O Complexo Cryptococcus neoformans compreende as espécies C. neoformans e C. gattii. Estas leveduras basidiomicéticas causam criptococose em indivíduos imunocomprometidos e imunocompetentes, respectivamente. Particularmente em fungos, proteínas ancoradas por Glicosilfosfatidilinositol (GPI-Ps) estão envolvidas em muitos aspectos da interação patógeno-hospedeiro, como adesão e invasão das células hospedeiras, modulação e evasão da resposta imune do hospedeiro e patogênese. Este trabalho tem por objetivo identificar proteínas ancoradas por GPI nas espécies do Complexo C. neoformans por análise in silico de suas sequências genômicas. Para isso, foi utilizado um conjunto de algorítimos para predição de GPI-Ps nas linhagens C. neoformans var. grubii (H99) e C. gattii (R265) através da análise de 6967 e 6210 seqüências de ORFs traduzidas, respectivamente. A classificação de uma proteína como sendo uma GPI-P seguiu o seguinte critério: a seqüência de aminoácidos apresentou (i) um peptídio sinal de secreção N-terminal; (ii) uma sequência sinal de ancoramento por GPI na extremidade C-terminal; (iii) ausência de domínios transmembrana internos. As seqüências foram obtidas no banco de dados genômicos do Broad Institute (http://www.broadinstitute.org/science/data). Neste estudo, 63 proteínas foram identificadas como GPI-Ps em C. neoformans var. grubii (H99) e 47 em C. gattii (R265). Fosfolipase B1, Endo-1,3 -glucanases, Quitina desacetilases e Glioxaloxidases foram encontradas em ambas as espécies. Estas proteínas já foram previamente descritas como GPI-Ps, demonstrando que a metodologia empregada no estudo mostrou-se eficiente. As proteínas identificadas puderam ser, de maneira geral categorizadas funcionalmente, destacando-se aquelas envolvidas na biogênese e remodelamento da parede celular. Aproximadamente 70% das proteínas identificadas em ambas espécies não têm função conhecida, algumas tendo homólogas com outras proteínas fúngicas e outras sendo únicas da espécie. A identificação dessas proteínas será de extrema importância na elucidação de aspectos relacionados à patogênese e servirá de modelo para outras doenças causadas por fungos. / The Cryptococcus neoformans species Complex includes the Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii yeasts. These basidiomycete yeasts can cause disease in immunocompromised and immunocompetent patients, respectively. Notably in fungus, glicosylphosphatidilinositol-anchored proteins (GPI-Ps) are involved in different aspects of host-pathogen interaction, such as host cells adhesion and invasion, host immune response modulation and evasion and pathogenesis. In this work, we performed a systematic, genome-wide in silico identification of C. neoformans complex species GPI-Ps. A set of prediction tools was apllied for the screening of 6967 and 6210 predicted protein sequences from C. neoformans var. grubii (H99 strain) an C. gattii (R265 strain), respectively. The sequences were retrieved from the Broad Institute genome database (http://www.broadinstitute.org/science/data). The identification of putative GPI-Ps was based on the following criteria: i) the presence of an N-terminal signal peptide for secretion; ii) the presence of a C-terminal GPI-attachment site and iii) absence of internal transmembrane domains. A total of 63 putative GPI-Ps were identified in C. neoformans var. grubii and 47 proteins were identified as GPI-P in C. gattii. Proteins previously described as GPI-anchored, such as Phospholipase B1, Endo-1,3--glucanases, Chitin deacetylases and Glyoxaloxidases were identified in both species C. neoformans var grubii and C. gattii. The proteins identified could be classified in several functional categories, especially those involved in cell wall biogenesis and remodeling. About 70% of the GPI-Ps identified have unknown functions. Many of the putative GPI-Ps do not display conserved domains, but some possess have fungal orthologs homólogs while others are currently unique to specie. The GPI-P identification in Cryptococcus neoformans species complex is of extreme importance for elucidating aspects related to the pathogenesis and will serve as a model for others fungal diseases.

Sabe-se há algum tempo que a expressão de glicanas muda de acordo com a condição celular. A alteração do processo de glicosilação de proteínas é um processo comum em vários estados fisiopatológicos, sendo observado como um evento frequente em processos alérgicos e em células tumorais. O principal alérgeno do gato, a proteína Fel d 1, é um dímero composto de duas subunidades, sendo cada subunidade composta por uma cadeia α e β. A proteína possui um sítio de N-glicosilação em cada uma de suas subunidades, sendo preenchidos por diferentes glicoformas. Além disso, estudos cristalográficos detectaram três possíveis sítios de ligação a Ca2+ em sua estrutura. Diversos tipos de tumores apresentam expressão aumentada de GTs, dentre estas a FUT8 e a C2GnT-L. A FUT8 é uma β-1,6-fucosiltransferase, que transfere uma Fuc do substrato doador (GDP-β-L-fucose) à primeira GlcNAc do núcleo pentassacarídico de uma N-glicana. Esta enzima apresenta expressão aumentada em câncer de pulmão, gástrico e de cólon, além de estar envolvida em outros processos patológicos. A C2GnT-L transfere um resíduo de GlcNAc, em ligação β-1,6, ao núcleo 2 (Core 2) de glicanas O-ligadas, sendo superexpressa em câncer de pulmão, próstata e colorretal e relacionada com progressão tumoral e metástase. Considerando o papel da glicosilação e dos sítios ligadores de Ca2+ nos processos alérgicos, assim como a presença das GTs mencionadas em alta quantidade em processos tumorais, bem como a inexistência de dados estruturais e conformacionais destas proteínas e das estruturas sacarídicas em solução, o trabalho tem como objetivo contribuir na caracterização da glicobiologia estrutural destas proteínas. Para tal, foram estudados diversos sistemas da proteína Fel d 1 (PDBID 2ejn) e das enzimas FUT8 (PDBID 2de0) e C2GnT-L (PDBIDs 2gak e 2gam) por DM em solução aquosa em diferentes condições. Após os experimentos, pode-se observar que, para Fel d 1, apenas o íon Ca2+ central está ligado à proteína, enquanto os laterais ficam livres. A Fel d 1 com glicosilação reduzida apresentou um aumento de flexibilidade em duas hélices em uma das subunidades da Fel d 1, devido a desenovelamento das mesmas. Já a proteína completamente glicosilada apresentou uma redução no tamanho da cavidade de uma das subunidades. No estudo da FUT8, observou-se que o domínio N-terminal