Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T01:51:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 297593.pdf: 1091974 bytes, checksum: c69f67dcc2b97a7b63484a12f1e4985e (MD5) / Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e PCR quantitativa em tempo real são usadas para detecção e quantificação de ingredientes geneticamente modificados (GM) em alimentos. Os objetivos deste trabalho foram desenvolver iniciadores e sondas para detecção dos elementos cry1A.105 e cry2Ab2 presentes no evento de milho GM MON89034; aplicar técnicas de PCR e PCR em tempo real para avaliar alimentos disponíveis no mercado brasileiro quanto à presença de material GM; e analisar os resultados segundo as exigências de legislação e rotulagem para esses produtos. Diferentes alimentos derivados de milho e soja foram analisados quanto à presença dos eventos de milho GM Bt11 e Bt176 e do evento de soja GM Roundup Ready (RR). No primeiro estudo, a presença dos eventos de milho GM Bt11 e Bt176 foi avaliada em 81 produtos derivados de milho (farinha de milho, fubá, biju e polenta) comercializados no Brasil. Foi observada a ausência dos eventos Bt11 e Bt176 em todas as amostras analisadas. No segundo estudo, PCR e PCR em tempo real foram aplicadas a fim de detectar e quantificar o evento de soja RR em produtos à base de soja e em derivados de carne. No total de 59 amostras analisadas, seis foram positivas para presença do evento de soja RR e apenas uma amostra apresentou soja RR acima do limite para rotulagem. No terceiro estudo, iniciadores e sondas foram desenvolvidos e avaliados em termos de especificidade, eficiência e limite de detecção para identificação específica dos elementos cry1A.105 e cry2Ab2 presentes no evento de milho GM MON89034. Os resultados mostraram alta especificidade e eficiência para detecção de cry1A.105 e cry2Ab2 sendo o limite de detecção entre 0,05 e 0,01 ng de DNA por PCR para ambos os ensaios. Este trabalho permitiu confirmar a importância e a aplicabilidade da PCR e da PCR em tempo real para detecção e quantificação de eventos e elementos GM em alimentos. / Polymerase Chain Reaction (PCR) and quantitative real time PCR have been used to detect and to quantify genetically modified (GM) ingredients in foods. The aims of this work were: to develop primers and probes for detection of the cry1A.105 and cry2Ab2 elements present in GM maize event MON89034; to apply PCR and real time PCR to evaluate the presence of GM material in foods available at Brazilian market; and to analyze the results according to law and label requirements for these products. Different types of foods derived from maize and soy were analyzed for the presence of GM maize events Bt11 and Bt176 and GM soybean event Roundup Ready (RR). On the first study, the presence of GM maize events Bt11 and Bt176 was evaluated in 81 products derived from maize (maize flour, corn meal, maize flour flakes and polenta) commercialized in Brazil. It was observed the absence of GM maize Bt11 and Bt176 in all samples analyzed. On the second study, PCR and real time PCR were applied to detect and to quantify RR soybean event present in soy and meat derived products. A total of 59 samples were analyzed, six of them were positive to the presence of RR soybean event and only one sample showed RR soybean bove the limit to be labeled. On the third study, primers and probes were developed and evaluated in terms of specificity, efficiency and limit of detection for specific detection of cry1A.105 and cry2Ab2 elements present in GM maize event MON89034. The results showed high specificity and efficiency to detect cry1A.105 and cry2Ab2 with a detection limit between 0.05 and 0.01 ng of DNA per PCR for both assays. This work allowed confirming the importance and the applicability of PCR and real time PCR to detect and to quantify GM events and elements in foods.