Camundongos tratados com DMBA, hidrocarboneto policíclico aromático (HPA), diminuem células da medula óssea (MO) e baço. Este processo envolvido na metabolização dos HPA depende da ativação do receptor aryl hidrocarboneto (Ahr). Duas linhagens de camundongos selecionados geneticamente para máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda (AIR) à uma substância não imunogênica difere quanto a susceptibilidade a indução por DMBA. Examinamos os efeitos do DMBA na MO. Somente camundongos AIRmin tratados com uma dose de 50mg/kg ip de DMBA depleta o total de células na MO. Células Mielóides e células B de camundongos AIRmin tratados com DMBA perdem a capacidade proliferativa depois do tratamento in vitro com GM-CSF e LPS, respectivamente. Por outro lado camundongos AIRmax e AIRmin são igualmente susceptíveis aos efeitos tóxicos dos metabólitos do benzeno (75mg/Kg fenol/hidroquinona durante 3 dias/2x dia). Observamos um aumento na expressão de CYP1A1 e Ahr nas células da MO as 12hs nos AIRmin e supressão as 24hs nos AIRmax após tratamento com DMBA. Ahr e principalmente CYP1A1 podem mediar a toxicidade das células da MO nos AIRmin. / In mice treated with DMBA, Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (PAH), decreases the bone marrow (BM) and spleen cellularity. This process involves the metabolism of the PAHs that depends on the activation of the aryl hydrocarbon receptor (Ahr).Two lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) or Minimal (AIRmin) local Acute Inflammatory Response (AIR) to a non immunogenic substance differs in susceptibility induced by DMBA. Examined the effects of DMBA on BM. Only AIRmin mice treated with one dose of 50mg/kg ip DMBA depletion of total BM cells. Myeloid cells and B cells from DMBA treated AIRmin mice showed impaired proliferation after in vitro GM-CSF and LPS, respectived. On the other hand, AIRmax and AIRmin mice are equally susceptible to the toxic effects of the Benzene (75mg/Kg phenol and hydroquinone during 3 days/2x day). An increase in CYP1A1 and Ahr expression in AIRmin at 12h and a suppression in AIRmax BM cells were observed after 24h of DMBA treatment. Ahr and mostly CYP1A1 mediate the toxicity of DMBA for AIRmin BM cells.

Os objetivos desse estudo transversal foram avaliar a presença e a quantidade subgengival de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola e Dialister pneumosintes, em indivíduos portadores de Gengivite associada apenas à placa bacteriana, Periodontite Crônica e Periodontite Agressiva, e correlacionar os resultados quantitativos com parâmetros clínicos periodontais (PCS e NCI). Dados clínicos e amostras de placa bacteriana subgengival foram coletados de um total de 176 indivíduos sendo, 67 indivíduos com Gengivite associada apenas à placa bacteriana (Grupo G), 71 com Periodontite Crônica (Grupo PC) e 38 com Periodontite Agressiva (Grupo PA). As amostras clínicas foram processadas pela PCR em tempo real através do uso de iniciadores e sondas específicos para regiões altamente conservadas do gene 16S rRNA de cada espécie bacteriana. Os resultados demonstraram a detecção dos cinco patógenos nos três grupos analisados, havendo associação significativa entre grupo e presença da bactéria para P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola e D. pneumosintes (p<0,01). A bactéria A. actinomycetemcomitans apresentou semelhantes freqüências de detecção nas condições periodontais analisadas (Grupo G, 100%; Grupo PC, 94,4%; Grupo PA, 92,1%), não havendo associação significativa entre grupo e presença dessa bactéria (p=0,09). As quantidades subgengivais de A. actinomycetemcomitans e de T. forsythia foram significativamente maiores no grupo PA (1,66x106 ± 5,39x106 e 1,96x106 ± 4,82x106, respectivamente), em relação aos grupos G (8,28x104 ± 1,76x105 e 3,86x105 ± 1,96x106, respectivamente) e PC (2,25x104 ± 3,11x104 e 3,59x105 ± 1,40x106, respectivamente), não havendo diferenças significativas entre os grupos para as cargas subgengivais das demais bactérias. A correlação obtida entre as cargas bacterianas subgengivais e os parâmetros clínicos, PCS e NCI, foi fraca ou muito fraca. / The aims of this cross-sectional study were to evaluate the presence and subgingival quantity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola and Dialister pneumosintes, in individuals with Gingivitis associated with dental plaque only, Chronic Periodontitis and Aggressive Periodontitis, and