmebranas, que não são detectadas por 2D-PAGE. Dos 23668 peptídeos detectados, 311 proteínas foram identificadas através do emprego dos algoritmos Mascot e Blast, entre as quais proteínas constituintes do sistema nervoso previamente reportadas nas frações de mielina de vertebrados. Quando proteínas típicas da mielina de vertebrados foram procuradas, apenas peptídeos relacionados à proteína proteolipídica (PLP) foram identificados. Uma busca complementar por seqüências de PLP no banco de dados de ESTs de L. vannamei resultou na identificação de seqüências adicionais. Estes achados demonstram que as proteínas presentes na mielina do L. vannamei refletem um perfil semelhante a frações de mielina de vertebrados, e também a identificação de seqüências relacionadas a PLP, uma das proteínas mais abundantes na mielina dos tetrápodes, pela primeira vez. Com base na identificação de múltiplos peptídeos correspondendo a domínios imunoglobulina típicos de proteínas de adesão na fração de mielina do camarão, utilizamos um anticorpo capaz de reconhecer as duas isoformas da glicoproteína associada à mielina (MAG) de mamíferos em cortes de cordão nervoso de L. vannamei. Os resultados demonstraram uma ligação específica que deverão ser explorados com estratégias complementares a fim de se confirmar a identidade do antígeno presente na mielina do camarão. Estes resultados sugerem a presença de proteínas com características próximas às já descritas na mielina dos vertebrados na mielina de L. vannamei. Estes achados, somados a estratégias complementares, podem contribuir para o melhor entendimento do surgimento da mielina ao longo da evolução e da relação entre os grupos de animais que apresentam mielina.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400016-Texto+Completo-0.pdf: 696310 bytes, checksum: 7f8908ad96586598d5473332eb4bd96b (MD5) Previous issue date: 2008 / Interferons are proteins expressed by different human cells and synthesized in response to many chemical and biological agents. They are involved in antiviral, antiproliferative and immunomodulatory responses, acting to both maintain homoeostasis and in host defense. Because of this biological activity, interferons are now licensed worldwide for the treatment of various viral, malignant and immune disorders. Interferon β1, for instance, is one of the few substances which has proved to have effectiveness in suppressing manifestations of multiple sclerosis that is a chronic disease of the central nervous system. It is commercially produced in microorganisms such as Escherichia coli by using recombinant DNA techniques and is thus designated as biopharmaceutical. The patents for many originator biopharmaceuticals are expiring, and a new generation of follow-on molecules, termed “biosimilars”, is under development. Interferon β1 was approved for use in the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis by U. S. Food and Drug Administration in 1993 and lost its patent protection in 2007 becoming a target to biosimilar production for pharmaceutical industries. The development of interferon β1 biosimilar is an alternative to the high cost of the originator biopharmaceutical. We have developed a protocol to produce large quantities of pure interferon β1 in which approximately 3 mg of homogeneous recombinant protein could be obtained from 1 g of E. coli Rosetta(DE3) cells. N-terminal amino acid sequencing and mass spectrometry analysis provided evidence for the identity and purity of the recombinant protein. Reverse phase liquid chromatography analysis demonstrated the content of deamidates and sulphoxides were similar to a commercial standard, and no heterogeneous forms of rhIFN-β1ser17 were detected. Size exclusion chromatography analysis demonstrated the absence of high molecular mass aggregates and dimers. The protocol developed may be used to biosimilar production by pharmaceutical industries and thereby lower costs to healthcare payers and consumers. / Interferons são proteínas expressas por diferentes células humanas e sintetizadas como resposta a muitos agentes químicos e biológicos. Eles estão envolvidos em repostas antiviral, antiproliferativa e imunomodulatória, atuando na manutenção da homeostase e na proteção do organismo contra patógenos. Devido a essa atividade biológica, os interferons são atualmente aprovados no mundo inteiro para o tratamento de várias desordens virais, malignas e imunológicas. Interferon β1, por exemplo, é uma das poucas substâncias que provou ser efetiva na supressão das manifestações da esclerose múltipla que é uma doença crônica do sistema nervoso central. Ele é produzido comercialmente em microorganismos como Escherichia