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-22T17:39:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Devido à introdução da soja geneticamente modificada Roundup ReadyTM (RR) no mercado brasileiro, a habilidade para detectar organismos geneticamente modificados (OGMs) tornou-se uma necessidade legal. O Decreto 4.680 de 24 de Abril de 2003 prevê que alimentos que contêm acima de 1 % de OGMs em sua composição devem ser obrigatoriamente rotulados. Uma vez que a legislação estipula um limite para a presença de OGMs em alimentos, a detecção qualitativa não atende à exigência imposta. É necessário, então, a utilização de uma ferramenta que forneça dados quantitativos. Tais dados, referentes à presença e teor de soja geneticamente modificada em alimentos, ainda são escassos, principalmente em relação ao Brasil. O objetivo deste trabalho foi a detecção por PCR e quantificação por PCR em tempo real de soja Roundup Ready em proteína texturizada de soja, extrato de soja e ingredientes utilizados na indústria de carnes. O DNA das 114 amostras foi extraído e purificado por um método CTAB. Todas as amostras foram submetidas à pesquisa do gene da lectina de soja, para a verificação da presença de DNA de soja amplificável. Com exceção de 7 amostras de ingredientes, todas as demais apresentaram sinal positivo para este gene. Para a detecção qualitativa de soja RR, foi utilizada uma nested PCR já estabelecida que resultou em uma sensibilidade de 0,01%, considerada aceitável para detecção de OGMs. De um total de 107 amostras analisadas, 62 apresentaram resultado positivo para soja transgênica. 40 amostras de extrato de soja e proteína texturizada foram analisadas por PCR em tempo real, sendo que apenas duas amostras de PTS estavam em desacordo com a legislação.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-23T11:07:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 239804.pdf: 3191082 bytes, checksum: d83994a4b805dea27292abefb7e3f082 (MD5) / Dirofilaria immitis is the ethiological agent of canine cardiovascular dirofilariosis or heartworm disease. This onchocercid nematode is widespread among dogs, cats, wild canids and eventually infected the human. The life cycle of parasite alternates between canids vertebrate hosts and mosquito vector. The parasite#s transmission to the dog, its main host, takes place through several mosquitoes species from the gender Culex, Aedes, Mansonia. The parasite#s detection at the vector is usually done by observation through the microscope and in the dog by the modified Knott#s method, where it is possible to observe the presence or absence of microfilarias released by the adult worm within the blood stream. However, these methods set space for errors once other kinds of worms from other filarias species might be found infecting the dog and the vector and they could be taken as D. immitis. For a more precise diagnose to this disease, techniques from molecular biology based on PCR are being developed in order to cope with the usual difficulties. In the present research we have used as a pattern the PCR for detection D. immitis, and we realized a survey of infection rates in mosquitos captured in Santa Catarina Island`s. For such, we have used the primers driven against gene, that transcrible for a surface antigene#s gene segment from the D. immitis. At the patternizing stage we used different DNA amounts withdrawn from D. immits worm, DNA from an infected and uninfected dog blood. We#ve amplified one DNA segment of 378pb of genome`s parasite with DNA extracted from Blood an infected dog. The primers sensibility allows the target segment#s amplification in a range which varies from 100 ng to 1 pg, such result points out the possibility of amplifying a minimum amount of the parasites# DNA at the dog#s blood stream and in the host. A DNA excess of 60 ng/ul extracted of dog`s blood and 80ng/ul DNA extracted the vector#s DNA does not inhibit the specific band#s amplification of the parasite. At the specificity session we did not observe the merge of unspecified bands when DNA of other kinds of nematodes and platelmints that infect dog`s. At the application#s stage in Field, a total of 400 mosquitoes of diferents species, were caugth in the north and central region of Santa Catarina Island`s and tested by PCR. Filarial DNA was found in 2,3% (1/44) of pools tested. These results prove that Oc scapularis is a natural vector of D. immitis in and indicating the existence of the disease at that specific locality Fort#s Beach. We believe that this techniques used as a pattern will be of great value to the diagnosis#s species-specific determination as well as to the canine dirofilariosis actual monitoring.