Orientadores: José Andrés Yunes, Ana Carolina de Mattos Zeri / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Canevarolo_RafaelRenatino_M.pdf: 3376497 bytes, checksum: f3e8edf217e0d57089ffcffbe4a8097a (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O uso intensivo e combinado de diferentes quimioterápicos tem permitido a cura de 70-80% das leucemias linfóides agudas (LLA) da infância, sendo que a recaída da doença decorre em grande parte da resistência intrínseca das células leucêmicas à quimioterapia. Alguns dos quimioterápicos utilizados na LLA são inibidores metabólicos, como o metotrexato (MTX), antagonista do ácido fólico, que impede a divisão celular ao inibir a síntese de nucleotídeos. Em uma abordagem metabolômica, foi investigada a associação entre linhagens leucêmicas resistentes ou sensíveis ao MTX e metabólitos biondicadores de cada um destes fenótipos. Seis linhagens celulares B-derivadas e oito T-derivadas foram classificadas como sendo resistentes ou sensíveis ao MTX pelo método do 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difenil brometo de tetrazolina (MTT) após 48h de co-cultura com diferentes concentrações da droga. Cinco linhagens foram classificadas como resistentes e nove como sensíveis ao MTX. Após 24h de cultura na presença ou ausência de MTX (ambos em triplicata), os metabólitos intracelulares das linhagens foram acessados por ressonância magnética nuclear (RMN) numa abordagem metabolômica. Ao total, oitenta e quatro metabólitos foram quantificados, dos quais 72 foram também identificados. A análise de componentes principais (PCA) não conseguiu segregar as amostras de acordo com sua resistência, ao passo que a análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi efetiva nesta separação. Os metabólitos mais relevantes para a construção dos modelos de classificação quanto à resistência ao MTX, tanto para amostras tratadas quanto controles foram: ATP, dimetilglicina, fosfocolina e sarcosina (associados à resistência); carnitina, CB-09 (composto não identificado), colato, fumarato, glicocolato, lactato, malato e succinato (associados à sensibilidade ao MTX). A capacidade de classificar corretamente as amostras em sensíveis ou resistentes foi obtida com a construção de curvas da característica operativa do receptor (ROC) para os metabólitos individualmente. Os metabólitos com desempenho bom ou excelente na análise ROC (AUC>0,8) foram selecionados para comporem "testes diagnósticos" de classificação de amostras. De todas as combinações possíveis dentre os metabólitos selecionados, o teste que considerou a combinação de carnitina, sarcosina e succinato em amostras não tratadas com MTX apresentou sensibilidade de 100% (identificou todas as 15 amostras resistentes) e especificidade de 92,3% ao classificar corretamente 24 de 26 amostras sensíveis. O melhor teste diagnóstico para amostras tratadas com MTX considerou as concentrações de CB-MTX, glicocolato, sarcosina e succinato; apresentou sensibilidade de 100% (identificou as 15 amostras resistentes) e especificidade de 85,2%, equivocando-se na classificação de 4 dentre 27 amostras sensíveis. As concentrações metabólicas diferenciais apontaram para uma superativação dos metabolismos energético e de lipídeos em linhagens sensíveis ao MTX, ao passo que linhagens resistentes teriam superativado o metabolismo da glicina. As análises metabolômicas e de integração bioquímica dos metabólitos revelaram interações gênicas, enzimáticas e metabólicas que podem estar alteradas em linhagens sensíveis ou resistentes ao MTX, bem como permitiram a especulação sobre possíveis alvos moleculares que poderiam tornar sensíveis células resistentes ao quimioterápico / Abstract: The intensive use of different and combined chemotherapics has allowed curing 70-80% of pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL), and the relapse of the disease stems largely from the intrinsic resistance of leukemic cells to chemotherapy. Some of the chemotherapics used in ALL are metabolic inhibitors such as methotrexate (MTX), a folic acid antagonist, which prevents cell division by inhibiting the synthesis of nucleotides. The association between leukemic strains resistant or sensitive to MTX and the metabolites associated with each of these phenotypes were investigated. Six B- and eight T-derived cell lines were classified as resistant or sensitive to MTX by the 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, after 48h in co-culture with different concentrations of the drug. Five lineages were classified as resistant, and nine as sensitive to MTX. After 24 hours of culture in the presence or absence of MTX (both in triplicates), the intracellular metabolites of the lineages were assessed by nuclear magnetic resonance (NMR), in a metabolomic approach. In total, 84 metabolites were quantified, 72 of which were also identified. The principal component analysis (PCA) did not segregate the samples according to their resistance, whereas the supervised partial least square discriminate analysis (PLS-DA) was effective in this separation. ATP, dimethylglycine, sarcosine and phosphocholine were associated with MTX resistance in both models constructed for treated and untreated samples, whereas carnitine, CB-MTX (unidentified compound), cholate, fumarate, glycocholate, lactate, malate and succinate were associated with sensitivity to MTX. The ability to correctly classify the samples into sensitive or resistant groups was checked with the construction of the receiver operating characteristic (ROC) curves for metabolites individually. Metabolites with good or excellent performance in ROC analysis (AUC> 0.8) were selected to compose "diagnostic tests" for classifying samples. Of all the possible combinations among the selected metabolites, the test composed by the comination of carnitine, sarcosine and succinate in untreated samples exhibited sensitivity of 100% (identified all 15 resistant samples) and specificity