La transplantation rénale reste le traitement de choix du stade terminal la maladie rénale chronique. Malgré la diminution très significative de l'incidence du rejet aigu à médiation cellulaire (ACR), la survie à long terme des greffons rénaux reste relativement stable probablement à cause de l'augmentation du rejet à médiation humorale. Dans cette thèse, nous avons exploré deux objectifs de l'analyse moléculaire au cours de la transplantation rénale dont les biomarqueurs font partie intégrante : la prédiction de l'épisode de rejet aigu avant même l'apparition des lésions histologiques et l'amélioration de nos connaissances sur la physiopathologie des mécanismes immunologiques afin de pouvoir adapter le mieux possible le traitement immunosuppresseur.Dans un premier travail clinique préliminaire à la recherche de biomarqueurs, nous avons analysé dans une cohorte rétrospective de 87 patients, les facteurs de risque indépendants de perte du greffon rénal après un épisode de rejet aigu à médiation humorale (AMR) C4d positif. L'analyse par régression de Cox a retrouvé deux deux facteurs de risque : le niveau initial de dégradation de la fonction du greffon rénal et la présence concomittante d'un rejet aigu à médiation cellulaire. Dans un deuxième travail, nous avons exploré la possibilité d'utiliser des biomarqueurs non invasifs plutôt que la biopsie du greffon rénal chez des patients avec dysfonction aigue du greffon, situation à risque de dysfonction chronqiue du greffon rénal. Nous avons mesuré le niveau d'expression urinaire de 26 ARN messagers préselectionnés chez 84 transplantés rénaux avec dysfonction aigue du greffon, 32 nécrose tubulaire aigue, 26 ACR et 26 AMR Puis par une analyse discriminante suivie d'une validation croisée, nous avons découvert et validé une combinaison linéaire de six ARNm CD3e, CD105, TLR4, CD14, le facteur B du complément et la vimentine différentiant efficacement le rejet aigu de la nécrose tubulaire aigue. Cette combinaison linéaire permet d'épargner un nombre significatif de biopsies du greffon non indispensables. Puis, par la même technique, nous avons découvert et validé une nouvelle combinaison linéaire d'ARNm CD3e, CD105, CD14, CD46, et l'ARNr 18S pouvant différentier efficacement l'ACR de l'AMR. A l'avenir ces signatures pourraient diminuer le recours à la réalisation d'une biopsie du greffon puis une aide au diagnostic précoce des épisodes de rejets aigus. Dans un troisième travail, nous avons analysé le phénotype lymphocytaire B de patients transplantés rénaux traités par anticalcineurines (CNI) (N=12) et belatacept (N=13), immunosuppresseur inhibiteur de la costimulation. Les patients traités par belatacept ont une meilleure survie à long terme que ceux traités par CNI. Chez les patients traités par belatacept, nous avons retrouvé un phénotype B particulier avec une augmentation significative des lymphocytes B et des lymphocytes B transitionnels CD19+ CD24hi CD38hi et CD19+ IgDhi CD38hi CD27 potentiellement régulateurs par rapport aux patients traités par CNI. Le niveau d'expression de l'ARNm de BAFF et de BAFF-R dans les PBMCs était significativement plus bas chez les patients traités par belatacept. Nos résultats pourraient expliquer en partie les meileurs résultats cliniques observés chez les patients traités par belatacept après transplantation rénale.En conclusion, au cours de cette thèse, nous avons évalué l'intérêt des biomarqueurs, dans deux domaines, la recherche de facteurs pronostiques et diagnostiques du rejet aigu à médiation humorale par l'analyse d'une cohorte clinique et du transcriptome urinaire d'une partie de cette cohorte et l'analyse des mécanismes physiopathologiques au cours de la tolérance induite par le belatacept. Nos résultats méritent d'être confirmés dans des cohortes indépendantes de patients avant leur utilisation en pratique clinique courante et l'évaluation de leur impact sur la survie des greffons rénaux. / Kidney transplantation remains the best treatment in advanced chronic kidney disease. Acute T-cell mediated rejection (ACR) decreased significantly but long-term kidney allograft survival did not increase significantly these last ten years. Antibody-mediated rejection is probably the main part of the problem. In this work, we explored two ways of the molecular analysis of kidney transplant, including biomarkers: prediction of rejection and study of the mechanisms of immunosuppressiv agents within kidney transplantation.The first one, a preliminary clinical work, identified in a retrospective cohort of 87 for-cause biopsies with C4d positive acute antibody-mediated rejection (AMR) independant risk factors for renal allograft failure after the AMR. The Cox regression analysis identified that concurrent ACR and estimated glomerular filtration rate are independent risk factors for allograft loss. The second one explored how noninvasive tests to differentiate the basis for acute dysfunction of the kidney allograft could replace invasive allograft biopsy. We measured absolute levels of 26 prespecified mRNAs in urine samples collected from kidney graft recipients at the time of for-cause biopsy for acute allograft dysfunction. We profiled 52 urine samples from 52 patients with biopsy specimens indicating acute rejection (26 ACR and 26 AMR) and 32 urine samples from 32 patients with acute tubular injury (ATI) without acute rejection. A stepwise quadratic discriminant analysis ofmRNA measures identified a linear combination ofmRNAs for CD3e, CD105, TLR4, CD14, complement factor B, and vimentin that distinguishes acute rejection from