Neste trabalho avaliamos a formação de oxigênio singlete in vitro em fagócitos, (células mononucleares e neutrófilos) isolados de sangue periférico humano, e eosinófilos, de lavado bronco alveolar de camundongos balb/c, ativados por estímulo partículado: zimosan opsonizado contendo o 9,10difenilantraceno (DPA) adsorvido como sonda captadora de 1O2. Por este método, a formação do 1O2 pode ser verificada pela formação do 9,10-difenilantraceno endoperóxido (DPAO2), que é detectado por HPLC. Observamos, que os fagócitos formam 1O2 e que esta formação parece ocorrer de forma diferenciada para os dois tipos celulares (neutrófilos e células mononucleares). Visando ampliar os estudos anteriores sobre o papel da melatonina (MLT) no processo inflamatório, foi testado seu efeito em fagócitos e a relação na produção de 1O2 destas células. Observamos que MLT inibe a formação de 1O2 totalmente no caso de neutrófilos e parcialmente no caso de células mononucleares e eosinófilos. Paralelamente, foi desenvolvida a síntese de um novo captador químico de 1O2, o éster 9,10-antracenil-3-bispropionato de etila (ABPE), cuja finalidade principal é o acúmulo no interior da célula, depois de sofrer hidrólise enzimática. Esta sonda, terá facil acesso ao interior das células em sua forma ester. Este novo captador de 1O2 foi testado em células mononucleares e neutrófilos estimulados de formas diferentes: via receptor independente e dependente. Os resultados demonstraram produção equivalente de 1O2 nestes fagócitos. / In this study, we evaluated the singlet oxygen (1O2) formation in vitro from phagocytes (neutrophils and mononuclear cells) isolated from human blood cells and eosinophils isolated from bronchoalveolar lavage fluid of mice balb/c activated, by opsonized zymosan. To determine whether singlet oxygen is produced by phagocytes, zymosan particles were coated with a specific chemical trap for 1O2, 9,10-diphenylanthracene (DPA). The production of 1O2 was followed using HPLC, to measure its product, 9,10-diphenylanthracene endoperoxide (DPAO2). We also noticed that the 1O2 production occurs at different levels of for two cell types, neutrophils and mononuclear cells. In order to broaden previous studies on the role of melatonin (MLT) in inflammatory processes, its effect was tested in phagocytes was tested in relation to 1O2 formation by these cells. We observed that MLT inhibits the 1O2 formation totallymt neutrophils and partiallym mononuclear cells and eosinophils. At the some time, it was also developed the synthesis of a new probe for 1O2, the 9,10-anthracene-bis-3-ethyl-propionate (ABEP), with the purpose to accumulate inside the cells, after its enzymatic hydrolysis. This probe presents easy acess to the inferior of the cells in its ester form. This new probe for trapping 1O2 was tested in mononuclear cells and neutrophils stimulated in two ways: via independent and dependent receptor. The results showed equivalent production of 1O2 for both cell types.

Neste trabalho, foram analisados alguns sistemas bioquímicos relacionados ao estresse oxidativo em diferentes tecidos de moluscos bivalves, em resposta a diferentes tipos de estresse ambiental, com o intuito de se verificar a possibilidade de utilização destes sistemas em programas de biomonitoramento do ambiente marinho, assim como verificar a influência de variações em parâmetros ambientais não relacionados à poluição sobre esses sistemas. Mexilhões Perna perna e Mytella guyanensis coletados em ambientes poluídos apresentaram níveis significativamente maiores de lesões em DNA e lipídeos que animais coletados em local limpo. Além disso, mexilhões expostos a metais apresentaram também maiores níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados indicam que as lesões analisadas nos mexilhões apresentaram uma boa resposta aos diferentes contaminantes, o que sugere sua utilização como biomarcadores da contaminação ambiental marinha. Entretanto, outros fatores tais como os ciclos de exposição ao ar, sazonalidade e variações de salinidade também ocasionaram oscilações nos níveis de lesões em DNA e lipídeos. Estes dados sugerem que deve-se ter especial atenção às condições de coleta em estudos de biomonitormanento ambiental, uma vez que variações ambientais não controladas em fatores abióticos podem influenciar nos resultados obtidos Em mexilhões expostos a diferentes metais em laboratório por diferentes períodos, foram estudadas as atividades de algumas enzimas antioxidantes tais como a catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx), glutationa peroxidase específica para hidroperóxidos de lipídeos (PHGPx), glutationa S-transferase (GST), níveis de glutationa reduzida (GSH) e de peroxidação lipídica. Algumas oscilações foram observadas nestes parâmetros, em relação à susceptibilidade dos tecidos à peroxidação lipídica. As maiores correlações foram observadas entre a atividade da PHGPx e os níveis de peroxidação lipídica, indicando um possível papel protetor da PHGPx contra lesões oxidativas às membranas, como também sua modulação pelos metais. Níveis de serotonina (5HT) e dopamina (DOPA) foram também avaliados em glândulas digestivas e tecido muscular de mexilhões P. perna, onde verificou-se que os metais causaram depleção dos níveis de 5HT e DOPA. No caso específico de tecidos musculares, uma diminuição dos níveis destes dois compostos poderia ser devido à contração tônica das valvas dos mexilhões em resposta a presença dos metais, uma vez que estes dois compostos estão envolvidos no relaxamento muscular dos mexilhões. Quando mexilhões foram expostos ao ar, constatamos também uma diminuição nos níveis de 5HT e DOPA no músculo, o que provavelmente estava associado à contração muscular para o fechamento das valvas, evitando assim a dessecação. Ao serem re-submersos, os níveis voltaram aos anteriores (similares aos controles), o que indicaria o relaxamento dos músculos com a conseqüente abertura das valvas. Nenhuma diferença foi observada nas glândulas digestivas. Pequenas variações foram também observadas nos níveis de 5HT e DOPA, entre mexilhões coletados em diferentes horários do dia, indicando o papel destes dois compostos no controle dos ritmos biológicos. Sendo assim, oscilações nos níveis destes dois compostos em função da exposição a metais pesados podem comprometer também os ritmos biológicos destes animais. Ainda, em estudos adicionais foi caracterizado por cromatografia líquida de alta performance acoplado à espectrometria de massas (HPLC/MS) e por ressonância magnética nuclear de próton e carbono, o produto de oxidação da melatonina pelo oxigênio singlete, o AFMK. Como parte deste estudo, comprovamos a hipótese de que a reação de nitrilas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino gera oxigênio singlete, em estudos de monitoramento das emissões de luz bi e monomoleculares do oxigênio singlete, e pela detecção do produto acetamida por HPLC/MS. Por fim, um novo método de detecção de melatonina e AFMK com alta especificidade e sensibilidade por HPLC/MS foi desenvolvido. / In this work, some biochemical systems were evaluated in different tissues of bivalve mollusks, in response to different stress, in order to verify the possibility of use of these systems as pollution bioindicators in marine environmental monitoring studies, as well as to verify the influence of environmental variations not related to pollution on these systems. Mussels Mytella guyanensis and Perna perna collected in polluted environments presented higher levels of DNA and lipid damage, compared to mussels from a reference site. Mussels exposed to different metals also presented high levels of DNA and lipid damage. These data indicates that the lesions evaluated in mussels showed good responses to the contaminants, suggesting its use as biomarkers of marine contamination. On the other hand, other environmental variations such as air exposure cyvles, seasonality and variations in salinity also caused changes in the levels of DNA and lipid damage, indicating that the collection procedure of mussels, including observations of the environment conditions, should be considered for better interpretation of the results. In mussels exposed to different metal at different time intervals, the activities of the antioxidant enzymes catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase (PHGPx), and glutathione S-transferase (GST), as well as the levels of reduced glutathione (GSH) and lipid peroxidation were evaluated. Some oscillations were observed in these parameters, related to the susceptibility of the digestive gland to lipid peroxidation. Major relationships were observed between the activity of PHGPx and the levels of lipid peroxidation, suggesting a protective role of PHGPx against lipid peroxidation and its modulation by metals. The levels of serotonin (5HT) and dopamine (DOPA) were also evaluated in digestive gland and muscle tissues of the mussels, being observed 5HT and DOPA depletion in both tissues. In muscle tissues, this would be related to the tonic catch contraction of muscle fibers in response to the metal exposure, since 5HT and DOPA are involved in this process. Experiments of exposure of mussels to air and re-submersion were also done to verify the effects on 5HT and DOPA levels. When mussels were exposed to air, decreases in 5HT and DOPA were observed, and when mussels were re-submersed, the levels back to the control values, which would also be related to the muscle contraction. No differences were observed in digestive glands. Little variations in 5HT and DOPA levels were observed between mussels collected at different times of the day, indicating a role of these compounds in the control of biological rithms. Additional studies were done, were the oxidative melatonin product by singlet molecular oxygen was characterized by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (HPLC/MS), and proton and carbon nuclear magnetic resonance. The chraracterized product was the kynurenine N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK). Along this study, the theory that the reaction of nitriles with hydrogen peroxide in alkaline solutions were confirmated through monitoring of the ligh emmited by singlet oxygen and the detection of the product formed (acetamide). Also, a new method for the simultaneous detection of melatonin and AFMK with high specificity and sensibility by HPLC/MS were developed.

Nesse trabalho enfatizamos o uso de marcadores bioquímicos de estresse oxidativo em microalgas como sinalizadores precoces de exposição a agentes xenobióticos. A curva de crescimento e a taxa de crescimento diário (µ) foram determinadas através do monitoramento in vivo da fluorescência da clorofila. Baseado nos protocolos de testes toxicológicos in vitro, usando microalgas expostas por 48h, determinou-se a concentração efetiva que inibiu 50% de µ (IC50). Culturas de M. polymorphus, com concentração inicial de 1 X 106 células.mL-1, foram submetidas separadamente ao IC50 de oxiflurfeno (OxF) e benzo[a]pireno (BaP) por 48h sendo, posteriormente, coletadas para a análise de cinética enzimática em espectrofotômetro. As análises tanto dos níveis de MDA como dos níveis de GSH/GSSG e Asc- foram feitas em HPLC usando detectores de fluorescência e detectores coulométricos flow-through respectivamente. Além disso, os ensaios sobre a excreção/liberação de H2O2 in vivo foram feitos em um luminômetro usando-se a técnica do luminol. Os valores de IC50 para o OxF e BaP foram de 0,24 µg.L-1 e 0,99 µg.L-1 respectivamente. Os resultados das análises enzimáticas, obtidos nos ensaios com OxF, ao serem comparadas com controles, mostram aumentos para SOD (150 ± 7 e 32 ± 6 USOD.mg.prot-1), seguidos por aumentos menores para CAT (6,5 ± 0,7 e 3,9 ± 0,5 U.mg.prot.