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-23T13:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241375.pdf: 1485309 bytes, checksum: 05c20e06033ffcb90d5a5cb22e1c3751 (MD5) / Neste trabalho, o método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi utilizado para detecção do milho geneticamente modificado (GM) em amostras de alimentos comercializados no Brasil (farinha de milho, fubá, biju e polenta) e para duas amostras de alimentos comercializados na Argentina (farinha de milho e polenta). O método da PCR foi usado para detecção do promotor CaMV 35S (P35S) e do gene cryIA(b) em 64 amostras de alimentos. A nested PCR foi usada para o monitoramento da presença de MON810 em 81 amostras. O DNA das amostras de milho foi extraído com brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB), e a presença do DNA amplificável do milho foi evidenciada pela amplificação dos genes da invertase e da zeína. Todas as amostras foram positivas para amplificação do gene da zeína, entretanto a amplificação do gene da invertase não apresentou boa reprodutibilidade para a maioria das amostras analisadas. No total das 64 amostras brasileiras analisadas para detecção do promotor 35S e do gene cryIA(b), 1 foi positiva para ambos, gene cryIA(b) e promotor P35S, e 19 amostras foram positivas para o gene cryIA(b). A sensibilidade da nested PCR para a detecção do MON810 foi 0,1 %. No total das 81 amostras brasileiras analisadas para a detecção de MON810, nenhuma foi positiva. Ambas as amostras argentinas foram positivas para presença de P35S, gene cryIA(b) e MON810. Os resultados demonstraram a presença em uma amostra do promotor P35S e do gene cryIA(b), a presença em 18 amostras do gene cryIA(b) e ausência do milho GM MON810 nas amostras analisadas de alimentos comercializados no Brasil entre 2005 e 2007.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2012-10-23T21:39:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 263770.pdf: 3998274 bytes, checksum: 425226ccd7df05c5e380b6db8a2580d6 (MD5) / Staphylococcus xylosus é um microrganismo envolvido na fermentação de produtos cárneos e produtor de lipases extracelulares, que catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados por glicerol e ácidos graxos e são ferramentas valiosas em biotecnolgia. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar e purificar lipase recombinante de uma linhagem de Staphylococcus xylosus isolada de lingüiça colonial produzida no sul do Brasil. A extração de DNA foi realizada a partir de linhagens de S. xylosus isoladas de lingüiça colonial e de uma linhagem padrão de S. xylosus (ATCC 29971). Os fragmentos correspondentes a região madura da lipase (AF208229) foram amplificados (1,1 kb) e clonados em plasmídio pGEM-T Easy. As seqüências obtidas apresentaram homologia de 99% com o gene de lipase de S. xylosus AF208229. Estes fragmentos que correspondem à região de codificação da lipase madura foram inseridos em um plasmídeo pET14b para construir as proteínas-fusão. As proteínasfusão foram expressas em E. coli e purificadas em coluna de afinidade por metal imobilizado de níquel. As proteínas purificadas apresentaram atividade de lipase usando ésteres de p-nitrofenilpalmitato e p-nitrofenilbutirato como substratos. Desta forma, a lipase obtida a partir de Staphylococcus xylosus apresenta potencial de aplicabilidade na indústria de embutidos cárneos fermentados. Entre as bactérias predominantes envolvidas em doenças transmitidas por alimentos está a bactéria Staphylococcus aureus que produz enterotoxinas nos alimentos provocando intoxicação gastrintestinal. Os objetivos da pesquisa foram avaliar a contaminação por estafilococos coagulase positiva (ECP) em produtos cárneos e derivados de leite comercializados em Santa Catarina e detectar por PCR multiplex a presença dos genes que codificam as enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE e gene específico para espécie S. aureus. Foram coletadas 72 amostras de alimentos entre queijos tipo mussarella (15), prato (15) e colonial (15), lingüiça colonial (18) e salaminho (09) em estabelecimentos comerciais na região do Alto Uruguai Catarinense em Santa Catarina. Foram realizadas a contagem de estafilococos coagulase positiva (ECP) e a detecção por PCR dos genes específicos para S. aureus (femA) e para os genes (sea, seb, sec, sed e see) das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE, a partir do DNA extraído de 102 cepas isoladas das amostras. A presença de ECP foi detectada em 33 amostras (45,8%) de produtos de origem animal analisadas e as contagens de ECP estavam acima do valor máximo permitido pela legislação (103 UFC.g-1) em 22 amostras (30,5%). De 102 cepas isoladas ECP, para 91 (89,2%) cepas ocorreu a amplificação do gene femA. A amplificação dos genes sea, sed e see que codificam as enterotoxinas, ocorreu em 10, 12 e 4 cepas, respectivamente. Os resultados do presente trabalho confirmam que a PCR multiplex é um método rápido e sensível para análise de varredura de Staphylococcus coagulase positiva interotoxigênico, sendo