ATI; 10-fold cross-validation of the six-gene signature yielded an estimate of the area under the curve of 0.92 (95% CI, 0.86 to 0.98). In a decision analysis, the sixgene signature yielded the highest net benefit across a range of reasonable threshold probabilities for biopsy. Next, among patients diagnosed with acute rejection, a similar statistical approach identified a linear combination ofmRNAs for CD3e, CD105, CD14, CD46, and 18S rRNA that distinguishes ACR from AMR, with a cross-validated estimate of the area under the curve of 0.81 (95% CI, 0.68 to 0.93). Incorporation of these urinary cell mRNA signatures in clinical decisions may reduce the number of biopsies in patients with acute dysfunction of the kidney allograft. In the third one, we analyzed B cell phenotype in kidney transplant recipients treated with the costimulation blocker belatacept and compared them to recipients treated with calcineurin inhibitors (CNI). Phase III clinical studies have shown that patients kidney treated belatacept exhibited a better renal allograft function and lower donor-specific anti-HLA immunization when compared to recipients treated with CNI. Thirteen patients treated with belatacept and 12 with CNI were phenotyped. In belatacept group, the frequency and absolute number of transitional B cells as defined by both phenotypes: CD19+ CD24hi CD38hi and CD19+ IgDhi CD38hi CD27-, as well as naïve B cells were significantly higher compared with CNI group. B cell activating factor (BAFF) and BAFF receptor mRNA levels were significantly lower in belatacept group than in CNI group. These results show for the first time that belatacept influences B cell compartment by favoring the occurrence of transitional B cells with potential regulatory properties, as described in operational tolerant patients. This role may explain the lower alloimmunization rate observed in belatacept-treated patients.To conclude, we evaluated biomarkers analysis within two ways, acute antibody-mediated rejection prognosis and diagnosis with a clinical cohort and urinary transcriptomic analysis and mechanisms of action of belatacept induced tolerance. Our results need to be validated in an independent cohort before to be integrated in clinical decision and evaluation of their impact on long term graft survival.

Chez le xénope, le pronéphros constitue le rein fonctionnel du têtard. Le sang est filtré par le glomus et l'urine est modifiée lors de son transit dans le tubule. Au cours de ma thèse, nous avons analysé l'expression des quatre membres de la famille pou3f au cours du développement embryonnaire chez le xénope. Nous avons montré que leur expression neurale, otique ou encore épidermique est conservée entre le xénope et la souris, de même que l'expression rénale de pou3f3. Nous avons également mis en évidence une expression pronéphrique de pou3f4. Nous avons ensuite analysé le rôle de Pou3f4 au cours du développement du pronéphros. La perte de fonction de Pou3f4 entraine des défauts de différenciation terminale du tubule intermédiaire et distal. Sa surexpression aboutit au contraire à une augmentation de l'expression des marqueurs de différenciation slc12a1 et clcnkb1. Les morphants Pou3f4 présentent aussi des défauts de morphogenèse du tubule intermédiaire caractérisés par des circonvolutions réduites. Nos résultats montrent que Pou3f4 contrôle l'expression de l'ephrine efnA3 dans le tubule pronéphrique. La perte de fonction d'EfnA3 conduit à des défauts de morphogenèse du tubule, suggérant que Pou3f4, par la régulation de l'expression d'efnA3, est impliqué dans les mouvements cellulaires nécessaires à l'élongation antérieure du tubule. Enfin, nous avons observé que pou3f3 et pou3f4 ne se régulent pas l'un de l'autre. Nous avons en revanche mis en évidence une redondance fonctionnelle de ces gènes dans la morphogenèse et la différenciation du tubule puisque la perte de fonction combinée de Pou3f3 et Pou3f4 entraine un phénotype plus sévère que chaque simple perte de fonction. / In Xenopus, pronephros is the functional kidney at tadpole stage. The blood is filtrated by the glomus and the urine is modifed all along the tubule. Pou3f3 is required for intermediate and distal tubule formation in mouse. During my PhD, we have analyzed the expression of the four pou3f genes during Xenopus embryonic development. We found that neural, otic, or epidermic expression of the various pou3f genes is conserved between Xenopus and mouse. Pou3f3 expression in the pronephros is similar to that observed in mouse. We futher showed for the first time pou3f4 expression in the developping kidney. Then, we analyzed the role of Pou3f4 during pronephros development. Pou3f4 depletion inhibits the expression of terminal differentiation marker genes in the intermediate and distal tubule. Pou3f4 upregulates the expression of slc12a1 and clcnkb1 in the tubule. Moreoer, we found that Pou3f4 loss of function leads to intermediate tubule morphogenesis defects. While ephrin signaling pathway is largely described as playing crucial role in cellular movement, Pou3f4 controls efnA3 expression in the intermediate and distal tubule. EfnA3 depletion phenocopies Pou3f4 loss of function, suggesting that Pou3f4, by regulationg efnA3 expression, is implicated in cell movements necessary for anterior elongation of the tubule. Finally, we find that pou3f3 and pou3f4 do not regulate each other expression. However, they act redundantly in pronephros development since the combined Pou3f3 and Pou3f4 loss of function results in a more severe phenotype than each loss of function alone.

