Resumo: As plantas daninhas da família Poaceae são as principais plantas que infestam a cultura de cana-de-açúcar. As espécies de gramíneas conhecidas por capim-colchão, estão entre as de maior ocorrência nas lavouras de cana-de-açúcar no Brasil. Atualmente o uso do controle químico está sendo o mais empregado para controle de Digitaria, porém há alguns relatos de falha no controle, principalmente com referência a herbicidas pertencentes ao grupo das triazinas, que bloqueiam a cadeia fotossintética, no fotossistema. As técnicas moleculares estão sendo bem recomendadas para análise da diversidade genética em plantas daninhas. Para a caracterização molecular vinte iniciadores foram utilizados para o RAPO e, para o PCR¬RFLP utilizou-se de dois iniciadores específicos P1 e P2 e a enzima de restrição Mael. O seqüenciamento foi realizado com o amplicom produzido com os iniciadores P1 e P2. Para o tratamento químico utilizou-se a ametrina. Com isso, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar dez acessos de Digitaria spp. por marcadores RAPO e PCR¬RFLP, sequenciar uma região conservada do gene psbA e verificar possíveis associações entre o polimorfismo desse gene e a resposta fenotípica à ametrina. Pela análise molecular não houve variabilidade genética entre os acessos e todos apresentaram a mesma resposta fenotípica ao herbicida utilizado. Com esses resultados, concluiu-se que o capim-colchão dos dez acessos estudados pertence à espécie Digitaria nuda e não foi observada relação entre a ocorrência de polimorfismo e a suscetibilidade à ametrina, provavelmente porque todos os acessos estudados foram controlados na dose recomendada do herbicida. / Abstract: The weed of family Peaceae are the most important infesting sugarcane crop plants. The gramineous species known as crabgrass are among the ones with high occurrence in Brazil sugarcane crop. Presently the use of chemical control is being the most common way used for the control of Digitaria, but with few controlling occurrences fails, with emphasis for those herbicides belonging to triazine group which block the photosynthetic chain at the photosystem II leveI. Molecular techniques are being recommended for the analysis of the genetic diversity such weed. For the molecular characterization twenty primers were used for RAPO and for the PCR¬RFLP a set of two specific primers P1 and P2 were used together with restriction enzyme Mael. The ONA sequencing was performed with an amplicon sample produced with the primers P1 and P2. For the chemical treatment control ametryn was selected. Thus this work had objectives as follows: to characterize ten accessions of Digitaria spp. by RAPO and PCR-RFLP markers, and to sequence a conserved region of the psbA gene so as to investigate the possible polymorphic associations of this gene in response to the phenotypic response to ametryn. For the molecular analysis it did not have genetic variability among the accessions and all had presented the same phenotypic response to the used herbicide. Based on the obtained results, it is concluded the crabgrass that ten collected accessions belong to the species Digitaria nuda, and it was not observed any relation among the polymorphism and susceptibility to ametryn probably because all the studied accessions had been controlled in the recommended dose of the herbicide. / Orientador: Janete Apparecida Desidério Sena / Coorientador: Pedro Luís da Costa Aguiar Alves / Banca: Robinson Antonio Pitelli / Banca: Josélia Oliveira Marques / Banca: Nubia Maria Correia / Banca: José Eduardo Garcia / Doutor

O neuroblastoma é o tumor sólido extra-cranial mais comum e mortal da infância, sendo o tempo de sobrevida nos casos mais agressivos ainda muito curto. Uma das esperanças nesses casos é que os estudos moleculares possam fornecer informações sobre os genes ou as vias moleculares que governam a patogênese dos neuroblastomas. Pois, há poucos genes como o MYCN, que foi descrito por estar diretamente ligado ao neuroblastoma. A amplificação deste oncogene ocorre em pouco mais de 25% dos neuroblastomas e é considerada como o mais importante marcador de prognóstico nestes tumores, sendo fortemente relacionada aos estádios avançados da doença e falha no tratamento. Outros genes do amplicon do MYCN, incluindo o DDX1 \"DEAD