correlate the quantitative results with periodontal clinical parameters (PD and CAL). Clinical data and subgingival plaque samples were collected from a total number of 176 individuals, among whom there were 67 individuals with Gingivitis associated with dental plaque only (Group G), 71 with Chronic Periodontitis (Group CP) and 38 with Aggressive Periodontitis (Group AP). The clinical samples were processed by real-time PCR with the use of specific primers and probes for regions of the highly conserved 16S rRNA gene of each bacterial species. The results demonstrated the detection of the five pathogens in the three analyzed groups, and there was significant association between the group and presence of the bacteria for P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola and D. pneumosintes (p<0.01). The bacterium A. actinomycetemcomitans presented similar frequencies of detection under the periodontal conditions analyzed (Group G, 100%; Group CP, 94.4%; Group AP, 92.1%), and there was no significant association between group and the presence of this bacterium (p=0.09). The subgingival quantities of A. actinomycetemcomitans and T. forsythia were significantly higher in the Group AP (1.66*106 ± 5.39*106 and 1.96*106 ± 4.82*106, respectively), in comparison with Groups G (8.28*104 ± 1.76*105 and 3.86*105 ± 1.96*106, respectively) and CP (2.25*104 ± 3.11*104 and 3.59*105 ± 1.40*106, respectively), there being no significant differences among the groups with regard to the subgingival loads of the other bacteria. The correlation obtained between the subgingival bacterial loads and the clinical parameters PD and CAL was weak or very weak.

A interface do implante com o componente protético geralmente apresenta lacunas que servem de nichos para a colonização bacteriana. A proposta deste estudo é verificar a eficácia do dimetacrilato na vedação desta interface. Foram utilizados 20 implantes ósseos Bone Level® Straumann, indicados para reabilitação protética unitária cimentada. Os pilares protéticos foram instalados nos grupos controle e experimental, adicionando-se o dimetacrilato à interface da conexão protética. Foram realizadas uma coleta inicial e uma coleta ao final do período de 90 dias no interior de cada implante, e através da técnica de PCR quantitativo foi analisada a infiltração e a detecção das espécies bacterianas Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia. No Grupo Controle, todas as amostras apresentaram quantificação de microrganismos, confirmando infiltração bacteriana. No Grupo Experimental, apenas 30% das amostras apresentou quantificação após o período estudado. Assim, a ausência de bactérias no Grupo Experimental foi associada ao tratamento com o dimetacrilato para o período. Quando considerada a presença de pelo menos uma das bactérias específicas estudadas nas amostras, a diferença também foi estatisticamente significante. Entretanto, mais estudos devem ser desenvolvidos a fim de verificar se a vedação será eficiente por períodos mais longos. / The implant/prosthetic component interface often has gaps that serve as niches for bacterial colonization. The purpose of this study is to verify the effectiveness sealing this interface with dimethacrylate. Twenty two Straumann ® Bone Level implants was installed in areas with indication for single cemented prosthetic rehabilitation. The prosthetic components were installed in the control and experimental groups following the fabricant instructions, and adding the dimethacrylate in the interface of the experimental group. An initial collection and a second collection at the end of 90 days within each implant were performed, and after that, the technique of quantitative PCR was developed to analyze whether there was infiltration and detection of four bacterial species: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia. In the control group, all samples showed quantification of microorganisms, confirming bacterial percolation. In the control group, only 30% of the samples submitted quantification after the study period. Thus, the absence of bacteria in the experimental group was associated with the treatment for the period dimethacrylate. Considering the presence of at least one specific bacteria in the samples studied, the difference was also statistically significant. However, more studies should be conducted to verify that the seal will be effective for longer periods.

