A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype

A idade normal para início da puberdade em meninas varia bastante, de 8 a 13 anos, e os genes envolvidos nesse controle são parcialmente conhecidos. Fatores ambientais, como alimentação e exposição a disruptores endócrinos, contribuem para essa variabilidade, de modo que genes modulados epigeneticamente podem justificar parte da complexidade desse processo. O termo epigenética se refere às modificações na expressão gênica que não são causadas por alterações na sequência do DNA. A metilação do DNA é o mecanismo epigenético mais bem estudado. Na última década surgiram evidências demonstrando a relação entre metilação do DNA e desenvolvimento puberal. Em fêmeas de roedores, a hipermetilação do DNA levou à puberdade precoce. Em humanos, a puberdade precoce central (PPC) familial causada por mutações nos genes MKRN3 e DLK1 é considerada um defeito do imprinting, fenômeno epigenético no qual apenas um dos alelos parentais é expresso, estando o outro metilado e inativo. Além disso, um conceito atual propõe que o início da puberdade requer a repressão epigenética de fatores inibidores do eixo gonadotrófico. Recentemente, genes zinc finger (ZNF) foram relacionados ao processo puberal, e muitos deles codificam repressores transcricionais. Neste trabalho, estudamos a metilação do DNA do sangue periférico de 10 pacientes do sexo feminino com PPC familial (casos índices) e 33 meninas com desenvolvimento puberal normal (15 pré-púberes e 18 púberes), usando a plataforma Human Methylation 450 BeadChip. Duas pacientes tinham PPC de causa genética (uma com mutação no MKRN3 e outra com deleção no DLK1) e oito tinham PPC idiopática, sem mutações identificadas pelo sequenciamento exômico global. Cento e vinte regiões diferencialmente metiladas foram identificadas entre as meninas saudáveis pré-púberes e púberes, estando 74% delas no cromossomo X. Apenas uma região mostrou-se hipometilada no grupo púbere e, de maneira importante, contém a região promotora do ZFP57, fator necessário para manutenção do imprinting. Uma vez que a hipermetilação nas regiões promotoras dos genes é relacionada à inibição transcricional, o achado de hipermetilação global do DNA na puberdade sugere que haja inibição de fatores inibidores do eixo gonadotrófico, o que resultaria no início do processo puberal. O receptor estrogênico destacou-se como um fator transcricional que se liga a sete genes diferencialmente metilados entre os controles pré-púberes e púberes. As pacientes com PPC apresentaram mais sítios CpG hipermetilados tanto na comparação com as meninas pré-púberes (81%) quanto púberes (89%). Há doze genes ZNF contendo sítios CpG hipermetilados na PPC. Não foram encontradas anormalidades de metilação nos genes MKRN3 e DLK1 nem em suas regiões regulatórias. Em conclusão, este estudo evidenciou hipermetilação global do DNA em meninas com puberdade normal e precoce, sugerindo que esse padrão é uma marca epigenética da puberdade. Pela primeira vez, mudanças no metiloma de pacientes com PPC foram descritas. Modificações na metilação de vários genes ZNF parecem compor a complexa rede de mecanismos que leva ao início da puberdade humana / Normal puberty initiation varies greatly among girls, from 8 to 13 years, and the genetic basis for its control is partially known. Environmental factors, such as nutrition and exposure to endocrine disruptors, contribute to this variance, and epigenetically modulated genes may justify some of the complexity observed in this process. Epigenetics refers to alterations in gene expression that are not caused by changes in DNA sequence itself. DNA methylation is the best studied epigenetic mechanism. In the last decade, evidence has emerged showing the relationship between DNA methylation and pubertal development. In female mice, DNA hypermethylation led to precocious puberty. In humans, familial central precocious puberty (CPP) caused by mutations in the MKRN3 and DLK1 genes is considered a disorder of imprinting, an epigenetic phenomenon in which only one parental allele is expressed, and the other allele is methylated and inactive. In addition, animal studies indicated that pubertal timing requires epigenetic repression of inhibitory factors of the gonadotrophic axis. Recently, zinc finger genes (ZNF) were related to pubertal development, many of which encode transcriptional repressors. In the present study, we analyzed the DNA methylation of peripheral blood samples from 10 female patients with familial CPP (index cases) and 33 girls with normal pubertal development (15 pre-pubertal and 18 pubertal), using the Human Methylation 450 BeadChip assay. Genetic CPP was diagnosed in two patients (one with a MKRN3 mutation and the other with a DLK1 deletion). The remaining eight cases with idiopathic CPP were previously evaluated by whole exome sequencing and no causative mutations were identified so far. We evidenced 120 differentially methylated regions between pre-pubertal and pubertal healthy girls, and 74% of them were located at the X chromosome. Only one genomic region was hypomethylated in the pubertal group. Of note, it contains the promoter region of ZFP57, an important factor for imprinting maintenance. As DNA hypermethylation in gene promoters is related to gene silencing, the finding of global DNA hypermethylation in puberty suggests inhibition of inhibitory factors of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis that results in puberty onset. Importantly, the estrogen receptor was identified as a transcriptional factor that binds to seven differentially methylated genes associated with pubertal process. Patients with CPP exhibited more hypermethylated CpG sites compared to both pre-pubertal (81%) and pubertal (89%) controls. Twelve ZNF genes were recognized as having hypermethylated CpG sites in CPP. The methylation analyses of MKRN3 and DLK1 genes showed no abnormalities. In conclusion, this study revealed a widespread DNA hypermethylation in girls with normal and precocious puberty, suggesting that this pattern can be an epigenetic signature of puberty. For the first time, changes in the methylome of patients with CPP were described. We highlight that alterations in methylation levels of several ZNF genes may impact the onset of human puberty

Introdução: Na adolescência ocorre importante período de desenvolvimento sexual e acentuado crescimento corporal, caracterizado por alterações na quantidade e distribuição de gordura e massa magra diferente entre os sexos com importante impacto no estado nutricional, tanto atual como futuro. Objetivo: Analisar a associação entre maturação sexual e adiposidade em crianças e adolescentes. Método: Foi realizado estudo longitudinal com 617 estudantes de 8 a 18 anos de idade de duas escolas do município de São Paulo. Foram realizadas três coletas de dados com intervalo de 6 meses.. Dados de peso, estatura, perímetro da cintura foram coletados. O excesso de peso foi classificado com base nos valores críticos do índice de massa corporal (IMC) para crianças e adolescentes brasileiros. Valores de resistência (R), reactância (Xc), ângulo de fase e composição corporal foram obtidos por meio de impedância bioelétrica. O estágio de maturação sexual (EMS) foi auto-avaliado e os indivíduos foram distribuídos em quartis de idade segundo EMS e sexo. Foram comparados os indivíduos com maturação relativamente acelerada