box polypeptide 1 gene\" e o NAG \"neuroblastoma-amplified gene\", estão sendo observados por se apresentarem co-amplificados com o MYCN. Entretanto, a importância deste fenômeno no prognóstico ainda é desconhecida. Os objetivos deste trabalho foram determinar qual o melhor método para estudar a amplificação dos genes MYCN, DDX1 e NAG, além de esclarecer a importância da coamplificação dos genes DDX1 e NAG no prognóstico. Procedimento: O número de cópias dos genes MYCN, DDX1 e NAG foi determinado por PCR em Tempo Real e PCR convencional em 100 neuroblastomas primários. Os dados da PCR em Tempo Real foram analisados por quantificação absoluta e relativa. Os resultados da PCR convencional foram analisados por eletroforese em gel de agarose, medindo a intensidade das bandas formadas no gel no sistema Kodak. A relevância da amplificação gênica como marcador de prognóstico foi avaliada em 74 pacientes, dos quais nós obtivemos o acompanhamento clínico. Resultados: Nos 74 casos estudados, ambos os métodos demonstraram que a amplificação do MYCN estava associada com os estádios mais avançados da doença. A análise das curvas de sobrevida livre de progressão confirmou que pacientes com ausência de amplificação do MYCN apresentavam maior tempo de sobrevida. Nós também analisamos a amplificação do DDX1 nas mesmas amostras incluindo aquelas com ausência de amplificação de MYCN. Não foi encontrada nenhuma relação entre a co-amplificação com idade ao diagnóstico ou tempo de sobrevida. Conclusões: Os métodos aplicados para calcular o número de cópias dos genes na PCR em Tempo Real mostraram-se equivalentes. A PCR em Tempo Real apresentou maior acurácia nos resultados quando comparada à PCR convencional. A análise da sobrevida não demonstrou relação entre a amplificação dos genes DDX1 e/ou NAG com piora no prognóstico. / Neuroblastoma is the most common and deadly extra-cranial solid childhood tumor. Survival rates for aggressive neuroblastomas are still disappointingly low. One of the hopes is that molecular studies will provide insights into the genes and molecular pathways that govern neuroblastoma pathogenesis. However, at present only a few genes as MYCN have been directly linked to neuroblastoma. MYCN oncogene amplification, occurring in up to 25% of neuroblastomas, has been considered the most important prognostic factor, strongly correlating to advanced stage disease and treatment failure. Another genes in the MYCN amplicon, including the DEAD box polypeptide 1 (DDX1) gene, and neuroblastoma-amplified gene (NAG gene), have been found to be frequently co-amplified with MYCN in NB. But the prognostic significance of the coamplification remains unclear. The aims of this study were to evaluate which is the best method to study the gene amplification of those three genes MYCN, DDX1 and NAG, as well as clarify the prognostic significance of the co-amplification or DDX1 and NAG with MYCN. Procedure: The gene copy numbers of MYCN, DDX1, and NAG were determined by the real-time quantitative polymerase chain reaction and conventional polymerase chain reaction in 100 primary NBs. Real-Time data were analyzed by absolute and relative quantification. For conventional PCR, samples were electrophoresed on a 2% agarose gel and the intensity of each band evaluated by Kodak image software. To evaluate of the prognostic significance of the gene amplification we had only 74 cases in witch we could analyze the follow-up. Results: In all 74 cases, both methods demonstrated that MYCN amplification was associated mainly with advanced cancer stages, and the analysis of overall survival confirmed that patients without MYCN amplification had a cumulative survival significantly higher than patients with oncogene amplification. We also studied DDX1 and NAG amplification for all NB samples even that without MYCN amplification. No relationship between any gene co-amplification status and disease stage, age at diagnosis, or overall survival was found. Conclusions: The two methods used to calculate gene copy number for Real Time PCR assay shown to be equivalent. Real Time PCR assay shown to be more accurate to study gene amplification than conventional PCR assay. Survival analysis pointed out that DDX1 and/or NAG amplification has no additional adverse effect on prognosis.