As leishmanioses constituem um grupo de zoonoses causadas por várias espécies do gênero Leishmania. O diagnóstico molecular associado aos exames clínicos, sorológicos e parasitológicos facilitam a investigação epidemiológica e controle das infecções. A PCR convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) são utilizadas para detectar moléculas de DNA do parasita em diferentes amostras biológicas, no entanto, quando a carga parasitária é baixa, resultados falsos-negativos são comuns na rotina diagnóstica. O objetivo deste estudo foi o avaliar a utilidade dos iniciadores para qPCR para substituir ou associar à cPCR no diagnóstico molecular da leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA). Foram testados iniciadores moleculares pelo sistema TaqMan® com o objetivo de discriminar Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi a partir de sequências da actina de Leishmania. O gênero Leishmania foi identificado pelos iniciadores LEISH18S que amplifica uma região 18S de Leishmania. Os iniciadores ACTLDon amplifica uma região da actina de L. (L.) infantum chagasi. L. (V.) braziliensis foi identificada pelos iniciadores ACTLVian, que amplifica uma região da actina do complexo L. (V.) braziliensis. Foram testadas 581 amostras de DNA, extraídas de sangue, necropsias de órgãos, aspirados de linfonodo ou medula e biópsia de lesão. Para LV foram testadas 361 amostras (243 caninas e 118 humanas). Destas, 214 foram positivas na cPCR, foi o padrão ouro, e a sensibilidade com os iniciadores da qPCR variou de 92,99% (199) a 95,32% (204). A especificidade foi determinada por 147 amostras negativas na cPCR e variou de 95,91% (141) a 98,63% (145). Os índices de concordância variaram de 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) a 95,32% (RV1-RV2 e LEISH18S). Foram testadas 220 amostras para LTA. A especificidade com os iniciadores foi determinada por 80 amostras negativas e os resultados foram 98,75% e 100% para LEISH18S e ACTLVian respectivamente, e das 140 amostras positivas na cPCR 129 (92.14%) e 124 (88,57%) foram positivas com os iniciadores LEISH18S e ACTLVian respectivamente. Os índices de concordância foram de 88,57% (LB-3C/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) e 92,14% (LB-3C/LU-5A e LEISH18S). Estes resultados mostram que a associação dos iniciadores para qPCR em conjunto com a cPCR pode aumentar a detecção do parasita em amostras clínicas. / Leishmaniasis are a group of zoonosis caused by several species belonging to the genus Leishmania. The molecular diagnostic associated with the clinical, serological and parasitological examination favor the epidemiological investigation and the infection control. The conventional PCR (cPCR) and the real time PCR (qPCR) are used to detect the parasite as from DNA molecules in a number of biological samples, however, when the parasite load is low, false results are common in the diagnostic routine. The ain of the present study was to evaluate the advantage of the primers in qPCR in order to replace or associate with cPCR in the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) molecular diagnostic. The primers were tested on TaqMan® system in order to discriminate Leishmania (Viannia) braziliensis and Leshmania (Leishmania) infantum chagasi based on a sequence of Leishmania actin. The genus Leishmania was recognized by the primer LEISH18S, which amplifies an 18S region of Leishmania. The primer ACTLDon amplifies a region of the L. (L.) infantum chagasi actin. The L. (V.) braziliensis was determined by the primer ACTLVian and this primer amplifies a region of the L. (V.) braziliensis complex actin. A total of 581 DNA samples were tested. These samples were extracted from blood, organs necropsy, lymph node and bone marrow aspirate and lesion biopsy. A number of 361 samples (243 canine and 118 human) were tested for VL. From these 361 samples, 241 were positive in cPCR and the sensitivity in the qPCR primers ranged from 92,99% (199) to 95,32 (204). The specificity was determined by 147 negative samples in cPCR and ranged from 95,91% (141) to 98,63 % (145). The agreement indices ranged from 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) to 95,32% (RV1-RV2 and LEISH18S). A total of 220 samples were tested for CL. The primer\'s specificity was determined by 80 negative samples and the results were 98,75% and 100% for LEISH18S and ACTLVan respectively, and from 140 positive samples in cPCR 129 (92,14%) and 124 (88,57%) were positive for primers LEISH18S and ACTLVian respectively. The agreement indices were 88,57% (LB-3/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) and 92,14% (LB-3C/LU-5A and LEISH18S). These results show that the primers for qPCR are likely to improve the detection of the parasite in clinical samples. These results show that the associate use of qPCR primers with cPCR primers can increase the detection of the parasite in clinical samples.