é o principal componente da flexibilidade proteica desta proteína. Ainda, foi possível caracterizar, através de atracamento molecular, a região de interação da FUT8 com sua glicana-alvo e com uma de suas proteínas-alvo, a integrina α5β1. Os resultados para C2GnT-L demonstraram que o sítio caracterizado para o substrato aceptor pode na verdade estar ocupado pelo substrato doador desta enzima, já que este permanece no local durante a DM, ao contrário do substrato aceptor. Espera-se que este trabalho contribua na compreensão do funcionamento destas proteínas, possibilitando futuros estudos acerca de seus papéis em enfermidades e, consequentemente, para novas estratégias terapêuticas. / We know for a while that glycan expression varies according to the cellular condition. Alterations in protein glycosylation is a common process in several physical and pathological processes, and are frequently observed in allergy and tumorous cells. The major cat allergen, Fel d 1, is a dimer composed by two subunits, each subunit containing one α and β chain. This protein contains one N-glycosylation site in each subunit, which are filled by different glycoforms. In addition, crystallographic studies detected three possible Ca2+ binding sites in its structure. Several types of tumors have higher expression of GTs, like FUT8 and C2GnT-L. FUT8 is an β-1,6-fucosyltransferase, transferring one Fuc from GDP-b-L-fucose to the inner most GlcNAc in the pentassaccharidic core of an N-glycan. This enzyme is highly expressed in lung, gastric and colon cancer and is involved in other pathological processes. C2GnT-L transfers a GlcNAc residue, in a β-1,6 linkage, to the Core 2 of O-linked glycans and is overexpressed in lung, prostate and colon-rectal cancer, related to tumoral progression and metastasis. Considering the role of glycosylation and Ca2+ binding sites in allergy, and considering the presence of the GTs mentioned above in high amounts in tumoral processes, as well as the inexistence of structural data concerning these proteins in solution, this study intents to contribute in characterizing the structural glycobiology of these proteins. In this matter, we studied several systems containing Fel d 1 (PDBID 2ejn), FUT8 (PDBID 2de0) and C2GnT-L (PDBID 2gak and 2gam) by MD in aqueous solution, under different conditions. We were able to observe, after the experiments, that in Fel d 1, only the central Ca2+ ion is bound to the protein, while the lateral ions are free. Fel d 1 containing reduced glycosylation form presented larger flexibility in two helices, in one of the subunits, due to their unfolding. Fully glycosylated Fel d 1 presented reduced cavity size in one of the subunits. In FUT8 study, we observed that the N-terminal domain is the principal component of protein flexibility. We were also able to characterize, using molecular docking, the sites of interaction of FUT8 with its target glycan and one of its target protein, integrin α5β1. Results for C2GnT-L showed that the characterized acceptor substrate site might, in fact, be occupied by the donor substrate, since the donor substrate remains in the site during MD, and the acceptor substrate does not. We expect that the refinement of these crystallographic structures, by introducing the saccharidic information, will contribute in comprehending the proteins functioning, and will further possibilitate studies into its roles in infirmities and, in this matter, to new therapeutic strategies.

Em vista do forte envolvimento de fatores genéticos na patogênese da obesidade e diabetes mellitus tipo 2 (DM2), grandes esforços têm sido realizados para se identificar genes associados a estas doenças. Neste contexto, diversos estudos têm sido focados em genes relacionados ao gasto energético, como os genes para as proteínas desacopladoras (UCPs), receptor 3-adrenérgico ( 3-AR) e, mais recentemente, irisina. As UCPs estão presentes na membrana mitocondrial interna e, apesar de terem similaridades nas suas estruturas, possuem uma expressão tecidual diferente. Estas proteínas desacoplam a oxidação dos substratos na mitocôndria da síntese de ATP, dissipando a energia do potencial de membrana e, consequentemente, diminuindo a produção de ATP pela cadeia respiratória mitocondrial (CRM). Este desacoplamento está associado a funções tecido-específicas como regulação do gasto energético e do metabolismo de ácidos graxos livres e diminuição da secreção de insulina e da formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), mecanismos associados à patogênese da obesidade e DM2. Sendo assim, as associações entre polimorfismos nos genes UCP1-3 e suscetibilidade a estas doenças têm sido investigadas em diversas populações. No entanto, o impacto destes polimorfismos na obesidade e DM2 ainda está em debate, com resultados contraditórios sendo relatados. Deste modo, realizou-se um estudo de caso-controle na nossa população, seguido de uma revisão sistemática e metanálise dos estudos disponíveis na literatura para avaliar se os seguintes polimorfismos nos genes UCP1-3 estavam associados com a suscetibilidade à obesidade: -3826A/G (UCP1); -866G/A, Ala55Val e Ins/Del (UCP2) e -55C/T (UCP3). Os resultados do estudo de caso-controle foram incluídos na metanálise. No estudo de caso-controle, não encontramos nenhuma associação dos polimorfismos analisados com suscetibilidade à obesidade em pacientes com DM2. Quarenta e sete estudos foram incluídos na metanálise e os resultados mostraram que os polimorfismos -866G/A (UCP2) e -55C/T (UCP3) estão associados com proteção para obesidade em europeus. Por outro lado, os polimorfismos Ala55Val e Ins/Del (UCP2) foram associados com risco para obesidade em asiáticos e europeus, respectivamente. Considerando que polimorfismos nos genes UCP1-3 podem estar associados a pequenas variações no índice de massa corporal (IMC) sem estarem, necessariamente, associados à obesidade, realizou-se outra revisão sistemática e metanálise com o objetivo de investigar se os polimorfismos descritos acima estavam associados com variações no IMC. A metanálise de 56 estudos mostrou que os polimorfismos Ins/Del (UCP2) e -55C/T (UCP3) estão associados a um aumento no IMC em asiáticos, enquanto o polimorfismo Ala55Val (UCP2) está associado a um aumento do IMC em europeus. Entretanto, o polimorfismo -866G/A (UCP2) parece estar associado a uma diminuição do IMC em europeus. As duas metanálises sugerem que o polimorfismo - 3826A/G (UCP1) não está associado com obesidade ou IMC. Interações entre