Affibody® molecules are small therapeutic proteins which mimics antibody functionality. This is a report of several methods for increasing productivity and yield in recombinant production of Affibody® molecules. This literature study shows several steps in the production line which can be optimised, several novel methods for cultivating and harvesting cells and purication of proteins. There is also a section about validation of therapeutic protein production according to The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) are presented.

Philosophiae Doctor - PhD / Nitric Oxide (NO) influences a wide range of physiological processes in plants including growth and development, responses to abiotic and biotic stress and pathogen responses. NO binds to the heme group of the mammalian soluble guanylyl cyclase, which activates the enzyme to convert guanosine 5’ triphosphate (GTP) to a second messenger guanosine 3’, 5’ cyclic monophosphate (cGMP). Cyclic GMP further activates other signalling cascades including the regulation of protein kinases, ion gated channels and phosphodiesterases. In plants, a few GCs have been identified and these include AtGC1, AtBRI1, AtWAKL10, and AtPSKR1, however, a GC that contains a heme binding motif that senses NO has yet to be identified. In order to identify such molecules, a search motif based on conserved HNOX domains and the conserved and functionally assigned amino acid residues in the catalytic centres of annotated GCs was designed and used to search the Arabidopsis thaliana proteome. Several candidate molecules were identified including a flavin-containing monooxygenase (FMO)-like protein and the At5g57690 which is currently annotated as a diacylglycerol kinase. FMOs found in bacteria, yeast, and animals are the most important monooxygenases since they are involved in xenobiotic metabolism and variability in drug response. FMOs in plants are implicated in catalysing specific steps in auxin biosynthesis,metabolism of glucosinolates and pathogen defense mechanisms. The human diacylglycerol kinase acts as a lipid kinase that mediates a wide range of biological processes which include cell proliferation, differentiation and turmogenesis. In prokaryotes, the structure of Escherichia coli lipid kinase has been solved however, its function has not yet been demonstrated. So far, the occurrence of the diacylglycerol kinases in plants has not yet been reported, and their structure and function also remain elusive. The domain architecture of the 2 molecules (AtNOGC1 and At5g57690) identified by the HNOX-based search strategy revealed that these molecules contain a GC and a heme-binding motif that is conserved among all known heme-binding proteins.In this study, the role of AtNOGC1, a novel NO binding protein in higher plants was investigated and the results showed that this molecule contains an NO-dependant active GC domain. The sequence was first analysed and the location of the HNOX and the GC motifs highlighted. The protein was then recombinatly expressed as a His-SUMO fusion protein and the purification optimised by a second step of ion exchange chromatography. Electrochemical techniques such as cyclic voltammetry and square wave voltammetry were used to demonstrate the binding of NO and O2 to the AtNOGC1. Electrochemical data revealed that AtNOGC1 has a lower affinity for O2 and a higher affinity for NO, an important signalling molecule in plants.The presence of the GC activity in AtNOGC1 was investigated by conducting GC activity assays in vitro in the presence or absence of NO. The GC activity assays demonstrated that AtNOGC1 can synthesize cGMP from GTP in vitro. It was also noted that NO was required for the maximum activation of AtNOGC1 catalytic activity. NO-activated catalysis resulted in a >2 fold excess of cGMP production compared to an NO-independent GC activity assay. The effect of calcium in regulating the GC activity was also investigated and an increase in cGMP levels was observed however, this was just a preliminary finding that requires further experimentation.3 Homology models for both the FMO-like (AtNOGC1) and the diacylglycerol kinase(At5g57690) were built using Modeller program, and important amino acid residues underlying the heme-binding and GC motifs were identified. Residues corresponding to the motifs, which give signature to AtNOGC1 as an FMO, were also noted. In addition,computational functional prediction also suggested the role of AtNOGC1 in a number of processes which include ion binding and functioning as an FMO.Taken together, these findings suggest that AtNOGC1 is a novel Arabidopsis thaliana hemebinding protein that senses NO with higher affinity than for O2. Though AtNOGC1 is currently annotated as a FMO-like protein, it contains a NO-sensitive GC activity and shares limited sequence similarities with mammalian sGC and the recently identified HNOX domains. Homology modelling strongly suggests that AtNOGC1 and At5g57690 belong to the families of FMOs and diacylglycerol kinases respectively. The domain organisation of AtNOGC1 suggests that more of its functions still remain to be identified. The cloning and characterisation of the At5g57690 gene will provide possible means for further experimentation as well as affording more insights into the exact functions of lipid kinases in plants.