O presente estudo objetivou investigar a relação genética entre linhagens isoladas de infecções endodônticas e sistêmicas, bem como sua correlação com marcadores de virulência e resistência antimicrobiana. As linhagens genéticas de 40 isolados clínicos de E. faecalis foram determinadas por Multilocus sequence typing. Clusters virulentos foram investigados por PCR quanto à presença do polimorfismo do operon da cápsula, genes associados à virulênciae resistência antimicrobiana. A maioria dos isolados sistêmicos pertencia ao complexo clonal 2, eram produtores de cápsula e carregavam muitos genes de virulência/resistência. Por outro lado, isolados endodônticos apresentaram uma maior diversidade genética, eram em sua maioria não-capsulados e com poucos genes de virulência. Concluímos que isolados endodônticos de E. faecalis apresentaram um perfil genético e de virulência diferente dos clusters patogênicos de pacientes hospitalizados, provavelmente devido a especialização ao nicho de colonização conferida principalmente por regiões variáveis no genoma. / The aim of the present study was investigate the genetic relation between lineages isolated from endodontic and systemic infections, as well as its correlation with virulence markers and antibiotic resistance. The genetic lineages of 40 E. faecalis clinical isolates were determined by Multilocus sequence typing. Virulent clusters were investigated by PCR for the presence of capsule operon polymorphism, genes associated to virulence and antibiotic resistance. Most systemic isolates belonged to clonal complex 2, were capsule-producers and carried many virulence/resistance genes. On the other hand, endodontic isolates presented a greater genetic diversity, were mostly non-capsulated and carried few virulence genes. We conclude that endodontic isolates of E. faecalis showed a different genetic and virulence profile of pathogenic clusters of hospitalized patients, probably due to a specialized niche colonization conferred primarily by variable regions in the genome.

A cosmomicina D é um policetídeo aromático da família das antraciclinas com propriedades antitumorais e antimicrobianas produzida por Streptomyces olindensis. A elucidação de genes responsáveis pela síntese desta molécula foi abordada neste trabalho com as técnicas de LDGW-PCR e PCR que permitiram amplificar fragmentos gênicos envolvidos na formação da aglicona. O cluster gênico completo foi caracterizado numa região de 43,1 kb produto do seqüenciamento do genoma, onde se agruparam funcionalmente 40 ORFs em varias categorias: síntese de aglicona, reguladores, glicosiltransferases, deoxiaçúcares, resistência e com função desconhecida. Visando obter mutantes nulos para os genes cosS e cosY foram construidos os plasmídeos pCCSII e pCCYII onde a transformação da cepa selvagem com pCCSII resulto na cepa mutante SoDS, deficiente em produção de cosmomicina. As analises dos produtos obtidos da expressão de ambos os genes mostrou um efeito na redução de cosmomicina e supressão de intermediários do complexo antitumoral. / Cosmomycin D produced by Streptomyces olindensis is an aromatic polyketide of the anthracycline family with antitumor and antimicrobial properties. The amplification of genes responsible for the molecule synthesis were approached in this study by LDGW-PCR and PCR techniques, the obtained fragments showed high similarities with genes involved in aglycon core assembly. The complete gene cluster was characterized in a genome region of 43.1 kb product of genome sequencing, containing 40 ORFs grouped functionally into different categories: aglycon synthesis, regulators, glycosyltransferases, deoxisugars, resistance and unknown function. In order to obtain null mutants for cosS and cosY genes, the plasmids pCCSII pCCYII were constructed, the transformation of the wild strain with pCCSII result in SoDS mutant, deficient in production of cosmomycin. The analyses of the obtained products from the expression of both genes showed an effect in reducing cosmomycin levels and suppression of various intermediates in the antitumor complex.

