Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Medici_MarceladosAnjos_M.pdf: 9527499 bytes, checksum: 3e5801335af84a91e3a95359e36cb43b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A neuromielite ótica (NMO) é uma doença inflamatória do sistema nervoso central. Por muito tempo, a NMO foi considerada uma variante da Esclerose Múltipla (EM). Atualmente, as duas doenças são distinguidas por meio de exames da neuroimagem e achados laboratoriais. Em 2004, mostrou-se a presença de um anticorpo, inicialmente nomeado de anti-NMO, em 85% dos pacientes portadores de NMO. Pacientes com EM clássica não apresentam esse anticorpo em seu soro. Através de técnicas de imunofluorescência indireta, em que o soro do paciente entra em contato com tecido de SNC de camundongos ou de macacos, mostrou-se que o alvo desse anticorpo era a aquaporina-4 (AQP4). Alguns pacientes podem apresentar também autoanticorpos que reconhecem a mielina de oligodendrócito (MOG). A obtenção da AQP4 recombinante seria de grande importância para aplicação em imunodiagnóstico e pesquisa científica. Como a AQP4 é uma proteína transmembrânica, visamos nesse trabalho melhorar o rendimento e a solubilização da proteína recombinante. Buscando maximizar o processo de expressão da AQP4 em E. coli, foram escolhidos vetores de expressão e linhagens apropriadas para expressão de proteínas heterólogas recombinantes. Ainda, foram utilizados alguns artifícios moleculares, como a utilização de proteínas e tags de fusão e o aprimoramento do processo de extração protéica. Desta forma, neste estudo descrevemos a clonagem e expressão da AQP4 humana e a detecção de anticorpos anti-MOG no soro de pacientes com diagnóstico de NMO / Abstract: Neuromyelitis optica (NMO) is an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). For a long time, NMO was considered a Multiple Sclerosis (MS) variant. Nowadays, the two diseases are differentiated by neuroimaging exams and laboratorial findings. In 2004 was shown the presence of an antibody, initially named anti-NMO, in 85% of NMO patients. Classic MS patients were tested seronegative for this antibody. Through indirect immunofluorescence techniques, in which patient's serum and CNS tissue from mice and monkeys are in contact with each other, was shown that the antibody's target was aquaporin-4 (AQP4). Some patients can also present autoantibodies against myelin oligodendrocyte protein (MOG). The attainment of recombinant AQP4 would be of great importance for immunodiagnosis and scientific research applications. As the AQP4 is a transmembranic protein, the improvement of the recombinant protein yields and its solubility were envisioned for this study. Seeking to maximize the AQP4 expression process in E. coli, we chose expression vectors and specific safe lineages for heterologous recombinant protein expression. Moreover, molecular artifice was utilized, as fusion proteins and tags and the enhancement of protein extraction process. Therefore, the purpose of this study was to clone and express human AQP4 and the detection of anti-MOG antibodies in NMO patients' serum / Mestrado / Imunologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Sandra Martha Gomes Dias / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barsottini_MarioRamosdeOliveira_M.pdf: 16356564 bytes, checksum: 9cf8e738f13f95639e35471c9a7da160 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O fungo Moniliophthora perniciosa desperta grande interesse agroeconômico, pois é o agente etiológico da Vassoura-de-Bruxa do cacau. A cultura do cacaueiro é de grande importância no cenário nacional e na América Latina, sendo o entendimento dos mecanismos moleculares desta doença de grande valia. Durante a interação entre patógeno e hospedeiro, o primeiro produz moléculas para evadir ou alterar as respostas normais de defesa do segundo. O sequenciamento do genoma de M. perniciosa levou à identificação de proteínas-chave potencialmente envolvidas no processo patogênico do fungo, dentre as quais, estão: proteínas pertencentes à família das Cerato-plataninas (MpCPs), bem como proteínas pertencentes à família das Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). As CPs são amplamente associadas à interação fungo-hospedeiro, agindo como toxinas, indutoras de resposta de defesa ou alergenos. As NEPs induzem morte celular e necrose em plantas dicotiledônes através da permeabilização da membrana celular. O objetivo desse projeto foi caracterizar funcionalmente as MpCPs e as MpNEPs, determinando assim sua relevância durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir do transcriptoma de M. perniciosa e da análise filogenética das doze MpCPs encontradas, foi revelada uma correlação entre grupos de MpCPs e sua expressão diferencial ao longo da doença. Quatro MpCPs foram clonadas, expressas em sistema heterólogo e tiveram sua estrutura cristalográfica resolvida. Ensaios bioquímicos e biofísicos confirmaram que as MpCPs presentes em diferentes grupos filogenéticos apresentam capacidades distintas no tocante à interação com o açúcar N-acetilglicosamina e de formar agregados ordenados. Estudos funcionais indicaram que estas características estão potencialmente relacionadas ao bloqueio de resposta de defesa da planta e ao crescimento do fungo, respectivamente. Quanto às MpNEPs, somente a isoforma MpNEP2 foi detectada durante a Vassoura-de-Bruxa. A partir da estrutura cristalográfica dessa proteína e ensaios de mutação sítio-dirigida, foi identificado um hairpin hidrofóbico exposto ao solvente, possivelemte associado à ancoragem da MpNEP2 na membrana celular, o qual é tão importante quanto o sítio ativo da proteína para a atividade biológica da mesma / Abstract: Moniliophthora perniciosa is the causal agent of Witches' Broom Disease of cocoa and a major agroeconomic concern in Brazil and Latin America. In order to efficiently control this disease, it is crucial to understand the molecular basis underlying its progression. During the attack to the plant, a pathogen releases