-1) e APx (1,01 ± 0,06 e 0,82 ± 0,05 U.mg.prot.-1) respectivamente. Nas culturas expostas ao BaP os resultados, comparados ao controle, mostraram maior atividade de CAT (35,7 ± 1,3 e 4,0 ± 0,9 U.mg.prot.-1) e APx (4,95 ± 0,06 e 0,86 ± 0,03 U.mg.prot.-1) enquanto a SOD foi menos pronunciada (105 ± 6 e 35 ± 5 USOD.mg.prot.-1). As análises das enzimas GR e DHAR quando comparadas ao controle (0,78 ± 0,07 e 0,43 ± 0,08 U.mg.prot.-1 respectivamente) apresentaram-se inibidas em quase 50% quando sob a ação de OxF e não apresentaram variações na presença de BaP. As análises de GST comparadas aos controles, tiveram menor atividade nos grupos sob OxF (176 ± 28 e 73 ± 18 ) frente ao BaP (402 ± 67 e 71 ± 24). Os resultados em HPLC revelaram níveis de MDA elevados nos dois grupos, especificamente 9 e 5 vezes o valor dos controles para as amostras expostas ao OxF e ao BaP respectivamente. Os resultados de GSH mostram diminuição de GSHtotal frente aos controles, em quase 40% sob ação do OxF e mais de 50% nas culturas com BaP. Além disso, a percentagem de GSH na forma de GSSG comparada ao GSHtotal (%IR Índice redox) foi de 60 e 75% nos grupos com OxF e BaP respectivamente. Nos valores obtidos nas análises de Asc- os resultados apontam diminuição em 45% sob OxF e pouco mais de 15% na presença de BaP. As análises de excreção/liberação in vivo de H2O2 mostram acentuada liberação nas células expostas ao OxF quando comparadas ao tratamento com BaP. A observação dos valores de IC50, mostra uma maior toxicidade de OxF quando comparada ao BaP e os resultados das análises das enzimas antioxidantes nos revelam que M. polymorphus usa diferentes estratégias frente aos agentes tóxicos. Tendo em vista a inibição de CAT e APx, as células sob exposição ao OxF utilizam a eliminação direta de H2O2 no meio e, eliminação via ação da GST. No entanto, tal situação parece não diminuir os níveis de lipoperoxidação, mesmo com consumo excessivo de Asc. As culturas expostas ao BaP evitam a evolução de H2O2 via atividade enzimática preferencial e os níveis baixos de GSH denotam a utilização de GST em processos de conjugação de xenobióticos. / The use of biochemical oxidative stress biomarkers in microalgae, as early watches during xenobiotic exposure are emphasized. The growth curve and the diary cells population increase rate (µ) were determined by chlorophyll fluorescence in vivo monitoring. Applying toxicological in vitro tests protocols and using microalgae exposed for 48h, we have determined the effective concentration that provoked 50% of µ inhibition (IC50). M. polymorphus cultures in an initial cellular concentration of 1 X 106 cell.mL-1 were separately submitted to IC50 oxyfluorfen (OxF) and benzo[a]pyrene (BaP) during 48h and, after that, they were gathered to the kinetics enzymatic assay using spectrophotometer. The levels of MDA and the levels of GSH/GSSG plus Asc- were determined in the HPLC system coupling to the fluorescence and coulometric flow-through detectors, respectively. Additionally, in vivo H2O2 excretion/releasing assays were done using a luminometer associated to the luminol technique. The IC50 obtained in the OxF and BaP tests brought out the values 0.24 µ.L-1 and 0.99 µg.L-1 respectively. The results from the enzymatic analyses in the culture under OxF exposure, when compared to the controls, have shown increases in the SOD activities (150 ± 7 and 32 ± 6 USOD.mg.prot-1) followed by minor results to CAT (6.5 ± 0.7 and 3.9 ± 0.5 U.mg.prot.-1) and APx activities (1.01 ± 0.06 and 0.82 ± 0.05 U.mg.prot.-1), respectively. On the other hand, in cultures under BaP treatment, the results compared to the control have shown an increase of CAT (35.7 ± 1.3 and 4.0 ± 0.9 U.mg.prot.-1) and APx activities (4.95 ± 0.06 and 0.86 ± 0.03 U.mg.prot.-1) followed by minor SOD activities (105 ± 6 and 35 ± 5 USOD.mg.prot-1). The results from enzymatic analyses of GR and DHAR under OxF exposure presented around 50% of controls value (0.78 ± 0.07 and 0.43 ± 0.08 U.mg.prot.-1respectively). Contrarily, the culture under BaP treatment didnt show any variation compared to the controls. Instead, GST analyses - in the culture under OxF treatment - have shown minor activity (176 ± 28 and 73 ± 18) facing the cell cultures under BaP exposure (402 ± 67 and 71 ± 24), when compared to the controls. In the cultures under OxF and BaP treatment, HPLC analyses displayed an increase of 9 and 5 fold, respectively, in the MDA levels. The results of GSH in cultures under OxF have shown a decrease of 40% GSHtotal when compared to the control, and more than 50% in cultures under BaP treatment. In addition, the percentage of GSH in the GSSG form compared to GSHtotal (%RI Redox index) was 60 and 75% in the OxF and BaP groups, respectively. In the results obtained in analyses of Asc- there are a decrease of 45% in cultures under OxF and a little bit more than 15% in cultures under BaP treatment. The analyses of in vivo H2O2 excretion/releasing have shown pronounced freeing in the cell under OxF exposure when compared with BaP cultures. The results of IC50 value point to an increased toxicity in cells under OxF treatment in comparison to BaP cultures. On the other hand the results of antioxidant enzymes have shown us different strategies used by M. polymorphus facing the toxic agents. Having in mind the inhibition of CAT and APx, the cells under OxF exposure adopt the direct elimination of H2O2 in the culture medium and via GST activity. However, this situation seems not reduce the lipoperoxidation levels, not even, under the exceedingly Asc- consuming. Cultures exposed to BaP avoid H2O2 evolution de mainly via enzymatic activity and the lower levels of GSH pointing to the activity of GST during xenobiotic conjugation process.