Foram analisados dentes decíduos com cárie dental profunda de 110 crianças, sendo coletadas 103 amostras de polpa necrosada e 7 de fístulas gengivais. Morfotipos bacterianos foram visualizados pelas colorações de Gram e Brenn-Brown, e os DNA foram obtidos e usados na detecção bacteriana por PCR. A predominância de cocos Gram positivos (81,8%) e cocobacilos Gram negativos (49,1%) foram observadas. Em 88 amostras de polpas, microrganismos com maior ocorrência foram: Enterococcus spp. (50%), P. gingivalis (49%), F. nucleatum (25%) e P. nigrescens (11,4%). Foram detectados em fístulas: P. gingivalis (43%), Enterococcus spp. (28,6%), F. nucleatum (14,3%), P. nigrescens (14,3%), e D. pneumosintes (14,3%). Os nossos resultados permitem concluir que a microbiota envolvida nas infecções pulpares em dentes decíduos é similar em termos qualitativos àquela observada em dentes permanentes. Entretanto, a predominância de Enterococcus spp. e P. gingivalis deve ser levado em consideração pelos clínicos em casos necessários de tratamento endodôntico em crianças com dentição decídua. / In this study, deciduous teeth with deep caries from 110 children, with 103 pulp necrosis and 7 gingival fistula samples were evaluated. Bacterial morphotypes were visualized by Gram staining and Brown-Brenn. DNA were obtained and used in bacterial detection by using PCR. The predominance of Gram-positive cocci (81.8%) and Gram-negative coccobacilli (49.1%) were observed. In 88 pulp samples a high frequency of microrganisms were observed: Enterococcus spp. (50%), P. gingivalis (49%), F. nucleatum (25%) and P. nigrescens (11.4%). In fistulas were detected: P. gingivalis (43%), Enterococcus spp. (28.6%), F. nucleatum (14.3%), P. nigrescens (14.3%), and Dialister pneumosintes (14.3%). Our results, suggest that the involved microbiota in pulp infections of deciduous teeth are qualitatively similar than those permanent teeth. However, a predominance of Enterococcus spp. and P. gingivalis was observed, and it must be considered in the endodontic treatment in children with primary dentition.

As leishmanioses constituem um grupo de zoonoses causadas por várias espécies do gênero Leishmania. O diagnóstico molecular associado aos exames clínicos, sorológicos e parasitológicos facilitam a investigação epidemiológica e controle das infecções. A PCR convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) são utilizadas para detectar moléculas de DNA do parasita em diferentes amostras biológicas, no entanto, quando a carga parasitária é baixa, resultados falsos-negativos são comuns na rotina diagnóstica. O objetivo deste estudo foi o avaliar a utilidade dos iniciadores para qPCR para substituir ou associar à cPCR no diagnóstico molecular da leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA). Foram testados iniciadores moleculares pelo sistema TaqMan® com o objetivo de discriminar Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi a partir de sequências da actina de Leishmania. O gênero Leishmania foi identificado pelos iniciadores LEISH18S que amplifica uma região 18S de Leishmania. Os iniciadores ACTLDon amplifica uma região da actina de L. (L.) infantum chagasi. L. (V.) braziliensis foi identificada pelos iniciadores ACTLVian, que amplifica uma região da actina do complexo L. (V.) braziliensis. Foram testadas 581 amostras de DNA, extraídas de sangue, necropsias de órgãos, aspirados de linfonodo ou medula e biópsia de lesão. Para LV foram testadas 361 amostras (243 caninas e 118 humanas). Destas, 214 foram positivas na cPCR, foi o padrão ouro, e a sensibilidade com os iniciadores da qPCR variou de 92,99% (199) a 95,32% (204). A especificidade foi determinada por 147 amostras negativas na cPCR e variou de 95,91% (141) a 98,63% (145). Os índices de concordância variaram de 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) a 95,32% (RV1-RV2 e LEISH18S). Foram testadas 220 amostras para LTA. A especificidade com os iniciadores foi determinada por 80 amostras negativas e os resultados foram 98,75% e 100% para LEISH18S e ACTLVian respectivamente, e das 140 amostras positivas na cPCR 129 (92.14%) e 124 (88,57%) foram positivas com