Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:27Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-09-29 / Objetivo: investigar a participação da imunidade inata, através da análise de expressão dos genes TLR4 e MYD88, na disfunção precoce do enxerto renal em humanos. Métodos: A quantificação do mRNA foi realizada por PCR em tempo real, em biópsias pré-implantação do enxerto, na urina e no sangue (leucócitos) do primeiro dia póstransplante, em 75 transplantes (TX) com doador falecido (DF) e 18 transplantes com doador vivo (DV). Os desfechos considerados foram DGF (delayed graft function) e retardo na recuperação da função renal, independentemente de necessidade de diálise. Resultados: Em biópsias, os níveis de expressão de TLR4 e MyD88 foram maiores em rins de DF do que de DV; mas não se correlacionaram com disfunção precoce do enxerto; na urina, não diferiram entre DF e DV, e tenderam a ser mais elevados em casos de TX-DF com disfunção precoce do enxerto; no sangue, não diferiram entre DF e DV e foram mais baixos em casos com disfunção precoce. Conclusão: os resultados sugerem uma participação de TLR4 e MYD88 na patogenia das alterações que ocorrem em rins de DF e que baixos níveis de expressão gênica de TLR4 e MYD88, mensurados em amostra de leucócitos do sangue periférico colhida nas primeiras 24 horas pós-transplante, podem predizer retardo na recuperação da função do enxerto e, portanto, poderão vir a ter utilidade clínica no tratamento de receptores de transplante renal de doador falecido. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularmente conhecida como \"marcela\", é utilizada popularmente para tratar diversas doenças, como mal estar gástrico e intestinal, inflamações, diabetes e outros. Como os mecanismos de ação do extrato de A. satureoides ainda não são conhecidos, o presente trabalho visou esclarecer os mecanismos antiinflamatórios do extrato bruto hidroalcoólico das inflorescências de A. satureoides, focando na migração e função fagocítica e microbicida de neutrófilos. Para tanto, o extrato hidroalcoólico foi administrado por gavage (50, 100 e 250mg/kg) em ratos Wistar, machos, adultos, e a inflamação foi induzida pela injeção do lipopolisacarídeo de E. coli (LPS; 2mL de solução; 500 µg/mL em PBS) no tecido subcutâneo dorsal (modelo da bolsa de ar). Animais controles receberam volumes equivalentes de veículo do extrato e indometacina (30mg/kg). Foram quantificados o número de neutrófilos (câmara de Neubauer e esfregaços corados por Panótico) e a concentração de Leucotrieno B4 e CINC-1 (ELISA) no foco de lesão; a interação leucócito-endotélio em vênulas da microcirculação mesentérica após estímulo in situ pelo lipopolisacarídeo de E.coli (LPS; 30µg/40µL; por microscopia intravital); a expressão de moléculas de adesão e do toll-like receptor (TLR-4), além da quantificação do burst oxidativo (induzido pelo miristato-acetato de forbol - PMA) e fagocitose em neutrófilos circulantes (citometria de fluxo); análise histológica e quantificação dos marcadores hepáticos (AST, ALT e Gama-GT) e renais (uréia e creatinina) no plasma por espectrofotometria. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento com o extrato reduziu o número de neutrófilos e a concentração de LTB4 e CINC-1 na bolsa de ar; reduziu a expressão de TLR4 pelos neutrófilos circulantes e a porcentagem de neutrófilos positivos para L-selectina e β2-integrina; inibiu a adesão e o comportamento rolling de leucócitos ao endotélio microvascular; reduziu o burst induzido por PMA; aumentou o potencial de fagocitose, sem alterar o burst induzido por Staphylococcus aureus, não alterou a morfologia tecidual e a concentração sérica dos marcadores de atividade hepática e renal. Em conjunto, os dados obtidos mostram que dose, aparentemente, não tóxica do extrato de A. satureoides exerce efeito antiinflamatório in vivo frente ao LPS, quantificados pela redução da migração e pelas interferências nas atividades fagocítica e microbicida dos neutrófilos. / Achyrocline satureoides (Lam) D.C., popularly known as \"marcela\", is popularly used to treat several diseases, such as gastric and intestinal disorders, inflammation, diabetes and others. As the mechanisms of the extract of A. satureoides have not been elucidated, this study aimed to investigate the anti-inflammatory mechanisms of the crude hydroalcoholic extract of the flowers of A. satureoides, focusing on migration and phagocytic and microbicidal neutrophils function. The hydroalcoholic extract was administered by gavage (50, 100 and 250mg/kg) into male Wistar rats, adult, and inflammation was induced by injection of lipopolysaccharide E. coli (LPS; 2 mL of solution; 500µg/mL in PBS) into the dorsal subcutaneous tissue (air pouch model). Control animals received equivalent volume of extract vehicle or indomethacin solution (30mg/kg). It was quantified the numbers of neutrophils (Neubauer chamber and stained smears by Panoptic) and