molecules to suppress or alter the regular defense response of the host. Results obtained from the genome sequencing of M. perniciosa lead to the identification putative virulence factors belonging to the Cerato-platanin protein family (MpCPs), and to the Necrosis- and Ethylene-inducing Proteins (MpNEPs). CPs are important to fungus-host interaction process, acting as toxins, defense response-inducing molecules or allergens. NEPs are toxin-like pore-forming proteins, which affect only dicot plants. This project aimed at the functional characterization of the MpCPs and MpNEPs, as well as understanding their importance for the Witches' Broom Disease progression. Twelve MpCP-coding genes were identified, and comprehensive transcriptome and phylogenetic analyses showed a correlation between MpCPs evolutionary clusters and their expression patterns throughout the disease. Four representative MpCPs had their crystal structure resolved. Biophysical and biochemical characterizations showed a correlation between the MpCP clusters, regarding sugar (N-acetylglucosamine) binding and protein self-assembling, which are possibly related to plant defense response suppression and hyphal growth, respectively. As for the MpNEPs, only the isoform MpNEP2 was shown to be expressed during the Whitches' Broom Disease. Its crystalloghaphic structure, along with site-directed mutagenesis and functional assays revealed that, besides the protein's active site, an hydrophobic hairpin exposed to te solvent is important to the necrosis-promoting activity, probably mediating the contact of MpNEP2 with the cell membrane / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: José Mario Martínez Pérez, Margarida Pinheiro Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_RodrigoSilva_D.pdf: 3475914 bytes, checksum: e7fad42e859de59d5e4db3f0a5a41417 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Neste trabalho estudamos inicialmente o problema da reconstrução 3D de uma proteína dadas as distâncias entre pares de átomos de sua estrutura. Formulamos a situação como um problema de otimização não linear com função objetivo contínua no domínio de variáveis e mostramos através de experimentos computacionais que a estrutura original da proteína é recuperada mesmo quando admitimos conhecidas apenas um subconjunto de distâncias intra- átomos. Em seguida, estudamos problema da representação de um conjunto de proteínas comparadas em relação as suas estruturas tridimensionais. Propomos algumas formulações para este problema onde as proteínas são representadas por objetos em espaços euclidianos e elaboramos também um procedimento para classificar proteínas novas sem a necessidade de realizar exaustivas comparações estruturais envolvendo as proteínas analisadas / Abstract: In this work we initially study the problem of reconstruct the 3D structure of a protein given the distances between pairs of its atoms. We formulate this situation as a nonlinear optimization problem with a continuous objective function over the domain of variables. We show by computational experiments that the original protein structure is recovered even when we do not use all the distances between its atoms. Next, we study the problem of representing a set of proteins. The proteins are compared with respect to their 3D structures. We propose some formulations to this problem, where the proteins are represented by objects in euclidean spaces and we elaborate also a form of use these representations to classify new proteins without perform many comparisons between the analyzed structures / Doutorado / Doutor em Matemática Aplicada

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes Marcondes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pertile_Tatiane_M.pdf: 1613871 bytes, checksum: 2d715c00e32e2a411050801a7a1ac95f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O câncer pode promover a morte do hospedeiro, pois durante sua evolução há modificações da homeostasia dos processos metabólicos, promovendo profundas alterações caracterizadas como caquexia, que por sua vez relaciona-se à diminuição da qualidade e do tempo de vida do hospedeiro. Assim, no presente estudo, analisamos os efeitos da evolução do crescimento de neoplasia - carcinossarcoma de Walker 256 - em ratos jovens e adultos e os efeitos modulatórios do tratamento desses animais com EPA (ácido eicosapentaenóico) sobre o processo de caquexia e a concentração de citocinas anti e proinflamatórias no músculo gastrocnêmio, pois o tecido muscular é o tecido mais afetado no processo de caquexia. Foram utilizados 108 ratos Wistar machos, com idade de 30 dias (jovens) e 100 dias (adultos), os quais foram distribuídos de acordo com o local de implante tumoral, intraperitônio e subcutâneo, e tratamento ou não com ácido eicosapentaenóico, 100?g/Kg de peso corpóreo. Os animais receberam gavagem diária do EPA (animais tratados) ou de óleo mineral (grupos sem tratamento) até a fase pré-agônica. A partir dos órgãos coletados, foram calculados o ganho de peso corpóreo, os pesos relativos de cada órgão, do tumor e da carcaça. Com o objetivo de identificarmos a via de degradação protéica predominante nos grupos experimentais, foram avaliados, no tecido muscular, o teor de proteína muscular total e as atividades das seguintes enzimas: chymotrypsin-like, catepsinas B e H, calpaína e fosfatase alcalina,. A partir do sangue desses animais foram feitas análises fluorimétricas do fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e das citocinas - interleucinas 4 (IL-4), 6 (IL-6) e 10 (IL-10), interferon gama (INF-?) e leptina, utilizando-se kits específicos para citômetro de fluxo de fluorescência (Luminex). Também foi analisada a expressão gênica, no tecido muscular, por reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR-RT), para a via proteossômica e também para os fatores eucarióticos de inicialização. Os dados indicam efeitos modulatórios do EPA sobre o tecido muscular (manutenção da proteína e do peso), principalmente para