com os demais indivíduos. Resultados: Foi observada associação negativa entre escore z do IMC e idade de início da maturação sexual em meninos. A maturação sexual relativamente acelerada se associou com excesso de peso e com maior incremento nos valores de escore z do IMC. Meninas com maturação relativamente acelerada apresentaram maior adiposidade central. A maturação acelerada se associou a R/E, Xc/E e ângulo de fase e quantidade absoluta de massa magra. Menores vetores de impedância foram observados em meninas com maturação acelerada. Conclusão: A maturação sexual acelerada associouse a alterações nos parâmetros bioelétricos, composição corporal, maior incremento no IMC e obesidade em crianças e adolescentes / Adolescence is considered an important period of sexual development and an increase body-growth, characterized by changes in the amount and distribution of fat and lean mass distinct between sexes, with a significant impact on nutritional status, current and future. Objective: To evaluate the association between sexual maturation and adiposity in children and adolescents. Method: We conducted a longitudinal study with 617 students 8-18 years old from two schools in São Paulo. Were performed three data collections at intervals of six months. Data on weight, height, waist circumference were collected. Overweight was classified based on cutoffs of body mass index (BMI) for Brazilian children and adolescents. Resistance (R), reactance (Xc), phase angle (PA) and body composition values were obtained by bioelectrical impedance. The sexual maturation stage (SMS) was self-assessed and subjects were divided into quartiles of age second sex and SMS. We compared the subjects with relatively rapid maturation with other individuals. Results: We observed a negative association between BMI z score and age of onset of sexual maturation in boys. The relatively rapid sexual maturation was associated with overweight and greater increase in the values of z scores of BMI. Girls with relatively rapid maturation had higher central adiposity. The accelerated maturation was associated with R/H, Xc/H and PA and the absolute amount of lean mass. Lower impedance vectors were observed in girls with accelerated maturation. Conclusion: The accelerated sexual maturation was associated with changes in bioelectrical parameters, body composition, greater increase in BMI and obesity in children and adolescents

O mecanismo de controle da secreção de GnRH inclui diversas vias neuronais. Estudos em modelos animais identificaram genes que codificam fatores de transcrição, tais como TTF-1 (thyroid transcription factor 1) e EAP1 (enhanced at puberty), que atuam no controle transcricional de genes codificadores de fatores excitatórios (KiSS1 e GnRH) e inibitórios (preproencefalinas) regulando a secreção de GnRH. Em primatas, a expressão de EAP1 e TTF-1 aumenta, no início da puberdade, nas regiões hipotalâmicas envolvidas na secreção de GnRH. Nos modelos animais, a deleção pós-natal de TTF-1 e o silenciamento do EAP1 provocam atraso puberal e prejuízo na função reprodutiva. TTF-1 também está envolvido na morfogênese diencefálica, por meio da via de sinalização da família Sonic-Hedgehog. Anormalidades na secreção de GnRH resultam em distúrbios puberais, que variam de puberdade precoce central (PPC) a hipogonadismo hipogonadotrófico. Hipotetizamos que anormalidades genéticas no TTF-1 e EAP1 estejam envolvidas na patogênese dos distúrbios puberais centrais. A PPC pode ser idiopática ou devido a causas orgânicas, sendo o hamartoma hipotalâmico, uma malformação congênita não neoplásica, a mais conhecida. Os pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico podem cursar com alterações neurológicas e cognitivas. Nossos objetivos foram: estudar as regiões codificadora do TTF-1 e do EAP1 e a região promotora do TTF-1 em pacientes com distúrbios puberais centrais; estabelecer a prevalência, taxa de penetrância e modo de herança da forma familial de PPC e caracterizar as manifestações neurológicas e neurocognitivas de pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico. Foram selecionados 133 pacientes com distúrbios puberais centrais - PPC idiopática (n=71), PPC devido a hamartoma hipotalâmico (n=15) e hipogonadismo hipogonadotrópico isolado normósmico (HHIn) (n=47) - e controles (n=53). Os genes TTF-1 e EAP1 foram amplificados e submetidos a sequenciamento automático. Os tratos de poliglutamina e polialanina no EAP1 foram estudados por software de análise de tamanho de fragmento (GeneScan). A avaliação neurológica e neurocognitiva dos pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico consistiu de exame neurológico, eletroencefalograma, ressonância magnética de encéfalo e aplicação da escala de inteligência (WISC-III, WAIS-III, WPPSIR). Identificamos 25% de casos familiais de PPC, com modo de herança autossômica dominante e taxa de penetrância de 67,5%. Variantes alélicas no TTF-1 não foram identificadas nos pacientes estudados. No gene EAP1 foram identificadas quatro variantes alélicas sinônimas: p.E87E, p.A163A, p.Y415Y e uma nova variante alélica p.C758C, encontradas em pacientes com PPC e HHIn. A distribuição das frequências alélica e genotípica das variantes alélicas do EAP1 não diferiram entre pacientes com PPC, HHIn e controles (p >0,05). Nas regiões poliglutamina e polialanina 5 distal foi identificada variação similar no número de repetições glutamina e alanina em pacientes e controles. Não houve diferença significativa da frequência alélica em relação ao número de repetições glutamina e alanina entre os grupos PPC e HHIn (p >0,05). A avaliação neurológica dos pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico revelou epilepsia gelástica e crises focais com generalização em 3/15 (20%) pacientes. Não houve diferença significativa entre a mediana do maior diâmetro dos hamartomas dos pacientes com PPC com e sem epilepsia (13 e 10 mm, respectivamente). Quanto à forma, 10 hamartomas eram sésseis e 5 pedunculados, sendo que a forma pedunculada foi detectada exclusivamente em pacientes sem epilepsia. A avaliação neurocognitiva em 11 dos 15 pacientes com PPC devido a hamartoma hipotalâmico detectou 2 pacientes com epilepsia com QI significativamente menor que o grupo sem epilepsia (p <0,05). Em conclusão, (i) a considerável prevalência de casos familiais de PPC reforça a influência dos fatores genéticos na puberdade humana; (ii) mutações germinativas no TTF-1 e no EAP1 não estão envolvidas na patogênese dos distúrbios puberais centrais; (iii) a função neurocognitiva reduzida nos pacientes com hamartoma e epilepsia sugere um efeito deletério das crises convulsivas no sistema nervoso central / GnRH secretion control involves multiple neuronal pathways. Animal studies have identified genes which codifies transcription factors, such as TTF-1 (thyroid transcription factor 1) and EAP1 (enhanced at puberty), that act in the transcriptional control of genes that codifies excitatory (KiSS1 and GnRH) and inhibitory factors (preproenkephalines) regulating GnRH secretion. In nonhuman primates, expression of EAP1 and TTF-1 are increased at the hypothalamic regions involved in GnRH secretion, at the beginning of puberty. In animal models, post-natal TTF-1 deletion and silencing of EAP1 lead to pubertal delay and damage of reproductive function. TTF-1 is also involved in diencephalic morphogenesis, through signalization via Sonic-Hedgehog