concentrations of leukotriene B4 (LTB4) and CINC-1 (ELISA) in the focus of the injury; the leukocyte-endothelium interactions in mesenteric venules of the microcirculation after stimulation by LPS (30µg/40µL; intravital microscopy); the adhesion molecules and toll-like receptor (TLR-4) expressions and quantification of oxidative burst and phagocytosis in circulating neutrophils (flow cytometry); histological analysis and the hepatic markers (AST, ALT and gamma-GT) and kidney (urea and creatinine) concentrations in plasma by spectrophotometry. Data obtained showed that the treatment reduced the numbers of neutrophils and concentrations of LTB4 and CINC-1 in the subcutaneous tissue; reduced the TLR4 expression by circulating neutrophils and the number of β2-integrin- and L-selectin-positive neutrophils; inhibited the leukocyte adhesion and the rolling behavior to vascular endothelium; reduced the burst evoked by PMA; increased the phagocytosis without changing the burst induced by Staphylococcus aureus; and did not alter the tissue morphology and concentration of hepatic and renal enzymes in the serum. Together, these data suggest that dose, apparently non-toxic, of extract of A. satureoides exerts anti-inflammatory effect in vivo, quantified by the reduced migration and by interference in the phagocytic and microbicidal activities of neutrophils.

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.

O recrutamento de neutrófilos para o sítio da infecção é um evento crucial para o combate aos microrganismos e sobrevivência na sepse. A migração destes polimorfonucleares é dirigida através de um gradiente quimiotático por meio do reconhecimento de quimiocinas por receptores acoplados a proteína G (GPCRs), os quais são regulados por quinases específicas (GRKs). Estudos prévios demonstraram que na sepse ocorre uma falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso em função da dessensibilização de receptores quimiotáticos via GRKs induzida pela ativação de receptores toll-like (TLRs), TLR2 e TLR4. Apesar de a ausência de TLR9 em células dendriticas ter sido relacionada a maior sobrevivência de camundongos sépticos, o papel do TLR9 atuando diretamente em neutrófilos não foi avaliado. Objetivando preencher esta lacuna, propôs-se avaliar o papel direto de TLR9 na falência de migração de neutrófilos na sepse. Os camundongos TLR9-/- apresentaram maior sobrevivência a sepse polimicrobiana avaliada por meio do modelo de ligadura e perfuração do ceco (CLP). A deficiência de TLR9 também acarretou em aumento na migração de neutrófilos para o foco da infecção, menor seqüestro de neutrófilos no pulmão, bem como, menor número de bactérias no lavado peritoneal e sangue. A ativação de TLR9 por oligodeoxinucleotídeo contendo o dinucleotídeo CpG não metilado (ODN CpG) nos neutrófilos reduziu a quimiotaxia destes em direção a quimiocina CXCL2 e expressão do receptor quimiotático CXCR2. Além disso, neutrófilos estimulados com ODN CpG apresentaram aumento na expressão da quinase tipo 2 relacionada a receptores acoplados a proteína G (GRK2). Dessa forma, a ativação de TLR9 em neutrófilos circulantes no sangue é prejudicial na sepse por reduzir a quimiotaxia destes para o foco da infecção ao induzir a dessensibilização de CXCR2 via GRK2. / The recruitment of neutrophils to the site of infection is a crucial event for combating the microorganisms and survival on sepsis. The neutrophil migration is directed by a chemotactic gradient through the recognition of chemokines by G protein-coupled receptors (GPCRs), which are regulated by specific kinases (GRKs). Previous studies have shown a failure of neutrophil migration into infectious focus on sepsis due to chemotactic receptor desensitization via GRKs induced by activation of toll- like receptors (TLRs), TLR2 and TLR4. Despite the absence of activation of TLR9 in dendritic cells have been related to increase survival of septic mice, the role of TLR9 acting directly on neutrophils was not evaluated. We proposed to verify the direct role of TLR9 in the failure of neutrophil migration on sepsis. The TLR9 knockout mice (TLR9-/-) showed high survival to polymicrobial sepsis using cecal ligation and puncture model (CLP). TLR9-/- mice had high neutrophil migration to the focus of infection, low neutrophil sequestration in the lung, as well as, few bacteria in the peritoneal exudates and blood. The activation of TLR9 by oligodeoxinucleotide containing unmethylated dinucleotide CpG (CpG ODN) in neutrophils also reduced chemotaxis toward CXCL2 and the expression of chemokine receptor CXCR2. In addition, neutrophils stimulated with CpG ODN showed increased expression of kinase-related G protein-coupled receptor type 2 (GRK2). Thus, the activation of TLR9 in blood circulating neutrophils is harmful on sepsis by reducing their chemotaxis into the site of the infection by inducing CXCR2 desensitization via GRK2.