Objectif: Environ 30% des patients ayant un cancer du rein métastatique présentent d’emblée des résistances aux agents de thérapie ciblée. Les autres patients développent des résistances thérapeutiques à plus long terme. Une amélioration de la capacité du clinicien à prédire la réponse thérapeutique avant l’initiation du traitement pourrait améliorer le pronostic des patients. Le but de notre projet a été de développer un modèle de xénogreffes dérivées de patients afin d’évaluer la sensibilité des cellules tumorales de chaque patient aux différents agents de thérapie ciblée, avant d’initier un traitement.Méthodes: La membrane chorio-allantoïque de l’embryon de poulet a servi de base à notre modèle. Dans une première phase de notre travail, une xénogreffe de cellules tumorales rénales humaines en suspension a été réalisée afin de vérifier que les caractéristiques histologiques et phénotypiques des tumeurs d’origine étaient conservées dans les xénogreffes réalisées sur notre modèle. Dans une seconde étape, des fragments tissulaires de tumeurs rénales de 5 patients opérés pour néphrectomie cytoréductive dans notre centre hospitalier étaient prélevés et greffés sur notre modèle (>60/patient). Différents agents dethérapie ciblée étaient testés sur les xénogreffes ainsi réalisées.Résultats : Les caractéristiques histo-pathologiques et phénotypiques des tumeurs rénales d’origine étaient conservées après xénogreffes. Il existait une hétérogénéité spatiale intra-tumorale en termes de sensibilité aux différents agents de thérapie ciblée. Il existait également un polymorphisme nucléotidique au sein des différentes régions de chaque tumeur rénale.Conclusion : Ce modèle de xénogreffes rénales dérivées de patients est utile pour l’évaluation de la sensibilité aux agents de thérapie ciblée des cellules tumorales en amont de la prise en charge thérapeutique. Ce modèle permet au clinicien de personnaliser le traitement de chaque patient ayant un cancer du rein métastatique, avant la mise en route d’un traitement systémique. Une évaluation prospective de notre modèle pourrait permettre de mieux appréhender les potentielles retombées cliniques liées à son utilisation. / Objective: Approximately 30% of patients with metastatic renal cancer are resistant to targeted therapy agents. The other patients will eventually develop long-term therapeutic resistances. An improvement in the clinician's ability to predict therapeutic response before treatment initiation could improve patients' prognosis. The aim of our projet was to develop a patient-derived xenograft models to be able to test the sensibility of each patient's renal tumor cells to the different available targeted therapy agent prior to treatment.Methods: The chicken embryo chorioallantoic membrane has been the base of our model. In a first phase of our work, a xenograft of human kidney tumor cells has been carried out in order to verify that the histologic and phenotypic characteristics of the original tumors were preserved in the xenografts performed on our model. As a second step, fragments of the kidney tumor speciments of 5 patients undergoing cytoreductive nephrectomy in our hospital center were grafted on our model (> 60/patient). Different targeted therapy agents were tested on the xenografts we performed.Results: The histopathologic and phenotypic characteristics of the original renal tumors were preserved in our xenografts. There was intra-tumor spatial heterogeneity in terms of sensitivity in different targeted therapy agents. There was also a nucleotide polymorphism within the different regions of each renal tumor.Conclusion: This patient-derived renal xenograft model could be useful prior to treatment for the evaluation of each patients'renal tumor cells to the different available targeted therapy agents. This model could make it possible to personalize the treatment of each metastatic kidney cancer patient, prior to systemic treatment. A prospective evaluation of our model could help assess the potential clinical benefits of its use.