A lipoperoxidação gera diversas espécies carbonílicas altamente reativas dentre as quais se destacam acroleína (ACR), malondialdeído (MDA), 4-hidroxi-2-hexenal (HHE) e 4-hidroxi-2-nonenal (HNE). A principal via endógena de metabolização desses compostos é através de conjugação com glutationa por ação da glutationa-S-tranferase. Contudo, diversos trabalhos têm mostrado que dipeptídeos contendo histidina, tal como a carnosina (CAR), também podem formar conjugados com aldeídos e auxiliar na detoxificação desses compostos. Em nosso trabalho adutos de CAR com ACR, HHE, HHEd5, HNE e HNEd11 foram sintetizados, purificados e caracterizados. A reação da CAR com ACR foi estudada em detalhes. Resultados mostraram que a carnosina reage com acroleína formando 03 produtos principais: m/z = 265, m/z = 283 e m/z = 303, sendo este último mais estável e mais abundante. Dados de RMN H1, COSY e HSQC permitiram elucidar a estrutura dessa molécula (m/z = 303) e propor uma rota de reação. Em seguida, uma metodologia baseada em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas do tipo \"Ion Trap\" (ESI+ HPLC/MS-MS) foi desenvolvida e validada para quantificação simultânea dos adutos sintetizados. Pelo método desenvolvido é possível quantificar com precisão 25 pmol de CAR-HHE, 1 pmol de CAR-ACR e 1 pmol de CAR-HNE com um coeficiente de variação de aproximadamente 10 % e acurácia de 98 % (HHEd5 e HNEd11 foram usados como padrão interno). Análise em urina de adultos não fumantes mostraram que os produtos sintetizados estão presentes na urina de humanos em concentrações de 3,6 ± 1,4; 2,3 ± 1,5 e 1,3 ± 0,5 nmol / mg de creatinina, respectivamente para CAR-ACR, CAR-HHE e CAR-HNE. Em ratos transgênicos SODG93A modelo para esclerose lateral amiotrófica (ELA), a suplementação da dieta dos animais com 35 ± 5 mg carnosina/animal/semana melhorou a manutenção do peso e a sobrevida dos animais. Análises dos adutos sintetizados em amostras de músculo sugerem que a metabolização de aldeídos esteja comprometida nesses animais e que a carnosina poderia funcionar como \"scavenger\" para esses compostos. Esses resultados comprovam que dipeptídeos de histidina atuam na detoxificação de compostos carbonílicos e participa de suas vias de excreção. Além disso, a caracterização da estrutura e desenvolvimento de método sensível de detecção abre a possibilidade de utilização desses adutos como biomarcadores de estresse redox e exposição a aldeídos. / Lipid peroxidation generates reactive carbonyl species, including 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), acrolein (ACR), 4-hydroxy-2-hexenal (HHE) and malondialdehyde (MDA). One major pathway of aldehyde detoxification in vivo is through conjugation with glutathione catalyzed by glutathione-S-transferases or, alternatively, by conjugation with endogenous histidine containing dipeptides, such as carnosine (CAR). The reaction of CAR with ACR was investigated in an effort to assess its possible biological role. One stable adduct was isolated by reverse-phase HPLC and characterized on the basis of extensive spectroscopic measurements. The proposed reaction route for product formation involves the reaction of the CAR amino group with ACR via a Schiff base formation followed by dehydration and cyclization through Michael addition in the imidazole ring forming an instable compound with m/z = 265. The subsequent reaction with another molecule of ACR followed by cyclization gives rise to the final product with m/z = 303.A highly sensitive method involving HPLC-MS analysis was developed for the simultaneous accurate quantification of CAR- ACR, CAR-HHE and CAR-HNE adducts in human urinary samples from non-smoking adults. This methodology permits quantification of 10 pmol CAR-HHE and 1 pmol of CAR-ACR and CAR-HNE. Adduct levels in urine were 3.6 ± 1.4, 2.3 ± 1.5, 1.3 ± 0.5 nmol/mg of creatinine, respectively to CAR-ACR, CAR-HHE and CAR-HNE. In SODG93A transgenic rats model to amyotrophic lateral sclerosis (ALS), the food supplementation of the animals with 35 ± 5 mg carnosine/animal/week improve de body weight and the life span of the ALS treated group. Analysis of the synthesized adducts in muscle sample showed suggest than aldehyde metabolization is compromised in this animals and that may be carnosine work like a scavenger for these compounds. Our results indicate that carnosine adduction can be an important detoxification route of α,β -unsaturated aldehydes. Moreover, carnosine adducts quantification may be useful as redox stress indicator in vivo.

O presente trabalho apresenta estudos de lesão em biomoléculas (DNA e 2\'-deoxiguanosina) induzida por Cu(III)/tetraglicina (Cu(III)/G4), radicais de óxidos de enxofre (SO3·-, SO4·-, SO5·-), HO· e HSO5-, espécies estas geradas durante a autoxidação de S(IV) na presença de Cu(II)/G4 ou Cu(II) (ausência de tetraglicina) e traços de um segundo íon metálico (Ni(II), Co(II) ou Mn(II)). A formação dos radicais SO3·- e HO· foi detectada pela técnica de ressonância paramagnética eletrônica (EPR). As técnicas de espectrofotometria e dicroísmo circular foram empregadas para avaliar a formação de Cu(III)/G4 em diferentes condições experimentais, na presença e ausência de S(IV), e a interação entre os complexos de cobre (II)/(III) e a molécula de DNA. A eficiência da formação de Cu(III) depende da acidez, concentração de S(IV) e dos tampões utilizados. A lesão no DNA plasmidial pUC19 foi verificada empregando-se a técnica de eletroforese em gel de agarose. A extensão da lesão no DNA depende da acidez, concentração de S(IV), tempo de incubação e da presença de um segundo íon metálico. Usando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi possível estudar a oxidação de 2\'-deoxiguanosina a 8-oxo-7,8-dihidro-2\'-deoxiguanosina na presença dos oxidantes fortes gerados durante a autoxidação de S(IV) catalisada por Cu(II)/G4. Um estudo comparativo do efeito de vários íons metálicos evidenciou o sinergismo de Cu(II) e traços de um segundo íon metálico (Ni(II), Co(II) ou Mn(II), complexados ou não com tetraglicina). / The present work presents studies related to biomolecules damage (DNA and 2\'-deoxyguanosine) induced by Cu(III)/tetraglycine (Cu(III)/G4), oxysulfur radicals (SO3·-, SO4·-, SO5·-) and HSO5-, species generated during S(IV) autoxidation in the presence of Cu(II)/G4 or Cu(II) (absence of tetraglycine) and trace level of a second metal ion (Ni(II), Co(II) or Mn(II)). The formation of SO3·- and HO· radicals was detected by electronic paramagnetic resonance technique (EPR). Spectrophotometric and circular dichroism techniques were used to evaluate the Cu(III)/G4 formation in different experimental conditions, in the presence and the absence of S(IV), and the interaction of copper (II)/(III) complexes and DNA molecule. The effectiveness of Cu(III) formation depends on the acidity, S(IV) concentration, and buffers used. The damage on pUC 19 plasmid DNA was verified by agarose gel electrophoresis. The extent on the DNA damage was related to acidity, S(IV) concentration, incubation time and to the presence of a second metal ion. Using the high performance liquid chromatography technique (HPLC) it was possible to study the oxidation of 2\'-deoxyguanosine to 8-oxo-7,8-dihydro-2\'-deoxyguanosine in the presence of strong oxidants generated during the S(IV) autoxidation catalyzed by Cu(II)/G4. A comparative study of the effect of several metal ions showed the synergism of Cu(II) and traces of a second metal ion (Ni(II), Co(II) or Mn(II), as tetraglycine complexes or not).