os grupos jovens, e também no processo inflamatório crônico (aumento de citocinas pró e antiinflamatórias). Entretanto, efeitos mais expressivos do EPA não foram verificados na prevenção da espoliação de gordura (gordura perirrenal e leptina), no processo de síntese protéica (manutenção da expressão gênica de fatores eucarióticos de inicialização) ou também sobre a via proteossômica / Abstract: Cancer can promotes the host death, because during its evolution there are modifications in metabolic processes of homeostasis, promoting deep changes characterized as cachexia, which in turn relates with reduction in quality and lifetime of the host. Thus, in this study, we analyze the effects of development in Walker 256 carcinoma evolution - in young and adults rats and the modulatory effect of treatment with EPA (eicosapentaenoic acid) in gastrocnemius muscle as this tissue is the most affected in the cachexia process. Wistar males rats were used (n=108 animals), 30 days-old (young) and 100 days-old (adults), which were distributed according to the tumour implant, intraperitoneally and subcutaneously and treatment or not with eicosapentaenoic acid, 100 ?g/Kg of body weight. The animals receive daily EPA by gavage (treated animals) or nujol (sham groups) and were cared up to pre-agonic state. The bodies weight were measured and the body weight gain was calculated, as well the relative weights of tissues, tumour, and carcass. In order to identify the predominant pathway of protein degradation the total muscle protein content and proteolytic enzymes activities (chymotrypsin-like, cathepsin B and H, calpain and alkaline phosphatase) were measured in gastrocnemius muscle. The blood samples were assessed to measure the insulin-like growth factor 1 (IGF-1), leptin and the cytokines - interleukins (IL-4), 6 (IL-6) and 10 (IL-10), gamma interferon (INF-?), using specific kits for cytometer fluorescence (Luminex). It was also examined gene expression, in the muscle tissue, by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), assessing keys of ubiquitin-proteasome pathway and also on the eukaryotic initiation factors. The data indicated some modulatory effects of EPA on the muscle tissue (maintenance of protein and weight), mainly for the young rats, and also the chronic inflammatory process. However, more expressive effects of EPA have not been verified as preventing fat wasting (perirenal fat and leptin), nor in the process of protein synthesis (maintenance of eukaryotic initiating factors gene expression) or also in the ubiquitin-proteasome via / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Mário Tyago Murakami / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_NadiaHelena_D.pdf: 33217097 bytes, checksum: 6cbd9ad5dcfddd06e2357b3c680cd3f6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A enzima purina nucleosídeo fosforilase hexamérica de Bacillus subtilis (BsPNP233) c uma nucleosídeo fosforilase do tipo 1 , responsável pela catalise reversível da reação de guebra de urn nucleosídeo em base nitrogenada e ribose-1-fosfato na via de salvação de purinas. Essa enzima possui interesses biomédicos e biotecnológicos devido ao uso na terapia gênica em canceres sólidos e na biossíntese de análogos de nucleosídeos...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The hexamcric purine nucleoside phosphorylase from Bacillus subtilis (BsPNP233) is a nucleoside phosphorylase typc-1 involved in purine salvage pathway by the nucleoside phosphorolysis resulting in purine base and ribose-1-phosphatc. The interest about this enzyme involves gene therapy application in solid cancers treatment and nucleoside analogs biosynthesis...Note: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Edson Rosa Pimentel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:52:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hocoya_LuciaMassuda_M.pdf: 1034739 bytes, checksum: b693a6ca4a0d913bdd0884beaa896940 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A valva mitral é uma complexa estrutura de tecido conjuntivo, constituída por proteínas colagênicas, não colagênicas e proteoglicanos. Histologicamente, o folheto valvar é constituído por 4 camadas: auricular, esponjosa, fibrosa e ventricular. A camada fibrosa forma o núcleo estrutural, enquanto a camada esponjosa funciona como amortecedor de choques. A corda tendínea possui 2 camadas distintas, um largo núcleo fibroso e uma camada esponjosa ao redor. Várias anormalidades da valva mitral têm sido constatadas, desde lesões causadas por acúmulo degenerativo de cálcio, endocardite infecciosa e anormalidades relacionadas com alterações da quantidade de colágeno, ácido hialurônico e glicosaminoglicanos. Entre os tratamentos normalmente utilizados, tem-se realizado técnica de reparo de porções da valva danificadas, ou a substituição destas por valvas artificiais ou biopróteses. Para tanto, um melhor conhecimento sobre os aspectos organizacionais e composicionais são necessários, tanto do folheto, como da corda tendínea. Para a análise morfológica, montagem total e cortes histológicos do folheto e corda tendínea foram corados com azul de toluidina e analisados em microscopia de polarização. Feixes de colágeno intensamente birrefringentes foram encontrados altamente organizados na corda tendínea e com orientação multidirecional no folheto, onde fibrilas colágenas vindas da corda tendínea ramificam-se e entrelaçam-se formando uma estrutura em rede no folheto. A metacromasia foi intensa nas regiões de inserção das cordas tendíneas no folheto, ocorrendo de maneira não uniforme. Cortes transversais do folheto mostraram a camada esponjosa, com características de tecido conjuntivo frouxo, e a fibrosa, onde os feixes de colágeno estão densamente arranjados. Para o estudo bioquímico componentes da matriz extracelular foram extraídos com cloreto de guanidina 4M, fracionados em DEAE-Sephacel e analisados em SDS-PAGE. As proteínas não colagênicas encontradas mostraram Mr entre 19 e 179 kDa e 19 e 235 