coli, utilizando a tecnologia do DNA recombinante e é chamado de biofármaco. As patentes de muitos biofármacos originais estão expirando e uma nova geração de moléculas, chamadas “biossimilares”, está em desenvolvimento. O interferon β1 foi aprovado para uso no tratamento da esclerose múltipla surtoremissão pelo Departamento de Controle de Drogas e Alimentos dos EUA em 1993 e perdeu sua proteção de patente em 2007, tornando-se um alvo para a produção do biossimilar pelas indústrias farmacêuticas. O desenvolvimento do biossimilar interferon β1 é uma alternativa para o alto custo do biofármaco original. Desenvolvemos um protocolo para produzir grandes quantidades do interferon β1, no qual aproximadamente 3 mg da proteína recombinante homogênea podem ser obtidos a partir de 1 g de células de E. coli Rosetta(DE3). As análises por seqüenciamento N-terminal de aminoácidos e espectrometria de massas proveram evidências para a identidade e pureza da proteína recombinante. A análise por cromatografia líquida de fase reversa demonstrou que o conteúdo de deamidados e sulfóxidos foi similar ao padrão comercial, e nenhuma forma heterogênea da proteína rhIFN-β1ser17 foi detectada. A análise por cromatografia líquida de exclusão molecular demonstrou a ausência de agregados de alta massa molecular e de dímeros. O protocolo desenvolvido poderá ser utilizado para a produção do biossimilar pelas indústrias farmacêuticas e deste modo, diminuir os custos do Ministério da Saúde e dos consumidores com este biofármaco.

Orientador: Maria Célia Bertolini / Coorientador: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Dulce Helena Ferreira de Souza / Banca: Iran Malavazi / Resumo: Os organismos pertencentes ao reino dos fungos têm exercido um papel fundamental no avanço da compreensão dos mecanismos moleculares de organismos eucariotos devido as suas facilidades de manipulação e o conhecimento das características genéticas e bioquímicas envolvidas em seu ciclo de vida. Neurospora crassa é um fungo cujos mecanismos genéticos e bioquímicos básicos são bem definidos, e por isso tem sido muito usado como um sistema modelo em pesquisas que visam à elucidação de processos celulares complexos. Em trabalhos anteriores desenvolvidos em nosso laboratório foram identificadas algumas proteínas que se ligam à região promotora do gene gsn que codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória no processo de síntese de glicogênio. O presente trabalho teve como objetivo estudar algumas dessas proteínas, anotadas como hipotéticas, numa tentativa de entender melhor as suas participações no mecanismo de regulação. Para isto linhagens mutantes nos genes que codificam as referidas proteínas foram adquiridas junto ao Fungal Genetics Stock Center. Análises de determinação do conteúdo de glicogênio nas linhagens mutantes foram realizadas tanto em condições normais de crescimento (30º C) como em situações de choque térmico (45º C). Todas as linhagens mutantes avaliadas apresentaram um perfil de acúmulo de glicogênio semelhante ao da linhagem selvagem, isto é, todas apresentaram uma queda nas quantidades de glicogênio após o choque térmico. Entretanto a linhagem mutante na ORF NCU06679 apresentou o conteúdo de glicogênio mais reduzido, em ambas as situações ambientais (antes e depois do choque térmico). Com o objetivo de verificar o envolvimento das proteínas estudadas na expressão do gene gsn, experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram que na situação de estresse térmico, os níveis do transcrito gsn diminuem semelhantemente... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The organisms belonging to the kingdom of fungi have played a key role in advancing the understanding of the molecular mechanisms of eukaryotic organisms due to their easy handling and the genetic and biochemical mechanisms involved in their life cycle. Neurospora crassa is a fungus whose basic biochemical and genetic mechanisms are well defined, and therefore has been widely used as a model system in studies aimed to elucidate complex cellular processes. In a previous work developed in our laboratory we identified some proteins that bind to the promoter region of the gsn gene that encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in the glycogen synthesis. This work aimed to start studying these proteins, annotated as hypothetical proteins, in an attempt to better understand their roles in the regulation of glycogen metabolism. For this, mutant strains in genes encoding the proteins were purchased from the Fungal Genetics Stock Center. Analysis of glycogen determination were performed in the mutant strains both under normal growth (30º