La NIgA primaire est la plus fréquente des glomérulonéphrites. Elle représente, selon l'origine géographique et ethnique des populations, 10 à 40% des glomérulonéphrites primitives. Le diagnostic de NIgA est fait nécessairement sur la ponction biopsie rénale (PBR) en immunofluorescence. La grande difficulté dans cette maladie se trouve dans la prédiction au moment du diagnostic par les facteurs pronostiques de l'évolution vers l'insuffisance rénale chronique terminale à 10 et 20 ans après le début de la maladie. L'hypertension artérielle, la protéinurie ≥l g/24 h et la sévérité des lésions histologiques sur la biopsie rénale sont les facteurs de risque majeurs qui permettent la prédiction initiale. Objectifs de l'étude : confirmer et valider dans notre cohorte de NIgA les 3 facteurs de risque (FdR) comme facteurs significatifs et indépendants prédictifs d'une évolution ultérieure vers la Dialyse ou le Décès (avant dialyse) et utiliser ces 3 FdR pour développer un modèle simple de Risque Rénal Absolu (RRA) dont le score évalué au moment du diagnostic permettrait une prédiction du devenir à long terme (10 et 20 ans). Notre cohorte de patients (332) avec NIgA a été recrutée par le Service de Néphrologie, Dialyse, et Transplantation Rénale du CHU de Saint Etienne à l'Hôpital Nord (IGAN-STET-CO). La cohorte est prospective et inclut tous les patients avec diagnostic de Néphropathie à IgA primaire dont la biopsie rénale diagnostique a été réalisée entre le 1er janvier 1990 et le 31 décembre 1999. Le diagnostic histologique de NIgA est défini par la présence de dépôts mésangiaux d'IgA, d'intensité au moins 1+ comme immunoglobuline dominante ou codominante en immunofluorescence. L'intervalle de temps entre le début la maladie et la PBR diagnostique a été de : moyenne (déviation standard, DS) = 5.7 (8.5) ans et médiane (extrêmes) = 2.5 (0.1-46.9) ans. La durée totale d'exposition au risque principal entre le début de NIgA et le dernier recul ou le l'évènement principal était: moyenne (DS) = 12.9 (9.5) ans et médiane (extrêmes) = 11.3 (0.l-56.0) ans; chez 44 patients cette durée d'exposition était supérieure à 20 ans (l3.3%). La progression de la NIgA a été basée sur l'apparition de deux évènements : l'évènement principal (primary end-point) était la dialyse (Di; correspondant à la mort rénale avec un DFG de stade V autour de 8 ml/mn/1.73m2S) ou le décès du patient (De; s'il survenait avant le début de la dialyse), et représenté par Di/De ou plus simplement par D/D; l'évènement secondaire (secondary end-point) était la survenue d'un DFGe<60 ml/mn/1.73m2S marquant le début de l'IRC et correspondant à l'entrée dans le stade III de la maladie rénale chronique (MRC-3+). Les facteurs de risque majeurs étudiés dans cette étude sont l'hypertension artérielle (supérieure à 140/90 mmHg), la protéinurie (≥1g/24 h), et le score optique global (GOS ≥8). Le risque rénal absolu (RRA) de dialyse/décès (D/D) a été calculé à partir de ces trois facteurs simplifiés et dichotomiques après avoir confirmé leur caractère indépendant (les uns des autres) et que leur poids spécifique dans cette prédiction était quantitativement très similaire. 0 pour aucun de ces FdR, 3 pour leur présence simultanée et un score intermédiaire de 1 ou de 2 pour la présence de 1 ou 2 parmi ces 3 facteurs. Ce RRA a été utilisé comme une variable qualitative avec 4 catégories. Nous avons utilisé les courbes de survie sans l'évènement étudié selon Kaplan-Meier (KM) et la méthode de régression de Cox qui permet d'étudier l'influence d'une variable sur la survie sans l'évènement et permet ainsi d'isoler des facteurs pronostiques. Le DFG estimé au moment du diagnostic est de: moyenne(DS) = 74.7 (28.3) et médiane = 80 ml/mn/1.73m2S contre au dernier recul: moyenne (DS) = 68.0 (3 l .3) et médiane = 72.5 avec un P très significatif. La répartition des patients selon le RRA était la suivante: 151 patients (45,5%) avec un score de 0, 69 (20,8%) avec un score de 1,65 (19,6%) avec un score de 2, et 47 patients (14,2%) avec un score de 3. Le taux d'incidence cumulative de D/D, respectivement à 10 ans et 20 ans, a été de 2% (81 à risque) et 4% (15 à risque) pour RRA = 0,2% (38 à risque) et 9% (12 à risque) pour RRA = 1,7% (42 à risque) et 18% (9 à risque) pour RRA = 2, et 29% (27 à risque) et 64% (8 à risque) pour RRA = 3 (test du Logrank global; Chi2 = 62,1; P <0,0001). Les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier ont montré une meilleure survie avec un contrôle effectif de l'HTA. Le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et à 20 ans était respectivement, pour le groupe non hypertendu de 4% (84 patients à risque) et 5% (17 patients à risque); pour le groupe des patients avec HTA contrôlée de 1% (54 patients à risque) et 19% (14 patients à risque), et pour le groupe des hypertendus non- contrôlés de 19% (50 patients à risque) et 42% (13 patients à risque) avec une différence significative entre les groupes des non hypertendus et des hypertendus contrôlés avec le groupe des hypertendus non contrôlés (P <0,0001). Pour la protéinurie, les courbes de survie des patients sans D/D, selon Kaplan-Meier, ont montré une amélioration significative (p<0,0001) en cas de réduction effective de la protéinurie. Ainsi, le taux d'incidence cumulée pour dialyse/décès à 10 et 20 ans était de 3% (118 à risque) et 5% (25 à risque) pour le groupe avec protéinurie faible/absente, 2% (40 à risque) et 2% (10 à risque) pour le groupe avec " protéinurie réduite", et 29% (30 à risque) et 67% (9 à risque) pour le groupe avec protéinurie non-réduite. Le contrôle des lésions histologiques graves est difficile à estimer à partir de notre cohorte en l'absence de biopsies répétées. Notre score de Risque Rénal Absolu est basé sur trois facteurs de risque majeurs, indépendants