kDa para o folheto e corda tendínea respectivamente. Várias proteínas similares são encontradas em ambos os tecidos. Bandas polidispersas em torno de 67 kDa e 80-100 kDa foram encontradas, as quais provavelmente correspondem aos pequenos proteoglicanos fibromodulim e decorim respectivamente. Análise em gel de agarose-poliacrilamida revelou a presença de banda polidispersa e matacromática, indicando a presença de proteoglicanos de alto peso molecular, que provavelmente trata-se do versicam, tanto no folheto, como na corda tendínea. A análise de GAGs mostrou a presença de condroitim sulfato e dermatam sulfato nas duas regiões. De acordo com nossos estudos bioquímicos e morfológicos, podemos concluir que: 1) A corda tendínea apresentou maiores quantidades de proteínas e glicosaminoglicanos que o folheto; 2) Pequenos e grandes proteoglicanos estão presentes em ambos os tecidos; 3) Os feixes de colágeno estão altamente organizados na corda tendínea, enquanto assumem várias direções no folheto; 4) A distribuição de proteoglicanos no folheto ocorre de maneira não uniforme, provavelmente devido a atuação também não uniforme de forças compressivas nesta estrutura / Abstract:The mitral valve is a complex connective tissue structure, constituted by collagenous proteins, non collagenous proteins and proteoglycans. Structurally the valve leaflets are composed of four main layers: auricularis, fibrosa, spongiosa and ventricularis. The fibrosa layer forms the structural core of the valve, while the spongiosa has an important role in absorption of shock. The chordae tendineae has two distinct layers, a large fibrous core surrounded by a spongenous layer. Several abnormalities of mitral valve have been reported, as the result of injuries caused by degenerative calcium accumulation, infectious endocarditis and disorders associated with collagen content, hyaluronic acid and glycosaminoglycans abnormalities. Among the treatments normally used, have been realized repair techniques of portions of the valve or replacement of these with a prosthetic valve or bioprostheses. Detailed information about organization and composition aspects of the leaflets and chordae tendineae are necessary. For morphological analysis, whole mounts and histological sections of leaflets and chordae tendineae were stained by toluidine blue. Analysis of whole mounts in polarization microscopy showed an intense brightness of the collagen fibrils, demonstrating the high molecular organization of the collagen in the chordae tendineae while in the valve leaflets collagen fiber is multidirectional. In this case, collagen fibrils coming from the chordae tendineae branch cross each other forming a network-like structure. Intense metachromasy was observed in leaflet region of chordae tendineae insertion, with a non uniform distribution. Leaflets transversal sections showed the spongiosa layer with soft connective tissue characteristics, and the fibrosa, where collagens bundles are highly arranged. For the biochemical study extracelular matrix components were extracted with 4M guanidinium chloride, fractionated in DEAE-Sephacel and analysed by SDS-PAGE. The non collagenous proteins found showed Mr values between 19-179kDa and 19-235kDa to the leaflet and chordae tendineae respectively. Several similar proteins were found in both tissues. Polidisperses bands around 70kDa and 80-100kDa which probably correspond to the small proteoglycans fibromodulin and decorin respectively were found. The analysis in agarose-polyacrylamide gel revealed a polydisperse and metachromatic band in the leaflet and chordae tendineae, indicating the presence of proteoglycans of high molecular weight presumables versican. According to our morphological and biochemical studies, it may be concluded that: 1) The chordae tendineae showed larger amounts of proteins and glycosaminoglycans than the leaflet; 2) Small and large proteoglycans are present in both tissues; 3) The collagen bundles are highly organized in the chordae tendineae while in the leaflet they have a multidirectional arrangement; 4) Proteoglycans have a non uniform distribution in the leaflets, probably due to a non uniform action of compressive forces on these structures / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular

Orientador: Iris Concepcion Lineares de Torriani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica "Gleb Wataghin" / Made available in DSpace on 2018-08-04T15:02:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CristianoLuisPintode_D.pdf: 31759545 bytes, checksum: a92d80aac97e4e41bdf268c343cbd43e (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Apresentamos nesta tese estudos relacionados à obtenção de parâmetros estruturais e modelagem ab initio para macromoléculas biológicas e sistemas densos de partículas elipsoidais a partir de dados de espalhamento de raios X a baixos ângulos. Aspectos teóricos e experimentais são discutidos, complementados por simulações computacionais e pela apresentação de resultados experimentais que exemplificam a aplicação dos métodos de cálculo revelando assim os alcances e limites da técnica. Progressos recentes em biologia molecular estrutural revelam que a correlação entre a forma e a função de macromoléculas biológicas é crucial para a compreensão dos processos biológicos. Além disso, diversos estudos associam várias doenças a defeitos estruturais em proteínas, aumentando ainda mais o interesse na determinação das estruturas protéicas. A técnica de espalhamento de raios X a baixos ângulos permite a obtenção de parâmetros estruturais de proteínas, apresentando diversas vantagens sobre a cristalografia de proteínas e a ressonância magnética nuclear, mesmo não atingindo alta resolução. Trataremos, portanto, dois assuntos principais: estudos de sistemas diluídos e estudos de sistemas densos. Para o estudo de sistemas diluídos o enfoque principal será na modelagem estrutural de proteínas em solução, onde são apresentados e discutidos diversos métodos de simulação tanto da