polimorfismos nos genes UCP1-3 com polimorfismos nos genes de suas proteínas regulatórias (como, por exemplo, nos genes ADRB3 e FNDC5) podem influenciar as suas associações com obesidade e DM2. O gene ADRB3 codifica o receptor 3-AR, um importante regulador da expressão de UCP1 e mediador da lipólise. O gene FNDC5 codifica o hormônio irisina, uma nova miocina associada à redução de obesidade visceral e melhora no metabolismo da glicose em camundongos. A irisina atua no tecido adiposo branco, estimulando a expressão de UCP1, a qual induz a transformação do tecido em um fenótipo mais parecido com o do tecido adiposo marrom, aumentando o gasto energético. Em vista do exposto, investigamos se os polimorfismos -3826A/G (UCP1) e Trp64Arg (ADRB3), sozinhos ou em combinação, estavam associados com DM2 ou características associadas. Os dois polimorfismos não foram associados ao DM2; entretanto, em pacientes com DM2, o alelo 64Arg foi associado com proteção para sobrepeso e obesidade [IMC W 25 Kg/m²; razão de chances (RC) = 0,598; p = 0,014]. Interessantemente, a prevalência de sobrepeso/obesidade foi menor em portadores de W3 alelos raros dos dois polimorfismos quando comparados a portadores de <3 alelos raros (54,5% vs. 79,1%; RC = 0,288; p = 0,007). Os portadores de W3 alelos raros destes polimorfismos também tiveram os níveis do colesterol HDL aumentados (p = 0,018). Em outro estudo de caso-controle avaliamos se os polimorfismos rs1746661 e rs3480 no gene FNDC5 estavam associados ao DM2 e características associadas. As frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas destes polimorfismos foram similares em casos e controles. Entretanto, mulheres com DM2 portadoras do alelo G do polimorfismo rs3480 apresentaram um aumento na hemoglobina glicada (HbA1c) quando comparadas ao genótipo A/A. O alelo T do polimorfismo rs1746661 foi associado com o aumento da pressão sistólica, colesterol total e colesterol LDL e diminuição do colesterol HDL em mulheres com DM2. Essas associações não foram observadas em homens. A UCP2 parece ter também um papel importante na regulação da apoptose das células-beta pancreáticas; entretanto, se este papel é anti-apoptótico ou pró-apoptótico ainda precisa ser melhor definido. Recentemente, um estudo do nosso grupo demonstrou que a expressão de Ucp2 estava aumentada no pâncreas de um modelo murino de morte encefálica (ME), possivelmente devido ao aumento da inflamação e estresse oxidativo associado à ME. Sendo assim, um dos objetivos do presente estudo foi avaliar a expressão da UCP2 no pâncreas de doadores de órgãos em ME. Também foi realizado um estudo experimental em células INS-1E, uma linhagem de células-beta de ratos, para avaliar o papel do bloqueio da Ucp2 na apoptose das células-beta submetidas à inflamação. Em concordância com nossos resultados prévios em ratos, a expressão de UCP2 foi aumentada no pâncreas de doadores de órgãos em ME comparado aos controles (1,73 ± 0,93 vs. 0,75 ± 0,66 fold change; p< 0,05). O bloqueio de Ucp2 reduziu em 30% a apoptose e a produção de óxido nítrico em células INS-1E incubadas com citocinas pró-inflamatórias. Dados obtidos sugerem que esta proteção está associada à via intrínseca de apoptose. Em conclusão, nossos resultados sugerem que polimorfismos nos genes UCP2 e UCP3 estão associados à obesidade em diferentes populações. Os alelos G do polimorfismo -3826A/G (UCP1) e Arg do polimorfismo Trp64Arg (ADRB3) parecem interagir na modulação do sobrepeso/obesidade e níveis de colesterol HDL em indivíduos com DM2. Além disso, o alelo G do polimorfismo rs3480 (FNDC5) está associado com níveis aumentados de HbA1c, enquanto que o alelo T do polimorfismo rs1746661 parece estar associado com pressão sistólica aumentada e dislipidemia em mulheres com DM2. Por último, nossos dados experimentais sugerem que a UCP2 tem um efeito apoptótico em células-beta submetidas a condições pró-inflamatórias, por meio da regulação da via intrínseca de apoptose. / In view of the strong involvement of genetic factors in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes mellitus (T2DM), great efforts have been done to identify genes associated with these diseases. In this context, several studies have been focused on genes encoding proteins related to energy expenditure, such as uncoupling proteins (UCPs), 3-adrenergic receptor ( 3-AR) and, more recently, irisin. UCPs are located in the mitochondrial inner membrane and, despite similarities in their structures, they have different tissue expressions. These proteins uncouple substrate oxidation in mitochondria from ATP synthesis, thereby dissipating the membrane potential energy and, consequently, decreasing ATP production by mitochondrial respiratory chain (MRC). The uncoupling is associated with tissuespecific functions such as energy expenditure and free-fatty acids regulation and decreasing insulin secretion and reactive oxygen species (ROS) production, all mechanisms associated with obesity and T2DM pathogenesis. Thus, the relationship between UCP1-3 polymorphisms and susceptibility to these diseases has been investigated in several populations. However, the impact of these polymorphisms on obesity and T2DM is still under debate, with contradictory results being reported. Therefore, we performed a case-control study in our population followed by a systematic review and meta-analysis of published studies in order to evaluate whether the following polymorphisms were associated with susceptibility to obesity: -3826A/G (UCP1); -866G/A, Ala55Val and Ins/Del (UCP2), and -55C/T (UCP3). Results obtained in our case-control study were also included in the meta-analysis. In the casecontrol study, we did not found any association between the analyzed polymorphisms and obesity. Forty-seven studies were included in the meta-analysis, and results showed that UCP2 -866G/A and UCP3 -55C/T polymorphisms are associated with protection to obesity in Europeans. On the other hand, UCP2 Ala55Val and Ins/Del polymorphisms were associated with obesity in Asians and Europeans, respectively. Considering that UCP1-3 polymorphisms may be associated with small changes in body mass index (BMI) without being, necessarily, associated with obesity, we performed another systematic revision with meta-analysis aiming to evaluate if the polymorphisms described above are associated with BMI changes. Meta-analysis of 56 studies showed that UCP2 Ins/Del and UCP3 -55C/T polymorphisms were associated with increased BMI in Asians, while the UCP2 Ala55Val polymorphism was