family. Abnormalities in GnRH secretion are responsible for pubertal disorders, varying from central precocious puberty (CPP) to hypogonadotropic hypogonadism. We hypothesized that genetic anomalies at TTF-1 and EAP1 are involved in the pathogenesis of central pubertal disorders. CPP may be idiopathic or due to organic alterations and hypothalamic hamartoma, a non-neoplasic congenital malformation, is the most frequent known organic cause. Patients with CPP due to hypothalamic hamartoma may have neurological and cognitive disfunctions. Our aims were: to evaluated the codifying region of TTF-1 and EAP1 and the promoter region of TTF-1 in patients with central pubertal disorders; to establish the prevalence, penetrance rate and inheritance mode of familial CPP and to characterize neurologic and neurocognitive aspects of patients with CPP due to hypothalamic hamartoma. We selected 133 patients with central pubertal disorders idiopathic CPP (n=71), CPP due to hypothalamic hamartoma (n=15) and normosmic isolated hypogonadropic hypogonadism (nIHH) (n=47) - and controls (n=53). TTF-1 and EAP1 genes were amplified and sequenced. Polyglutamine and polyalanine tracts of EAP1 were studied by a fragment size analyser software (GeneScan). Neurologic and neurocognitive evaluation of CPP patients due to hypothalamic hamartoma consisted of neurologic exam, electroencephalogram, brain magnetic resonance and application of intelligence scale (WISC-III, WAIS-III, WPPSI-R). We identified 25% of familial CPP cases with autosomal dominant mode of inheritance and penetrance rate of 67.5%. No TTF-1 allelic variants were identified in the patients analysed. At EAP1 gene, four synonimous allelic variants were identified: p.E87E, p.A163A, p.Y415Y and a new allelic variant p.C758C, found in CPP and nIHH patients. The allelic and genotypic distribution of theses variants of EAP1 did not differ among patients with CPP and nIHH, and controls (p >0.05). At polyglutamine and 5 distal polyalanine region, similar glutamine and alanine repeats variation was found. No significative difference of allelic frequency distribution regarding the number of glutamines and alanines repeats was found among the studied groups (p >0.05). Neurologic evaluation of CPP patients due to hypothalamic hamartoma revealed epilepsy and focal crisis with generalization in 3/15 (20%) of the patients. No significant difference between the median of the larger diameter of hypothalamic hamartoma of CPP patients with and without epilepsy was found (10 mm and 13 mm, respectively). Regarding the shape, 10 hamartomas were sessile and 5 pedunculated, and the pedunculated shape was found only in non epileptic patients. Neurocognitive evaluation performed in 11 of the 15 patients with CPP due to hypothalamic hamartoma detected 2 patients with epilepsy whose IQ were significantly lower than the IQ found in the group without epilepsy (p <0.05). In conclusion, (i) the considerable prevalence of familial CPP cases reinforce the influence of genetic factors in human puberty; (ii) germinative mutations in TTF-1 and EAP1 are not involved in the pathogenesis of central pubertal disorders; (iii) reduced neurocognitive function in patients with hypothalamic hamartoma and epilepsy suggests a deleterious effect of crisis at the central nervous system

O ácido gama-aminobutírico (GABA), principal neurotransmissor inibitório, está envolvido no mecanismo intrínseco do início da puberdade. Os efeitos inibitórios do GABA sobre a secreção de GnRH (hormônio hipotalâmico estimulador da secreção das gonadotrofinas) são mediados pelo receptor tipo A (GABAA) que é composto por diferentes subunidades organizadas de forma heteropentamérica. A subunidade a1, codificada pelo gene GABRA1 localizado no locus 5q34-35, é a mais implicada na atividade inibitória do GABA. A puberdade precoce dependente de gonadotrofinas (PPDG) predomina no sexo feminino, sendo na maioria dos casos idiopática. Recentemente, defeitos moleculares das subunidades dos receptores de GABA têm sido identificados em pacientes com anormalidades eletroencefalográficas específicas. Neste estudo, investigamos a presença de mutações funcionais ou polimorfismos do GABRA1 em meninas com a forma idiopática de PPDG e avaliamos as anormalidades EEG neste grupo. Trinta e uma meninas com diagnóstico clínico e hormonal da forma idiopática da PPDG, sendo 6 casos familiais (19,4%) e 25 casos esporádicos (80,6%), e 73 controles não relacionados foram selecionados. Todas as pacientes com PPDG apresentaram ressonância magnética de sistema nervoso central normal. Vinte e três meninas foram submetidas a estudo eletroencefalográfico (EEG). O DNA genômico foi extraído do sangue periférico de todas as pacientes e controles. A região codificadora do GABRA1 foi amplificada utilizando-se oligonucleotídeos intrônicos específicos, seguida por purificação enzimática e seqüenciamento automático. Dois polimorfismos conhecidos do GABRA1 foram também estudados pelo programa GeneScan e pela técnica de digestão enzimática (enzima TaiI). O seqüenciamento automático do GABRA1 não revelou mutações funcionais. Identificamos 7 polimorfismos no GABRA1: duas variantes exônicas 156T>C e 1323G>A, localizados no éxons 4 e 11, respectivamente, e 5 polimorfismos intrônicos - IVS2-712(GT)n, no íntron 2, caracterizado por número variável de repetições GT; IVS3+12A>T, no íntron 3; IVS8+45T>G no íntron 8; IVS9+76T>G no íntron 9 e IVS10+15G>A, no íntron 10. Estes polimorfismos não alteram o uso do sítio de splice original. Não houve diferença estatisticamente significante entre a distribuição genotípica e a freqüência alélica dos 2 polimorfismos exônicos e do polimorfismo IVS2-712(GT) encontrados no grupo de pacientes e no grupo controle. O EEG revelou anormalidades em 6 de 23 meninas (4 sem epilepsia). A distribuição genotípica e a freqüência alélica dos polimorfismos do GABRA1 não difereriram significativamente entre as pacientes com PPDG sem e com anormalidades eletroencefalográficas. Nós concluímos que mutações funcionais ou polimorfismos no GABRA1 não estão envolvidos na etiologia da forma idiopática da PPDG e não estão associadas às anormalidades eletroencefalográficas encontradas. Adicionalmente, a presença de alterações eletroencefalográficas em pacientes com PPDG sem epilepsia sugere que a análise eletroencefalográfica deva ser incluída na investigação da PPDG / The gamma-aminobutyric acid (GABA), a dominant inhibitory neurotransmitter, is involved in the intrinsic mechanism of the onset of the puberty. Their inhibitory effects on the GnRH (hypothalamic gonadotropin release hormone) secretion are mediated by type A receptor (GABAA), composed by different subunits which are organized in a heteropentameric form. The alpha-1 subunit, encode by GABRA1 gene located at locus 5q34- 35, is the most implicated in the inhibitory activity of GABA. The gonadotropin-dependent precocious puberty (GDPP) is predominant in females, being idiopathic in the majority of the cases. Recently, molecular defects of the GABA receptor subunits have been identified in patients with specific electroencephalographic (EEG) abnormalities. In this study, we investigated the presence of functional mutations or polymorphisms of the GABRA1 in girls with the idiopathic form of the GDPP and evaluated EEG abnormalities in this group. Thirty-one girls with clinical and hormonal diagnosis of GDPP idiopathic