C) and under heat shock condition (45º C). All mutant strains showed a glycogen content profile similar to the wild type strain, that is, all showed a decrease in the amounts of glycogen after heat shock. However the mutant strain in the ORF NCU06679 presented lower glycogen content compared to the wild type strain, in both environmental condition (before and after heat shock). To verify the participation of the proteins in the gsn gene expression, Northern blot experiments were performed and showed that under heat stress the gsn transcript levels decreased similarly to that observed in the wild type strain. However the reduction in the gene expression was higher in the mutant strain containing the ORF NCUO6679 knocked out / Mestre

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-09-24T17:51:37Z No. of bitstreams: 1 2008_CarolinneIsabellaDiasGomes.pdf: 346210 bytes, checksum: 9d2dd76b6ac9d26db1572836a9b7b749 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-06-29T13:27:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CarolinneIsabellaDiasGomes.pdf: 346210 bytes, checksum: 9d2dd76b6ac9d26db1572836a9b7b749 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-29T13:27:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CarolinneIsabellaDiasGomes.pdf: 346210 bytes, checksum: 9d2dd76b6ac9d26db1572836a9b7b749 (MD5) Previous issue date: 2008 / A literatura tem mostrado que mamíferos alimentados com dietas ricas em proteína são mais resistentes ao jejum. Entretanto, ao contrário do observado o morcego vampirocomum Desmodus rotundus, apesar de possuir uma dieta muito rica em proteínas (sangue), é marcadamente susceptível ao jejum. Para esclarecer se a fragilidade frente à privação alimentar seria uma característica de D. rotundus, ou se poderia estar presentes também em outros morcegos de dieta hematófaga, este estudo utilizou o morcego Diphylla ecaudata para investigar as reservas energéticas desses animais alimentados e as respostas ao jejum. Para isso, foram determinadas as concentrações de glicose e ácidos graxos livres (AGL) plasmáticos, ácidos graxos totais da carcaça, glicogênio, lipídios e proteínas totais hepáticas e musculares em morcegos alimentados (ALM) e jejuados por 24 (J24) e 36 h (J36). Nossos resultados sugerem que D. ecaudata possui um padrão metabólico similar ao observado para D. rotundus: pequenas reservas de carboidratos e lipídios no estado alimentado e ausência de mobilização das reservas de lipídios e proteínas durante o jejum, o que resulta em grande susceptibilidade à restrição alimentar por períodos superiores a 36 h. Porém, esse padrão metabólico difere do observado para a maior parte dos animais de dietas ricas em proteínas. Além da pequena contribuição das reservas energéticas na resposta à privação alimentar, uma via metabólica normalmente associada à resposta ao jejum - a neoglicogênese - parece não estar ativa na espécie D. ecaudata, pelo menos nos animais jejuados por 36 h, hipótese reforçada, principalmente, pela grande queda da glicemia após 24 h de privação alimentar. No entanto, em animais J24, a glicemia mantém-se em níveis similares aos vistos em animais alimentados, semelhantes aos normalmente observados em mamíferos com dietas ricas em proteínas. A glicogenólise e a neoglicogênese poderiam ser os mecanismos responsáveis pela manutenção da glicemia em D. ecaudata J24, porém, como as reservas de glicogênio são pequenas e também não foi observada mobilização protéica e lipídica, é possível que animais ALM e J24 mantenham a glicose circulante em níveis normais para mamíferos (entre 70 e 100 mg/dL) também a partir da glicose da dieta, ou seja, a partir do sangue de suas presas (aves). A glicemia das aves que costumam predar seria uma das responsáveis por manter a glicemia de D. ecaudata em níveis compatíveis com a vida de mamíferos até 24 h de jejum, período de privação alimentar normalmente enfrentado por estes animais em condições naturais. Não se pode, no entanto, desconsiderar a participação do glicogênio hepático na manutenção da homeostase glicêmica no jejum de 24 h. A manutenção das altas concentrações de AGL plasmáticos no estado alimentado e J24, independente de mobilização lipídica significativa, também sugere a participação da dieta na manutenção desses metabólitos. A maior fragilidade ao jejum observada em D. ecaudata parece ser uma característica de morcegos com dieta hematófaga. Essa susceptibilidade que coloca esses animais em risco freqüente de morte e até mesmo de extinção parece ter sido compensada pelo mecanismo de compartilhamento recíproco de alimento, um comportamento, portanto, fundamental para a perpetuação da espécie. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / It has been demonstrated that mammals fed with protein-rich diets are more resistant to fasting. However, the hematophagous bat Desmodus rotundus exhibits high susceptibility when subjected to food deprivation, though its diet is rich in proteins. This study investigated whether the hematophagous bat Diphylla ecaudata also shows fragility in response to fasting. In order to answer this question, the concentrations of plasmatic glucose and free fatty acids (FFA), total fatty acids from carcass, glycogen, lipids and protein total concentrations in the liver and breast muscle in bats were determined in fed (FED) and 24-h (F24) and 36-h (F36) fasted individuals. Plasma glucose levels in FED and F24 bats were similar to other mammals, but after a 36 h without food these levels were markedly reduced. Plasma FFA levels in FED bats were higher than in other mammals and remained unaltered following a 24-h fasting. Liver glycogen content decreased significantly during fasting. The protein and lipid reserves were not modified in response to fasting. Our results suggest that glucose and plasmatic FFA of D. ecaudata could have an exogenous source, probably from the glucose content of the blood of its prey (pigeons). However, the contribution of the hepatic glycogen reserves of D. ecaudata to the maintenance of glucose homeostasis in response to a 24-h fasting can not be discarded. Despite the decrease in liver glycogen, D. ecaudata is unable to keep their plasma glucose at adequate levels for mammal survival after only 36 h of food deprivation, suggesting the inefficiency of mechanisms usually present at fasting, such as gluconeogenesis. Low energy reserves found in FED bats and/or the absence of protein and lipid mobilization in fasting seem to corroborate our hypothesis and suggest that a hematophagous diet could be associated with high susceptibility in response to food shortage.

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A imunização genética com um DNA plasmidial, contendo o gene que codifica a proteína 2 da superfície de amastigotas (ASP-2), é capaz de proteger parte dos camundongos altamente suscetíveis A/Sn contra uma infecção letal pelo Trypanosoma cruzi. Com base neste resultado, a hipótese central desta tese foi a de que se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações. Para tal, empregaram-se protocolos de imunização e reforço homólogo ou heterólogo, usando DNA plasmidial, proteínas recombinantes, e vírus recombinantes da ASP-2 de T. cruzi. Inicialmente, testou-se se o reforço heterólogo com a proteína ASP-2 recombinante aumentava a eficácia da vacinação com o DNA plasmidial (pIgSPCl.9). Este protocolo não se mostrou mais eficaz, mas abriu a possibilidade de que a imunização com a proteína ASP-2 recombinante pudesse ser utilizada como um protocolo vacinal alternativo. Com esta abordagem, descreveu-se que a administração de 3 doses de uma proteína recombinante (GST-P4P7), representando os aminoácidos 261-500 da ASP-2 em fusão com a glutationa S-transferase, na presença dos adjuvantes alum e CpG ODN 1826, era capaz de induzir altos níveis de proteção. Neste modelo experimental, observou-se que a imunidade protetora foi de longa duração e dependente dos linfócitos CD8 específicos para o epítopo imunodominante TEWETGQI. Determinou-se também que o adjuvante CpG ODN 1826 melhorou a eficácia da imunidade protetora, e que linfócitos T CD4 específicos são importantes para a indução dos linfócitos CD8 protetores. Como o protocolo de vacinação com a proteína recombinante GST-P4P7 exigia o uso de três doses, testou-se então a possibilidade de que um adenovírus recombinante, expressando a ASP-2 (AdASP-2), pudesse ser utilizado num protocolo de imunização e reforço homólogo ou heterólogo (somente duas doses). Na comparação dos protocolos de vacinação homólogos ou heterólogos com pIgSPCl.9 e AdASP-2, observou-se que, nos animais A/Sn, tanto a imunização homóloga quanto a heteróloga, usando o AdASP-2, proporcionaram um alto grau de imunidade protetora contra a infecção pelo T. cruzi. Os estudos utilizando o protocolo heterólogo (pIgSPCl.9 seguido por AdASP-2), que protege 80-100% dos camundongos, mostraram que a imunidade era de longa duração e dependente dos linfócitos T CD4 e CD8. Esta imunidade protetora se correlacionou com a atividade citotóxica específica in vivo, antes do desafio com o T. cruzi. Com base nestes resultados, analisou-se a imunidade protetora após a vacinação heteróloga em camundongos com deficiência de um importante mediador da citotoxicidade, a perforina. Os animais deficientes (KO) da expressão de perforina vacinados se mostraram