altamente específica. Este trabalho sugere que os produtos analisados podem conter as enterotoxinas SEA, SED e SEE e aponta a necessidade de melhoria na produção e nos sistemas de fiscalização dos produtos analisados. Staphylococcus xylosus causes fermentation in meat products and produces extracellular lipases which catalyze hydrolysis and synthesis from esters formed by glycerol and fatty acids. These lipases are also valuable tools to biotechnolgy. The aim of this work was cloning, sequencing and express a S. xylosus recombinant lipase. The DNA extraction was made from S. xylosus strains isolated from artisanal salami and from a S. xylosus standard strain (ATCC 29971). Fragments corresponding to a mature lipase (AF208229) were amplified (1.1 kb) and cloned into pGEM-T Easy plasmid. The sequences obtained showed 99% homology with the lipase gene of S. xylosus AF208229. Fragments corresponding to the mature region of lipase were inserted into a pET14b plasmid to build fusion proteins containing histidine tail. Fusion-proteins were expressed into E. coli and then purified with nickel affinity column. Purified proteins showed lipase activity using p-nitrophenilpalmitate and p-nitrophenilbutirate esters as substrates. The lipase obtained from Staphylococcus xylosus has a potential applicability in the fermented meat industry. The other organism studied was Staphylococcus aureus which is involved in food diseases and produce enterotoxins in food causing gastrointestinal poisoning. Contamination by coagulase-positive Staphylococci (CPS) in meat and milk-derived products commercialized in Santa Catarina, Brazil was evaluated and the presence of genes for classical staphylococcal enterotoxins A, B, C, D and E (sea, seb, sec, sed and see) and for gene femA, specific por S. aureus species, by multiplex PCR, detected. A total of 72 food samples including mozzarella (15 samples), American cheese (15 samples), colonial cheese (15 samples), colonial sausage (18 samples) and salaminho (09 samples) were analised. Of 102 strains isolated CPS, for 91 (89.2%) strains of gene amplification occurred at fema. The amplification of genes sea, sed and see coding for enterotoxins, occurred in 10, 12 and 4 strains, respectively. Results of the present work confirm that multiplex PCR is a rapid and sensitive method for screening of enterotoxigenic coagulase-positive Staphylococci, being highly specific. Results also indicate that better hygiene practices and better inspection are required in the production of the foods included in the study.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos / Made available in DSpace on 2013-07-16T02:05:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 260053.pdf: 16747728 bytes, checksum: 431d6e878e5dab85f697f36db4ad4975 (MD5) / A introdução de organismos geneticamente modificados (OGMs) no comércio levou a adoção de legislação que impõe a rotulagem dos alimentos GMs. No Brasil, o decreto Nº 4680 de 24 de abril de 2003 do governo federal estabelece rotulagem para alimentos que contenham mais de 1% de OGMs, sendo necessário implementar medidas que garantam que o mesmo seja cumprido. Atualmente, a detecção de OGMs está principalmente baseada na presença de DNA GM através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Diversos fatores influenciam o desempenho da reação de PCR, destacando-se o desenho de iniciadores e a qualidade do DNA extraído. Na primeira etapa deste trabalho, foram preparadas amostras contendo 0%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1% e 10% de soja Roundup ReadyTM (RR) e a detecção de soja RR foi avaliada pela amplificação com três grupos de iniciadores a partir de DNA de soja RR extraído com três diferentes protocolos derivados do método CTAB. Os DNAs extraídos foram submetidos a PCR com os grupos de iniciadores: GMO5/GMO9 e GMO/7GMO8, RR1/RR2 e RR3/RR4; CAM/CTP, este último confirmado por digestão com BglII. As amostras extraídas com o Protocolo 3 apresentaram maior sensibilidade e as extraídas com Protocolo 1, a menor. A PCR com CAM/CTP apresentou alta sensibilidade para DNA extraído com Protocolo 3, porém não pôde ser confirmada para os demais. Os iniciadores GMO foram considerados mais adequados por apresentar boa sensibilidade (0,01% RR com Protocolo 3), além de obter perfil com menor número de bandas inespecíficas e maior repetibilidade de resultados, sendo utilizado na segunda etapa deste trabalho para detectar soja RR em seis amostras de farinha de soja e seis de fórmula infantil contendo isolado