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-21T17:31:58Z No. of bitstreams: 1 marcilenegomesevangelista.pdf: 1574607 bytes, checksum: acb74a623ce9dd5bb6068182a1172534 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-07T19:11:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 marcilenegomesevangelista.pdf: 1574607 bytes, checksum: acb74a623ce9dd5bb6068182a1172534 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:11:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 marcilenegomesevangelista.pdf: 1574607 bytes, checksum: acb74a623ce9dd5bb6068182a1172534 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória, crônica e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). É na maioria dos casos grave e incapacitante, afetando cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo mundo. Encefalomielite autoimune experimental (EAE) é um modelo murino de doença autoimune, mediada por linfócitos Th1 e Th17, desenvolvido para o estudo da EM. O protocolo de indução do modelo utiliza o adjuvante completo de Freund (CFA) que contem padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPs) que se ligam aos receptores Toll-like (TLRs), expressos em células apresentadoras de antígeno (APC), cruciais para ativação dos linfócitos T. Estes receptores são necessários à indução da EAE, ativando vias de sinalização nas células da imunidade inata e adaptativa, que podem induzir a produção de mediadores pró-inflamatórios, responsáveis pela lesão no SNC, ou mediadores anti-inflamatórios, que podem participar da regulação da doença. O presente estudo avaliou a resposta imune inata na fase inicial de desenvolvimento da EAE em camundongos C57BL/6 imunizados com o peptídeo MOG35-55 (glicoproteína mielínica de oligodendrócitos) e CFA (grupo EAE) ou somente CFA (grupo MOG negativo). Os animais foram sacrificados nos dias 2, 4 e 7 após a indução do modelo. Os linfonodos inguinais e a medula espinhal foram removidos e submetidos à análise histológica, dosagens de citocinas e quimiocinas, assim como avaliação da expressão dos TLRs. Os resultados obtidos indicaram que somente os animais do grupo EAE desenvolveram sinais clínicos da doença. Este grupo também apresentou intenso infiltrado celular na medula espinal no 7º dia após a indução, níveis elevados de quimiocinas CCL5 e CCL20 e citocinas IL-6, IL-12, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-10 e TGF- β no SNC, além de maior número de APCs expressando TLR3, TLR4 e TLR9. Desta forma, estes dados sugerem que a expressão dos TLRs e a produção das citocinas pró-inflamatórias mostram-se como sendo fatores críticos para a indução da EAE e, o aumento de padrões anti-inflamatórios, ainda nos pontos iniciais do desenvolvimento da doença, sugere o uso destes padrões, como mecanismos de regulação do modelo experimental e, possivelmente da EM. / Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory, chronic demyelinating disease of the central nervous system (CNS). It is in most cases severe and disabling, affecting about 2.5 million people worldwide. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a murine model of autoimmune disease mediated by Th1 and Th17 lymphocytes developed for studying MS. The induction protocol model uses the complete Freund's adjuvant (CFA) containing the pathogen associated molecular patterns (PAMPs) that bind to Toll-like receptors (TLRs) expressed on antigen presenting cells (APC), crucial for activation T lymphocytes. These receptors are necessary for the induction of EAE by activating signal pathways in cells of the innate and adaptive immunity, which can induce the production of pro-inflammatory mediators responsible for the CNS lesions or anti-inflammatory mediators that can participate in the regulation of disease. The present study evaluated the innate immune response in the initial phase of development of EAE in C57BL/6 mice immunized with MOG35-55 peptide (myelin oligodendrocyte glycoprotein) and CFA (group EAE) or CFA alone (group MOG negative). The animals were sacrificed on days 2, 4 and 7 after induction model. The inguinal lymph nodes and spinal cord were removed and subjected to histological, serum cytokines and chemokines, as well as evaluating the expression of TLRs. The results showed that only animals of group EAE developed clinical signs of disease. This group also showed an intense cellular infiltrate in the spinal cord on day 7 after induction, high levels of chemokines CCL5 and CCL20 and cytokines IL-6, IL-12, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-10 and TGF-β in the CNS, and increased number of APCs expressing TLR3, TLR4 and TLR9. Thus, these data suggest that expression of TLRs and production of pro-inflammatory cytokines are shown as being critical for the induction of EAE, and increased anti-inflammatory patterns, still in the initial points of development of the disease, suggests the use of these patterns as regulation mechanisms of the experimental model and possibly the MS.