associated with increased BMI in Europeans. However, the UCP2 -866G/A polymorphism seems to be associated with decreased BMI in Europeans. Both meta-analyses suggest that the UCP1 -3826A/G polymorphism is not associated with obesity or BMI. Interactions between polymorphisms in UCP1-3 genes with polymorphisms in genes for their regulatory proteins (such as in ADRB3 and FNDC5 genes) could influence their associations with obesity or T2DM. ADRB3 gene codifies for `3-AR, an important UCP1 regulator and mediator of lipolysis. FNDC5 gene codifies for the hormone irisin, a novel myokine which reduces visceral obesity and improves glucose metabolism in mice. Irisin acts on white adipose cells, stimulating UCP1 expression, which induces the transformation of these cells in brown fat-like cells, increasing energetic expenditure. In view of the foregoing, we investigated if UCP1 -3826A/G and ADRB3 Trp64Arg polymorphisms, individually or in combination, were associated with T2DM or related characteristics. Both polymorphisms were not associated with T2DM; however, in T2DM patients, the 64Arg allele was associated with protection against overweight and obesity [BMI W25 kg/m2; odds ratio (OR) = 0.598; P = 0.014). Interestingly, prevalence of overweight/obesity was lower among carriers of at least three minor alleles of the two polymorphisms than among patients with fewer than three minor alleles (54.5% vs. 79.1%; OR = 0.288; P = 0.007). Subjects with at least three minor alleles also had higher HDL-cholesterol levels (P = 0.018). In another case-control study, we evaluated if rs1746661 and rs3480 polymorphisms in the FNDC5 gene were associated with T2DM or related features. Genotype, allele and haplotype frequencies of both polymorphisms were similar between case and control subjects. Nevertheless, women with T2DM carrying the rs3480G allele showed increased HbA1c levels compared with A/A carriers. The rs1746661T allele was associated with increased systolic blood pressure, total cholesterol and LDL-cholesterol and decreased HDL-cholesterol in women with T2DM. These associations were not observed in men. There is increasing evidence that UCP2 also plays a role in regulating apoptosis in pancreatic beta-cells; however, if this role is proapoptotic or anti-apoptotic still needs to be better defined. Recently, a study from our group showed increased Ucp2 expression in pancreas from a rat brain-death (BD) model, possibly due to BDassociated increased inflammation and oxidative stress. Therefore, one aim of the present study was to evaluate UCP2 expression in pancreas from human BD donors. Also, an experimental study was conducted in INS-1E cells (lineage of murine betacells) to analyze the role of Ucp2 knockdown in beta-cell apoptosis submitted to inflammation. In agreement with our previous results in rats, UCP2 expression was increased in pancreas from BD donors compared to controls (1.73 ± 0.93 vs. 0.75 ± 0.66 fold change; P< 0,05). Ucp2 knockdown was able to reduce by 30% cytokine-induced apoptosis and nitric-oxide production in INS-1E cells. Our data suggest that this protection was associated to the intrinsic apoptotic pathway. In conclusion, our results indicate that polymorphisms in UCP2 and UCP3 genes are associated to obesity in different populations. The G allele of -3826A/G (UCP1) polymorphism and Arg allele of Trp64Arg (ADRB3) polymorphism seem to interact in the modulation of overweight/obesity and HDL cholesterol levels in T2DM subjects. Moreover, the G allele of the rs3480 (FNDC5) polymorphism is associated to higher HbA1c levels, while the T allele of the rs1746661 polymorphism seems to be associated with higher systolic blood pressure and dyslipidemia in women with T2DM. Lastly, our experimental data suggest that UCP2 has an apoptotic effect in beta-cells exposed to pro-inflammatory conditions through regulation of the intrinsic apoptosis pathway.

A criptococose é uma micose profunda causada pela levedura encapsulada Cryptococcus neoformans, um basidiomiceto que geralmente acomete pacientes imunocomprometidos. A infecção primária é pulmonar, ocorrendo posteriormente sua disseminação para outros sítios anatômicos, sendo a meningoencefalite a forma clínica mais comum e também a maior causa de morte por esta infecção. A grande proporção de humanos infectados ocorre em pacientes imunocomprometidos embora também possa causar infecção em indivíduos hígidos. Este estudo teve como objetivo geral a avaliação da prevalência de anticorpos de classe IgG frente a dois extratos protéicos da levedura C. neoformans: uma amostra ATCC sorotipo A e um isolado clínico recente da levedura C. neoformans var. grubii. Foram analisadas 26 amostras de soro de pacientes com criptococose, provenientes da soroteca do Laboratório de Micologia do Hospital Universitário de Santa Maria (HUSM). Também fazem parte desta investigação de soroprevalência, 24 amostras de soro de trabalhadores em laboratório de pesquisa, que manipulam a levedura C. neoformans e 48 pacientes pediátricos atendidos no ambulatório do Hospital Trombudo, no município de Vale do Sol. A resposta imune humoral de anticorpos de classe IgG contra antígenos protéicos de C. neoformans apresentou um grande número de proteínas reconhecidas pelos soros de pacientes com criptococose e dos trabalhadores em laboratório onde a levedura é manipulada. A massa molecular dos principais antígenos imunodominantes reconhecidos foi de aproximadamente 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 e 110 kDa. Estes principais antígenos identificados podem tornar-se de grande relevância para a elaboração de testes diagnósticos, identificação de possíveis alvos, elaboração de vacinas e para avaliação do estado imunitário em relação ao desenvolvimento da criptococose. / Cryptococcus neoformans is a pathogenic fungus that causes life-threatening meningoencephalitis in HIV positive patients, and in patients subjected to immunosuppressive therapies. The objective of this study was to investigate the profile of immune humoral responses to C. neoformans proteins by means of the analysis of sera from three groups consisting of 48 children, 24 laboratory workers, and 26 patients with acute cryptococcal meningitis. The results of latex polysaccharide antigen detection were positive and similar to the ones from the culture of cerebrospinal fluid (CSF) for fungal infection in all 26 patients. Analysis of the IgG antibody response to protein antigens by ELISA revealed different levels of recognition when