Oxigênio molecular singlete [O2(1Δg)], uma espécie excitada, desempenha um papel importante em sistemas químicos e biológicos. É um poderoso eletrófilo, que reage com moléculas ricas em elétrons através de cicloadições [2+2], [4+2] e reações tipo ene. Ácidos graxos poliinsaturados, proteínas e DNA são alvos vulneráveis para o ataque de O2(1Δg). Os endoperóxidos de derivados de naftaleno são muito úteis e versáteis como fontes limpas de O2(1Δg), uma vez que são quase quimicamente inertes. Por outro lado, o desenvolvimento de novas fontes de O2(1Δg) ainda é uma tarefa desafiadora. Os derivados de naftaleno são capazes de armazenar O2(1Δg) por reação de cicloadiação [4+2] e liberá-lo em temperaturas amenas, o que os torna muito adequados para uso em estudos biológicos. A síntese destes compostos está baseada em modificações nos substituintes ligados nas posições 1 e 4 da estrutura do naftaleno. Na primeira parte deste trabalho, a síntese de três endoperóxidos derivados do naftaleno solúveis em água foi realizada. DHPNO2 e NDPO2 foram preparados de acordo com métodos similares descritos na literatura. A síntese de um novo endoperóxido dicatiônico derivado do naftaleno (NBTEO2) foi desenvolvida, contendo dois grupos de cloreto de amônio quaternário nas posições 1,4 do anel aromático. O intermediário chave na síntese dos três endoperóxidos é o BBMN, o qual foi preparado a partir da bromação radicalar do 1,4-dimetilnaftaleno. Nossos resultados têm indicado que este composto dicatiônico pode ser uma fonte química de O2(1Δg) em potencial, e pode ser explorado em estudos com mitocôndrias, onde o papel biológico de O2(1Δg) é investigado. A segunda parte deste trabalho foi dedicada a investigar a geração de O2(1Δg) através das reações entre hidroperóxidos de lipídeos (ácido oleico, linoleico e colesterol), hidroperóxidos orgânicos (cumeno e t-butila), bem como peróxido de hidrogênio com NO2+, utilizando o composto NO2BF4. Evidências da geração de O2(1Δg) foram obtidas através de medidas de emissão de luz na região do infravermelho próximo, no comprimento de onda de 1270 nm. Além disso, a prova inequívoca da presença de O2(1Δg) foi demonstrada através da caracterização espectral direta da emissão de luz no infravermelho próximo. O uso de azida de sódio como captador físico de O2(1Δg), juntamente com as medidas da quimiluminescência, contribuíram para identificar a geração desta espécie na reação entre hidroperóxidos de lipídeos e NO2BF4. Embora seja uma abordagem química, nossos resultados adicionaram informações importantes sobre a peroxidação lipídica, principalmente quando espécies reativas de nitrogênio estão envolvidas. O O2(1Δg) poderia ser gerado como um subproduto da peroxidação lipídica em condições onde espécies reativas de nitrogênio interagem com hidroperóxidos lipídicos. Isto pode contribuir para um melhor entendimento deste evento complexo com implicações fisiológicas ou fisiopatológicas. / Singlet molecular oxygen [O2(1Δg)], an excited species, plays an important role in chemical and biological systems. It is a powerfull electrophile, reacting with electron rich molecules through [2+2] cycloadditions, [4+2] cycloadditions and ene reactions. Polyunsaturated fatty acids, proteins and DNA are vulnerable targets for O2(1Δg) reaction. Naphthalene derivatives endoperoxides are very useful and versatile as a clean source of O2(1Δg), once they are almost chemically inert. On the other hand, developing new sources of O2(1Δg) are still a challenging task. Naphthalene derivatives are able to trap O2(1Δg) by [4+2] cycloaddition and release it in mild temperatures, which make them very suitable for biological studies. The synthesis of these compounds is based on modifications in substituents bonded in 1,4 positions of nafhthalene backbone. In the first part of present work, the synthesis of three water soluble naphthalene derivatives endoperoxides was performed. DHPNO2, NDPO2 were prepared according to similar methods described in the literature. A new di-cationic naphthalene derivative endoperoxide (NBTEO2) synthesis was developed, containing two quaternary ammonium chloride groups in 1,4-positions of aromatic ring. The key intermediate: for the synthesis of the three endoperoxides is the compound BBMN, which was prepared from radicalar bromination of 1,4-dimethylnaphthalene. Our results have indicated that this di-cationic compound can be a potential chemical source of O2(1Δg) and may be explored in mitochondrial studies where O2(1Δg) biological role is investigated. The second part of this work is dedicated to the investigation of generation of O2(1Δg) through reaction of lipid hydroperoxides (oleic acid, linoleic acids and cholesterol), organic hydroperoxides (cumene and t-butyl), as well as hydrogen peroxide with NO2+, using the compound NO2BF4. Evidences of generation of O2(1Δg) were obtained recording the monomol light emission measurement in near infrared region at wavelength of 1270 nm. Moreover, the proof of the presence of O2(1Δg) was unequivocally demonstrated by the direct spectral characterization of near-infrared light emission. The use of sodium azide as a physical quencher of O2(1Δg), associated to chemiluminescence measurements, contributed to identify the generation of this species in the reaction of lipid hydroperoxides and NO2BF4. Although, it is a chemical approach, our results add important information about lipid peroxidation, mainly when reactive species of nitrogen are involved. O2(1Δg) might be generate as a byproduct of lipid peroxidation, in conditions where reactive nitrogen species interact with lipid hydroperoxides. This might contribute to a better understand of this complex event and physiological or physiopathological implications