As amostras sangüíneas de 108 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de Fibrose Cística foram analisadas com o objetivo de padronizar uma PCR clássica e uma PCR- ASO para a detecção da mutação delta F508. Dos 108 pacientes analisados, 23 eram homozigotos para a deleção delta F508 (21,29%), 50 eram heterozigotos (46,29%), e 35 não portadores (32,40%). Ambas as PCR apresentaram reprodutibilidade de 100%, e houve concordância absoluta entre os resultados deste estudo e aqueles dos laboratórios de referência. Concluímos que as padronizações propostas foram bem sucedidas, e recomendamos que os pacientes sejam testados com as duas técnicas, o que, encarece a investigação laboratorial, porém, aumenta significativamente o grau de confiabilidade dos resultados / Blood samples were drawn from 110 clinically and laboratory diagnosed Cystic Fibrosis patients in order to standardize one classical amplification and one ASO-PCR for detecting the delta F508 mutation. Twenty-four of 110 patients (21,8%) were homozygous for the delta F508 deletion, 51 were heterozygous, and the remaining 35 (31,8%) were non-carriers. Both PCR techniques presented with 100% reproducibility, and there were no discrepancies between our results and those from the reference laboratories. We concluded that the 2 amplification systems were successfully standardized in this study, and recommended that all patients should be tested by both techniques in order to increase reliability, albeit the increment of laboratory costs

A Lawsonia intracellularis é uma bactéria intracelular obrigatória que causa Enterite Proliferativa em vários animais, como suínos, cervos, ratos, hamsters, cobaios, coelhos, ovinos, eqüinos, raposas, cães, furões, primatas não humanos, emas e avestruzes. Atualmente não há relatos da ocorrência do agente ou dos sinais clínicos de sua infecção em aves comerciais (Gallus gallus domesticus). O presente estudo reporta a detecção através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) de Lawsonia intracellularis em matrizes pesadas de diferentes idades provenientes de quatro linhagens de aves comerciais. Dentre os 100 suabes de fezes colhidos a partir de fragmentos intestinais, 34% foram positivos para a detecção do agente pela PCR. O agente foi encontrado com maior freqüência em aves de 80 semanas de idade apresentando ou não quadro diarréico. Os fragmentos intestinais das aves cujas fezes foram positivas para detecção de Lawsonia intracellularis foram submetidos ao exame histopatológico e na maioria das lesões analisadas foi observada enterite necrótica crônica proliferativa. Apesar das lesões serem sugestivas de infecção por Lawsonia intracellularis pela coloração de Warthin-Starry, a presença do patógeno no interior dos enterócitos ou células glandulares não foi observada. Esses resultados poderiam levar a novas pesquisas sobre a importância da Lawsonia intacellularis na avicultura do Brasil e do mundo. / Lawsonia intracellularis is an obligate intracellular bacterium responsible for proliferative enteritis in many animals, such as swine, deers, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, ovine, horses, foxes, dogs, ferrets, no human primats, emus and ostrichs. Currently there is no reports about the occurrence of this agent or clinical signs of its infection in chickens (Gallus gallus domesticus). The present study reports the detection of Lawsonia intracellularis at different ages of broiler breeder in four avian commercials lineages by Polymerase Chain Reaction (PCR). Of 100 faecal swabs collected from intestinal fragments, 34% were positive for Lawsonia intracellularis detection by PCR. The agent was more frequently found in chickens of 80 weeks of age presenting or not diarrhea. The intestinal fragments which faeces were positive for Lawsonia intracellularis PCR detection were submitted to histopathological exam and in the most analysed lesions were observed proliferative necrotic cronic enteritis. Although the lesions were suggestive of L. intracellularis infection by Warthin-Starry staining, the presence of the pathogen inside of enterocytes or gland cells was not observed. This results could lead to new researches about the mean of Lawsonia intacellularis in broiler industry of Brazil and the world.