protéico de soja, com DNA extraído com Protocolo 3. Quatro das amostras de farinha apresentaram resultado positivo e nenhuma de fórmula infantil. O protocolo nested PCR com iniciadores GMO e DNA extraído pelo protocolo 3 mostrou-se adequado para a detecção de soja RR em amostras de farinha de soja e fórmula infantil. Due to the market introduction in Brazil of the genetically modified (GM) crop Roundup ReadyTM (RR) soybean, the ability to detect GM crops has became a legal necessity. The Brazilian regulatory agency (decree nº 4680, 04/24/2003) requires a labeling limit of 1% genetically modified organisms (GMO) in foodstuffs. The detection of GMO is mainly based on GM DNA presence through PCR. Several factors influence the performance of PCR, standing out the designed of primers and the extracted DNA quality. In this study, the RR soybean detection was evaluated by the amplification with three primer sets of PCR from soybean DNA extracted with three different extraction protocols. Samples containing 0%, 0,001%, 0,01%, 0,1%, 1% and 10% of RR soybean were prepared and extracted from three CTAB derived protocols. Extracted DNA was submitted to PCR with three set of primers: GMO5/GMO9 and GMO/7GMO8; RR1/RR2 and RR3/RR4; CAM/CTP, this last one confirmed by digestion with BglII. The extracted DNA samples using the Protocol 3 showed the best sensibility and the extracted ones using Protocol 1 the worst. PCR with CAM/CTP showed high sensibility for DNA extracted using Protocol 3, however it could not be confirmed for the other primers. The primers GMO were considered more appropriate for presenting good sensibility (0,01% RR with 3 Protocol), besides obtaining profile with less non-specific bands and the best repeatability of results, being used to detect RR soybean in 6 flour samples and 6 samples of infantil formula containing soybean isolated protein, extracted using Protocol 3. Four of flour soy samples showed positive result and none of infantil formula. Nested PCR using GMO primers and DNA extracted using Protocol 3 was appropriate for RR soybean detection in flour soy samples and infant formula samples.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T07:08:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290517.pdf: 1159098 bytes, checksum: 58a9d7baad568d225d6b7768c445df02 (MD5) / O câncer de colo uterino representa o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres. As estimativas mundiais sobre incidência e mortalidade por este câncer são de 493.000 casos/ano e 288.000 óbitos/ano, sendo a incidência maior em países em desenvolvimento. No Brasil, para o ano de 2010, segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA) estimou-se 18.430 novos casos. O rastreamento do câncer cervical é baseado na citologia oncótica, entretanto este é um método subjetivo, com um grau variável de resultados falso-negativos e falso-positivos. Estudos epidemiológicos e experimentais demonstram importante associação entre o Papiloma Vírus Humano (HPV) e o câncer de colo uterino, observando que este agente está presente em 99,7% dos casos. Este estudo detectou o DNA do HPV pela PCR (PCRHPV) utilizando os iniciadores consenso MY09/MY11 e nested PCR com os iniciadores GP5+/GP6+, a expressão de E6/E7 RNAm dos tipos de HPVs de alto risco 16, 18, 31, 33 e 45 pela metodologia NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) e identificou os principais tipos virais: 6, 11, 16, 18, 31, 33 e 45 pela PCR-HPVte. Os resultados foram comparados com a citologia oncótica para estimar o rendimento da PCR e a contribuição da expressão de E6/E7 RNAm ao diagnóstico precoce do câncer cervical na população do estudo. Foram estudadas 162 amostras cervicais de mulheres atendidas em Florianópolis. A sensibilidade encontrada para a detecção do DNA-HPV pela PCR foi de 90,6%, especificidade de 74,6%, VPP de 46,8% e VPN de 97%. O DNA do HPV pela PCR foi detectado em 38,3% (62/162) das amostras, em 90,6% (29/32) das citologias classificadas como positivas (ASC-US +) e em 25,4% (33/130) das citologias classificadas como negativas. A expressão de E6/E7 RNAm foi detectada em 13,6% (22/162) das amostras, dessas 6,9% (9/130) foram classificadas como citologia negativa. A PCR-HPVte identificou o tipo viral em 37,1% (23/62) das amostras. Os tipos de HPVs mais frequentes do estudo considerando-se a expressão de E6/E7 RNAm e a PCR-HPVte foram: HPVs: 16 (12,5%), 33 (10,9%), 18 (7,8%), 6 (6,3%), 31 (4,7%), 45 (4,7%) e 11 (1,6%). Das 22 amostras que expressaram E6/E7 RNAm 15 eram de pacientes com idade