O transplante de ilhotas pancreáticas humanas é considerado uma estratégia promissora para curar pacientes portadores de Diabetes Mellitus tipo 1. Entretanto, sua eficiência é dramaticamente afetada pelo rendimento das ilhotas no processo de isolamento/purificação e pela viabilidade das células após o transplante. As ilhotas pancreáticas isoladas são obtidas através da perfusão do pâncreas com colagenase e purificação em gradiente de densidade. As espécies reativas de oxigênio (ERO) exercem um papel importante durante a obtenção e o transplante de ilhotas pancreáticas humanas, contribuindo significativamente para diminuir a viabilidade dessas células. Nesse trabalho foram avaliadas as respostas oxidativas de ilhotas pancreáticas humanas durante os processos de isolamento/purificação e cultivo. As atividades da superóxido dismutase (SOD), da catalase, bem como os níveis de oxidação em proteínas mostraram-se, na maioria dos casos, aumentados, principalmente durante a etapa de purificação das ilhotas em gradiente de Ficoll e no período de cultura das ilhotas. Esses resultados indicam que a purificação em gradiente de Ficoll parece ser uma etapa crítica de geração das ERO, assim como longos períodos de cultivo. Porém, verificou-se que influências advindas dos diferentes doadores (idade, causa- mortis, estilo de vida, etc.) e condições de preservação do órgão (tempo de isquemia, solução de conservação, etc.) poderiam estar relacionadas à discrepância de alguns resultados encontrados. Com o intuito de minimizar tais variáveis, optou-se por estudar os efeitos relacionados ao Ficoll em células de insulinoma INS-1E, um modelo celular fisiologicamente semelhante. Para tanto, as atividades das enzimas antioxidantes SOD, catalase, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), assim como os danos oxidativos em proteínas e lipídeos, os níveis de glutationa reduzida (GSH) e de glutationa oxidada (GSSG), a viabilidade celular e os níveis de algumas enzimas envolvidas no processo apoptótico como p38, JNK-1, ERK 1-2 e PI3-K expostas a polissacarose (1100 mg/mL), um genérico do Ficoll, foram determinadas. De acordo com os resultados, as atividades da SOD, catalase e GPx presentes em amostras expostas a polissacarose mostraram-se aumentadas. Em cultura, a atividade de isoforma mitocondrial da SOD (Mn-SOD) de células INS-1E correspondeu a 50% da atividade total da SOD. Na presença da polissacarose, a atividade da Mn-SOD aumentou para 80% do total. Além disso, a oxidação de lipídios e de proteínas aumentou e os níveis de GSH e GR diminuíram discretamente. Estes resultados mostraram que a exposição dessas células a polissacarose está associada com o estresse oxidativo. Entretanto, tal exposição não foi responsável pela diminuição da viabilidade celular embora os níveis protéicos de JNK-1, ERK1-2 e PI3-K tenham se mostrado consideravelmente aumentados e os níveis de p38, diminuídos. Os níveis de expressão e a atividade de enzimas antioxidantes são conhecidamente baixos em ilhotas pancreáticas. A N-acetilcisteína (NAC) foi adicionada em cultura de células para prevenir o estresse oxidativo. Nessas condições, a NAC foi capaz de proteger as células INS-1E do estresse oxidativo induzido. Esses resultados sugerem que a exposição à polissacarose está associdada ao estresse oxidativo em células INS-1E e que a NAC foi capaz de prevenir a morte celular de células INS-1E expostas a ERO através do aumento intracelular de GSH. / Human pancreatic islet transplantation is considered a promising strategy to cure the cure Diabetes Mellitus type I. However, transplantation efficiency is dramatically affected by sub-optimum islet recovery in the isolation/purification procedure and islet viability after transplantation. Isolated pancreatic islets are obtained through collagenase perfusion and cell purification in a Ficoll gradient. Reactive oxygen species (ROS) play an important role during human pancreatic islet isolation and may contribute to the decrease in cell viability. The aim of this study was evaluated the response of human pancreatic islets during its isolation/purification and culture time. Activities of superoxide dismutase (SOD) and catalase as well as protein oxidation levels increased in most of analyzed samples, mainly during the Ficoll gradient islet purification step and further culture. Ficoll seems to be the critical step for ROS generation. Nevertheless, it was observed that donors characteristics (aging, cause of death, habits, etc.) and organ preservation conditions (ischemic time, preservation solution, etc.) may be related to our results. To minimize these variations, a physiological cellular model based on INS-1E cells was chosen. The antioxidant enzymes SOD, catalase, glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities as well the oxidative damage to proteins and lipids, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) levels, cellular viability and the protein levels of some enzymes responsible for apoptotic signaling like p38, JNK-1, ERK 1-2 and PI3-K upon exposure to polysucrose (1100 mg/mL), a similar of Ficoll, were determined. The SOD, catalase and GPx in samples exposed to polysucrose displayed hight activities. In all cultures, the activity of mitochondrial isoform of SOD (Mn-SOD) corresponds to 50% of total SOD activity. In the presence of polysucrose, the activity of Mn-SOD increased up to 80%. Lipids and protein oxidation levels were also increased and the GSH levels with the GR activity decreased. These results indicated that the exposure of INS-1E cells to polysucrose is associated with oxidative stress. However, the polysucrose exposure was not responsible for cell death although JNK-1, ERK1-2 and PI3-K levels showed hight levels but not p38, upon polysucrose exposure. The expression and activities of antioxidants enzymes are known to be very low in pancreatic islets. N-acetylcysteine (NAC) was added to the INS-1E cultures to prevent oxidative stress. Under these conditions, NAC was able to protect INS- 1E cells from induced oxidative damage by increasing intracellular GSH levels. Taken together, these results suggest that the exposure to polysucrose is related to the oxidative stress in INS-1E cells and NAC seems to be able to maintain cell viability.