O objetivo deste estudo foi avaliar a plataforma OpenArray para testes genéticos em doadores de sangue e determinar as frequências genotípicas e alélicas de alterações pontuais (SNPs) associadas à trombose venosa (G1691A e G20210A), à hiperhomocisteinemia (C677T, A1298C), e à hemocromatose hereditária (C282Y, H63D e S65C) na população de doadores de sangue de São Paulo, Brasil. Foram analisadas 400 amostras de sangue total coletadas de outubro a novembro de 2011. A detecção dos SNPs foi realizada utilizando a tecnologia de microarray em superfície sólida OpenArray. As amostras também foram analisadas utilizando a técnica de PCR em Tempo Real sistema FRET para comparação dos resultados e determinação da acurácia do sistema OpenArray. Observamos que houve 100% de concordância de resultados entre ambas as técnicas para todas as amostras, em todas as variantes pesquisadas, com exceção da mutação C282Y no gene HFE, a qual apresentou 99,75% de concordância. O resultado da amostra em questão foi posteriormente confirmado por sequenciamento direto (Sanger), que confirmou o resultado fornecido pelo método OpenArray. As frequências calculadas para cada SNP foram: FV G1691A 98,8% (G/G), 1,2% (G/A); FII G2021A 99,5% (G/G), 0,5% (G/A); MTHFR C677T 45,5% (C/C), 44,8% (C/T), 9,8% (T/T); MTHFR A1298C 60,3% (A/A), 33,6% (A/C), 6,1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78,1%(C/C), 20,3% (C/G), 1,6% (G/G); e HFE S65C 98,1% (A/A), 1,9% (A/T). Esses resultados descrevem as frequências de SNPs associados a doenças e são importantes para aprimorar o conhecimento atual do perfil genético da população de doadores de sangue brasileiros, embora um estudo maior seja necessário para determinar com a maior acurácia a frequência das mutações pesquisadas. Além disso, observamos que a plataforma OpenArray, demonstrou alta taxa de concordância com o método de PCR em Tempo Real sistema FRET. / The aim of this study was to evaluate the OpenArray platform for genetic testing of blood donors and to assess the genotype frequencies of nucleotide-polymorphisms (SNPs) associated with venous thrombosis (G1691A and G20210A), hyperhomocysteinemia (C677T, A1298C), and hereditary hemochromatosis (C282Y, H63D and S65C) in blood donors from Sao Paulo, Brazil. We examined 400 blood donor samples collected from October to November 2011. The SNPs were detected using OpenArray technology. The blood samples were also examined using a real-time PCR-FRET system to compare the results and determine the accuracy of the OpenArray method. We observed 100% agreement in all assays tested, except HFE C282Y, which showed 99.75% agreement. The HFE C282Y assay was further confirmed through direct sequencing, and the results showed that OpenArray analysis was accurate. The calculated frequencies of each SNP were FV G1691A 98.8% (G/G), 1.2% (G/A); FII G2021A 99.5% (G/G), 0.5% (G/A); MTHFR C677T 45.5% (C/C), 44.8% (C/T), 9.8% (T/T); MTHFR A1298C 60.3% (A/A), 33.6% (A/C), 6.1% (C/C); HFE C282Y 96%(G/G), 4%(G/A), HFE H63D 78.1%(C/C), 20.3% (C/G), 1.6% (G/G); and HFE S65C 98.1% (A/A), 1.9% (A/T).Taken together, these results describe the frequencies of SNPs associated with diseases and are important to enhance our current knowledge of the genetic profiles of Brazilian blood donors, although a larger study is needed for a more accurate determination of the frequency of the alleles. Furthermore, the OpenArray platform showed a high concordance rate with standard FRET RT-PCR

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

Nos últimos anos a incidência da clorose letal, causada pelo Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) vem aumentando em plantios de cucurbitáceas e preocupando produtores pelos danos causados na produção. Devido às poucas informações sobre esta virose em cucurbitáceas, somente algumas medidas profiláticas de controle têm sido recomendadas para minimizar a incidência da doença. A resistência genética, seja da forma tradicional ou por meio da transgenia, é considerada a melhor e mais eficiente forma de controle de viroses em geral. Sendo assim essa proposta de pesquisa visou caracterizar a resistência da moranga Exposição ao ZLCV, para gerar informações que auxiliem programas de melhoramento vegetal e também estudar a possível interferência do Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) e do Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) na resistência das plantas ao ZLCV. A infecção pelo ZLCV e sua movimentação na planta foram avaliadas por PTA-ELISA, RT-PCR, impressão de tecido (Tissue printing) e teste de recuperação biológica. Os resultados mostraram que o vírus pôde ser detectado no local da infecção, mas não foi detectado além do ponto de inoculação. Estes resultados sugerem que a moranga Exposição apresenta uma resistência à invasão sistêmica de longa distância ao ZLCV. Para verificar a possível interferência dos potyvirus na resistência da moranga Exposição ao ZLCV foram conduzidos experimentos em casa de vegetação, onde os vírus foram inoculados em mistura nas plantas teste e experimentos em campo onde os potyvirus foram pré-inoculados e a infecção pelo ZLCV ocorreu naturalmente pelo vetor. Em nenhum dos casos foi verificada interferência dos potyvirus na resistência das plantas de moranga ao ZLCV. / The occurrence of lethal chlorosis in the past years, caused by Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV), has