suscetíveis à infecção experimental. Uma análise da resposta imune celular destes camundongos mostrou que eles apresentavam uma menor produção de IFN-γ por esplenócitos re-estimulados in vitro, na presença do antígeno recombinante. Na análise dos linfócitos T CD8 específicos observou-se que havia: i) uma expansão numérica normal; ii) uma redução numérica significativa dos linfócitos multifuncionais, capazes de expressar simultaneamente IFN-γ/CD107a e IFN-γ/TNF-α.; iii) baixa citotoxicidade in vivo; iv) baixa expressão de CD44 e de KLRG-1. Por fim, para definir a importância relativa do IFN-γ e da citotoxicidade na proteção contra a infecção pelo T. cruzi após a vacinação heteróloga, camundongos IFN-γ KO foram imunizados com pIgSPCl.9 seguido por AdASP- 2. Estes animais apresentaram um alto grau de citotoxicidade in vivo, mas nenhuma imunidade protetora detectável. Em resumo, ao longo deste trabalho obtiveram-se evidências que confirmam a hipótese inicial de que, utilizando diferentes formulações vacinais e/ou esquemas de vacinações, se poderia melhorar racionalmente a eficácia da vacinação contra a infecção experimental pelo T. cruzi. Pela utilização de depleções in vivo e de animais geneticamente deficientes, definiu-se a importância dos linfócitos T CD4 e CD8, da perforina e do IFN-γ na imunidade gerada pela vacinação com a ASP-2 de T. cruzi. Acredita-se que os dados obtidos no decorrer desta tese serviram para: i) uma melhor compreensão dos mecanismos imunológicos de resistência à infecção pelo T. cruzi e dos seus antígenos alvos; ii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra infecções por protozoários intracelulares em geral e, especificamente, contra a doença de Chagas; iii) o desenvolvimento de vacinas recombinantes capazes de induzir uma potente resposta imune mediada por linfócitos T. / Genetic immunization with plasmidial DNA containing the gene encoding the amastigote surface protein 2 (ASP-2) protects part of the highly susceptible A/Sn mice against a lethal challenge with Trypanosoma cruzi. Based on these results, in this thesis, we tested the hypothesis that the efficacy of the vaccination against T. cruzi experimental infection could be rationally improved by the use of different vaccine formulations and/or vaccinations strategies. For that purpose, we employed homologous or heterologous priming and boosting strategies, with plasmidial DNA, recombinant proteins, and adenovirus expressing T. cruzi ASP-2. Initially, we tested whether boosting with a recombinant protein of ASP-2 could improve the efficacy of the priming vaccination with plasmidial DNA (pIgSPCl.9). This protocol was not more efficient, but opened the possibility that the immunization with the recombinant protein could be used as an alternative vaccine strategy. Using this approach, we described that the administration of 3 doses of a recombinant protein representing the amino acids 261-500 of ASP-2 in fusion o the gluthatione Stransferase (GST-P4P7), in the presence of the adjuvants alum and CpG ODN 1826, was capable of eliciting high levels of protective immunity. In this experimental model, protective immunity was: i) long-lasting; and ii) dependent on the effector CD8 T lymphocytes specific for the immunodominant epitope TEWETGQI. We also established that the adjuvant CpG ODN 1826 improved the efficacy of protective immunity, and that CD4 T lymphocytes were important for the induction of protective CD8 T cells. Because the vaccination strategy employing the recombinant protein GST-P4P7 required 3 doses, we tested the possibility that a recombinant adenovirus expressing ASP-2 (AdASP-2) could be used in a homologous or heterologous priming and boosting protocol with two doses only. By comparing homologous or heterologous priming and boosting with pIgSPCl.9 and AdASP- 2, we found that homologous or heterologous immunizations with AdASP-2 led to a high degree of protective immunity against T. cruzi infection, in highly susceptible A/Sn mice. Follow up studies using the heterologous priming and boosting strategy (pIgSPCl.9 followed by AdASP-2), which protects 80-100% of the mice, showed that protective immunity was long-lived and dependent on the activation of CD4 or CD8 T cells. Protective immunity correlated with antigenspecific in vivo cytotoxic activity prior to the challenge with T. cruzi. Based on this observation, we evaluated the protective immunity following the heterologous vaccination in mice genetically deficient for an important mediator of cytotoxicity, perforin. Vaccinated perforin knock-out (KO) mice were extremely susceptible to the experimental infection. The analyses of the immune response of these mice