Orientador: Pablo A. Fiorito / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia/Química.

Objetivos. Avaliar o papel do transplante de células hematopoiéticas (TCH) e da interleucina 6 (IL – 6) sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD). Métodos. A concentração de malondialdeído (MDA), o conteúdo de carbolinas e sulfidrilas e a concentração de ácido hexacosanóico (C26:0) foram quantificados no plasma de pacientes X-ALD antes e após serem submetidos ao TCH. E, a concentração de MDA, a formação de carbonilas e a concentração de IL-6 foram quantificados em plasma e o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foi quantificado em eritrócitos de pacientes X-ALD com fenótipos cerebral infantil (cALD) ou assintomáticos no momento diagnóstico. Resultados. Observamos um aumento significativo na concentração de MDA em plasma de pacientes X-ALD antes e após o TCH em comparação ao grupo controle e uma redução significativa nesses valores após o transplante em comparação aos anteriores ao procedimento. Verificamos uma redução significativa no conteúdo de sulfidrilas no plasma de pacientes X-ALD antes do TCH em comparação ao grupo controle e um aumento significativo desses níveis após o TCH. Não observamos diferenças significativas no conteúdo de carbonilas no plasma de X-ALD antes e após o TCH, em comparação aos controles, apesar de observarmos uma redução significativa nesta determinação nos pacientes após o transplante em relação a antes do TCH. Os pacientes X-ALD apresentam níveis plasmáticos de C26:0 significativamente aumentados antes do TCH em comparação aos controles e, após o TCH, as concentrações de C26:0 foram reduzidas. Observamos uma correlação negativa significativa entre a medida do conteúdo de sulfidrilas e os níveis plasmáticos de C26:0 de indivíduos X-ALD antes do TCH. Também evidenciamos elevados níveis de MDA e da formação de carbonilas no plasma de pacientes cALD e assintomáticos em comparação ao grupo controle. Ainda, observamos redução significativa do conteúdo de GSH nos dois grupos testados comparados aos controles. A quantificação de IL-6 foi significativamente maior nos pacientes cALD, o que não foi observado nos pacientes assintomáticos, apesar destes mostrarem uma tendência de aumento da concentração de IL-6. Conclusões. Os resultados obtidos a partir do plasma de pacientes X-ALD antes e após o TCH demonstram que esta terapia, quando bem indicada e bem sucedida, tem alta efetividade em reduzir a concentração plasmática de C26:0 e é eficaz em reduzir a peroxidação lipídica e o dano oxidativo às proteínas nos pacientes X-ALD. Ainda, é possível relacionar o acúmulo de C26:0 e o dano oxidativo na patogênese da X-ALD. Nossos dados permitem sugerir que a lipoperoxidação e o dano oxidativo às proteínas possam de alguma forma estar envolvidos na fisiopatologia da X-ALD. Além disso, podemos presumir que, nos pacientes X-ALD assintomáticos estudados, o dano oxidativo e os aspectos inflamatórios desempenham papéis importantes na evolução e nas futuras manifestações do fenótipo neuronal. Também podemos supor que a administração de antioxidantes deve ser considerada como uma terapia adjuvante potencial para os pacientes assintomáticos e sintomáticos afetados pela X-ALD, inclusive para aqueles submetidos ao TCH. / Objective. We aimed to evaluate the role of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and interleukin 6 (IL – 6) on various parameters of oxidative stress in X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) patients. Methods. Malondialdehyde (MDA), sulfhydryl, carbonyl and hexacosanoic acid (C26:0) levels were measured in plasma from X-ALD patients before and after HSCT. And, MDA, carbonyl and IL-6 levels were measured in plasma and reduced glutathione (GSH) content was measured in erythrocytes from X-ALD patients with different phenotype (asymptomatic and childhood cerebral (CCER patients) at diagnosis moment. Results. We observed increased levels of MDA in plasma from X-ALD before and after HSCT compared to control group, but there was a significant reduction in MDA values after transplantation compared to levels found before the procedure. We verified a significant decrease in sulfhydryl content in plasma of X-ALD patients before HSCT compared with the control group and we also verified a significant increase in the levels of sulfhydryl content after HSCT. No significant differences were observed in carbonyl content in plasma of X-ALD before and after HSCT, compared to controls. However, we observed a significant reduction of plasma carbonyl content from X-ALD patients after HSCT compared to before HSCT. X-ALD patients presented a significant increase of C26:0 plasma level before HSCT when compared to controls and an important reduction of C26:0 plasma concentration in X-ALD patients after HSCT when compared to before HSCT C26:0 levels. We observed an inverse significant correlation between sulfhydryl content and plasma C26:0 levels of X-ALD individuals before HSCT. We also evidenced high levels of MDA and carbonyl formation in plasma from CCER and asymptomatic patients compared to controls. Still, we observed a significant decrease of GSH content in both groups tested compared to controls. The quantification of IL-6 is significantly higher in CCER patients, which is not observed in asymptomatic patients, despite these patients show a tendency of increased concentration of IL-6. Conclusions. The results obtained from plasma of X-ALD patients before and after HSCT demonstrate that this therapy, when well indicated and successful, has high effectiveness in reducing C26:0 plasma and is effective in reducing lipid peroxidation and oxidative damage to proteins in X-ALD patients. Still, it is possible to relate the accumulation of C26:0 and oxidative damage in the pathogenesis of X-ALD. Our data also suggest that lipid peroxidation and protein damage may somehow be involved in the pathophysiology of X-ALD. Moreover, we can assume that in our asymptomatic X-ALD patients, oxidative damage and inflammatory issues seem to play an important role in the evolution and future manifestations of neuronal phenotype. We can also assume that the administration of antioxidants should be considered as a potential adjuvant therapy for asymptomatic and symptomatic patients affected by X-ALD, including those that are submitted to HSCT.