form, being 6 familial cases (19.4%) and 25 sporadic cases (80.6%), and 73 unrelated controls were selected. All patients with GDPP had normal magnetic resonance of central nervous system. Twenty-three girls were submitted to electroencephalographic study. Genomic DNA was extracted from peripheral blood of all patients and controls. The entire coding region of the GABRA1 was amplified using specific intronic oligonucleotides, followed by enzymatic purification and automatic sequencing. Two known polymorphisms of the GABRA1 were also studied by GeneScan software and digestion with restriction endonuclease TaiI. The automatic sequencing of the GABRA1 did not reveal any functional mutations. We identified 7 polymorphisms in the GABRA1: two silent exonic variants 156T>C e 1323G>A, located at exons 4 e 11, respectively, e 5 polymorphisms - IVS2-712(GT)n, at intron 2, characterized by a variable number of repeat GT; IVS3+12A>T, at intron 3; IVS8+45T>G at intron 8; IVS9+76T>G at intron 9 and IVS10+15G>A, at íntron 10. These polymorphisms did not alter the use of original splicing site. No significant statistical difference of the genotypic distribution and allele frequency of the exonic polymorphisms (156T>C and 1323G>A) and IVS2-712(GT)n between unrelated patients and control group was obtained. Electroencephalographic tracings were abnormal in 6 of 23 girls (4 without epilepsy). No significant statistical difference of the genotype distribution and allele frequence were found between patients without and with EEG abnormalities. We conclude that functional mutations or polymorphisms in the GABRA1 are not involved in the etiology of idiopathic GDPP in this study, and they are not associated with electroencephalografic abnormalities. In addition, EEG abnormalities present in girls with GDPP without epilepsy, suggest that EEG analysis should be included in the investigation of the precocious puberty.

Pubarca precoce (PP), definida como o surgimento de pelos pubianos antes dos oito anos de idade em meninas após exclusão de causas secundárias, tem sido associada a maior prevalência de componentes da síndrome metabólica e desenvolvimento da síndrome dos ovários policísticos (PCOS) na adolescência. Em mulheres com PCOS, foi relatado aumento da massa ventricular esquerda (MVE) e disfunção diastólica, associados à resistência insulínica (RI). Os objetivos dos estudos foram: 1) avaliar a MVE e a função cardíaca sistólica e diastólica através de ecocardiografia em meninas com PP e controles, além de analisar a associação entre os parâmetros cardíacos com androgênios e marcadores de RI; 2) determinar a frequência da PCOS em uma coorte de meninas com PP na pós-menarca e avaliar se existem preditores para o desenvolvimento da PCOS. Variáveis clínicas, hormonais e metabólicas, ecocardiografia e composição corporal foram obtidas em 35 meninas com PP e 35 controles saudáveis pareadas pela idade (artigo 1). Trinta e quatro meninas com mais de dois anos pós-menarca da coorte de PP da Unidade de Endocrinolgia Ginecológica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (UEG/HCPA) foram classificadas em PCOS e não-PCOS e seus dados pré-puberais foram analisados para detectar preditores do desenvolvimento de PCOS e comparados com os de 17 meninas controles saudáveis da mesma idade (artigo 2). Após ajuste para gordura corporal total, a MVE foi maior no grupo PP (97,31 ± 33,37 vs. 81,25 ± 19,06 g, p = 0,017), bem como a onda A’ (5,66 ± 1,34 vs. 5,09 ± 0,98 cm / s, p = 0,025), uma medida da função diastólica. O índice de androgêncios livres (FAI) e gordura corporal total foram preditores independentes de maior MVE e, juntamente com HOMA-IR contribuíram com 72% da variabilidade da MVE no grupo PP (artigo 1). No segundo artigo, 44,1% das meninas com PP foram diagnosticadas com PCOS na pósmenarca. Na pré-puberdade, esse grupo apresentou maior índice de massa corporal (IMC) e HOMA-IR em relação às controles, bem como níveis mais elevados de testosterona, escore de hirsutismo e insulina em jejum quando comparadas às não-PCOS e às controles. O risco para o desenvolvimento de PCOS entre as PPs esteve associado ao IMC z-escore ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; intervalo de confiança 95% [IC] 1.33 – 18.66); escore de Ferriman-Galwey ≥ 4 (OR = 2,7; IC 95% 1,15-5,14); HOMA-IR ≥ 2,42 (OR = 7; IC 95% 1,39-12,0) e volume ovariano ≥ 1,17 mL (OR = 8; IC 95% 1,60-39,9) no período pré-puberal. Em conclusão, meninas com PP apresentaram maior MVE associada aos níveis de androgênios, RI e gordura corporal total. Além disso, foi encontrada alta freqüência de PCOS na coorte de PP da UEG/HCPA. Obesidade, maior escore de hirsutismo, RI e volume ovariano na pré-puberdade foram preditores de desenvolvimento da PCOS na adolescência. / Precocious pubarche (PP) in girls, defined as idiopathic appearance of pubic hair before the age of eight years, has been associated with higher prevalence of components of metabolic syndrome and post pubertal development of polycystic ovary syndrome (PCOS). Increased left ventricular mass (LVM) and diastolic dysfunction have been reported in women with PCOS associated with insulin resistance (IR). The aims of the studies were: 1) to assess LVM and cardiac systolic and diastolic function using echocardiography in girls with PP and controls, and to analyze the relationship between cardiac parameters with androgens and IR; 2) to determine the frequency of PCOS in a cohort of postmenarcheal PP girls and to assess whether possible predictors exist for development of PCOS Clinical, hormonal and metabolic profiles, echocardiography and body composition were examined in 35 PP girls and 35 healthy age-matched controls (article 1). Thirty-four postmenarcheal girls with PP of the Gynecological Endocrinology Unit, Division of Endocrinology of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (GEU/HCPA) clinic cohort were classified as PCOS and non-PCOS and prepubertal data were analyzed to detect PCOS development predictors and compared with data of 17 age-matched controls (article 2). After adjusting for total body fat, LVM was higher in the PP group (97.31 ± 33.37 vs. 81.25 ± 19.06 g, p = 0.017) as well as A’ wave (5.66 ± 1.34 vs. 5.09 ± 0.98 cm/s, p=0.025), a measurement of diastolic function. Free androgen index (FAI) and total body fat were independent predictors of higher LVM, and together with HOMA-IR contributed with 72% of LVM variability in the PP group (article 1). In the second article, fifteen (44.1%) PP girls were classified as PCOS and had higher body mass index standard deviation score (BMI SDS) and HOMA-IR than controls, as well as higher testosterone, hirsutism score and fasting insulin than non-PCOS girls and controls in prepubertal period. The risk for PCOS development among PP girls increased with prepubertal BMI SDS ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; 95% confidence interval [CI] 1.33 – 18.66), Ferriman-Galwey hirsutism score ≥ 4 (OR = 2.7; 95% CI 1.15 - 5.14), HOMA-IR ≥ 2.42 (OR = 7; 95% CI 1.39 - 12.0) and ovarian volume ≥ 1.17 mL (OR= 8; 95 CI 1.60 – 39.9). In conclusion, PP girls had greater LVM associated with higher androgen levels, IR, and total body fat, occurred early in pubertal development. In addition, we found high frequency of PCOS in Southern Brazil PP cohort. Obesity, clinical androgenism, IR and ovarian volume were predictors of development of PCOS later.