showed that their splenocytes produced less IFN-γ when re-stimulated in vitro with recombinant antigen. Analysis of specific CD8 T lymphocytes showed: i) a normal numeric expansion; ii) a significantly lower frequency of polyfunctional cells expressing simultaneously IFN-γ/CD107a or IFN-γ/TNF-α.; iii) lower in vivo cytotoxicity; iv) lower expression of CD44 and KLRG-1. Finally, to define the relative importance of IFN-γ and cytotoxic T lymphocytes in the protection against T. cruzi infection following heterologous vaccination, IFN-γ KO mice were immunized with pIgSPCl.9 followed by AdASP-2. These mice developed a high level of in vivo cytotoxicity, but no detectable protective immunity. In summary, during this work we gathered evidences that confirmed our initial hypothesis that we could rationally improve the efficacy of vaccination against T. cruzi experimental infection using different vaccine formulations and/or vaccination strategies. Using in vivo depletions and KO mice, we defined the importance of CD4 cells, CD8 cells, perforin and IFN-γ during immunity generated by vaccination with ASP-2 of T. cruzi. We believe that our findings will provide: i) a better understanding of the immunologic mechanisms and the target antigens during the resistance to T. cruzi infection; ii) to aid the development of recombinant vaccines against intra-cellular parasitic protozoan infections in general and Chagas’ disease, specifically; iii) to aid the development of recombinant vaccines capable of eliciting potent immune response mediated by T lymphocytes. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su documento / La Parotiditis Crónica Recurrente Infantil (PCRI) es una inflamación recurrente y dolorosa, de etiología desconocida. Se inicia a los 2 años de edad y se mantiene hasta la adolescencia, comprometiendo la calidad de vida. Estudios recientes relacionan alteraciones de la composición molecular salival parotídea de pacientes con PCRI, con el grado de alteración sialográfico parotídeo. El propósito de este estudio fue realizar un seguimiento de la composición molecular de la saliva parotídea de pacientes con PCRI sometidos a mantención terapéutica. Se incluyeron 28 pacientes con PCRI tratados en el Servicio Máxilofacial Infantil del Hospital San Juan de Dios. Se tomó muestra de saliva parotídea bilateral para determinar: a) Concentración de proteínas, b) Perfiles electroforéticos unidimensionales y c) Frecuencia de actividad metaloproteinasa MMP9 y MMP2; antes y después de un periodo de mantención terapéutica. La saliva parotídea de los pacientes con PCRI luego de la mantención terapéutica no presenta variaciones en la concentración de proteínas y en la frecuencia de individuos que presentan actividad MMP-9 y MMP-2. Los perfiles electroforéticos se mantienen relativamente estables a excepción de dos bandas: la banda I que se presentó en una menor cantidad de pacientes que recibieron el tratamiento, y la banda J que se presenta en una mayor cantidad de pacientes luego de que estos recibieran tratamiento. El conjunto de observaciones realizadas, ha permitido determinar que después de un largo periodo de tiempo de mantención terapéutica, la saliva parotídea de pacientes con PCRI presenta una mantención de las alteraciones en la composición molecular. Se requiere de estudios adicionales que permitan identificar y caracterizar las proteínas que variaron después del tratamiento en la saliva de estos pacientes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2009-09-14T20:03:10Z No. of bitstreams: 1 2008_ManuelPereiraOliveiraJunior.pdf: 4716264 bytes, checksum: 1e91e7c80a57c82364bf5bb781ed2835 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2010-01-26T13:25:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_ManuelPereiraOliveiraJunior.pdf: 4716264 bytes, checksum: 1e91e7c80a57c82364bf5bb781ed2835 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-26T13:25:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_ManuelPereiraOliveiraJunior.pdf: 4716264 bytes, checksum: 1e91e7c80a57c82364bf5bb781ed2835 (MD5) Previous issue date: 2008-04 / O presente trabalho foi realizado com intuito de se determinar a máxima produção e o ótimo econômico de matéria seca, os níveis de proteína bruta e fibra em detergente neutro de forragem de aveia-preta (Avena strigosa Shreb) em relação aos insumos água e nitrogênio. A irrigação foi feita por aspersão com linha única. O delineamento foi o de blocos casualizados para a variável água e a variável nitrogênio em parcelas subdivididas com cinco repetições. As oito lâminas de água aplicadas foram: 1,3; 107,1; 135,7; 295,9; 330,3; 469,7; 544,3 e 546,1 mm e as seis doses de