Orientadora: Profª Drª Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2017. / A leishmaniose visceral, causada pelos parasitas das espécies Leishmania infantum e Leishmania donovani, do Velho Mundo, e pela Leishmania infantum chagasi, do Novo Mundo, é uma doença infecciosa e letal se não for tratada. O número de casos desta doença está aumentando no Estado de São Paulo. Uma vez diagnosticada, o tratamento para a leishmaniose visceral tem efeitos colaterais importantes, além da ocorrência de parasitas resistentes aos medicamentos disponíveis. Sabe-se que algumas peptidases desempenham um papel importante na fisiologia e doença causada por parasitas do género Leishmania. A inibição específica destas enzimas pode constituir uma importante estratégia para a produção de potentes agentes antiparasitários. Em bactérias E. coli, inibidores de serino peptidases (ISPs) denominados ecotinas, têm sido descritos, sendo também identificados em espécies de Leishmania. A caracterização funcional da ISP1 e ISP2 de L. major mostrou o seu papel na formação de flagelo de promastigotas e na inibição da elastase de neutrófilos de hospedeiro vertebrado, respectivamente. Portanto, os objetivos deste projeto são a expressão e a purificação das proteínas ISP1 e ISP2 de L. i. chagasi (LcISP1 e LcISP2) recombinantes. A amplificação das sequências que codificam as LcISP1 e LcISP2 foi realizada por PCR a partir do DNA genômico, de L. i. chagasi extraído de uma estirpe de referência cedida pelo Laboratório Nacional de Referência de Espécies de Leishmania da Fiocruz, Rio de Janeiro. Os fragmentos de PCR foram clonados no vetor de expressão bacteriano pET28a e as proteínas recombinantes LcISP2 e LcISP1 foram obtidas na fração solúvel do extrato proteico bacteriano. Após expressão das proteínas recombinantes, elas foram purificadas por cromatografia de afinidade em níquel. / Visceral leishmaniasis, caused by the Old World parasites species Leishmania infantum and Leishmania donovani, and by the New World Leishmania infantum chagasi, is an infectious and lethal disease, if untreated. The number of cases of this disease is increasing in the State of São Paulo. Once diagnosed, treatment for visceral leishmaniasis has important side effects, besides occurrence of parasites resistant to the available drugs. It is known that some peptidases play an important role in physiology and disease caused by parasites of the genus Leishmania. The specific inhibition of these enzymes may constitute an important strategy for producing potent antiparasitic agents. In bacteria E. coli, inhibitors of serine peptidases (ISPs) called ecotins, have been described, being also identified in Leishmania species. Characterization of genes encoding ISP1 and ISP2 of L. major, showed its role in the promastigote flagellum formation and in the inhibition of vertebrate host neutrophil elastase, respectively. Therefore, the aims of this project are to produce L. i. chagasi ISP1 (LcISP1) and ISP2 (LcISP2) recombinant forms and to evaluate the its biochemical activity. Amplification of the LcISP1 and LcISP2 encoding sequences were performed by PCR from L. i. chagasi DNA extracted from a reference strain obtained from the Leishmania collection of the Leishmania National Reference Laboratory of the Instituto Oswaldo Cruz. PCR fragments were cloned into the pET28a bacterial expression vector and the recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins were present in soluble bacterial extract fraction. After purification by niquel affinity chromatography, recombinant LcISP1 and LcISP2 proteins e were tested for biochemical activity.