comparing protein extracts originated from American Type Culture Collection (ATCC), and a Brazilian strain recently isolated in a clinical sample of CSF (P<0,05). Reactivity to C. neoformans proteins analysed by Western blot showed ten antigens which were more frequently recognized with a relative molecular mass of approximately 25, 34, 38, 50, 60, 70, 80, 95, 100 and 110 kDa. The differences in sera antigen recognition were minimal when comparing different protein extracts. The identification of these antigens decreased by absorbing the sera with C. neoformans extracts. Periodate treatment reduced the intensity of antigen recognition, but did not eliminate reactivity to any individual antigen. Strain and host factors were important when studying the immune response to C. neoformans infection. Our findings support clinical and epidemiological data showing differences in the susceptibility to cryptococcosis, and the use of these techniques may be a powerful tool to evaluate the human population in serological studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-12-02T15:18:07Z No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-12-03T10:59:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-12-03T10:59:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KarinaSmidtSimon.pdf: 7781707 bytes, checksum: 40fadf97a8c91530c0bc1e7607cb65a6 (MD5) / A ocorrência de infecções causadas por patógenos oportunistas, dentro das UTIs são responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade, caracterizando um grave problema de saúde pública. Um desses patógenos é o Cryptococcus neoformans, um fungo basidiomiceto, causador da criptococose. Essa é uma doença manifestada principalmente por indivíduos imunocomprometidos, onde a incapacidade do organismo desses pacientes de eliminar o fungo acaba por permitir a migração do mesmo para diversos tecidos, incluindo o sistema nervoso. Lá ele se estabelece, causando a meningoencefalite, que é a forma mais grave da doença, e eventual morte. O sucesso terapêutico para a criptococcose é bastante baixo, necessitando-se, então, de novas estratégias para o tratamento da doença. AMPs vem sendo investigados como elementos promissores no tratamento de diversas doenças. Estes peptídeos são encontrados em todos os organismos pluricelulares, onde exercem atividades regulatórias e microbicida. Os peptídeos com atividade protetora do organismo, podem, no caso de animais venenosos, ser expressos constitutivamente nas glândulas de veneno. Considerado que esses peptídeos tem o potencial de eliminar patógenos e alterar a atividade de células relacionadas com a defesa dos organismo, foram testados seis peptídeos para ação fungicida contra o C. neoformans e atividade imunomodulatória com macrófagos murinos. Esses peptídeos foram sintetizados a partir da biblioteca de cDNA das glândulas de veneno de escorpiões das espécies Tityus obscurus, Tityus serrulatus e Hadrurus gerstchi. Testes de atividade hemolítica, atividade citotóxica para células de mamíferos, e capacidade microbicida direta e indireta foram executados para todos os peptídeos. Foi verificada a atividade antinflamatória de dois dos peptídeos, além a da alta tóxicidade para o fungo de um terceiro peptídeo Estes peptídeos apresentaram, na concentração em que foram capazes de exercer suas respectivas atividades, baixa capacidade hemolítica e baixa toxicidade para células de mamíferos. Além disso, foi feito um primeiro esforço para entender a estrutura secundária dos peptídeos com atividades modulatória e microbicida, na tentativa de compreender melhor a ação dessas sequências. A utilização desses peptídeos pode ser considerada promissora para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento da criptococose. __________________________________________________________________________ ABSTRACT / The occurrence of infections caused by opportunistic pathogens within the ICU is responsible for high morbidity and mortality inside the hospitals, featuring a serious public health problem. One of them is the fungus Cryptococcus neoformans, a basidiomycete that is the cause of cryptococcosis. This is a disease manifested mainly in immunocompromised patients, where the body's inability to eliminate the pathogen eventually allow the fungus migration to various tissues, including the nervous system. There it establishes, causing meningoencephalitis, the most severe form of the disease, and eventual death. Successful treatment for cryptococcosis is rather low, so it becomes a necessity to search for new strategies of treatment for this infirmity. Antimicrobial peptides are being investigated as a promising treatment for many illness. These peptides are found in all multicellular organisms, where they exert regulatory and microbicidal activities. The peptides with protective activity of the organism may be expressed constitutively in venom glands, in the case of poisonous animals. Considering that these peptides has the potential to eliminate pathogens and alter the activity of cells related to the defense of the organisms, here we tested six peptides for a fungicide activity against C. neoformans and immunomodulatory capacity in murine macrophages. These peptides were synthesized from the cDNA library of the venom gland of Tityus obscurus, Tityus serrulatus and Hadrurus gerstchi scorpion species. Tests of hemolytic activity, cytotoxic activities to mammalian cells, and direct and indirect microbicidal capacity were performed for all peptides. There was verified the anti-inflammatory activity of two of the peptides, in addition to the high toxicity to the fungus of a third peptide. At the concentration in which they were able to pursue their activities, these peptides presented low hemolytic capacity and low toxicity to mammalian cells. Furthermore, a first effort has been made to understand the secondary structure of peptides with microbicidal and modulatory activities, in an attempt to better understand the action of these sequences. The use of these peptides may be considered promising for the development of new therapies for the treatment of cryptococcosis.