et simplifiés prédictifs de la progression vers la MRC-3+, puis vers la dialyse/décès. Ces FdR avaient finalement un poids identique dans cette prédiction à long terme, comme en témoignent : - une valeur de β/SE comprise entre 4 et 5 dans l'analyse monofactorielle et entre 2 et 3 dans l'analyse multifactorielle de Cox, - ainsi que des paramètres d'exactitude quasi similaires: même valeur prédictive négative autour de 0,95 et même valeur prédictive positive autour de 0,30; de même la probabilité de survenue de dialyse/décès était d'environ 31% en leur présence, mais seulement de 3 à 6% en leur absence. Au moment du diagnostic, 47 patients présentaient les 3 FdR ensemble (RRA = 3) et 28 (60%) sont arrivés en dialyse ou sont décédés. La probabilité de l'évolution à long terme vers la dialyse/décès était de 60% chez les patients avec RRA = 3 contre seulement 6% chez les patients avec RRA =0. Nous sommes les premiers à publier sur le Risque Rénale Absolu de dialyse e/o de décès et de proposer un score global avec une application clinique importante. L'utilisation de ce score RRA, nous permet de prédire à 10 et 20 ans après le début de la maladie, le taux d'incidence cumulative de dialyse/décès en retenant les chiffres arrondis à 20ans de 5% si RRA=0, de 10% si RRA=1, de 20% si RRA= 2, et de 60% si RRA=3, et cela dans une population activement traitée. Notre RRA est très simple à calculer par une simple addition des FdR présents au diagnostic, ne nécessite pas de calcul et s'affranchit des autres facteurs de risque (cliniques, biologiques, pathologiques et génétiques) décrits chez les patients avec NIgA comme le sexe ou l'âge du patient au moment de la biopsie ou l'indice de masse corporelle, IMC . Le point important est que l'utilisation du RRA, permettrait de bien sélectionner les patients à inclure dans des essais randomisés et contrôlés L'autre avantage sera dans les études génétiques de démontrer l'impact d'un génotype / allèle spécifique lié à la progression de la maladie en montrant une augmentation pas à pas de la fréquence du génotype/allèle dans les sous- groupes de RRA= 0 à RRA=3

La thérapie antirétrovirale (TAR) n'éradique pas le VIH de l'organisme. Le VIH persiste grâce à la prolifération de lymphocytes T CD4+ infectés de manière latente. De plus, bien que la plupart des provirus persistent sous une forme latente, un petit nombre de cellules infectées produisent des protéines virales et des virions. Les immunosuppresseurs administrés aux personnes subissant une greffe de rein, pour prévenir le rejet d’organe, inhibent la prolifération des lymphocytes T et l'activation immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que les immunosuppresseurs pourraient réduire à la fois la taille du réservoir viral latent ainsi que les marqueurs associés à la production résiduelle de VIH. Sept participants vivant avec le VIH sous TAR efficace et ayant subi une transplantation rénale suivie de la prise d’un traitement immunosuppresseur ont été recrutés. Des échantillons sanguins longitudinaux ont été prélevés avant et après la greffe (6-7 échantillons/participant, sur 2 ans). Les effets des immunosuppresseurs sur l'activation des lymphocytes T ainsi que les taux d’anticorps plasmatiques dirigés contre l'enveloppe du VIH (un reflet de la production virale résiduelle) ont été évalués par cytométrie en flux et ELISA, respectivement. L'ADN total du VIH et les transcrits d'ARN-gag-LTR associés aux cellules ont été quantifiés par qPCR et la fréquence des cellules p24+ par HIV-Flow. Pour confirmer les résultats obtenus in vivo, nous avons optimisé un protocole de culture cellulaire pour évaluer l'impact des immunosuppresseurs les plus fréquemment utilisés (MMF, tacrolimus, dasatinib) sur les cellules infectées dans un environnement contrôlé. Suite à la transplantation et à l’initiation du traitement immunosuppresseur, nous avons observé une diminution significative des niveaux d'expression des marqueurs d’activation et de prolifération HLA-DR et Ki67 dans les lymphocytes T CD4+, accompagnée d'une augmentation de la fréquence des cellules mémoires centrales et d'une forte diminution de la fréquence des lymphocytes T régulateurs. Les niveaux d'anticorps ciblant l'enveloppe du VIH ont également diminué pendant le traitement immunosuppresseur. Il y avait une diminution modeste et transitoire des niveaux d'ADN et d'ARN du VIH un mois après la transplantation rénale. Les résultats de HIV-Flow n'ont montré aucun impact significatif des immunosuppresseurs sur le réservoir inductible, avec de grandes variations entre les participants. Le modèle de culture cellulaire in vitro a révélé que de faibles doses d'immunosuppresseurs induisent généralement une diminution des marqueurs du VIH, alors que des doses plus élevées conduisent à des variations dépendantes des donneurs. Ainsi, nos résultats montrent que les traitements immunosuppresseurs diminuent la prolifération et l'activation des lymphocytes T CD4+, ce qui est concomitant avec une diminution modeste et transitoire des taux d'ADN et d'ARN du VIH. Nos résultats indiquent que la combinaison des traitements immunosuppresseurs actuels sont toutefois insuffisants pour affecter profondément et durablement le réservoir du VIH et suggèrent que la taille du réservoir est étroitement régulée par des forces homéostatiques difficiles à contrer. / Antiretroviral therapy (ART) does not eradicate HIV from the body. HIV persists through proliferation of latently infected CD4+T-cells. Moreover, although most proviruses persist in a latent form, a small number of infected cells produce viral protein and virions. Immunosuppressants given to people undergoing kidney transplants to prevent rejection inhibit T-cell proliferation and immune activation. We hypothesized that