estrutura das macromoléculas quanto de seus parâmetros hidrodinâmicos. Estes métodos foram aplicados ao estudo de diversos problemas, tais como: (i) as estruturas das hemoglobinas extracelulares de Biomphalaria glabrata e Glossoscolex paulistus, proteínas gigantes com elevada cooperatividade funcional entre suas subunidades; (ii) as diferenças estruturais entre as formas livres e ligadas a lipídeos da proteína básica de mielina, uma das proteínas principais do axônio nervoso e cujo mal funcionamento leva a doenças neuronais; (iii) a interação entre proteínas e polímeros, tema relevante para processos de cristalização e construção de sistemas bio-poliméricos; e (iv) a estrutura da proteína precursora amilóide, proteína transmembrana que, apesar de diversas funções conhecidas, é uma das precursoras principais do Mal de Alzheimer. Já no estudo de sistemas densos é apresentada uma nova metodologia baseada em simulações de Monte Carlo para elipsóides de revolução. Como elipsóides podem servir de sistemas modelos para diversos sistemas reais, simulações de propriedades de soluções concentradas destes sistemas são de grande interesse. Com base nestas simulações, funções de espalhamento e funções de correlação puderam ser calculadas para um grande intervalo de anisotropias e concentrações, permitindo a obtenção de funções numéricas que podem ser utilizadas no estudo de sistemas reais uma vez que não existem expressões analíticas para este tipo de sistema. Como aplicação, este método foi utilizado no estudo de nanopartículas de ferro em matriz de silício, fornecendo parâmetros estruturais do sistema. / Abstract: In this dissertation, theoretical and experimental aspects of the calculation of structural parameters and ab-initio modeling for biological macromolecules and condensed particle systems are being discussed. Two main applications will be presented, complemented by computational simulations and many experimental results. For dilute systems the focus will be on the structural modeling of several proteins in solutions, including the calculation of hydrodynamic parameters. Recent developments in structural molecular biology reveal that knowledge about the correlation existing between the structure and function of biological macromolecules is crucial for the understanding of biological processes. Many studies have proved that structural defects detected in certain proteins are responsible for serious diseases. Small angle X-ray scattering has proved to be very useful in the determination of the low resolution structure of macromolecules in solution. This technique offers clear advantages with respect to other techniques, like singlecrystal X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. The low resolution structural studies of proteins included: (i) the 3D solution structure of the extracellular hemoglobin from the species Biomphalaria glabrata and Glossoscolex paulistus, giant proteins with high functional cooperativity between their subunits; (ii) the determination of the structural differences between the lipid free and lipid bound forms of myelin basic protein (MBP), one of the most important proteins of the axon sheath whose bad functioning leads to neural diseases; (iii) the study of protein-polymer interactions, relevant subject for crystallization processes and development of bio-polymeric systems; (iv) the 3D solution structure of the amyloid precursor protein, APP, transmembrane protein which is related to the Alzheimer disease. For the study of dense systems, a Monte Carlo based method for the simulation of a system of hard ellipsoids of revolution was developed. Ellipsoidal particles can be used as model systems for many real problems and simulations of the properties of concentrated solutions are of great interest. As a result of these simulations, scattering functions and correlation functions could be derived for a wide interval of anisotropies, permitting the calculation of numerical functions that can be used in real systems. As an example, this method was used for the study of iron nanoparticles in a silica matrix, leading to the determination of mean radius and size distribution of the particles. / Doutorado / Física da Matéria Condensada / Doutor em Ciências

Orientador: Marcelo Cristianini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T00:01:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Torrezan_Renata_D.pdf: 7323790 bytes, checksum: 207de2c2a0d4ced64e9eb7e22e1a3857 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O isolado proteico de soja (IPS) é um produto com pelo menos 90% de proteínas que, devido às suas características físico-químicas, possui certas propriedades funcionais tecnológicas que influenciam a sua aceitação e utilização como ingrediente em produtos cárneos, alimentos infantis, bebidas e produtos de panificação. Os polissacarídeos, pectina e k-carragena são utilizados em alimentos como espessantes, geleificantes e estabilizantes de emulsões. Neste trabalho foram avaliados os efeitos do tratamento sob alta pressão, utilizando-se os dois tipos de equipamentos existentes no mercado: isostático e dinâmico, sobre as características funcionais tecnológicas (solubilidade e índice de atividade emulsificante - IAE) do isolado proteico de soja, como também da mistura de isolado proteico de soja com pectina e k-carragena, com o equipamento isostático. No caso do equipamento isostático, foram também analisadas as propriedades reológicas ¿ G¿ e G¿¿. Para a análise dos efeitos do tratamento sob alta pressão isostática sobre o isolado proteico de soja foi utilizado o planejamento fatorial completo (23), cujas variáveis independentes foram a concentração de proteína, pH e nível de pressão. Para o equipamento dinâmico as variáveis foram o pH e o nível de pressão aplicado. Um planejamento fatorial fracionário (24-1) foi utilizado inicialmente, para os sistemas proteína de soja¿polissacarídeos para avaliar os efeitos das variáveis independentes (concentração de isolado de