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Pós-graduação em Ciências Médicas, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-14T16:04:32Z No. of bitstreams: 1 2015_EduardoAugustoRosa.pdf: 17236503 bytes, checksum: bbfab38745a25fee1717ad180d847582 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-14T20:42:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_EduardoAugustoRosa.pdf: 17236503 bytes, checksum: bbfab38745a25fee1717ad180d847582 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-14T20:42:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_EduardoAugustoRosa.pdf: 17236503 bytes, checksum: bbfab38745a25fee1717ad180d847582 (MD5) / Introdução: O câncer de boca está entre os dez tipos de câncer mais comuns em todo o mundo. Lesões precursoras como leucoplasia e líquen plano em geral precedem o surgimento do tumor invasivo. Nesse contexto, a busca por marcadores biológicos para o diagnóstico e prognóstico dessas lesões é extremamente relevante. Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas P16, BUB3, SOX4 e Ki67 no líquen plano oral (LPO) e comparar os resultados com a expressão dos mesmos anticorpos no líquen plano cutâneo (LPC), na displasia oral (DO) e na hiperplasia fibrosa oral (HFO). Materiais e Métodos: Conduziu-se um estudo retrospectivo, que incluiu 120 blocos de tecido parafinados, distribuídos igualmente em LPO, DO, HFO e LPC. A partir desses blocos foi realizada reação imunoistoquímica com os anticorpos citados em cada um dos grupos. A expressão dos anticorpos foi avaliada por um índice de positividade (IP) determinado após a contagem de 500 células de cada amostra. Resultados: Verificou-se que o IP (mediana) de P16 em LPC foi o mais elevado (86,59), seguido pelo LPO (20,65), HFO (11,8) e DO (7,85) (p <0,001). A comparação de pares post-hoc mostrou diferença estatisticamente significativa entre LPO / LPC, LPO / DO. O IP para BUB3 também foi maior no LPC (83,2), seguido por LPO (80), HFO (77) e DO (71,4) (p = 0,04). O maior IP para SOX4 foi encontrado em LPC (86,8) seguido por HFO (82,3), DO (72,4) e LPO (66,1) (p <0,001). Foi verificada diferença estatísticamente significativa entre LPO / LPC. O Ki67 apresentou expressão maior em DO (14,4) seguido de LPO (11,6), LPC (8,24) e HFO (5,5) (P <0,001). O teste post hoc mostrou diferença significativa entre LPO / HFO, LPC / DO e DO / HFO. Conclusão: Os resultados aqui apresentados sugerem que o LPO tem um potencial intermediário de transformação maligna. O P16 não se comportou como um marcador confiável de transformação maligna das lesões orais. A expressão de BUB3 e SOX4 devem ser melhor esclarecidas, mas talvez possam atuar como fatores de proteção. Mais estudos devem ser realizados envolvendo esses marcadores. / Background: Oral cancer is one of the ten most common types of cancer worldwide. In this context, the search for diagnosis and prognosis biological markers is extremely relevant. Objective: To evaluate the expression of the antibodies P16, BUB3, SOX4 and Ki67 in oral lichen planus (OLP) and compare its results with their expression among cutaneous lichen planus (CLP), oral dysplasia (OD) and oral fibrous hyperplasia (OFH). Materials and methods: This is a retrospective study design, which included 120 formalin fixed paraffin embedded tissue blocks of OLP, OD, OFH and CLP, equally distributed. Results: It was verified that positive index (median) of P16 in CLP was the highest one (86.59), followed by OLP (20.65), OFH (11.8) and OD (7.85) (p <0.001). Post-hoc pairwise comparisons showed significant statistical differences between OLP/CLP, OLP/OD, CLP/OD and CLP/OFH. Positive index for BUB3 was also higher in CLP (83.2) followed by OLP (80), OFH (77) and OD (71.4) (p = 0.04). The highest SOX4 index was found in CLP (86.8) followed by OFH (82.3), OD (72.4) and OLP (66.1) (p < 0.001). Significant statistical difference was verified between LPO/LPC and LPC/OD. Ki67 was higher in OD (14.4) followed by OLP (11.6), CLP (8.24) and OFH (5.5) (P < 0.001). Post hoc test showed significant difference between OLP/OFH, CLP/OD and OD/OFH. Conclusion: The results presented here suggest that OLP has an intermediate malignant potential. P16 can not be considered a reliable marker for malignant transformation in oral lesions. The expression of BUB3 and SOX4 should be further clarified, but they may act as protect factors. More studies should be performed envolving these markers.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-11-28T12:00:31Z No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-03T14:18:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ViniciusDanielFerreiraBatista.pdf: 1512646 bytes, checksum: e4fb096aa8b82d64fbc0c08c52e23512 (MD5) / O sistema de expressão Pichia pastoris tem sido utilizado com sucesso na produção de uma grande variedade de proteínas heterólogas. Esta levedura reúne características como fácil manipulação molecular, crescimento celular rápido, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e secreção eficiente de proteínas, além de atingir altas densidades celulares com grande produção da proteína heteróloga. O objetivo deste estudo foi construir um vetor de expressão em P. pastoris para produção de proteína heteróloga, reunindo elementos genéticos que possibilitem a seleção de transformantes com multicópias integradas, buscando aumentar o nível de expressão. Nesse sentido, foi utilizado o vetor comercial pPICZαA (Invitrogen) que teve seu gene de resistência Sh ble substituído pelo gene kanR, derivado do transposon Tn 903, alterando a resistência ao antibiótico zeocina para o antibiótico G418. Elevadas concentrações deste antibiótico podem ser utilizadas para a seleção de clones com alto número de cópias integradas. Após troca da marca de seleção, foram clonados no vetor um promotor do gene constitutivo glicolítico PGK1 (PPGK1) de P. pastoris, um sinal de secreção fator α de acasalamento de Saccharomyces cerevisiae - com códons otimizados para P. pastoris - e um novo sítio múltiplo de clonagem. Para analisar a capacidade de produzir uma proteína heteróloga, o gene da pró-quimosina B de Bos taurus foi clonado no vetor e mostrou-se capaz de coagular leite no teste de atividade. Novos elementos genéticos podem ser clonados no vetor a fim de aumentar a frequência de integração genômica, como uma porção repetitiva do DNA de P. pastoris - que servirá como alvo da integração - e o gene defectivo leu2-d de S. cerevisiae para uso de marca auxotrófica. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The Pichia pastoris expression system has been successfully used in the production of a wide variety of heterologous proteins. This yeast combines characteristics such as easy molecular handling, rapid cell growth, capacity to carry out post-translational modifications and efficient secretion. In addition, it can achieve high cell densities with high production of the heterologous protein. The aim of this study was to create a new P. pastoris vector using genetic elements that allow the selection of multicopy transformants aiming to increase heterologous expression. We used the commercial vector pPICZαA (Invitrogen) as a platform to replace the native Sh ble gene by kanR , derived from transposon Tn5, and, thus, changing antibiotic resistance from zeocin to G418. High concentrations of the former antibiotic can be used to select clones with high number of integrated copies. Next, we cloned the promoter of the constitutive glycolytic gene PGK1 (PPGK1) from P. pastoris, the α mating factor signal sequence of Saccharomyces cerevisiae - with codons optimized for P. pastoris - and a new multiple cloning site. To analyze the ability to produce a heterologous protein, the bovine chymosin B was cloned and successfully secreted as judged by milk coagulating test. Furthermore, we began the construction of a new vector based on the auxotrophic leu-2d marker from S. cerevisiae which should enable the selection of multiple events of integration in the genome of a LEU2-null strain of P. pastoris.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de pós-graduação em Biologia Molecular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-05-21T13:44:10Z No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-24T12:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf: 9474008 bytes, checksum: 13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79 (MD5) / A utilização da biomassa tem se tornado uma atrativa fonte alternativa para a produção de energia. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na indústria de fermentação alcoólica, porém não possui atividade amilolítica. Portanto, a modificação genética dessa levedura vem sendo feita para obteção de novas linhagens amilolíticas. O presente trabalho teve como objetivo a construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas na superfície de S. cerevisiae para coexpressar a enzima α-amilase de Bacillus subtilis juntamente com a glicoamilase de Aspergillus awamori na parede celular da levedura. Para ancorar as proteínas de interesse à parede foi feita a fusão destas com a região C-terminal da α-aglutinina da própria levedura, contendo a sequencia sinal para adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e as proteínas expressas na linhagem MFL. Utilizou-se três formas diferentes de glicoamilase, uma contendo o gene completo (gla1), outra apenas com o domínio catalítico e a região altamente O- glicosilada (gla2) e uma última com domínio catalítico e parte da região O- glicosilada (gla3). Os testes de atividade mostraram que a enzima α-amilase aderiu à parede celular, porém a maior parte da proteína produzida ainda era secretada para fora da célula. As maiores atividades encontradas para as construções contendo α-amilase fusionada à porção C-terminal da α-aglutinina foi de 0,99 ± 0,02 U/mL e 89,43 ± 5,27 U/mL, associada à célula e no sobrenadante, respectivamente. A secreção da α-amilase para o meio de cultura apresentou grande aumento quando fusionada a outra proteína. A atividade observada para glicoamilase também foi maior no sobrenadante de cultura. As três diferentes formas de glicoamilase fusionadas à α-aglutinina não apresentaram diferenças significativas de expressão entre si. A análise do perfil secretório mostrou que as enzimas fusionadas encontradas no sobrenadante de cultura apresentam a mesma massa molecular da enzima secretada sem fusão alguma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biomass has become an attractive alternative source for energy production. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism in industrial fermentation, however it doesn’t have amylolytic activity. Therefore, molecular engineering of this yeast have been done to obtain new amylolytic strains. The aim of this work was to construct a vector for expression of heterologous proteins on the cell surface of S. cerevisiae to coexpress the α-amylase from Bacillus subtilis and the glucoamylase of Aspergillus awamori in the yeast cell wall. To anchor the proteins to the wall, they were fused with the C-terminal region of α-agglutinin containing the signal sequence for addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and the protein produced expressed in the MFL strain. We used three different forms of glucoamylase: one containing the complete gene (gla1), another with only the catalytic domain and the highly-glycosylated region (gla2) and the last one with a catalytic domain and part of the O-glycosylated region (gla3). The activity tests showed that the enzyme α-amylase was attached to the cell wall, but most of the produced protein was secreted to the culture medium. The highest activities found for the constructs containing α-amylase fused to the C-terminal region of α-agglutinin was 0,99 ± 0,02 U/mL and 89,43 ± 5,27 U/mL, to pellet and supernatant, respectively. The secretion of α-amylase protein was greatly increased when fused to another protein. The activity found for glucoamylase was also higher in the culture supernatant. The three different forms of glucoamylase fused to C-terminal region of α-agglutinin showed no significant differences in expression among them. The secretory analysis showed that merged enzymes found in the culture’s supernatant presented the same molecular mass as the enzyme secreted without any fusion.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-12-01T17:24:45Z No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-01T23:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_AnaFlaviaAlvesParente.pdf: 2148290 bytes, checksum: 127fe8fbcd02590fb2f21a2a1e84641d (MD5) Previous issue date: 2007-11 / B. thuringiensis é um importante entomopatógeno amplamente estudado e empregado como agente de controle biológico, ainda assim, a ecologia desse microrganismo é pouco explorada. Apesar da crescente utilização na agricultura desse agente, as interações com plantas são pouco conhecidas. Com o intuito de construir uma ferramenta eficaz para o rastreamento dessa bactéria, foi desenvolvida a estirpe S76GFP+ a partir de uma estirpe brasileira selvagem de B. thuringiensis. O vetor de expressão pAD43-25 contendo o gene gfpmut3a funcional, além do vetor parental, pAD123, contendo o mesmo gene, porém sem promotor foram transferidos para a estirpe S76, permitindo no primeiro caso a expressão constitutiva do gene durante o crescimento vegetativo. Adicionalmente, como controle, ambos vetores foram transferidos para uma estirpe acristalífera (Cry-). Células verdes brilhantes foram detectadas por microscopia de fluorescência, em ambas hospedeiras transformadas com o vetor pAD43-25, a partir de duas horas após a inoculação em meio líquido e que puderam ser observadas pelo restante do tempo de cultivo até o fim da esporulação. A estirpe S76GFP+ apresentou um discreto acréscimo no tempo de geração, embora não tenham sido observadas alterações morfológicas das colônias e células. Análises dos perfis protéico e plasmidial indicaram, respectivamente, a manutenção da expressão das proteínas Cry e do elenco dos plasmídeos residentes. Do nosso conhecimento, não apenas é o primeiro relato de visualização da emissão de fluorescência pela expressão de GFP em B. thuringiensis. Igualmente, é o primeiro relato de expressão de GFP em uma estirpe de B. thuringiensis selvagem. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Although extensively studied by its recognized potential as bioinseticide, B. thuringiensis ecology is poorly understood, and despite its increasing use, little is known regarding interactions between this microorganism and plants. Thus, a tractable marker for detection of this bacterium under specific environment and physiological conditions is a valuable tool. A plasmid (pAD43-25) bearing a functional gfp gene and the parental vector, bearing the promotorless gfp gene, were introduced in the Brazilian wild-type strain B. thuringiensis kurstaki S76, allowing, in the first case, the constitutive synthesis of GFP during vegetative growth. Additionally, both vectors were transferred to a Cry- B. thuringiensis host. Green bright cells could be detected, by fluorescence microscopy and in both hosts, since 2h after inoculation in liquid medium and could be seen throughout remaining cultivation time, until complete sporulation was accomplished. Strain S76GFP+ seems to grow slower than the remaining recombinants and parental cells, whereas no perceptible change in cell or colony morphologies was observed. Protein profile and plasmidial DNA analyses indicate, respectively, that this recombinant maintained Cry proteins expression and resident plasmid outline. To our knowledge, it is the first time fluorescence is detected in a B. thuringiensis strain, as well as, that GFP is expressed in a wild-type B. thuringiensis.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-10T18:47:46Z No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-11T18:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-11T18:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_DanielLimaLogrado.pdf: 4716490 bytes, checksum: 5cc801a6d076dff66b230bb9caddb891 (MD5) Previous issue date: 2009-06 / Visando o desenvolvimento de uma metodologia analítica rápida e econômica orientada para estudos de sistemas moleculares formados por proteínas, o presente trabalho teve como objetivo primordial a associação entre duas poderosas técnicas para análise de proteínas, a microscopia de força atômica (AFM) e a espectrometria de massa (MS). Tendo como perspectiva principal para a associação AFM-MS o estudo do interatoma. A microscopia de força atômica é uma importante técnica para análise de sistemas supramoleculares, dentre outras informações, permite à obtenção da topografia desses sistemas possibilitando que as dimensões das estruturas que o compõe sejam mensuradas, sendo assim, essa ferramenta de análise fornece informações importantes no que diz respeito a estruturas quaternárias formadas por proteínas, sugerindo como as subunidades interagem para formação de complexos moleculares. A determinação precisa da massa molecular por espectrometria de massa possibilita a solução de diversos problemas relacionados às questões bioquímicas, como a determinação direta das estruturas primária e quaternária de proteínas, determinação de modificações pós traducionais, identificação de proteínas e etc. Graças a sua versatilidade e sensibilidade, a espectrometria de massa vem se destacando como ferramenta indispensável para a análise de proteínas. O presente trabalho propõe a associação da microscopia de força atômica com a espectrometria de massa objetivando análises rápidas nas quais uma mesma amostra é submetida às duas ferramentas analíticas, identificando, também, em quais aspectos essas duas técnicas se complementam na investigação de sistemas protéicos. Nos experimentos, proteínas adsorvidas em superfície de mica, suporte frequentemente utilizado nas análises por AFM, tiveram sua morfologia estudada por AFM e, em seguida, foram analisadas por MALDI-MS na mesma superfície, adaptada a placa do MALDI por meio de uma fita dupla face. Em outras circunstâncias, a amostra adsorvida em mica foi submetida a reações para caracterização e identificação das proteínas por MALDI-MS. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Aiming the development of analytical methodology oriented for rapid analysis of protein supramolecular systems, we present in this work the association between two powerful techniques for protein analysis: atomic force microscopy (AFM) and mass spectrometry (MS). The AFM-MS prospects are mainly directed to the interactome study. Atomic force microscopy is a powerful analytical technique for supramolecular systems. Among other information, it provides the system topography and enables the measurement of subunits dimensions. So, it deals about an analytical tool which provides important information regarding the quaternary protein structure, giving a track about how subunits interact to each other in molecular complexes formation. The precise molecular weight determination by mass spectrometry allows the solution of various problems related to biochemical issues, such as determining proteins primary and quaternary structure, characterization of their post-translational modifications, proteins identification and so on. Thanks to its versatility and sensitivity, mass spectrometry has been highlighting as an indispensable analytical tool for protein analysis. This work suggests the association of atomic force microscope and mass spectrometry for rapid analysis of a single sample. We identified the aspects in which these techniques are complementary for investigation of protein systems. For the first time, proteins adsorbed onto mica surface (support often used in AFM analysis) were identified by MALDI-MS, after having their topography examined by AFM. Samples adsorbed on mica were also subjected to reactions for protein characterization and identification by MALDI-MS.