become common in cucurbit crops, which concerns producers in terms of yield losses. Due to the lack of information about this virus disease, only few prophylactic precautions have been recommended in order to minimize the occurrence of the disease. The genetic resistance, either via conventional means or via transgenesis, is considered the most efficient way so far to control virus diseases. With that in mind, the present work aimed to characterize the genetic resistance of winter squash Exposição against ZLCV in order to generate important information for cucurbit breeding programs, as well as to investigate the potential effect of Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) and Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) in winter squash Exposição resistance against ZLCV. The ZLCV infection and its systemic mobility inside the plant were evaluated by PTA-ELISA, RT-PCR, tissue printing and biological recovery test. The results have shown that ZLCV can be detected at the infection spot, but was not detected beyond the inoculation point. These results suggest that winter squah Exposição is resistant to long-distance systemic invasion of ZLCV. In order to verify the potential interference of the potyviruses on the winter squash Exposição resistance against ZLCV, experiments were carried out into greenhouse, where the viruses were inoculated together into testing plants, and also in field trials, where the potyviruses were pre-inoculated and the infection by ZLCV naturally occurred by the vector. Interference of potyviruses on the winter squash resistance was not observed via the investigation methods presented.

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.

Foram desenhados três pares de primers, sendo um deles dirigido ao gene que codifica uma proteína periplasmática da Brucella (BP26) e dois outros dirigidos para a região interespaçadora entre os gene 16S e 23S do RNA ribossômico (ITS). Com os primers acima, foram padronizadas três PCRs, potencialmente capazes de detectar qualquer espécie de Brucella e denominadas PCR-ITS1, PCR-ITS2 e PCR-BP26. Soluções de DNA de sangue de cão livre de Brucella foram contaminadas com quantidades decrescentes de DNA de B. canis (RM6/66) e, então, submetidas às PCRs descritas anteriormente. Para a avaliação das PCRs quanto à capacidade de detecção de Brucella spp. em sangue de animais naturalmente infectados, foram utilizadas 75 amostras de sangue de cães provenientes de canis comerciais onde foram registrados casos clínicos sugestivos de infecção por Brucella. As 75 amostras de sangue de cães foram colhidas com anti-coagulante (citrato de sódio) por punção da veia jugular. As amostras foram separadas em duas alíquotas, uma das quais (2 ml) foi submetida ao isolamento e identificação bacteriológica e a outra alíquota (1ml), às PCRs. O DNA total das amostras de sangue foi extraído por método baseado em digestão com proteinase K, SDS e CTAB seguido de purificação com fenol e clorofórmio. Considerando os resultados da PCR de melhor desempenho (PCR-ITS1), entre as 35 amostras positivas pelo isolamento bacteriano, 30 (85,71%) foram positivas pela técnica de PCR, enquanto entre as 40 amostras negativas pelo cultivo bacteriológico, 11 (27,5%) foram positivas pela PCR. A PCR-ITS1 foi capaz de detectar um mínimo de 3,78fg de DNA bacteriano misturado a 450ng de DNA de cão, o que representa, teoricamente, a massa genômica de 1,26 bactérias. Pela aparente superior capacidade de classificar animais positivos que o método de cultura bacteriológica, a PCR-ITS1 parece ser uma técnica promissora para o diagnóstico direto da brucelose em cães. / Three pair of primers were designed against Brucella genetic sequences. Two of them were directed to 16S-23S rRNA interspacer and the other was directed to a periplasmatic protein coding gene (BP26). Three PCRs assays named PCR-ITS1, PCR-ITS2 and PCR-BP26, each one putatively capable of amplifying DNA from any Brucella species were tested using the aforementioned primers. Nucleic acid extracts from whole-blood from naïve dogs were spiked with decreasing amounts of B. canis (RM6/66) DNA and the resulting solutions were tested by PCR. The capability of the PCRs to amplify Brucella spp. genetic sequences from naturally infected dogs was evaluated by using 75 whole-blood samples from dogs raised in commercial kennels were clinically affected animals have already been detected with signs suggestive of Brucella infection. The whole-blood samples were collected with sodium citrate as anti-coagulant by venal puncturing the jugular vein. The samples were split into two aliquots, one of them (2mL) being submitted to bacterial isolation and identification and the remaining sample (1mL) to PCR. The DNA from whole-blood was extracted by using proteinaseK, SDS and CTAB following phenol-chloroform purification. Considering the results from the PCR with the best performance (PCR-ITS1), within 35 isolation positive samples, 30 were positive by PCR. Within 40 isolation negative samples, 11 were positive by PCR. PCR-ITS1 was capable of detecting as few as 3.78fg of bacterial DNA mixed to 450ng of host DNA. Theoretically, 3.78fg of Brucella DNA represents the total genomic mass of 1.26 bacterial cells. The superior ability of PCR-ITS1 on classifying positive animals suggest that PCR-ITS1 is a promising tool for the direct detection of canine brucellosis.