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Banca: José Moacir Marin / Banca: Eduardo Hilário / Banca: Maria da Glória Buzinaro / Resumo: Foram realizadas a clonagem e expressão do gene da nucleoproteína (N) de uma estirpe vacinal de referência M41 do vírus da bronquite infecciosa (VBI), como proteína recombinante de fusão, contendo uma cauda de poli-histidina na extremidade carboxi-terminal, em 2 sistemas hospedeiros; na levedura metilotrófica, Pichia pastoris e na bactéria Escherichia coli. A proteína N derivada de um isolado variante do VBI de surtos a campo no Brasil, também foi expressa em E. coli. As características bioquímicas e imunoquímicas de tais proteínas recombinantes, foram determinadas, tendo sido evidenciado maior eficiência de produção no sistema hospedeiro constituído por E. coli, comparativamente ao sistema composto por P. pastoris. Uma vez obtidas, caracterizadas e purificadas, através da técnica de cromatografia de afinidade em resina de níquel-sepharose, as preparações de proteína N recombinante expressas em E. coli e derivadas ou da estirpe de referência M41 ou do novo isolado de campo no Brasil, foram utilizadas de forma bem sucedida, como antígenos alvo de ensaios indiretos de ELISA, que foram aplicados na detecção e mensuração de anticorpos dos isótipos IgG e IgM em aves infectadas com estirpes homóloga ou variantes do VBI. Foi, também, investigada a atividade imunogênica da proteína N recombinante em aves, que depois de imunizadas e re-imunizadas com essas proteínas recombinantes, produziram no soro sanguíneo e na secreção lacrimal quantidades elevadas de anticorpos anti-VBI específicos, mas não desenvolveram proteção efetiva contra o desafio com a estirpe homóloga desse vírus. Concluindo, a proteína N recombinante do VBI expressa pela E. coli possui elevada imunogenicidade, no sentido de induzir altos níveis de anticorpos específicos, e reatividade cruzada com proteínas N de outras variantes desse vírus, tendo um grande potencial de ser aplicada em ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Two host systems, represented by Escherichia coli and Pichia pastoris were used for cloning and protein expression of the nucleoprotein (N) gene of M41 strain of infectious bronchitis virus (IBV) as a fusion recombinant protein containing a poli-histidine tag. The N protein from a new variant Brazilian field isolate was also cloned and expressed by E. coli system. The biochemical and immunochemical properties of these recombinant N proteins were determined and higher efficiency on protein production was achieved by using the E. coli expression system. Both recombinant N proteins expressed by E. coli were purified in nickel-sepharose resin and used as antigen in indirect ELISA methods for the detection of IgG and IgM antibodies in birds infected with homologous and variant IBVs. The immunogenicity of N recombinant protein was also evaluated by immunizing and re-immunizing birds and high antibody levels were generated in lachrymal secretion and serum, but no effective protection against challenge with homologous virulent stain of IBV was induced. Concluding, the recombinant N IBV protein expressed by E. coli is highly immunogenic for inducing specific and crossreactive antibodies, and can be applied in the immuno-diagnosis of IB / Doutor

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-β1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-β1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-β1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-β1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-β1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-β1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-β1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-β1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-β1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-β1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-β1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-β1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-β1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-β1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-β1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-β1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-β1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_paula_telmo.pdf: 809734 bytes, checksum: c94f446bc6a605fddb45c97bbeedb7ec (MD5) Previous issue date: 2013-04-09 / The toxocariasis is a widespread zoonosis worldwide, thus becoming an important public health problem. The diversity of clinical conditions associated with the different sites (liver, lungs, brain, eyes, lymph nodes, etc.) of the Toxocara canis larvae in the human body, hamper the diagnosis of this disease. In this context, immunological methods for detecting anti-T. canis serum antibodies were developed. Currently, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) associated with the excretorysecretory antigens of T. canis larvae (TES), and sera previously adsorved with somatic antigen of Ascaris spp. has been used as a standard method for testing of IgG anti-T. canis serum antibodies. The antigen TES is obtained from T. canis larvae cultivation and demand four months of expensive and laborious work. Given the above, recombinant antigens are being tested, aiming at improving the immunodiagnosis of human toxocariasis. The objective of this work was to produce recombinant excretion/secretion 30kDa T. canis larval antigen (TES30) in two heterologous protein expression systems, and evaluate them in the immunodiagnosis of human toxocariasis. The recombinants proteins rTES30E and rTES30P, respectively, produced in Escherichia coli and Pichia pastoris, were characterized by un indirect ELISA to detect anti-T. canis IgG in experimentally infected mice serum, which showed 100% effectiveness compared to native TES. For detecting anti-T. canis IgG antibodies in human sera, the rTES30E showed sensitivity and specificity (95% CI) of 95.8% and 82.6%, while rTES30P showed 95.4% and 92.8%, respectively, in comparison to native TES. Thus, we conclude that both recombinants proteins have antigenic potential, becoming an alternative to the use of native TES in immunodiagnosis of human toxocariasis. / A toxocaríase humana é uma zoonose difundida em todo o mundo, constituindo-se em um importante problema de saúde coletiva, porém é negligenciada. A diversidade de quadros clínicos associada aos diferentes sítios (fígado, pulmões, cérebro, olhos, gânglios linfáticos, etc.) em que as larvas de Toxocara canis podem se alojar no organismo humano, dificulta o diagnóstico desta parasitose. Neste contexto, métodos imunológicos para a detecção de anticorpos anti-T. canis foram desenvolvidos. Atualmente, o ensaio imunoenzimático (ELISA) associado ao antígeno de excreção e secreção de T. canis (TES), com adsorção prévia de soros com antígeno somático de Ascaris spp., tem sido utilizado como método padrão para pesquisa de anticorpos IgG séricos anti-T. canis. O antígeno TES é obtido a partir do cultivo de larvas de T. canis e demanda, aproximadamente, quatro meses de trabalho dispendioso e fastidioso. Diante do exposto, antígenos recombinantes estão sendo testados, visando o aperfeiçoamento do imunodiagnóstico da toxocaríase humana. Assim, o objetivo deste trabalho foi produzir o antígeno de excreção/secreção de 30kDa de T. canis (TES30) em dois sistemas heterólogos de expressão protéica, e avaliá-los no imunodiagnóstico da toxocaríase humana. As proteínas recombinantes rTES30E e rTES30P produzidas em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente, foram caracterizadas através de ELISA-IgG com soros de camundongos infectados experimentalmente, demonstrando 100% de eficácia em comparação ao TES nativo. Na análise dos soros humanos, com ELISA-IgG a rTES30E apresentou sensibilidade e especificidade (IC 95%) de 95,8% e 82,6%, enquanto a rTES30P apresentou 95,4% e 92.8%, respectivamente, em comparação ao TES nativo. Assim, conclui-se que ambas as proteínas recombinantes apresentam potencial antigênico, constituindo-se em uma alternativa ao uso do TES nativo no imunodiagnóstico da toxocaríase humana.