immunosuppressants could reduce both the size of the latent viral reservoir as well as markers associated with residual production of HIV. Seven participants living with HIV on suppressive ART who underwent kidney transplantation and initiated immunosuppressive therapy were enrolled. Longitudinal blood samples were collected before and after the transplant (6-7 samples/participant, over 2years). The effects of immunosuppressants on T-cell activation as well as plasma HIV-envelope antibody responses (a surrogate of residual viral production) were assessed by flow cytometry and ELISA, respectively. Total HIV-DNA and cell-associated LTR-gag-RNA transcripts were quantified by qPCR and the frequency of p24+ cells by HIV-Flow in isolated CD4+T-cells. To confirm the results saw in vivo, we optimized a cell culture protocol to assess the impact of frequently given immunosuppressants (tacrolimus, MMF and dasatinib) on infected cells in a controlled environment. Following organ transplant and initiation of immunosuppressive treatment, we observed a significant decrease in the expression levels of HLA-DR and Ki67 in CD4+T-cells, which was accompanied by an increase in the frequency of central memory cells and a sharp decrease in the frequency of regulatory T-cells. Antibody levels targeting HIV envelope also decreased during immunosuppressive therapy. There was a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels one month following kidney transplantation. HIV-Flow results showed no significant impact of immunosuppressants on the inducible reservoir, with large variations between participants. The in vitro cell culture model showed that low doses of immunosuppressants generally induces a reduction in HIV markers, but higher doses lead to variations between donors. Immunosuppressive therapy decreases the proliferation and activation of CD4+ T-cells which is concomitant with a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels. Our results indicate that current immunosuppressive drugs are insufficient to profoundly and durably affect the HIV reservoir and suggest that the size of the reservoir is tightly regulated by homeostatic forces that are difficult to counteract.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les patients en état critique nécessitant une ventilation artificielle sont particulièrement exposés au risque d'une agression rénale ischémique. L'apparition d'une insuffisance rénale aiguë (IRA) dans ce contexte est responsable d'une surmortalité. L'objectif de ce travail était l'optimisation de la prévention de l'IRA incluant deux axes de recherche. D'une part l'évaluation de mesures de protection rénale visant au maintien de la délivrance rénale en oxygène et d'autre part l'étude de la performance des outils d'évaluation de la fonction rénale pour la détection et la caractérisation d'une agression.La principale mesure de prévention de l'IRA proposée en pratique clinique pour la restauration et le maintien d'une perfusion rénale est l'expansion volémique mais avec un risque d'altération de la fonction pulmonaire. Nos travaux ont permis de montrer que le pronostic rénal au cours de la réanimation liquidienne dépend du type de soluté administré. L'incidence de l'IRA est plus élevée lorsque des colloïdes à base d'hydroxyéthylamidons et/ou ayant un pouvoir oncotique élevé sont utilisés. Contrairement au rein, l'évolution de la fonction respiratoire ne dépend pas de l'effet oncotique du soluté utilisé mais des volumes administrés. La degradation de la fonction respiratoire semble survenir pour un volume moindre de colloïdes que de cristalloïdes, sans doute du fait d'une efficacité plus importante sur l'augmentation du volume intravasculaire.Associé à la restauration de la perfusion rénale, le maintien de l'oxygénation artérielle est un autre déterminant potentiel de l'oxygénation rénale. Nous avons évalué la réponse rénale à une hypoxémie modérée, habituelle au cours du syndrome de détresse respiratoire aiguë. Une baisse de la FiO2 est en effet recommandée pour la prévention des lésions pulmonaires induites par l'oxygène. Une ventilation de 2 heures à un niveau de SaO2 entre 88 et 92% engendre une réponse diurétique et une augmentation des résistances artérielles rénales mesurées par la méthode Doppler. Cette réponse rénale est indépendante des modifications ventilatoires et hémodynamiques, elle est rapidement réversible avec la réoxygénation. En plus de sa capacité à détecter une modification de la vascularisation rénale, nous avons retrouvé que la mesure de l'index de résistance prédisait de façon satisfaisante la persistance d'une IRA, performance meilleure que celle de certains indices biochimiques urinaires habituellement recommandés.Ces différents travaux ont permis de mieux appréhender les interactions physiopathologiques entre la prévention des dysfonctions rénale et pulmonaire et soulignent les antagonismes qui peuvent exister entre ces deux organes. La réanimation liquidienne peut être optimisée par le choix d'un soluté hypo-oncotique pour réduire le risque d'IRA sans altérer la fonction respiratoire. La réponse rénale à une hypoxémie modérée suggère que la préservation de l'oxygénation artérielle puisse avoir un rôle dans la préservation de la fonction rénale. Enfin, le Doppler rénal est un outil prometteur pour la sélection, l'évaluation et l'optimisation des mesures de protection rénales. / Critically ill patients needing mechanical ventilation are particularly exposed to ischemic renal injury leading for acute kidney injury (AKI) occurrence is associated and poor outcome. The aim of this work was to optimize AKI prevention. We evaluated protective measures for renal oxygen delivery on one hand and the performance of usual tools for the detection and characterization