inferior a 30 anos. De acordo com os dados encontrados neste estudo, consideramos importante, no Brasil, a mudança das estratégias de rastreamento com a associação da PCR-HPV à citologia oncótica, pois esta parece ser uma alternativa economicamente viável. A identificação das pacientes com DNA HPV positivas seguidas da determinação do tipo viral pelo método da PCR HPVte, ou realização da expressão de E6/E7 RNAm poderá contribuir com o diagnóstico precoce do câncer cervical, assim como na elaboração e no desenvolvimento de vacinas anti-HPV. A possibilidade de intervenção precoce, além de salvar vidas pode ser uma medida de economia para o SUS. / The Cervical cancer is the second more frequent type of cancer in women worldwide. The majority of cases occur in the developing world and it is the leading cause of cancer mortality in women. In Brazil, was estimated the occurrence of 18.430 new cases for 2010. The cervical screening is based on cytology; however it is subject of a substantial degree of false-negative and false-positive results. Epidemiological and experimental studies have demonstrated an important association between Human Papilloma Virus (HPV) and cervical cancer, noting that this agent is present in 99.7% of cases. This study detected HPV DNA by PCR (PCR-HPV), the expression of mRNA E6/E7 by the NASBA method (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-BioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. The results were compared with cytology to estimate the yield of PCR and mRNA E6/E7 expression contribution to early diagnosis of cervical cancer in the study population. We studied 162 cervical samples of women from Florianopolis city, Brazil using the consensus primers MY09/MY11 and nested PCR with the primers GP5+/GP6+ to detect generic HPV, the oncogene expression of proteins E6/E7 mRNA to high-risk 16, 18, 31, 33 and 45 HPV types by NASBA (NucliSens ® HPV EasyQ 1.0-bioMérieux, France) and identified major viral types 6, 11, 16, 18, 31, 33 and 45 by PCR-HPVte. Our study found to PCR-HPV a sensitivity of 90.6%, a specificity of 74.6%, a PPV of 46.8% and a NPV of 97%. HPV DNA was detected in 38.3% (62/162) of samples, corresponding to 90.6% (29/32) of cytology positive (ASC-US +) and 25.4% (33/130) of cytology negative. The mRNA E6/E7 expression was detected in 13.6% (22/162), 6.9% (9/130) of these with negative cytology. The PCR-HPVte identified viral type in 37.1% (23/62) of samples. The most frequent HPV types found, considering the expression of mRNA E6/E7 and PCR-HPVte were: 16 (12.5%), 33 (10.9%), 18 (7.8%), 6 (6.3%), 31 (4.7%), 45 (4.7%) e 11 (1.6%). Of the 22 samples that expressed mRNA E6/E7 15 were from patients younger than 30 years. According to the data found in this study, we consider important in Brazil, change the screening strategies with the combination of PCR-HPV with the cytological analysis, as this seems to be an economically viable alternative. The identification of patients with positive HPV DNA followed by the determination of viral type by the CR-HPVte or detection of the E6/E7 oncogene expression may contribute to the early diagnosis of cervical cancer, as well as in formulating and developing strategies for vaccine#HPV. The possibility of early intervention, save lives and can be a cost-saving measure for the Brazilian Unified Health System.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T08:29:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 291568.pdf: 1333481 bytes, checksum: f8c41a5a2b2bda0cd5784e17c15d7081 (MD5) / O aumento crescente de bactérias resistentes devido a múltiplos fatores, incentiva à busca por novas substâncias farmacologicamente ativas contra estes patógenos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade ntimicrobiana de 34 chalconas e de 10 hidrazonas contra 14 cepas de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA), coletadas em mbiente hospitalar da Grande Florianópolis. Como controle, foi utilizada a cepa de S. aureus ATCC 25923. Inicialmente, a resistência à meticilina foi verificada através do método de difusão radial em ágar, no qual todas as cepas recebidas foram testadas frente aos antimicrobianos oxacilina (6µg) e cefoxitina (30µg). Foi realizada a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), a fim de detectar a presença do gene mecA, o estudo molecular foi complementado com o uso da amplificação randômica do DNA (RAPD), a fim de determinar o grau de correlação entre as cepas. As cepas confirmadas como sendo MRSA, juntamente com as cepas referência de