nitrogênio foram: 0, 20, 40, 80, 160 e 320 kg por ha. A máxima produção de matéria seca 4.217 kg por ha foi observada para a lâmina de irrigação de 336 mm e dose de nitrogênio de 217 kg por ha. Não houve efeito significativo de interação para a combinação entre a variável lâmina de água e dose de nitrogênio para teores de matéria seca, fibra em detergente neutro e número de perfilhos por planta e teor de proteína bruta. O teor de proteína bruta para a máxima produtividade econômica de matéria seca foi de 17,6%. Os teores de fibra em detergente neutro obtidos ficaram abaixo de 55%. Considerando as lâminas de irrigação e as doses de nitrogênio e respectivos custos dos insumos e valor da forragem o ótimo econômico foi calculado em 3.875 kg por ha de matéria seca de aveia, para uma lâmina de água de 280 mm e de 94 kg por ha de nitrogênio, gerando um lucro de R$ 147,32 por ha. A taxa marginal de substituição de água por nitrogênio foi calculada em 0,44 mm por kg por ha. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The experiment was accomplished aiming to determinate maximum and economical dry matter yield of rude protein levels, neutral detergent fiber of black oat (Avena strigosa Shreb) forage related with irrigation depth of water and nitrogen doses. Irrigation was done by a line source system. It was used a randomized complete block design for the irrigation variable, with the factor nitrogen a split plot on irrigation, and five replication. The eight irrigation levels applied were: 1.3, 107.1,135.7, 295.9, 330.3, 469.7, 544.3 and 546.1 mm. The six nitrogen doses were: 0; 20; 40; 80; 160 and 320 kg per ha. Maximum dry matter yield 4,217 kg per ha was verified for the irrigation depth of 336 mm and for the nitrogen dose of 217 kg per ha. There was no interaction among the two independent variables for dry matter content, neutral detergent fiber, number of tillers per plant and rude protein levels. The rude protein levels content for the maximum economical dry matter yield was 17.6%. Neutral detergent fiber values obtained were lower than 55%. Considering irrigation depths, nitrogen levels and theirs prices, and forage prices it was calculated the maximum economical yield of 3,875 kg per ha of dry matter for the 280 mm of irrigation depth and 94 kg per ha of nitrogen, allowing a supply of R$147.21 per ha. The change marginal rate of water to nitrogen was calculate in 0.44 mm kg per ha.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

A Síndrome de Guillain-Barré é caracterizada por uma polirradiculoneuropatia de instalação aguda, usualmente imuno-mediada, com características clínicas associado a um envolvimento sensitivo e motor progressivo, muitas vezes determinando grande incapacidade e morbimortalidade nos indivíduos acometidos pela doença. Este projeto de pesquisa teve como objetivo o seguimento de uma coorte de indivíduos portadores da Síndrome de Guillain-Barré admitidos no Hospital de Clínicas de Porto Alegre durante o período de Janeiro de 2008 à Dezembro de 2009 para a correlação dos achados clínicos com os níveis plasmáticos e liquóricos da proteína S100B. A proteína S100B é basicamente encontrada nos astrócitos e tem tido grande importância para o melhor entendimento dos processos fisiopatológicos na injúria do Sistema nervoso central. Alguns autores relataram a correlação entre a Síndrome de Guillain-Barré e os níveis liquóricos da proteína S100B, baseado nestas descrições acreditamos que o melhor entendimento fisiopatológico da Síndrome de Guillain-Barré associado a determinação dos níveis plasmáticos e liquóricos da proteína S100B possam auxiliar e estabelecer uma importante ferramenta prognóstica precoce na determinação da gravidade dos portadores da Síndrome de Guillain-Barré. / The Guillain-Barre syndrome is characterized by a polyradiculoneuropathy of acute onset, usually immune-mediated, with clinical features associated with a progressive motor and sensory involvement, often determining major disability and morbidity in individuals affected by this disease. This research Project was aimed at following a cohort of patients with Guillain-Barre syndrome admitted to the Hospital de Clinicas de Porto Alegre during the period of January 2008 to December 2009. We measured the sera and cerebrospinal fluid (CSF) concentrations of S100B protein, neuron-specific enolase, neurotrophins and interleukin 6 using enzyme immunoassay methods in 22 patients with Guillain- Barre syndrome and 32 controls. The clinical and laboratory findings observed in the cases were important for better understanding of the pathophysiology of this disease coupled with the outcome of disabilities among the cases.