os iniciadores LEISH18S e ACTLVian respectivamente. Os índices de concordância foram de 88,57% (LB-3C/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) e 92,14% (LB-3C/LU-5A e LEISH18S). Estes resultados mostram que a associação dos iniciadores para qPCR em conjunto com a cPCR pode aumentar a detecção do parasita em amostras clínicas. / Leishmaniasis are a group of zoonosis caused by several species belonging to the genus Leishmania. The molecular diagnostic associated with the clinical, serological and parasitological examination favor the epidemiological investigation and the infection control. The conventional PCR (cPCR) and the real time PCR (qPCR) are used to detect the parasite as from DNA molecules in a number of biological samples, however, when the parasite load is low, false results are common in the diagnostic routine. The ain of the present study was to evaluate the advantage of the primers in qPCR in order to replace or associate with cPCR in the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL) molecular diagnostic. The primers were tested on TaqMan® system in order to discriminate Leishmania (Viannia) braziliensis and Leshmania (Leishmania) infantum chagasi based on a sequence of Leishmania actin. The genus Leishmania was recognized by the primer LEISH18S, which amplifies an 18S region of Leishmania. The primer ACTLDon amplifies a region of the L. (L.) infantum chagasi actin. The L. (V.) braziliensis was determined by the primer ACTLVian and this primer amplifies a region of the L. (V.) braziliensis complex actin. A total of 581 DNA samples were tested. These samples were extracted from blood, organs necropsy, lymph node and bone marrow aspirate and lesion biopsy. A number of 361 samples (243 canine and 118 human) were tested for VL. From these 361 samples, 241 were positive in cPCR and the sensitivity in the qPCR primers ranged from 92,99% (199) to 95,32 (204). The specificity was determined by 147 negative samples in cPCR and ranged from 95,91% (141) to 98,63 % (145). The agreement indices ranged from 92,99% (RV1/RV2; LEISH18S e ACTLDon) to 95,32% (RV1-RV2 and LEISH18S). A total of 220 samples were tested for CL. The primer\'s specificity was determined by 80 negative samples and the results were 98,75% and 100% for LEISH18S and ACTLVan respectively, and from 140 positive samples in cPCR 129 (92,14%) and 124 (88,57%) were positive for primers LEISH18S and ACTLVian respectively. The agreement indices were 88,57% (LB-3/LU-5A/ACTLVian/LEISH18S) and 92,14% (LB-3C/LU-5A and LEISH18S). These results show that the primers for qPCR are likely to improve the detection of the parasite in clinical samples. These results show that the associate use of qPCR primers with cPCR primers can increase the detection of the parasite in clinical samples.

O carcinoma cervical invasivo é o terceiro tipo de câncer que mais acomete as mulheres no mundo, sendo responsável por 270 mil óbitos por ano. Estudos multicêntricos puderam identificar a presença do DNA do HPV em quase 100% dos carcinomas cervicais, estando já bem esclarecido que o papilomavírus humano (HPV) é causa para o câncer cervical, sendo fator necessário, mas não suficiente para o desenvolvimento da doença. A melhor forma de evitar o câncer de colo do útero é a prevenção. Considera-se como prevenção primária a vacina anti-HPV e, como prevenção secundária, o rastreio de lesões precursoras do câncer, seja pela citologia oncótica ou o rastreio molecular. Este último, por identificar a presença de DNA de HPV de alto risco oncogênico, tem se mostrado a maneira mais eficaz. Existem dúvidas sobre o melhor teste a ser usado para este tipo de rastreio, uma vez que existem ensaios distintos que identificam diferentes genes alvo, considerando-se que, durante o processo de integração do genoma do HPV ao genoma do hospedeiro, pode ocorrer a perda de qualquer um dos genes virais. Este pode ser um dos motivos de alguns tumores cervicais apresentarem resultados falsos negativos para HPV. Neste trabalho foram utilizadas 57 amostras de câncer cervical confirmadas no exame anatomopatológico, negativas para HPV na plataforma BD Onclarity HPV Assay(TM), cujo