Orientador: Everson Alves Miranda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T01:42:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_M.pdf: 2208429 bytes, checksum: 860e813410e0f18d21e22d51ca77e727 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os trabalhos realizados utilizando plantas transgênicas como biorreatores para produção de proteínas recombinantes indicam que a cano Ia, o milho e a soja são candidatos de grande potencial. Apesar da semente de soja e suas proteínas serem sistemas bem estudados, não existem estudos sistemáticos e comparativos sobre da utilização da soja como um biorreator, no tocante à extração e purificação de proteínas recombinantes. Até hoje, segundo a literatura consultada, só existe uma tentativa de usar soja como biorreator (Russel et al., 2005), mas por causa da baixa expressão da proteína recombinante (hormônio de crescimento humano), este estudo aparentemente não teve continuidade. O objetivo deste trabalho foi avaliar, sob o ponto de vista de recuperação (extração) e purificação, sementes de soja como biorreatores para produção de proteínas recombinantes, usando b-glucuronidase recombinante (rGUS) como proteína modelo / Abstract: The work done on the field of using trasgenic plants as bioreactors indicates the soybean, canola and corn as a plants of choice. Although the extraction and purification of soybean seed proteins is well studied and the plant is relatively easy to transform, there is practically no study done with transgenic soybean seeds expressing recombinant proteins in terms of downstream processing. To our knowledge, soybean was used to produce human growth hormone (Russel et al., 2005), but the study of purification was not done due to the low expression level of that recombinant protein. The objective of this work to evaluate the soybean seeds, in terms of recuperation (extraction) and purification, as a bioreactor for production of recombinant proteins using b-glucuronidase (rGUS) as a model protein / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Angela Maria Moraes, Ronaldo Zucatelli Mendonça, Thomas Noll / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-09T05:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Batista_FabianaReginaXavier_D.pdf: 3826216 bytes, checksum: 4aa1d7076a6bcbd23c7d0dcbd794541c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Células embrionárias de dípteros como as de Drosophila melanogaster S2 estão sendo utilizadas com sucesso na expressão de diversas proteínas recombinantes. Em comparação a células de mamíferos, este sistema de expressão mostra-se capaz de realizar modificações pós-tradução na complexidade requerida, apresentando maior facilidade de cultivo. O objetivo deste trabalho foi formular um meio de cultura livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, que proporcionasse o crescimento de células S2, aplicável a linhagens transfectadas (S2AcGPV2) produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Para tal, foi empregado o meio basal IPL-41 e avaliados os efeitos das concentrações de glicose, frutose, lactose, glutamina, metionina e tirosina, do hidrolisado de leveduras yeastolate, do agente Pluronic F68, assim como de uma emulsão lipídica, sobre a concentração de células viáveis e a viabilidade celular. Em adição, foram avaliadas a velocidade específica de crescimento, a produtividade celular e a produção de GPV nas formulações testadas. Os ensaios foram realizados primeiramente em frascos do tipo schott, e, após a obtenção da formulação do meio de cultura mais adequada, realizaram-se ensaios cinéticos, em maior escala, em frascos do tipo spinner, nos quais se pode estudar a influência da concentração de oxigênio dissolvido e do pH no cultivo. Durante o estudo foram empregados dois modos de operação de cultivo, batelada e batelada alimentada. Nos estudos enfocando a formulação do meio de cultura, verificou-se que o meio IPL-41 suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de frutose, 2 g/L de lactose, 3,5 g/L de glutamina, 0,6 g/L de tirosina, 1,48 g/L de metionina, 6 g/L de yeastolate, 1 % de emulsão lipídica e 0,05 % de Pluronic F68 mostrou-se como o mais adequado para a obtenção de elevadas concentrações celulares (superiores a 300 x 105 células/mL). Com esta formulação, foram realizados os ensaios em frascos spinner, no sistema Cellferm-pro®. Neste sistema as células S2AcGPV2 atingiram a maior concentração (368 x105 