soja, concentração de polissacarídeo utilizado - pectina ou k-carragena, pH e nível de pressão isostática) e posteriormente foi realizado um planejamento fatorial completo (23) fixando-se a concentração de IPS em 1%, obtendo-se as superfícies de resposta. De cada planejamento fatorial completo foram selecionados os ensaios que apresentaram as maiores respostas em cada característica funcional (solubilidade, índice de atividade emulsificante e conforme o caso, G¿) e avaliadas também o teor de sulfidrila livre, comportamento eletroforético, grau de desnaturação das proteínas (calorimetria diferencial de varredura), perfil cromatográfico e documentação da microestrutura (microscopia eletrônica de varredura). A solubilidade proteica foi fortemente influenciada pela variável pH em todas as faixas de pH estudadas, tanto quando se utilizou apenas a proteína de soja quanto da sua utilização adicionada de pectina e k-carragena, para ambos os equipamentos de alta pressão utilizados: isostático e dinâmico. Quando se trabalhou apenas com a proteína de soja, utilizando-se o equipamento de alta pressão isostática na faixa de pH mais baixa (2,66 ¿ 4,34) o valor de IAE foi máximo nos tratamentos sob baixa pressão. Na faixa de pH de 5,16 a 6,84 os valores mais altos de IAE foram obtidos na região de valores centrais de pressão e de baixo pH. Quando se adicionou pectina ou k-carragena à proteína de soja o IAE atingiu valores mais altos para os tratamentos sob pressão isostática nos pontos extremos (mais baixos ou nos mais altos). Quando se utilizou o equipamento sob alta pressão dinâmica os maiores valores de IAE estão próximos aos ponto isoelétrico da proteína de soja. Em todos os experimentos realizados no equipamento isostático o módulo de perda ou componente viscoso (G¿¿) foi o componente dominante, exibindo um comportamento predominantemente viscoso. A análise das amostras selecionadas em cada experimento com os maiores valores de solubilidade proteica, IAE e quando foi o caso G¿¿ utilizando apenas a proteína de soja ou misturas da proteína de soja com pectina ou k-carragena mostraram que o tratamento sob alta pressão isostática e dinâmica diminuíram em maior ou menor grau o teor de sulfidrila livre de todas as amostras analisadas, evidenciando uma mudança na molécula da proteína confirmada pelas alterações observadas através das análises de calorimetria diferencial de varredura, cromatografia líquida de fase reversa, eletroforese e microscopia eletrônica. Foi realizada também uma avaliação sobre os efeitos do tratamento sob alta pressão isostática (200-700 MPa) sobre os fatores antinutricionais teor de fitato e inibidor de tripsina, constatando-se que a alta pressão não alterou os teores do inibidor de tripsina; porém, não foram detectadas concentrações de fitato após este tratamento / Abstract: Soy protein isolate (SPI) contains at least 90% protein and its physics and chemical properties define some functional properties that influence its use and acceptance as an ingredient in meat products, baby foods, beverages and bread products. The polysaccharides pectin and k-carrageenan are used as a thickening, gelation and emulsion stabilising agent in some food products. The effects of isostatic and dynamic high pressure on functional properties (solubility and emulsifying activity index ¿ EAI) of SPI alone as well of SPI mixed with pectin and k-carrageenan (only for isostatic high pressure treatment) were evaluated in this work. For isostatic high pressure processing the rheological properties G¿ and G¿¿ were also evaluated. To analyse the effects of isostatic high-pressure treatment on SPI a complete factorial design 23 was applied with protein concentration, pH and pressure as independent variables. For dynamic high-pressure treatment the variables were the pH and the pressure. Initially, to analyse the effects of independent variables (protein concentration, polysaccharide concentration ¿pectin or k-carrageenan, pH and pressure level) in mixed protein-polysaccharide systems a fractional factorial design 24-1 was applied and the protein concentration was fixed at 1% for the next complete designs. The samples with the highest effect on protein solubility, EAI and in some cases also G¿¿ value were evaluated as well by electrophoresis (Native and SDS-Page), free sulphydryl determination, reversed phase high pressure liquid chromatography (RP-HPLC), differential scanning calorimetry (DSC) and having their microstructure documented. The pH was the main factor that affecting protein solubility in all studied pH ranges, for SPI alone and SPI mixed with polysaccharides and for both high-pressure equipments. The EAI was maximum in low high-pressure treatments (200-300 MPa) with isostatic equipment for pH 2.66-4.34 range, when the system was only SPI. In pH 5.16-6.84 range the highest EAI values was in middle high-pressure values (450 MPa) and low pH. When SPI was mixed with pectin and k-carrageenan the highest values of EAI was in the extreme points of isostatic high pressure (the highest or the lower). When dynamic high-pressure equipment was used the region of the highest values of EAI was near by the soy protein isoelectric point (pI). Loss modulus (G¿) was the dominant compound in all the isostatic experiments done and exhibited a predominantly viscous behaviour. The selected samples analysis with SPI alone as well SPI mixed with pectin or k-carrageenan samples showed that isostatic or dynamic high pressure treatment decreased in some degree the free sulphydryl content of all analysed samples showing that some change occurred in soy protein molecule as confirmed by DSC, RP¿HPLC, electrophoresis and scanning electronic microscopy. The evaluation of isostatic high pressure treatment (200-700 MPa) on antinutritional factors such as phytate content and trypsin inhibitor showed that high pressure did not change the trypsin inhibitor activity but was effective in eliminating the phytate content / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Everardo