Obesidade é fator de risco para a hipertensão arterial e os mecanismos envolvidos nesta doença não são totalmente esclarecidos. Camundongos C57BL/6J e transgênicos com com deleção em neurônios e glia da via inflamatória do receptor toll-like-NFκB foram submetidos à dieta hiperlipídica (HL) por 8 e 15 semanas e avaliados parâmetros metabólicos, pressão arterial, frequência cardíaca, atividade do sistema nervoso autônomo, fatores inflamatórios e neuropeptídeos no hipotálamo e no tronco encefálico. Os camundongos expostos HL desenvolveram hipertensão arterial acompanhada de disfunção autonômica e aumento de CART no DMH. Os animais transgênicos quando submetidos à dieta HL desenvolveram um quadro de obesidade, porém não apresentaram hipertensão arterial e disfunção autonômica. Além disso, o grupo de animais HL aumentou o RNAm de CCL5 no hipotálamo e de CD86 no tronco-encefálico e a densidade de microglia no NTS caudal. Os resultados sugerem novos mecanismos para a hipertensão e disfunção autonômica secundárias à ingestão de dieta hiperlipídica mostrando o papel do CART o DMH e o envolvimento da via inflamatória do TLR-NFκB em neurônios e glia nos mecanismos desta patologia. / Obesity is a risk factor for high blood pressure and the mechanisms involved in this disease are not fully clarified. C57BL/6J and transgenic mice with toll-like-NFκB receptor inflammatory- pathway deletion in neurons and glia were fed with high-fat diet (HL) for 8 or 15 weeks and assessed metabolic parameters, blood pressure, heart rate, autonomic nervous system activity, inflammatory factors and neuropeptides in the hypothalamus and brainstem. The HL mice developed hypertension accompanied with autonomic dysfunction and increased CART in DMH. Transgenic animals when submitted to HL diet developed obesity, but not showed high blood pressure and autonomic dysfunction. In addition, HL animals had increased CCL5 mRNA in hypothalamus, CD86 mRNA in brainstem and micróglia density in caudal NTS. The results suggest new mechanisms for hypertension and autonomic dysfunction secondary to intake of high-fat diet by showing CART role in DMH and the involvement of the inflammatory pathway TLR-NFκB in neurons and glia.

Obesidade é fator de risco para a hipertensão arterial e os mecanismos envolvidos nesta doença não são totalmente esclarecidos. Camundongos C57BL/6J e transgênicos com com deleção em neurônios e glia da via inflamatória do receptor toll-like-NFκB foram submetidos à dieta hiperlipídica (HL) por 8 e 15 semanas e avaliados parâmetros metabólicos, pressão arterial, frequência cardíaca, atividade do sistema nervoso autônomo, fatores inflamatórios e neuropeptídeos no hipotálamo e no tronco encefálico. Os camundongos expostos HL desenvolveram hipertensão arterial acompanhada de disfunção autonômica e aumento de CART no DMH. Os animais transgênicos quando submetidos à dieta HL desenvolveram um quadro de obesidade, porém não apresentaram hipertensão arterial e disfunção autonômica. Além disso, o grupo de animais HL aumentou o RNAm de CCL5 no hipotálamo e de CD86 no tronco-encefálico e a densidade de microglia no NTS caudal. Os resultados sugerem novos mecanismos para a hipertensão e disfunção autonômica secundárias à ingestão de dieta hiperlipídica mostrando o papel do CART o DMH e o envolvimento da via inflamatória do TLR-NFκB em neurônios e glia nos mecanismos desta patologia. / Obesity is a risk factor for high blood pressure and the mechanisms involved in this disease are not fully clarified. C57BL/6J and transgenic mice with toll-like-NFκB receptor inflammatory- pathway deletion in neurons and glia were fed with high-fat diet (HL) for 8 or 15 weeks and assessed metabolic parameters, blood pressure, heart rate, autonomic nervous system activity, inflammatory factors and neuropeptides in the hypothalamus and brainstem. The HL mice developed hypertension accompanied with autonomic dysfunction and increased CART in DMH. Transgenic animals when submitted to HL diet developed obesity, but not showed high blood pressure and autonomic dysfunction. In addition, HL animals had increased CCL5 mRNA in hypothalamus, CD86 mRNA in brainstem and micróglia density in caudal NTS. The results suggest new mechanisms for hypertension and autonomic dysfunction secondary to intake of high-fat diet by showing CART role in DMH and the involvement of the inflammatory pathway TLR-NFκB in neurons and glia.