gene alvo é E6/E7 e positivas para beta-globina humana, provenientes de um estudo anterior. Usando o restante do DNA já extraído, essas amostras foram genotipadas no sistema INNO-LiPA HPV Genotyping Extra II(TM), que tem como alvo o gene L1. Como controle, foram testadas mais 27 amostras cujo resultado foi positivo para algum tipo de HPV de alto risco naquela plataforma. Para tanto, selecionamos a amostra seguinte a cada uma das amostras negativas, cujo resultado fosse positivo. Nosso principal achado foi a constatação de que a concordância entre os dois métodos testados é boa (Kappa 70). Das 84 amostras genotipadas nas duas plataformas, 64 (76,2%) tiveram os mesmos resultados, sendo 26 negativas, 15 inadequadas e 23 positivas. No entanto, 20 amostras (23,8%) tiveram resultados discordantes. Para tentar esclarecer estes casos, foi realizado o ensaio de PCR em tempo real para HPV 16 com alvo em E7 em 4 amostras positivas para HPV nos dois métodos e 2 amostras com resultado de HPV 16 apenas em um dos ensaios. Nenhum dos testes deste estudo pôde chegar a 100% de positividade nestes tumores cervicais, apesar da histologia realizada pelo setor de anatomia patológica do ICESP ter confirmado serem todos tumores primários do colo do útero. Assim sendo, sugerimos que esses resultados falsos negativos podem ser devidos a problemas na coleta do material, na preservação ou dificuldade dos métodos detectarem HPV em amostras fixadas em formol e embebidas em parafina, hipótese reforçada pela concordância obtida nos casos considerados inadequados para análise pelos dois métodos. / Invasive cervical carcinoma is the third most common form of cancer in the world, accounting for 270,000 deaths per year. Multicenter studies have identified the presence of HPV DNA in almost 100% of cervical carcinomas, and it is well established that human papillomavirus (HPV) is cause of cervical cancer, being necessary, but not sufficient to the development of the disease. The best way to avoid cervical cancer is prevention. Primary prevention is the anti-HPV vaccine, and secondary prevention the screening of cancer precursor lesions, by either oncotic cytology or molecular screening, to identify the presence of high-risk oncogenic HPV. There are questions as to which test should be used for this type of screening, since they use different target genes, knowing that during the integration of the HPV genome into the host genome, any of the viral genes can be deleted . This may be one reason some cervical tumors have false negative results for HPV. In this work, we evaluated 57 samples of cervical cancer, confirmed by anatomic pathological examination, negative for HPV on the BD Onclarity HPV Assay(TM) platform, whose target is the E6 / E7 gene and positive for beta-globin, from a previous study using the remaining extracted DNA. These samples were genotyped by the INNO-LiPA HPV Genotyping Extra system, with target in L1 gene. As controls, we tested another 27 samples that were positive for some type of high-risk HPV on that platform. To do so, we selected the following sample to each of the negative samples, whose result was positive. Our main finding was that the results of the two methods were in good concordance (Kappa 70). Of the 84 genotyped samples in both platforms, 64 (76.2%) had the same results, 26 were negative, 15 inadequate and 23 were positive. Twenty samples (23.8%), however, presented different results. In the attempt to clarify the discordant cases, we performed real-time PCR for HPV 16 with E7 target, in four HPV positive samples in both methods, and two positive in only one of the assays. None of the tests in this study could reach 100% positivity in these cervical tumors, although the histology performed by ICESP\'s pathology department has confirmed that they were all primary tumors of the cervix. Therefore, these false negative results may be due to problems in the sample collection, preservation or difficulty of the methods to detect HPV DNA in formalin-fixed and paraffin-embedded samples, a hypothesis reinforced by the agreement obtained in cases considered unsuitable for analysis by the two methods.