Magalhães Carneiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_SandraMara_M.pdf: 1558318 bytes, checksum: d69677a862aa6ba8e96725b7d5c76a87 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Introdução e objetivos: A ARHGAP21 é uma Rho-GAP que promove a ativação de um fator intrínseco da Rho-GTPase Cdc42 responsável pela hidrólise de GTP à GDP e inativação da atividade da proteína. ARHGAP21 se associa à PKC? em cardiomiócitos e à porção C-terminal da FAK em glioblastomas, onde inibe a ativação de Rho-GTPases, e, com isso, o rearranjo do citoesqueleto de actina. A Cdc42, FAK e PKC? estão envolvidas na secreção de insulina estimula por glicose, diferenciação e proliferação de ilhotas pancreáticas. O objetivo deste trabalho foi investigar em células beta pancreáticas: 1) a expressão e localização da ARHGAP21; 2) o efeito da glicose na expressão das proteínas PKC?, FAK e Cdc42 e sua associação à ARHGAP21 e; 3) a função da ARHGAP21 no controle da secreção de insulina estimulada por glicose. Materiais e Métodos: A expressão e localização da ARHGAP21 em células MIN6 foram avaliadas por imunoflorescência. Células MIN6 foram tratadas na presença de 5,6 ou 22 mM de glicose ou, na ausência ou presença de insulina (0,2 U/ml) por 3 dias. Após a extração protéica a expressão das proteínas ARHGAP21, PKC, FAK e Cdc42 foi avaliada por Western blot. Células MIN6 foram incubadas em solução contendo 22 mM de glicose e coletadas em diferentes tempos (0, 5, 15, e 30 min) para avaliação da interação ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? por imunoprecipitação e, para análise do grau de fosforilação tirosina 397 e 925 da FAK e em treonina 410 da PKC?. A expressão dessas proteínas também foi avaliada em ilhotas pancreáticas de camundongos Swiss neonatos previamente tratados por dois dias com 1 nM de anti-sense anti-ARHGAP21 ou mismatch. Essas ilhotas foram incubadas com 2,8 ou 16,7 mM de glicose e a secreção de insulina avaliada. Resultados: A ARHGAP21 localiza-se no citoplasma, mais acentuadamente na região da membrana plasmática. Glicose reduziu a expressão da ARHGAP21 e PKC? e não alterou a expressão da FAK e Cdc42, enquanto a insulina não alterou a expressão de nenhuma das proteínas estudadas. A glicose também promoveu a dissociação ARHGAP21/FAK, levando ao aumento na fosforilação da FAK seguido de aumento na associação ARHGAP21/PKC? e redução na fosforilação da PKC? em Thr 410. Animais Knockdown para ARHGAP21 apresentaram menor expressão de PKC? e maior expressão de Cdc42, além de um aumento na secreção de insulina por ilhotas pancreáticas tanto em condição sub- (2,8 mM) quanto supra-estimulatória (16,7 mM) de glicose. Conclusão: ARHGAP21 modula Cdc42 e FAK, proteínas responsáveis pelo rearranjo do citoesqueleto de actina e extrusão do grânulo de insulina, reduzindo sua expressão e atividade, o que inibe a secreção de insulina. Além disso, observamos que a glicose modula as interações ARHGAP21/FAK e ARHGAP21/PKC? / Abstract: Background/Aims: ARHGAP21 is a Rho-GAP that promotes activation of the Rho-GTPase Cdc42 intrinsic factor, which is responsible for the hydrolysis of GTP to GDP and those proteins inactivation. ARHGAP21 associates with PKC? in cardiomyocytes and to the C-terminal portion of FAK in glioblastoma, inhibiting Rho-GTPases and actin cytoskeleton rearrangement. Cdc42, FAK and PKC? promote glucose-stimulated insulin secretion, differentiation and proliferation in pancreatic islets. The aim this study was to assess in pancreatic beta cells: 1) ARHGAP21 expression and localization; 2) glucose effect in PKC?, FAK e Cdc42 expression and association to ARHGAP21; 3) The role of ARHGAP21 on glucose-stimulated insulin secretion. Materials and Methods: ARHGAP21 expression and localization in MIN6 cells were evaluated by immunofluorescence. MIN6 cells were treated with glucose (5.6 mM and 22 mM) or insulin (0.2 U/ml) for 3 days. After protein extraction, the ARHGAP21, PKC?, FAK e Cdc42 expressions were evaluated by Western blot. MIN6 cells were exposed for 0, 5, 15, e 30 min to 22 mM of glucose. ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/PKC? interactions were evaluated for immunopreciption and phosphorylation of FAK in tyrosine 397 and 925 and phosphorylation of PKC? in threonine 410. The expression of these proteins also was evaluated in pancreatic islets of neonates Swiss mice previously treated for 2 days with 1 nM of ARHGAP21 antisense or mismatch oligonucleotides. These islets were incubated with 2.8 mM or 16.7 mM of glucose and insulin secretion was evaluated. Results: ARHGAP21 is localized in the cytoplasm, mainly the plasmatic membrane. Glucose reduced ARHGAP21 and PKC? expression but not altered FAK and Cdc42 expression, while insulin had no effect whatsoever on the expression of the studied proteins. Glucose also dissociated ARHGAP21/FAK, leading to increased FAK phosphorylation, which was followed by ARHGAP21/PKC? association and reduced Thr410 PKC? phosphorylation. ARHGAP21 Knockdown mice pancreatic islets had lower PKC? and higher Cdc42 expression, and also increased insulin secretion in both sub- (2.8 mM) and supra-stimulatory (16.7 mM) of glucose conditions. Conclusions: ARHGAP21 modulates Cdc42 and FAK, proteins responsible for rearrangement of actin cytoskeleton and extrusion of insulin vesicles, and reducing their expression leads to inhibited insulin secretion. Furthermore, we observed that glucose modulates ARHGAP21/FAK and ARHGAP21/ PKC? interactions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Yoon Kil Chang / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:53:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Schmiele_Marcio_D.pdf: 9722936 bytes, checksum: 95d9146270f349c5f3e7ad761ac0d266 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os análogos de carne obtidos por extrusão termoplástica de proteínas vegetais são caracterizados pelo seu elevado teor proteico e estrutura semelhante às fibras da carne, envolvendo diversos tipos de ligações e/ou interações