of renal injury on the other hand.The main measure in preventing AKI is the correction and the preservation of blood volume; fluid resuscitation is, however, associated with an increased risk of pulmonary oedema. Our results show that renal outcome depends on the type of fluid used with an increased risk of AKI using hydroxyethylstarches and/or hyper-oncotic colloids while pulmonary function is not influenced by the type of fluids used but depends on the volume infused. Pulmonary worsening seems to occure for a lower volume of colloids than crystalloids, probably because of a higher efficiency to increase intravascular volume.In addition to the restoration of renal perfusion, arterial oxygenation is a potential determinant of renal oxygenation. Because the use of a low FiO2 level is recommended to avoid oxygen related pulmonary lesions, we assessed the renal response to a moderate hypoxemia, usually applied in patient with acute respiratory distress syndrome. Two hours of mechanical ventilation with a SaO2 between 88% and 92% induces renal diuretic and vascular response identified by Doppler. This response is independent from ventilator and hemodynamic changes. Renal response is rapidly reversible with the correction of hypoxemia. In addition to the ability in detecting changes of intra-renal vascular resistances, we found that Doppler resistive index is helpful in predicting the persistence of AKI, better than most of the usual urinary indices.Our works allow a better approach of the intricate mechanisms in preventing renal and pulmonary functions. Fluid resuscitation can be optimized preferring hypo-oncotic fluids for reducing AKI incidence without apparent negative impact on pulmonary function. Renal response to a moderate hypoxemia suggests that arterial oxygen preservation might be essential for renal function preservation. Renal Doppler is a promising tool for the selection and the evaluation of AKI preventive measures.

Le cancer du rein compte parmi les 10 types de cancers les plus fréquents chez l’Homme. Il n’existe aujourd’hui aucun marqueur biomoléculaire dans ce type de cancer, et dans le cas d’un cancer métastatique, l’arsenal thérapeutique aujourd’hui disponible manque d’efficacité. Les différents processus mis en jeu lors de la progression tumorale sont encore mal connus. La connaissance de ces processus pourrait permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi que des marqueurs biomoléculaires pronostiques ou diagnostiques de la maladie. Dans un premier projet, et afin de mieux comprendre les mécanismes de la progression tumorale et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles et de nouveaux marqueurs biomoléculaires dans le cancer du rein, un nouveau modèle innovant a été généré à partir d’une lignée tumorale de RCC murine. Ce modèle de réimplantations successives de cellules tumorales issues de tumeur primaire ou de métastases a permis de générer différentes lignées cellulaires montrant une agressivité accrue au cours des passages. En utilisant une stratégie de biologie des systèmes, ce modèle pourra permettre de mettre en évidence des cibles d’études prometteuses qui pourraient être de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux marqueurs biomoléculaires dans le RCC. L’interleukine-34 est l’exemple d’une cible d’étude d’ores et déjà été sélectionnée, mettant en évidence la puissance du modèle généré. Dans un second projet, les rôles de certains membres de la matrice extracellulaire tumorale ont été évalués en utilisant cette même lignée de RCC murine (collagène de type I, fibronectine, matrigel). Cette étude a permis de mettre en évidence le potentiel pro-invasif et pro-métastatique du dépôt de collagène de type I dans les tumeurs. Des récepteurs activés par le collagène sont proposés comme potentiellement impliqués dans les effets induits par le collagène de type I dans le modèle. Ces deux projets permettent et permettront de mieux comprendre certains mécanismes de la progression tumorale, ainsi que de mettre en évidence des marqueurs biomoléculaires et de nouvelles cibles thérapeutiques. / Kidney cancer is one of the 10 commonest human cancers. To date, no biomolecular markers are available in this type of cancer, and in the case of metastatic cancer, the therapeutic arsenal is still inefficient. The different processes involved in cancer progression are still poorly understood. Understanding those processes could highlight new therapeutic targets, and new prognostic or diagnostic biomolecular markers of this disease. For a first project, a new innovative model has been generated from a murine RCC cell line as a tool to understand cancer progression mechanisms and to identify new therapeutic target and new biomolecular markers in kidney cancer. This model of sequential reimplantation of cancer cells isolated from primary tumours or metastases allowed us to generate different cell lines showing increased aggressiveness after passages. Using a systems biology strategy, this model will allow us to identify new potential therapeutic targets and new biomolecular markers in RCC. Interleukin-34 is an example of an already selected target, showing the power of the model generated. For a second project, the role of some members of extracellular matrix (collagen type I, fibronectin, matrigel).was studied using this same murine RCC cell line. This study demonstrated the potential pro-invasive and pro-metastatic roles of collagen type I deposition in tumors. Collagen-activated receptors are proposed as mediators of the effect induced by collagen type I in this model. Those two projects have and will continue to contribute to a better understanding of cancer progression mechanisms, and will bring out new biomolecular markers and new therapeutic targets.