Resumo:O presente estudo investigou a ocorrência de Tritrichomonas foetus em gatos no Brasil. T. foetus é um protozoário que em felinos coloniza o cólon causando colite. O sinal clínico é a diarreia crônica do intestino grosso. Gatos infectados podem apresentar resolução espontânea da diarreia, mas podem permanecer infectados pela vida toda. Existem três métodos diagnósticos mais difundidos que identificam a presença de T. foetus nas fezes do animal, sendo: o exame direto das fezes utilizando o microscópio óptico, a cultura e a PCR. No presente estudo, foram comparados dois métodos diagnósticos, o exame direto das fezes e a PCR. Também foi realizado o sequenciamento genético. Foram colhidas amostras fecais de 129 gatos por meio da técnica de lavado retal. Cada amostra foi examinada ao microscópio óptico. A presença de DNA do T. foetus foi verificada pela PCR através da amplificação de 347 pares de bases a partir dos primers TFR3 e TFR4. Amplicons dos casos positivos foram sequenciados. T. foetus foi observado em uma amostra através do exame diretos das fezes, enquanto que a PCR foi positiva para cinco gatos (6,45%). À análise estatística não houve correlação significativa entre positividade para T. foetus e sexo, idade, raça, presença de diarreia, histórico de diarreia, tratamento prévio, estilo de vida, ambiente, origem dos animais e presença de coinfecções. O isolado de T. foetus mostrou 100% de similaridade com outros isolados do parasito de felino no mundo e revelou polimorfismo num único nucleotídeo (T>C) quando comparado com o isolado de bovino. Devido ao crescente interesse sobre este parasito em gatos, o presente estudo visa contribuir com futuros registros da ocorrência do T. foetus em gatos visto que se trata do primeiro estudo sobre sua ocorrência no Brasil / Abstract:The present study investigated the occurrence of T. foetus in cats from Brazil. T. foetus is a protozoan that in cats it colonizes the colon resulting in colitis. The major clinical sign is chronic large bowel diarrhea. Infected cats may have spontaneous resolution of diarrhea, but they can remain infected for all life. In veterinary medical practice, there are three most widespread diagnostic methods that identify T. foetus in animal feces: direct examination of feces under the microscope, culture and PCR. In the present study, it was compared two diagnosis methods, direct examination of feces and PCR. And also it was done the genetic sequencing. Fecal samples from 129 cats were collected by rectal flush technique. Each sample was examined by optical microscopy (direct examination). The presence of T. foetus DNA was verified using PCR by amplification of 347 bases pairs from the primers TFR3 and TFR4. Amplicons of positive cases were sequenced. T. foetus was observed in one sample by direct microscopic examination of feces while PCR was positive in five cats (6.45%). Statistical analyses showed no significant associations between T. foetus infection and sex, age, breed, presence of diarrhea, history of diarrhea, previous treatment, lifestyle, environment, origin of the animals, and co-infections. The isolate of T. foetus showed 100% identical sequences with other T. foetus isolates from cats around the world and revealed a single nucleotide polymorphism (T>C) when compared with T. foetus isolate from cattle. Due the increasing interest in this parasite in cats, the present study contributes in further reporting the worldwide occurrence of T. foetus in cats because it is the first study about its occurrence in Brazil. / Orientador:Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca:Rosangela Zacarias Machado / Banca:Gosele Fabrino Machado / Mestre