químicas entre as proteínas. O objetivo deste trabalho foi avaliar as características tecnológicas e físico-químicas de análogos de carne, à base de isolado proteico de soja, obtidos por processo de extrusão termoplástica a alta umidade (AU) e baixa umidade (BU). Para cada condição de umidade foi utilizado um Delineamento Composto Central Rotacional de três variáveis independentes (glúten vital, umidade de condicionamento e temperatura de extrusão). As variáveis dependentes avaliadas foram a textura instrumental, cor instrumental, capacidade de absorção de água, índice de solubilidade em água, capacidade de absorção de óleo, índice de dispersibilidade de proteína, energia mecânica específica e o tipo de interações proteicas. Estas interações foram avaliadas através de sete tipos de solventes específicos: (i) tampão fosfato para as proteínas no estado nativo; (ii) dodecil sulfato de sódio para as interações hidrofóbicas e iônicas; (iii) Triton 100X para as interações hidrofóbicas; (iv) ureia para as interações hidrofóbicas e pontes de hidrogênio; (v) ß-mercaptoetanol para as ligações dissulfeto; e (vi) ß-mercaptoetanol e ureia e (vii) dodecil sulfato de sódio e ureia, para avaliar o efeito sinérgico entre os sistemas. O ponto otimizado (caracterizado principalmente por promover maiores valores de L* e de capacidade de absorção de água, menores valores de índice de solubilidade em água, de capacidade de absorção de óleo, de desnaturação proteica e valores intermediários de textura instrumental e de energia mecânica específica) foi processado juntamente com uma amostra controle para ambos os processos com o intuito de validar os modelos matemáticos e avaliar as possíveis alterações na morfologia dos análogos de carne, na massa molecular das proteínas, na composição de aminoácidos totais e na desnaturação proteica. As melhores condições de processamento foram obtidos para os análogos de carne contendo de 12 e 5 % de glúten vital, 58 e 18 % de umidade de condicionamento e 135 e 100 °C para a temperatura de extrusão, para o processo AU e BU, respectivamente. As principais interações proteína-proteína encontradas nos análogos de carne foram as ligações dissulfeto e ligações de hidrogênio para o processo AU e as ligações dissulfeto e interações iônicas para o processo BU. A adição de glúten vital promoveu uma aparência mais lisa e melhor orientação na estrutura das fibras. Verificou-se que ocorreu aumento nas proteínas de baixa massa molecular e diminuição nas proteínas de alta massa molecular. No perfil de aminoácidos totais houve maior variação negativa para os aminoácidos essenciais (triptofano e treonina), semi essenciais (cisteína) e não essenciais (serina), indicando que houve redução no valor nutricional. As estruturas secundárias (a-hélice, ß-folha, ß-volta e a estrutura desordenada) mostraram alteração na sua conformação devido à desnaturação proteica e formação de novos agregados / Abstract: Meat analogue obtained by termoplastic extrusion of vegetable proteins are characterized by its high protein levels and structure similar to meat fibers, which comprises many types of chemical bonds and/or interactions between proteins. The aim of this work was to evaluate the technological and physico-chemical characteristics of meat analogue based on isolated soy protein obtained by thermoplastic extrusion process at high moisture (HM) and low moisture (LM) content. For each moisture condition was used a Central Rotational Composite Design with three independent variables (vital gluten, moisture content and extrusion temperature). The dependent variables evaluated were instrumental texture, instrumental color, water absorption capacity, water solubility index, oil absorption capacity, protein dispersibility index, specific mechanical energy, and the type of protein interactions. These interactions were evaluated using seven specific solvents types: (i) phosphate buffer for proteins in native state; (ii) sodium dodecil sulphate for hydrophobic and ionic interactions; (iii) Triton 100X for hydrophobic interactions; (iv) urea for hydrophobic interactions and hydrogen bonds; (v) ß-mercaptoethanol for dissulfide bonds; and (vi) ß-mercaptoethanol and urea and (vii) sodium dodecil sulphate and urea, for the synergistic effect between the systems. The optimized point (characterized mainly by promoting higher values for L* and water absorption capacity, lower values for water solubility index, oil absoption capacity and protein denaturation and intermediate values for instrumental texture and specific mechanical energy) was processed, together with a control sample for each processes, in order to validate the mathematical models and to evaluate possibles changes in the meat analogues morphology, in the protein molecular weight, in the total amino acid composition, and in the protein denaturation. The best processing conditions were obtained for the meat analogue containing 12 and 5 % of vital gluten, 58 and 18 % of moisture content and 135 and 100 °C of extrusion temperature, for the HM and LM processes, respectively. The main protein-protein interactions found in meat analogues were the dissulfide bonds and hydrogen bonds for the LM process and the dissulfide bonds and ionic interactions for the HM process. The addition of vital gluten promoted a smoother appearance and better orientation in the fiber structure. It was found that occured an increase in the protein with low molecular weight and a reduction in the protein with high molecular weight. There were a greater negative variation for the essential (tryptophan and threonine), semi-essential (cysteine) and nonessential (serine) amino acids in the total amino acid profile, indicating a reduction of the nutritional value. The secondary structure (a-helix, ß-sheet, ß-turn and disordered structure) showed alteration in its conformation due to the protein denaturation and formation of new aggregates / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutor em Tecnologia de Alimentos