Le carcinome à cellules rénales (CCR) se caractérise par une résistance importante aux thérapies. Notre hypothèse était que des voies signalétiques prolifératives, anti-apoptotiques et/ou angiogéniques sont mises en jeu dans la résistance aux thérapies. Il s’agissait de mesurer la sensibilité de lignées cellulaires de CCR humain à différentes classes thérapeutiques in vitro et in vivo. Une étude pilote a été réalisée sur la base de xénogreffes de la lignée A498 chez la souris nude, puis exploitée pour des analyses sur biopuces à protéines afin d’identifier les voies de signalisation induites par le sunitinib. In vitro, les lignées cellulaires de CCR se sont révélées sensibles aux thérapies indépendamment du statut VHL. In vivo, la lignée A498 est apparue résistante au sunitinib. L’approche par biopuces a montré que plusieurs protéines de l’angiogenèse sont modulées sous l'effet du traitement, notamment l’angiogénine. Il n’y a pas de modification de l’expression des protéines de l’apoptose testées. Les formes phosphorylées d’Akt sont également augmentées dans les tumeurs traitées, de même que Lim1 alors que la forme phosphorylée de NFκB est diminuée. Ce travail a ainsi identifié de potentielles cibles impliquées dans les mécanismes de résistance et devraient permettre de définir de nouvelles options thérapeutiques dans le cancer du rein. / The renal cell carcinoma is characterized by a high resistance to therapies. Our working hypothesis was that proliferative signaling pathways, anti-apoptotic and / or angiogenic are involved in resistance to therapies. Thus, as part of this thesis, we measured the sensitivity to chemotherapy and targeted therapies in kidney cancer cell lines in vitro as well in vivo.A pilot study was conducted on the basis of the A498 cell line xenografts in nude mice, and then used for analysis on proteome arrays to identify the signaling pathways induced by sunitinib. In vitro, the cell lines of RCC were sensitive to therapy regardless of the VHL status. In vivo, the line A498 appeared resistant to sunitinib. The approach using the proteome array has shown that several angiogenesis proteins are modulated as a result of treatment, including angiogenin. There was no change in the expression of proteins of apoptosis. Phosphorylated forms of Akt were also increased in the treated tumors, as well as Lim1 whereas the phosphorylated form of NFkB was reduced. This work has identified potential targets involved in resistance mechanisms and should define new therapeutic options in renal cancer.

La dysfonction chronique du greffon est la cause majeure d’échec en transplantation rénale, que son mécanisme soit immunologique ou non. Lorsque l’épithélium tubulaire rénal subit des changements phénotypiques épithéliaux (CPE), évocateurs de transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et associés au développement de lésions irréversibles de fibrose interstitielle et d’atrophie tubulaire, l’évolution se fait vers la diminution de la fonction rénale et de la perte du greffon. Nous avons étudié le phénotype de l’épithélium tubulaire rénal par immunohistochimie et par la mesure dans les urines des ARN messagers de la vimentine, CD45, GAPDH et Uroplakine 1a par RT-PCR. Nous avons comparé les greffes avec donneurs cadavériques et celles avec donneurs vivants et nous avons évalué les performances diagnostiques de la RT-PCR dans les urines pour le diagnostic de CPE chez les patients greffés, ayant une biopsie rénale de surveillance à 3 mois et une biopsie sur indication particulière. Nous avons montré que le score de TEM sur la biopsie de surveillance et l’évolution de la fonction rénale sont meilleurs chez les greffés à partir de donneur vivant, comparé à ceux ayant un greffon de donneur cadavérique. La valeur de l’ARNm de la vimentine et CD45 rapportée à l’uroplakine 1a est corrélée avec le score de vimentine en immunomarquage dans les biopsies de surveillance. Ces biomarqueurs pourraient être utilisés comme un outil non invasif pour surveiller la fibrogénèse dans le greffon rénal. Ce test pourrait être utilisé pour le dépistage précoce des pathologies fibrosantes du greffon rénal. Une étude transcriptomique indépendante a été réalisée, confirmant l’intérêt de la normalisation des ARN messagers par l’ARNm de l’uroplakine, et montrant / Chronic graft dysfunction is the major cause for end-stage renal failure after renal transplantation, both through immune and non-immune mechanisms. When the renal tubular epithelium undergoes epithelial phenotypic changes (EPC), reminiscent of epithelial mesenchymal transition (EMT), and associated with interstitial fibrosis and tubular atrophy, the prognosis is poor with a diminution of renal function and graft loss. In this prospective study. We studied the renal epithelial phenotype by immunohistochemistry and measured mRNA in urine of vimentin, CD45, GAPDH and uroplakin 1a by RT-PCR. We compared grafts from living donors and those from deceased donors. We evaluated the diagnostic performance of RT-PCR on urine for the diagnosis of epithelial phenotypic changes in transplant patients, with renal biopsy surveillance at 3 months and a biopsy on particular indication. We have shown that the EMT score on renal biopsy surveillance and the evolution of graft renal function were better in the patients from living donors than in those from cadaveric donors. The value of the mRNA of vimentin and CD45 relative to the uroplakin is correlated with the score in vimentin immunostaining in routine biopsies. These biomarkers could be used as a noninvasive tool to monitor the renal graft fibrogenesis. This test could be used for early detection of fibrotic diseases of the kidney transplant. In an independant study, the transcriptome in urine was analyzed, and it was found that normalization of mRNA with uroplakin mRNA was useful, and that EPC were associated with immune and inflammatory profiles.