A pubarca precoce (PP) é definida como o desenvolvimento de pêlos pubianos antes dos 8 anos de idade em meninas e 9 anos de idade em meninos. Embora a PP não interfira diretamente com os eventos da puberdade, algumas evidências sugerem que estas meninas tenham maior risco para desenvolver, mais tarde, a Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS). A 17ß-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 5 (17ßHSD5) é a principal responsável pela conversão de androstenediona em testosterona. Variações no gene que codifica para essa enzima, em especial os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), podem estar relacionados com hiperandrogenismo e PCOS. A vitamina D, além dos efeitos sobre metabolismo ósseo, parece modular outras ações extra-esqueléticas, incluindo secreção e sensibilidade tecidual à insulina. A Vitamina D vem sendo associada com resistência insulínica e variantes do gene do receptor da vitamina D (VDR), vem sendo estudadas em populações de risco como no diabetes. No entanto, pouco se sabe sobre o envolvimento destes polimorfismos na PP. Os objetivos do presente trabalho foram: Avaliar os níveis de 25-hidroxivitamina D; determinar a frequência dos polimorfismos FokI, BsmI, ApaI e TaqI do gene do VDR e do SNP-71AG do gene da 17ßHSD5; verificar se existe associação entre esses polimorfismos com variáveis antropométricas, metabólicas e hormonais em uma amostra de pacientes com PP e controles do sul do Brasil. Foram arroladas 36 meninas com PP e 197 controles saudáveis. As genotipagens foram realizadas por PCR em tempo real para os SNPs -71AG, BsmI e FokI e por PCR-RFLP para os SNPs ApaI e TaqI. O SNP -71 AG do gene da 17ßHSD5 apresentou distribuição genotípica de 52,4% AA, 39,1% AG e 8,6% GG, sendo a frequência dos alelos A:G de 0,72:0,28. Analisando os dois grupos, verificamos uma maior freqüência do alelo variante (G) no grupo de meninas com PP quando comparadas aos controles (0,37 e 0,26, respectivamente), no entanto sem diferença estatística (p=0,054); não foram verificadas associações do polimorfismo com os dados clínicos e hormonais. As meninas com PP apresentaram níveis séricos de 25(OH)D inferiores aos das meninas controles (18,08±8,32 versus 21,27±7,03; p=0,032). Na análise dos polimorfismos, observou-se que o genótipo polimórfico GG do SNP ApaI TG, apresentou uma frequência maior em PP (30,6%) do que nas controles (16,2%) (Odds Ratio: 2,269; 95% Intervalo de Confiança: 1,015 – 5,076; p=0,042). Este genótipo foi também associado com níveis mais baixos de estradiol (35,30 (14,80 – 50,48) versus 12,22 (6,49 – 23,69); p=0,030) e testosterona total (0,52 (0,39 – 0,84) versus 0,20 (0,11 – 0,47); p=0,009) nas meninas com PP, mas não foi associado com os níveis de 25(OH)D. Por outro lado, verificou-se associação entre a presença dos polimorfismos TaqI TC (genótipo TC+CC) e BsmI GA (genótipo GA+AA) e níveis séricos de 25(OH)D mais elevados no grupo de meninas saudáveis (19,86±7,16 versus 22,55±6,69, p=0,007; 19,53±6,94 versus 22,88±6,76, p=0,001, respectivamente). Em conclusão, os dados deste estudo indicam que: 1) houve maior freqüência do alelo variante G SNP -71 AG do gene da 17βHSD5, com uma associação limítrofe desse alelo com o diagnóstico clínico de PP; 2) o polimorfismo ApaI TG associou-se com PP e parece estar modulando os processos esteroidogênicos nas meninas com PP; 3) houve uma interação entre os polimorfismos TaqI TC e BsmI GA e concentrações circulantes de vitamina D em meninas do sul do Brasil. / Precocious pubarche (PP) is usually defined as the development of pubic hair before the age of 8 in girls and age of 9 in boys. Although the PP does not interfere directly in puberty events, some evidence suggests that these girls have higher risk for the development of Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) at later ages. The Type 5 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase (17ßHSD5) is the principal responsible for the conversion of androstenedione to testosterone. Variations in the gene encoding for this enzyme, especially Single Nucleotide polymorphisms (SNPs), may be related with hyperandrogenism, and PCOS. Besides the effects on bone metabolism, vitamin D appears to modulate other extra-skeletal actions, including secretions and tissue sensitivity to insulin. Vitamin D has been associated with insulin resistance and variants in the vitamin D receptor (VDR) gene, have been studied in populations at risk of Diabetes. However, little is known about these polymorphisms in the PP. The aims of this work were: to evaluate the levels of the 25-hydroxyvitamin D; to determine the polymorphisms FokI, BsmI, ApaI and TaqI in VDR gene and SNP -71AG in 17ßHSD5 gene frequencies; to asses if exist association between this SNPs and anthropometric, metabolic and hormonal characteristics in patients with PP and controls of the southern Brazil. Were enrolled 36 girls with PP and 197 healthy controls. Genotypic analyzes were evaluated by Real Time for the SNPs -71AG, BsmI and FokI and by PCR-RFLP for the ApaI e TaqI polymorphisms. Genotype frequency for SNP -71 AG of the 17ßHSD5 gene was 52.4% AA, 39.1% AG and 8.6% GG, A:G allelic frequency was 0.72:0.28. Analyzing both groups, higher frequency of the variant allele (G) in patient PP than controls (0.37 e 0.26, respectively) was found but without statistical difference (p=0.054); there were no associations between this polymorphism and clinical and hormonal features. PP girls have serum levels of 25(OH)D lower than those from control group (18.08±8.32 versus 21.27±7.03; p=0.032). The polymorphism analyze was observed that genotype GG of the SNP ApaI TG showed a higher frequency in PP (30.6%) than controls (16.2%) (Odds Ratio: 2.269; 95% confidence interval: 1.015 – 5.076; p=0.042). The same genotype was associated with lower estradiol (35.30 (14.80 – 50.48) versus 12.22 (6.49 – 23.69); p=0.030) and total testosterone levels (0.52 (0.39 – 0.84) versus 0.20 (0.11 – 0.47); p=0.009), in girls with PP. There were no association between this polymorphism and serum 25(OH)D. On the other hand, there was association between the presence of the polymorphisms TaqI TC (TC + CC genotype) and BsmI GA (GA + AA genotype) and higher serum 25(OH)D in the group of healthy girls (19.86 ± 7.16 versus 6.69 ± 22:55 , p = 0.007; 19:53 ± 6.94 versus 22.88 ± 6.76, p = 0.001, respectively). In conclusion, data from this study indicate that: 1) there was a higher frequency of the variant allele G of the SNP -71 AG of the 17ßHSD5 gene, with a borderline association of this allele with the clinical diagnosis of PP; 2) ApaI TG polymorphism is associated with PP and seems to modulate the processes steroidogenesis in girls with PP; 3) there was an interaction between the polymorphisms TaqI TC and BsmI GA and vitamin D concentrations in girls from southern Brazil.