Objetivos. Avaliar o papel do transplante de células hematopoiéticas (TCH) e da interleucina 6 (IL – 6) sobre vários parâmetros de estresse oxidativo em pacientes com Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD). Métodos. A concentração de malondialdeído (MDA), o conteúdo de carbolinas e sulfidrilas e a concentração de ácido hexacosanóico (C26:0) foram quantificados no plasma de pacientes X-ALD antes e após serem submetidos ao TCH. E, a concentração de MDA, a formação de carbonilas e a concentração de IL-6 foram quantificados em plasma e o conteúdo de glutationa reduzida (GSH) foi quantificado em eritrócitos de pacientes X-ALD com fenótipos cerebral infantil (cALD) ou assintomáticos no momento diagnóstico. Resultados. Observamos um aumento significativo na concentração de MDA em plasma de pacientes X-ALD antes e após o TCH em comparação ao grupo controle e uma redução significativa nesses valores após o transplante em comparação aos anteriores ao procedimento. Verificamos uma redução significativa no conteúdo de sulfidrilas no plasma de pacientes X-ALD antes do TCH em comparação ao grupo controle e um aumento significativo desses níveis após o TCH. Não observamos diferenças significativas no conteúdo de carbonilas no plasma de X-ALD antes e após o TCH, em comparação aos controles, apesar de observarmos uma redução significativa nesta determinação nos pacientes após o transplante em relação a antes do TCH. Os pacientes X-ALD apresentam níveis plasmáticos de C26:0 significativamente aumentados antes do TCH em comparação aos controles e, após o TCH, as concentrações de C26:0 foram reduzidas. Observamos uma correlação negativa significativa entre a medida do conteúdo de sulfidrilas e os níveis plasmáticos de C26:0 de indivíduos X-ALD antes do TCH. Também evidenciamos elevados níveis de MDA e da formação de carbonilas no plasma de pacientes cALD e assintomáticos em comparação ao grupo controle. Ainda, observamos redução significativa do conteúdo de GSH nos dois grupos testados comparados aos controles. A quantificação de IL-6 foi significativamente maior nos pacientes cALD, o que não foi observado nos pacientes assintomáticos, apesar destes mostrarem uma tendência de aumento da concentração de IL-6. Conclusões. Os resultados obtidos a partir do plasma de pacientes X-ALD antes e após o TCH demonstram que esta terapia, quando bem indicada e bem sucedida, tem alta efetividade em reduzir a concentração plasmática de C26:0 e é eficaz em reduzir a peroxidação lipídica e o dano oxidativo às proteínas nos pacientes X-ALD. Ainda, é possível relacionar o acúmulo de C26:0 e o dano oxidativo na patogênese da X-ALD. Nossos dados permitem sugerir que a lipoperoxidação e o dano oxidativo às proteínas possam de alguma forma estar envolvidos na fisiopatologia da X-ALD. Além disso, podemos presumir que, nos pacientes X-ALD assintomáticos estudados, o dano oxidativo e os aspectos inflamatórios desempenham papéis importantes na evolução e nas futuras manifestações do fenótipo neuronal. Também podemos supor que a administração de antioxidantes deve ser considerada como uma terapia adjuvante potencial para os pacientes assintomáticos e sintomáticos afetados pela X-ALD, inclusive para aqueles submetidos ao TCH. / Objective. We aimed to evaluate the role of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and interleukin 6 (IL – 6) on various parameters of oxidative stress in X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) patients. Methods. Malondialdehyde (MDA), sulfhydryl, carbonyl and hexacosanoic acid (C26:0) levels were measured in plasma from X-ALD patients before and after HSCT. And, MDA, carbonyl and IL-6 levels were measured in plasma and reduced glutathione (GSH) content was measured in erythrocytes from X-ALD patients with different phenotype (asymptomatic and childhood cerebral (CCER patients) at diagnosis moment. Results. We observed increased levels of MDA in plasma from X-ALD before and after HSCT compared to control group, but there was a significant reduction in MDA values after transplantation compared to levels found before the procedure. We verified a significant decrease in sulfhydryl content in plasma of X-ALD patients before HSCT compared with the control group and we also verified a significant increase in the levels of sulfhydryl content after HSCT. No significant differences were observed in carbonyl content in plasma of X-ALD before and after HSCT, compared to controls. However, we observed a significant reduction of plasma carbonyl content from X-ALD patients after HSCT compared to before HSCT. X-ALD patients presented a significant increase of C26:0 plasma level before HSCT when compared to controls and an important reduction of C26:0 plasma concentration in X-ALD patients after HSCT when compared to before HSCT C26:0 levels. We observed an inverse significant correlation between sulfhydryl content and plasma C26:0 levels of X-ALD individuals before HSCT. We also evidenced high levels of MDA and carbonyl formation in plasma from CCER and asymptomatic patients compared to controls. Still, we observed a significant decrease of GSH content in both groups tested compared to controls. The quantification of IL-6 is significantly higher in CCER patients, which is not observed in asymptomatic patients, despite these patients show a tendency of increased concentration of IL-6. Conclusions. The results obtained from plasma of X-ALD patients before and after HSCT demonstrate that this therapy, when well indicated and successful, has high effectiveness in reducing C26:0 plasma and is effective in reducing lipid peroxidation and oxidative damage to proteins in X-ALD patients. Still, it is possible to relate the accumulation of C26:0 and oxidative damage in the pathogenesis of X-ALD. Our data also suggest that lipid peroxidation and protein damage may somehow be involved in the pathophysiology of X-ALD. Moreover, we can assume that in our asymptomatic X-ALD patients, oxidative damage and inflammatory issues seem to play an important role in the evolution and future manifestations of neuronal phenotype. We can also assume that the administration of antioxidants should be considered as a potential adjuvant therapy for asymptomatic and symptomatic patients affected by X-ALD, including those that are submitted to HSCT.