A definição de caso confirmado de leishmaniose visceral é baseada em aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. As técnicas padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral são as parasitológicas esfregaço e cultura de aspirado de medula óssea, que permitem a identificação do gênero Leishmania por visualização microscópica do parasito em lâmina, e os testes sorológicos, como o imunocromatográfico, que apresenta baixa sensibilidade em indivíduos imunodeprimidos. Em determinadas situações, como na coinfecção Leishmania/HIV, para o tratamento específico ou nos inquéritos epidemiológicos, faz-se necessária a identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral, que comumente é a L. (L.) infantum. Desse modo, propusemos um algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, com o emprego da kDNA PCR (K20-K22 E RV1-RV2) do ITS1 PCR (LITSR e L5. 8S), tendo como referência os resultados obtidos nos exames parasitológicos e sorológicos, além de dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Complementando nossa proposta, a realização da técnica de análise dos polimorfismos dos fragmentos da ITS1 PCR por RFLP, para identificação do agente etiológico, foi avaliada como alternativa à laboriosa técnica de eletroforese de isoenzimas, padrão-ouro para definição de espécies no diagnóstico das leishmanioses. As técnicas moleculares empregadas foram validadas em 82 amostras (ITS 1 PCR e kDNA PCR RV1-RV2) e 48 amostras (kDNA PCR K20-K22) de pacientes com leishmaniose visceral confirmada e em 30 amostras de pacientes saudáveis. Os ensaios obtiveram as seguintes sensibilidades: 97,5% (80/82) na ITS1 PCR, 98% (47/48) na kDNA PCR K20-K22, e 92,7% (76/82) na kDNA PCR RV1-RV2, e 100% de especificidade em todos os testes. Quando comparados os resultados obtidos nos testes moleculares ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 e kDNA PCR RV1-RV2 ao padrão ouro observou-se uma concordância quase perfeita, com um índice kappa maior que 0,80, e um valor de p < 0,001. No que concerne à realização da ITS1 PCR RFLP nas 80 amostras positivas, 52,5% (42/80) demonstraram perfil semelhante ao de L. (L.) infantum. Três das amostras que não demonstraram perfil na RFLP da ITS1 PCR e na kDNA PCR K20-K22 obtiveram mais de 90% de identidade com a cepa de L. (L.) chagasi, mediante análise das amostras na técnica do sequenciamento. Concluímos o presente estudo com a proposta de um algoritmo de diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, que deverá considerar a realização prévia do diagnóstico parasitológico e imunocromatográfico. E sugerimos, quando necessário, a realização da kDNA PCR K20-K22 e a kDNA PCR RV1-RV2 para a determinação do gênero e de subgênero da Leishmania, respectivamente. Por fim, que se complemente com a ITS1 PCR, seguida da ITS1 RFLP para a definição do agente etiológico da leishmaniose visceral. / The definition of visceral leishmaniasis case is based on clinical, epidemiological and laboratory aspects. The gold standard techniques for laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis are parasitological, smear and culture of bone marrow aspirate, which allow the identification of Leishmania in microscopic visualization, and the serological tests, like the immunochromatographic, which presents low sensitivity in immunodepressed individuals. In certain situations, such as Leishmania/HIV co-infection, for specific treatment or in epidemiological surveys, it is necessary to identify the etiological agent of visceral leishmaniasis, commonly caused by L. (L.) infantum. In this way, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis by kDNA PCR (K20/K22 and RV1/RV2) and ITS1 PCR (LITSR e L5.8S) was proposed, using as the gold standard, the parasitological and serological results, as well as clinical and epidemiological data of patients. Complementing our proposal, the performance of the Restriction Fragment Length Polymorphism of the ITS1 (ITS1 PCR RFLP) to identify the etiological agent, was evaluated as an alternative to technical laboriously isoenzyme electrophoresis, the gold standard for defining species in the diagnosis of leishmaniasis. The molecular techniques were validated on 82 samples (ITS 1 kDNA PCR and PCR-RV1 RV2) and 48 samples (K20-K22 kDNA PCR) from patients with confirmed visceral leishmaniasis and 30 samples from healthy patients. The following sensitivities were presented by the molecular tests: 97.5% (80/82) for the ITS1 PCR, 98% (47/48) for kDNA PCR K20-K22 and 92.7% (76/82) for kDNA PCR-RV2 RV1, and 100% specificity for all tests. When comparing the results from molecular tests ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 and kDNA PCR RV1-RV2 with the established gold standard, we see an almost perfect agreement with kappa index higher than 0.80, and p value <0.001 were obtained. As regard to ITS1 PCR RFLP, from 80 positive samples, 52.5% (42/80) showed a similar profile to that of L. (L.) infantum. Three of the samples that did not demonstrate RFLP profile in the ITS1 PCR and PCR kDNA K20-K22 obtained more than 90% of identity with strain L. (L.) chagasi, by analyzing the samples in sequencing. As our conclusion, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis must consider a previous performance of the parasitological and immunochromatographic diagnosis. When necessary kDNA PCR K20-K22 and kDNA RV1-RV2 PCR are suggested to determine the genus and the subgenus Leishmania, respectively. In addition, this molecular diagnosis can be complemented, with the ITS1 PCR, followed by RFLP ITS1, which can define the etiological agent of visceral leishmaniasis.