Pubarca precoce (PP), definida como o surgimento de pelos pubianos antes dos oito anos de idade em meninas após exclusão de causas secundárias, tem sido associada a maior prevalência de componentes da síndrome metabólica e desenvolvimento da síndrome dos ovários policísticos (PCOS) na adolescência. Em mulheres com PCOS, foi relatado aumento da massa ventricular esquerda (MVE) e disfunção diastólica, associados à resistência insulínica (RI). Os objetivos dos estudos foram: 1) avaliar a MVE e a função cardíaca sistólica e diastólica através de ecocardiografia em meninas com PP e controles, além de analisar a associação entre os parâmetros cardíacos com androgênios e marcadores de RI; 2) determinar a frequência da PCOS em uma coorte de meninas com PP na pós-menarca e avaliar se existem preditores para o desenvolvimento da PCOS. Variáveis clínicas, hormonais e metabólicas, ecocardiografia e composição corporal foram obtidas em 35 meninas com PP e 35 controles saudáveis pareadas pela idade (artigo 1). Trinta e quatro meninas com mais de dois anos pós-menarca da coorte de PP da Unidade de Endocrinolgia Ginecológica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (UEG/HCPA) foram classificadas em PCOS e não-PCOS e seus dados pré-puberais foram analisados para detectar preditores do desenvolvimento de PCOS e comparados com os de 17 meninas controles saudáveis da mesma idade (artigo 2). Após ajuste para gordura corporal total, a MVE foi maior no grupo PP (97,31 ± 33,37 vs. 81,25 ± 19,06 g, p = 0,017), bem como a onda A’ (5,66 ± 1,34 vs. 5,09 ± 0,98 cm / s, p = 0,025), uma medida da função diastólica. O índice de androgêncios livres (FAI) e gordura corporal total foram preditores independentes de maior MVE e, juntamente com HOMA-IR contribuíram com 72% da variabilidade da MVE no grupo PP (artigo 1). No segundo artigo, 44,1% das meninas com PP foram diagnosticadas com PCOS na pósmenarca. Na pré-puberdade, esse grupo apresentou maior índice de massa corporal (IMC) e HOMA-IR em relação às controles, bem como níveis mais elevados de testosterona, escore de hirsutismo e insulina em jejum quando comparadas às não-PCOS e às controles. O risco para o desenvolvimento de PCOS entre as PPs esteve associado ao IMC z-escore ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; intervalo de confiança 95% [IC] 1.33 – 18.66); escore de Ferriman-Galwey ≥ 4 (OR = 2,7; IC 95% 1,15-5,14); HOMA-IR ≥ 2,42 (OR = 7; IC 95% 1,39-12,0) e volume ovariano ≥ 1,17 mL (OR = 8; IC 95% 1,60-39,9) no período pré-puberal. Em conclusão, meninas com PP apresentaram maior MVE associada aos níveis de androgênios, RI e gordura corporal total. Além disso, foi encontrada alta freqüência de PCOS na coorte de PP da UEG/HCPA. Obesidade, maior escore de hirsutismo, RI e volume ovariano na pré-puberdade foram preditores de desenvolvimento da PCOS na adolescência. / Precocious pubarche (PP) in girls, defined as idiopathic appearance of pubic hair before the age of eight years, has been associated with higher prevalence of components of metabolic syndrome and post pubertal development of polycystic ovary syndrome (PCOS). Increased left ventricular mass (LVM) and diastolic dysfunction have been reported in women with PCOS associated with insulin resistance (IR). The aims of the studies were: 1) to assess LVM and cardiac systolic and diastolic function using echocardiography in girls with PP and controls, and to analyze the relationship between cardiac parameters with androgens and IR; 2) to determine the frequency of PCOS in a cohort of postmenarcheal PP girls and to assess whether possible predictors exist for development of PCOS Clinical, hormonal and metabolic profiles, echocardiography and body composition were examined in 35 PP girls and 35 healthy age-matched controls (article 1). Thirty-four postmenarcheal girls with PP of the Gynecological Endocrinology Unit, Division of Endocrinology of Hospital de Clínicas de Porto Alegre (GEU/HCPA) clinic cohort were classified as PCOS and non-PCOS and prepubertal data were analyzed to detect PCOS development predictors and compared with data of 17 age-matched controls (article 2). After adjusting for total body fat, LVM was higher in the PP group (97.31 ± 33.37 vs. 81.25 ± 19.06 g, p = 0.017) as well as A’ wave (5.66 ± 1.34 vs. 5.09 ± 0.98 cm/s, p=0.025), a measurement of diastolic function. Free androgen index (FAI) and total body fat were independent predictors of higher LVM, and together with HOMA-IR contributed with 72% of LVM variability in the PP group (article 1). In the second article, fifteen (44.1%) PP girls were classified as PCOS and had higher body mass index standard deviation score (BMI SDS) and HOMA-IR than controls, as well as higher testosterone, hirsutism score and fasting insulin than non-PCOS girls and controls in prepubertal period. The risk for PCOS development among PP girls increased with prepubertal BMI SDS ≥ 2 (odds ratio [OR] = 4; 95% confidence interval [CI] 1.33 – 18.66), Ferriman-Galwey hirsutism score ≥ 4 (OR = 2.7; 95% CI 1.15 - 5.14), HOMA-IR ≥ 2.42 (OR = 7; 95% CI 1.39 - 12.0) and ovarian volume ≥ 1.17 mL (OR= 8; 95 CI 1.60 – 39.9). In conclusion, PP girls had greater LVM associated with higher androgen levels, IR, and total body fat, occurred early in pubertal development. In addition, we found high frequency of PCOS in Southern Brazil PP cohort. Obesity, clinical androgenism, IR and ovarian volume were predictors of development of PCOS later.