células/mL) e o maior teor de GPV (9,39 ng/106 células) quando mantidas na concentração de 40 % de oxigênio dissolvido e pH 6,3. A avaliação do metabolismo celular mostrou que asparagina, serina, prolina, glutamina, glicose e a maltose foram os principais nutrientes consumidos e que alanina, lactato e amônia foram os principais metabólitos produzidos / Abstract: Drosophila melanogaster Schneider 2 cells have been used with success to produce several recombinant proteins. This expression system presents several advantages when compared with mammalian cells expression system, and usually provide an adequate postradutional protein processing, being easier to culture. The aim of this work was to produce an animal component-free medium for S2 cells growth, and also for transfected cells (S2AcGPV2) producing the G glycoprotein from rabies virus (GPV). The basal IPL-41 medium was used and the effects of supplements glucose, fructose, lactose, glutamine, methionine, tyrosine, yeastolate ultrafiltrate, Pluronic F68 and lipid emulsion on viable cell concentration and cellular viability were evaluated. In addition, the cell specific growth rate, cellular productivity and GPV production were analyzed in the formulations studied. The experiments were carried out in schott flasks, as well as in spinner flasks. The effects of dissolved oxygen concentration and pH were evaluated in spinner flasks. During the study, batch and fed- batch mode operation were used. In the studies focusing media formulation developed, IPL-41 supplemented with 10 g/L of glucose, 0.5 g/L of fructose, 2 g/L of lactose, 3.5 g/L of glutamine, 0.6 g/L of tyrosine, 1.48 g/L of methionine, 6 g/L of yeastolate, 1 % of lipid emulsion and 0.05 % of Pluronic F68 provided high cell density (above 300 x105 cells/mL). In the experiments performed in spinner flasks, using the Cellferm-pro® system, S2AcGPV2 cells reached the highest cell concentration (368 x105 cells/mL) and protein content (9.39 ng/106 cells), at 40 % of dissolved oxygen concentration and pH of 6.3. The cell metabolism shown that, amino acids as asparagine, serine, proline, glutamine, and carbohydrates as glucose and maltose were consumed. The main metabolities produced were alanine, ammonia and lactate / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Visando novos estudos com a proteína amilóide sérica A (SAA), propusemos a produção de seu recombinante humano em Escherichia coli, mais especificamente, a isoforma encontrada na fase aguda (A-SAA1) e da constitutivamente expressa (C-SAA4). Realizamos a expressão, identificação e purificação das proteínas recombinantes. Concomitantemente, também avaliamos o efeito da hipóxia na expressão e produção da proteína SAA nativa em linhagens de pré-adipócitos murinos 3T3-L1, não diferenciados e diferenciados e adipócitos humanos. Aparentemente quanto maior o grau de diferenciação celular, maior a expressão e produção da proteína. Para os adipócitos humanos, o perfil de expressão de mRNA da SAA mostra que SAA1>SAA2>SAA4 nas relações 500:150:1. Na hipóxia, há um aumento na expressão de SAA, entretanto não associamos esta expressão a um aumento da concentração da proteína. A importância do reconhecimento de que SAA pode ser umas das proteínas induzidas pela hipóxia em adipócitos é discutida em relação ao seu papel pró-inflamatório. / In order to provide more complex studies with the protein serum amyloid A (SAA), this study proposed the production of its human recombinant in bacteria (Escherichia coli), more specifically, the synthesis of the main isoform found in the acute phase (A-SAA1) and the constitutively expressed (C-SAA4). The expression, identification and purification of the recombinants proteins was performed. Concurrently, we also did a study evaluating the effect of hypoxia in the expression and protein production of native SAA in undifferentiated and differentiated murine preadipocytes 3T3-L1 and humans adipocytes. Apparently, the protein expression and production increases with the cell differentiation degree. For human adipocytes, we demonstrated the mRNA expression profile of SAA, in which SAA1 > SAA2 > SAA4 (500:150:1). In hypoxia, there is an increased expression of SAA, but we could not link it to an increase of protein concentration. The importance of recognizing that SAA may be one of the proteins induced by hypoxia in adipocytes is discussed in relation to the proinflammatory role of this protein.