S. aureus (ATCC 25923) e E. coli (ATCC 25922) foram avaliadas frente às chalconas e às hidrazonas através da determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) e bactericidas mínimas (CBM), pelo método de microdiluição em caldo. A CIM e a CBM foram consideradas as menores concentrações das substâncias-teste necessárias para inibir o crescimento ou provocar a morte bacteriana, respectivamente. Ambas foram expressas em µg/mL. Além disso, os compostos bioativos foram avaliados quanto à sua citotoxicidade in vitro. A análise do potencial citotóxico foi realizada em culturas de células da linhagem celular VERO, através do método colorimétrico com sal de tetrazólio (MTT). Os resultados foram expressos como a concentração de cada amostra, que reduziu em 50% a viabilidade celular (CC50). O cálculo de índice de seletividade (IS) foi realizado para que pudesse ser observado se os compostos foram tóxicos nas concentrações mínimas de inibição. Com isso, foi possível concluir que as hidrazonas apresentam melhor IS do que as chalconas, o que indica que são compostos com maior perspectiva de virem a se tornar futuros fármacos. De todos os compostos testados, as hidrazonas G6 e F29 apresentaram os menores valores de CIM, bem como os melhores índices de seletividade. Com relação a caracterização genotípica das cepas estudadas, ficou evidente que o gene mecA foi encontrado na maioria das cepas de MRSA, e enquanto que o RAPD revelou que a maioria das cepas utilizadas são correlacionadas evolutivamente. Conclui-se, portanto, que das 44 substâncias testadas, cinco são substâncias promissoras como novos antimicrobianos e os estudos químicos e microbiológicos com as mesmas devem ser continuados. / Increase in antibiotic resistance due to multiple factors encourages the search for new compounds active against multiresistant pathogens. The purpose of this study was to evaluate the antimicrobial activity of thirty-four chalcones and ten hydrazones against fourteen strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), obtained in hospitals of the Great Florianópolis area (Southern Brazil). S. aureus strain ATCC 25923 was used as control. Initially, the resistance to methicillin was detected by the method of radial diffusion in agar, in which all strains were tested against the antimicrobials oxacillin (6µg) and cefoxitin (30µg). Polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect the mecA gene. The molecular analysis was completed using the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) technique. Strains confirmed as MRSA, along with reference strains of S. aureus (ATCC 25923) and E. coli (ATCC 25922) were evaluated against the hydrazones and chalcones by determining the minimum inhibitory concentrations (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) by the broth microdilution method. The MIC and MBC were considered the lowest concentrations necessary to inhibit the growth or destroy the bacteria, respectively. Both measurements were expressed in µg/mL. Furthermore, the bioactive compounds were evaluated for their cytotoxicity in vitro. The analysis of the cytotoxic potential was performed in Vero cell cultures using a colorimetric method with tetrazolium (MTT). The results were expressed as the concentration of each sample, which reduced cell viability by 50% (CC50). Afterward, the selectivity index (IS) was calculated to determine if the compounds were toxic at minimal inhibitory concentrations. Based on this result it was possible to conclude that the hydrazones have better IS than the chalcones. This suggests that these compounds are more prominent than the chalcones to become potential therapeutical drugs. The hydrazones G6 and F29 had the lowest values for CIM and were also among the compounds that showed the highest levels of selectivity. Furthermore, the genotypic characterization of the strains revealed that the mecA gene was found in the majority of the strains of MRSA and RAPD, suggesting that most of the strains studied are evolutionarily related. It can be concluded that from the 44 compounds testes, five are potentially promising, including antibiotic-like substances and new chemical, and that microbiological studies to better evaluate these compounds should be continued.