A pubarca precoce (PP) é definida como o desenvolvimento de pêlos pubianos antes dos 8 anos de idade em meninas e 9 anos de idade em meninos. Embora a PP não interfira diretamente com os eventos da puberdade, algumas evidências sugerem que estas meninas tenham maior risco para desenvolver, mais tarde, a Síndrome dos Ovários Policísticos (PCOS). A 17ß-hidroxiesteróide desidrogenase tipo 5 (17ßHSD5) é a principal responsável pela conversão de androstenediona em testosterona. Variações no gene que codifica para essa enzima, em especial os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), podem estar relacionados com hiperandrogenismo e PCOS. A vitamina D, além dos efeitos sobre metabolismo ósseo, parece modular outras ações extra-esqueléticas, incluindo secreção e sensibilidade tecidual à insulina. A Vitamina D vem sendo associada com resistência insulínica e variantes do gene do receptor da vitamina D (VDR), vem sendo estudadas em populações de risco como no diabetes. No entanto, pouco se sabe sobre o envolvimento destes polimorfismos na PP. Os objetivos do presente trabalho foram: Avaliar os níveis de 25-hidroxivitamina D; determinar a frequência dos polimorfismos FokI, BsmI, ApaI e TaqI do gene do VDR e do SNP-71AG do gene da 17ßHSD5; verificar se existe associação entre esses polimorfismos com variáveis antropométricas, metabólicas e hormonais em uma amostra de pacientes com PP e controles do sul do Brasil. Foram arroladas 36 meninas com PP e 197 controles saudáveis. As genotipagens foram realizadas por PCR em tempo real para os SNPs -71AG, BsmI e FokI e por PCR-RFLP para os SNPs ApaI e TaqI. O SNP -71 AG do gene da 17ßHSD5 apresentou distribuição genotípica de 52,4% AA, 39,1% AG e 8,6% GG, sendo a frequência dos alelos A:G de 0,72:0,28. Analisando os dois grupos, verificamos uma maior freqüência do alelo variante (G) no grupo de meninas com PP quando comparadas aos controles (0,37 e 0,26, respectivamente), no entanto sem diferença estatística (p=0,054); não foram verificadas associações do polimorfismo com os dados clínicos e hormonais. As meninas com PP apresentaram níveis séricos de 25(OH)D inferiores aos das meninas controles (18,08±8,32 versus 21,27±7,03; p=0,032). Na análise dos polimorfismos, observou-se que o genótipo polimórfico GG do SNP ApaI TG, apresentou uma frequência maior em PP (30,6%) do que nas controles (16,2%) (Odds Ratio: 2,269; 95% Intervalo de Confiança: 1,015 – 5,076; p=0,042). Este genótipo foi também associado com níveis mais baixos de estradiol (35,30 (14,80 – 50,48) versus 12,22 (6,49 – 23,69); p=0,030) e testosterona total (0,52 (0,39 – 0,84) versus 0,20 (0,11 – 0,47); p=0,009) nas meninas com PP, mas não foi associado com os níveis de 25(OH)D. Por outro lado, verificou-se associação entre a presença dos polimorfismos TaqI TC (genótipo TC+CC) e BsmI GA (genótipo GA+AA) e níveis séricos de 25(OH)D mais elevados no grupo de meninas saudáveis (19,86±7,16 versus 22,55±6,69, p=0,007; 19,53±6,94 versus 22,88±6,76, p=0,001, respectivamente). Em conclusão, os dados deste estudo indicam que: 1) houve maior freqüência do alelo variante G SNP -71 AG do gene da 17βHSD5, com uma associação limítrofe desse alelo com o diagnóstico clínico de PP; 2) o polimorfismo ApaI TG associou-se com PP e parece estar modulando os processos esteroidogênicos nas meninas com PP; 3) houve uma interação entre os polimorfismos TaqI TC e BsmI GA e concentrações circulantes de vitamina D em meninas do sul do Brasil. / Precocious pubarche (PP) is usually defined as the development of pubic hair before the age of 8 in girls and age of 9 in boys. Although the PP does not interfere directly in puberty events, some evidence suggests that these girls have higher risk for the development of Polycystic Ovary Syndrome (PCOS) at later ages. The Type 5 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase (17ßHSD5) is the principal responsible for the conversion of androstenedione to testosterone. Variations in the gene encoding for this enzyme, especially Single Nucleotide polymorphisms (SNPs), may be related with hyperandrogenism, and PCOS. Besides the effects on bone metabolism, vitamin D appears to modulate other extra-skeletal actions, including secretions and tissue sensitivity to insulin. Vitamin D has been associated with insulin resistance and variants in the vitamin D receptor (VDR) gene, have been studied in populations at risk of Diabetes. However, little is known about these polymorphisms in the PP. The aims of this work were: to evaluate the levels of the 25-hydroxyvitamin D; to determine the polymorphisms FokI, BsmI, ApaI and TaqI in VDR gene and SNP -71AG in 17ßHSD5 gene frequencies; to asses if exist association between this SNPs and anthropometric, metabolic and hormonal characteristics in patients with PP and controls of the southern Brazil. Were enrolled 36 girls with PP and 197 healthy controls. Genotypic analyzes were evaluated by Real Time for the SNPs -71AG, BsmI and FokI and by PCR-RFLP for the ApaI e TaqI polymorphisms. Genotype frequency for SNP -71 AG of the 17ßHSD5 gene was 52.4% AA, 39.1% AG and 8.6% GG, A:G allelic frequency was 0.72:0.28. Analyzing both groups, higher frequency of the variant allele (G) in patient PP than controls (0.37 e 0.26, respectively) was found but without statistical difference (p=0.054); there were no associations between this polymorphism and clinical and hormonal features. PP girls have serum levels of 25(OH)D lower than those from control group (18.08±8.32 versus 21.27±7.03; p=0.032). The polymorphism analyze was observed that genotype GG of the SNP ApaI TG showed a higher frequency in PP (30.6%) than controls (16.2%) (Odds Ratio: 2.269; 95% confidence interval: 1.015 – 5.076; p=0.042). The same genotype was associated with lower estradiol (35.30 (14.80 – 50.48) versus 12.22 (6.49 – 23.69); p=0.030) and total testosterone levels (0.52 (0.39 – 0.84) versus 0.20 (0.11 – 0.47); p=0.009), in girls with PP. There were no association between this polymorphism and serum 25(OH)D. On the other hand, there was association between the presence of the polymorphisms TaqI TC (TC + CC genotype) and BsmI GA (GA + AA genotype) and higher serum 25(OH)D in the group of healthy girls (19.86 ± 7.16 versus 6.69 ± 22:55 , p = 0.007; 19:53 ± 6.94 versus 22.88 ± 6.76, p = 0.001, respectively). In conclusion, data from this study indicate that: 1) there was a higher frequency of the variant allele G of the SNP -71 AG of the 17ßHSD5 gene, with a borderline association of this allele with the clinical diagnosis of PP; 2) ApaI TG polymorphism is associated with PP and seems to modulate the processes steroidogenesis in girls with PP; 3) there was an interaction between the polymorphisms TaqI TC and BsmI GA and vitamin D concentrations in girls from southern Brazil.

A puberdade é um processo biológico complexo do desenvolvimento sexual que tem início no final da infância e se caracteriza pela maturação do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal, pelo desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, aceleração do crescimento e finalmente pela capacidade reprodutiva. Nos últimos anos, o peptídeo kisspeptina e seu receptor KISS1R têm sido fortemente envolvidos na regulação da secreção pulsátil do GnRH hipotalâmico e, portanto, com o início da puberdade humana. Mutações nos genes KISS1R e KISS1 foram identificadas em crianças brasileiras com puberdade precoce central (PPC). Estudos em famílias e em irmãs gêmeas estimaram que 50-70% da variação na idade de menarca pode ser hereditária, porém, até pouco tempo atrás, não se tinha conhecimento de variantes genéticas comuns que influenciassem no tempo de puberdade. Recentemente, quatro estudos independentes de associação ampla do genoma estabeleceram que marcadores genéticos próximos ou dentro do gene LIN28B estavam relacionados com a idade da menarca em mulheres normais. Além disso, mutações recessivas no gene lin28 levaram ao desenvolvimento precoce no C. elegans. Camundongos que superexpressam Lin28a apresentaram um retardo no desenvolvimento sexual. Com base nesses achados, investigamos a presença de variantes conhecidas ou novas nos genes KISS1, KISS1R e LIN28B em um grupo de crianças portadoras de PPC idiopática com o intuito de estabelecermos a prevalência dessas mutações na etiologia do desenvolvimento sexual prematuro em humanos. Cento e sete crianças com PPC (101 meninas e 6 meninos) foram selecionados, incluindo casos esporádicos e familiares. A população controle consistiu de 200 indivíduos adultos com história de desenvolvimento puberal normal em idade apropriada. A região promotora e os três exons do gene KISS1, os cinco exons do gene K1SS1R e os quatro exons do gene LIN28B foram amplificados e submetidos à sequenciamento automático. Uma variante em homozigose no gene KISS1, descrita anteriormente por pesquisadores do nosso laboratório, p.H90D, foi identificada em mais três crianças não relacionadas, portadoras de PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 3 do KISS1, levando a substituição de uma histidina por um ácido aspártico na posição 90 da kisspeptina-1 (p.H90D), correspondendo à região amino-terminal da kisspeptina-54 e estava ausente em 200 controles brasileiros. Estudos prévios in vitro com a variante p.H90D não revelaram alterações na capacidade de ligação ou ativação do KISS1R e na resistência a degradação. As mutações ativadoras p.R386P do KISS1R e p.P74S da kisspeptina, previamente descritas em puberdade precoce central, não foram identificadas no estudo atual. Uma nova e rara variante em heterozigose no gene LIN28B, p.H199R, foi identificada em uma menina brasileira com PPC idiopática. Essa variante está localizada no exon 4 do LIN28B, levando a substituição de uma histidina conservada por uma arginina na posição 199 da proteína (p.H199R) e estava ausente em 200 controles brasileiros. O pai da paciente, que apresentou desenvolvimento puberal normal, era portador da mesma variante em heterozigose. Estudos in vitro revelaram que a variante p.H199R não afeta a função de LIN28B na regulação da expressão do miRNA let-7. Outra variante alélica no gene LIN28B foi identificada numa menina com PPC. Essa variante estava localizada no íntron 2 do gene e uma análise computacional demonstrou que ela não altera o sítio de splicing no RNA maduro. Em conclusão, observamos que mutações nos genes KISS1 e KISS1R têm uma baixa prevalência em crianças com puberdade precoce central idiopática. Descrevemos uma nova e rara variante no gene LIN28B (p.H199R) numa menina com puberdade precoce central e os estudos funcionais do LIN28B selvagem ou contendo a variante p.H199R sugeriram que essa variante não está relacionada ao fenótipo de puberdade precoce / Puberty is a complex biological process of sexual development that begins in the late childhood and it is characterized by the maturation of the hipothalamic-pituitary-gonadal axis, secondary sexual characteristics development, growth acceleration and acquisition of the reproductive capacity. Over the last years, the kisspeptin peptide and its receptor KISS1R have been envolved in the regulation of the pulsatile hipothalamic GnRH secretion and consequently with the beginning of the puberty human. Researchers from our laboratory identified mutations in the KISS1R and KISS1 genes in Brazilian children with central precocious puberty (CPP). Studies performed in families and twins estimated that 50%-70% of the variation in the menarce age can be hereditary, however, until last years, we did not have knowledgment of the influence of commun genetic variants in the puberty time. Recently, four independent Genome-Wide Association Studies established that genetic markers near or inside of LIN28B gene were related with the menarce age in normal women. Furthermore, recessive mutations in the LIN28B gene caused a precocious develpment in C. elegans. Interestingly, mouse that overexpress Lin28a exhibited a sexual development delay. Accordingly with these datas investigated the presence of known or new variants in the KISS1, KISS1R and LIN28B genes in a larger cohort of children with CPP to establish the prevalence of these mutations in the etiology of premature sexual development in humans. 107 children with CPP (101 girls and 6 boys) were selected, including sporadic and familial cases. The control population consisted of 200 adults with normal pubertal development. The promoter region and the three exons of KISS1 gene, five exons of KISS1R and four exons of LIN28B were amplified and automatically sequenced. A homozygous variant previously described by researchers from our laboratory in the KISS1 gene, p.H90D, was identified in more 3 no related children with CPP idiophatic. This variant is located in exon 3 of KISS1, resulting in substitution of a histidine to an aspartic acid at position 90 of kisspeptin-1 (p.H90D), in the amino-terminal region of the protein-54 and was absent in 200 Brazilian controls. Previous studies in vitro with the p.H90D variant did not show alterations in the binding or activation capacity and in the resistance to degradation. The activating mutations p.R386P of the KISS1R and p.P74S of the kisspeptin, previously described in central precocious puberty, were not identified in the present study. A new and rare heterozygous variant in the LIN28B gene, p.H199R, was identified in a Brazilian girl with CPP idiophatic. This variant is located in exon 4 of the LIN28B, resulting in substitution of a histidine to an arginine at position 199 of protein (p.H199R) and was absent in 200 Brazilian controls. Her father, which had normal pubertal development, carried the same heterozygous variant. Studies in vitro revealed p.H199R did not affect the function of Lin28B in the regulation of let-7 miRNA expression. Another allelic variant in the LIN28B gene was identified in a girl with CPP. This variant was located in intron 2 of the gene and an in silico analysis showed that it does not change the splicing site in mature RNA. In conclusion, we observed that mutations in the KISS1 and KISS1R genes have a low prevalence in children with idiopathic central precocious puberty. We described a new and rare variant in LIN28B gene (p.H199R) in a girl with central precocious puberty and functional studies of the wild LIN28B or containing p.H199R variant suggested that p.H199R variant of the LIN28B is not related to the precocious puberty phenotype