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química. / Made available in DSpace on 2012-10-22T09:32:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 236846.pdf: 3341934 bytes, checksum: 795eed913f9a71409e2ecc36266754a7 (MD5) / A presente dissertação avalia o desempenho de uma nova metodologia de análise molecular pela reação em cadeia da polimerase (PCR), conhecida como Enhanced PCR, no diagnóstico da Síndrome do X Frágil (SXF), e faz um estudo comparativo com a técnica padrão. A SXF é causada pela expansão da repetição de uma seqüência de trinucleotídeos (CGG) na região reguladora do gene FMR1, localizado no cromossomo X (Xq27.3). Indivíduos portadores da síndrome são classificados em zona gray, pré-mutados ou afetados, conforme o número de repetições de CGG presentes no gene. Técnicas de PCR são utilizadas como triagem e suas limitações dificultam a conclusividade do diagnóstico de mulheres normais homozigotas, e de homens e mulheres com grandes expansões de repetições de CGG. Para comparação da eficácia de diagnóstico das técnicas avaliadas, o DNA de 122 pacientes foi extraído e submetido a dois métodos de PCR, conforme os protocolos descritos na literatura, aqui denominados PCR de Triagem (PCR-T) e PCR para Pré-mutação (PCR-P). A nova metodologia, PCR-P, produziu 60% de resultados conclusivos contra 26% de conclusividade pela técnica padrão (PCR-T). Alelos de até 130 CGG em mulheres e 93 CGG em homens foram amplificados pela PCR-P, possibilitando, assim, o diagnóstico de pré-mutação. Por outro lado os maiores alelos amplificados pela PCR-T foram de apenas 41 CGG em mulheres e 46 CGG em homens, ou seja, a técnica padrão, como está limitada ao diagnóstico da zona gray, não permitiu a identificação de alelos pré-mutados. A partir destas observações propõe-se uma estratégia para o diagnóstico da síndrome utilizando a PCR-P na pesquisa de pré-mutação em pais de indivíduos com resultados inconclusivos. Considerando os resultados bem sucedidos e aprimorados da nova técnica de PCR, incluindo o fácil diagnóstico da pré-mutação, sugere-se a sua implementação em laboratórios de genética para o diagnóstico da SXF.

Made available in DSpace on 2012-05-07T14:43:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000021.pdf: 1216388 bytes, checksum: 1b8348c104a6b955f95f038f53b279a3 (MD5) Previous issue date: 2007 / Os vírus linfotrópicos de células T humanas do tipo I (HTLV-I) e do tipo II (HTLV-II) são retrovírus humanos que causam destruição e/ou transformação nos linfócitos T. A transmissão ocorre através de relações sexuais, transfusões sanguíneas e produtos hemoderivados, agulhas e seringas contaminadas, da mãe infectada para seu filho, especialmente através do aleitamento materno. O diagnóstico da infecção pelo HTLV-I/II é feito, habitualmente, com testes sorológicos, baseados na pesquisa de anticorpos contra antígenos do vírus presentes no soro do indivíduo infectado. Como os genomas provirais do HTLV-I e HTLV-II exibem grande homologia, há uma expressiva sororeatividade cruzada. Assim, em muitos casos, a detecção de anticorpos anti-HTLV-I/II embora caracterize a infecção viral, não permite que se estabeleça a distinção entre ambos os agentes. Os testes moleculares empregados para o diagnóstico dos vírus HTLV-I/II, baseiam-se na pesquisa de seqüências genômicas provirais permitindo, com isso, o diagnóstico da infecção pelo antes do aparecimento de qualquer sinal ou sintoma. A carga proviral de HTLV em indivíduos infectados pode ser determinada através da utilização da PCR em tempo real, uma técnica mais rápida e com menor risco de contaminação que a PCR simples ou nested PCR. Para isso, 63 amostras, sendo 33 amostras de indivíduos com sorologia reagente para HTLV e 30 amostras de doadores de sangue da Fundação HEMOPE foram analisadas para identificação do tipo viral (I ou II) e determinação da carga proviral. A sensibilidade da PCR qualitativa, para identificação do tipo viral, em relação à sorologia foi de 87,5 por cento (IC 95 por cento: 70,1-95,9 por cento) e a especificidade foi de 100 por cento (IC 95 por cento: 85,9-100,0 por cento). Já a sensibilidade e especificidade da PCR em tempo real foram de 100 porcento (IC 95 por cento: 86,7-100,0 por cento) e 96,67 por cento (IC 95 por cento: 80,9-99,8 por cento), respectivamente. A carga proviral dos indivíduos reagentes na sorologia variou entre 13 cópias/ 106 células PBMC e 343820 cópias/106 células PBMC. Nosso estudo também observou que os indivíduos com PET/MAH tiveram carga proviral mais elevada que a dos indivíduos assintomáticos. A utilização da PCR em tempo real na rotina de monitoramento clínico dos indivíduos infectados permitirá um papel relevante na identificação do vírus e na determinação simultânea da carga proviral, contribuindo para direcionar um tratamento adequado