of 92.3% in classifying correctly 24 of 26 sensitive samples. The best diagnostic test for samples treated with MTX took into consideration concentrations of CB-MTX, glycocholate, sarcosina, succinato. It had a sensitivity of 100% (identified 15 resistant samples) and specificity of 85.2%, classifying incorrectly 4 out of 27 sensitive samples. Differential metabolic concentrations pointed to an over activation of energy and lipids metabolism in MTX-sensitive strains, whereas resistant strains seemed to have overactive the glycine metabolism. Metabolomic and biochemical integration analysis revealed genetic, enzymatic and metabolic interactions that might be altered in strains sensitive or resistant to MTX, as well as allowed speculations about possible molecular targets on which intervention could make resistant cells susceptible to chemotherapy / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Submitted by Biblioteca de Pós-Graduação em Geoquímica BGQ (bgq@ndc.uff.br) on 2017-02-09T16:54:27Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoJonatãBarbosaTeixeira.pdf: 5990535 bytes, checksum: 8add030cb936a2464b4cf4e4276b8dc6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-09T16:54:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissertaçãoJonatãBarbosaTeixeira.pdf: 5990535 bytes, checksum: 8add030cb936a2464b4cf4e4276b8dc6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Universidade Federal Fluminense. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Geociências- Geoquímica Ambiental. Niterói, RJ / O conhecimento da petrografia sedimentar de rochas reservatório areníticas fornece informações importantes para a indústria do petróleo no sentido de viabilizar a exploração de um poço. Para o presente estudo foi avaliado o potencial de técnicas para estimativas petrofísicas e a influência de fatores diagenéticos e petrográficos nessas estimativas. Com este objetivo foram selecionadas sete amostras de arenitos (Berea – BE; Briarhill – BR; Buff Berea – BU; Crab Orchad – CO; Boise Idaho Brown – IB; Leapord – LE; e Parker – PA) de análogos de rochas reservatório, consideradas padrão (benchmarks) da indústria do petróleo, e por isso alvo de estudos petrofísicos. Foram considerados na caracterização aspectos mineralógicos, grau de empacotamento, aspectos granulométricos, seleção, aspecto textural, maturidade textural e processos diagenéticos. Essas análises foram feitas com auxílio da difração de raios X (DRX), microtomografia de raios X (μ-CT), susceptibilidade magnética e lâminas petrográficas. Os testes de petrofísica foram feitos pela ressonância magnética nuclear (RMN) de baixo campo e comparados/complementados pelo μ-CT, cujas amostras foram imageadas nas resoluções espaciais de 5 μm e 40-42 μm. Os resultados encontrados permitiram classifica-los em: quartzoarenitos, subarcósios, sublitoarenito e arcósio. Quanto à mineralogia, os arenitos são compostos por quartzo, feldspatos, fragmentos líticos, biotita, muscovita, caulinita, zeólita (clinoptilolita), clorita, illita e opacos. A dissolução de feldspatos, micas e infiltração de illita foram responsáveis pela formação de epimatriz, provendo também a porosidade intragranular vista nas amostras. Estes processos explicam a microporosidade obtida por RMN. A macroporosidade vista nos espectros de RMN teve relação direta com a morfologia dos grãos e a intensidade dos processos diagenéticos tardios. A resolução de 5 μm do μ-CT apresentou-se como a melhor para o processamento e segmentação das imagens em relação a resolução de 40 μm, para análise de aspectos petrofísicos e diagenéticos em amostras heterogêneas ou com range de tamanho de poros alto a resolução de 40 μm se mostrou melhor. O μ-CT tendeu a subestimar os resultados de porosidade gerados pelo porosímetro (rotina). O RMN foi a técnica com maior acurácia na estimativa de porosidade. Entretanto, na estimativa de permeabilidade o μ-CT se mostrou muito mais confiável que a RMN. Quanto à distribuição de poros, foi possível estabelecer relação direta entre as técnicas de RMN e μ-CT. O arenito com mesoporosidade alta teve caráter unimodal (distribuição contínua) nos espectros de RMN. Os arenitos com baixa mesoporosidade tiveram distribuição de T2 com caráter bimodal / The knowledge of sandstone sedimentary petrography reservoir rocks provides important information for the oil industry to enable the operation of a well. Techniques for making petrophysical estimates and the influences of petrographic and diagenetic factors were evaluated. With this objective, seven sandstones samples were selected (Berea – BE; Briarhill – BR; Buff Berea – BU; Crab Orchad – CO; Boise Idaho Brown – IB; Leapord – LE; e Parker – PA). These samples are reservoir rocks analogues, considered benchmarks of the oil industry, and so that used in petrophysical studies. Packing, granulometric aspects, selection, textural appearance, textural maturity and diagenetic processes were considered in characterizing mineralogical aspects. These analyses were performed using the X-ray diffraction (XRD), X-ray microtomography (μ-CT), magnetic susceptibility and petrographic thin sections. The petrophysical tests were made by nuclear magnetic resonance (NMR) in downfield and compared/complemented with μ-CT analysis, imaging the samples in two different spatial resolutions (5 μm and 40-42 μm). The results made it possible to classifies the sandstones as: quartz sandstones, subarkoses, sublithic sandstone and arkoses. Their mineralogy included quartz, feldspar, lithic fragments, biotite, muscovite, kaolinite, zeolite (clinoptilolite), chlorite, illite and opaques. The dissolution of feldspar and mica, and illite infiltration were responsible for epimatriz formation also providing intragranular porosity seen in samples. These processes explain microporosity obtained by NMR. The macroporosity seen in the NMR spectra was directly related to the morphology of the grains and the intensity of the late diagenetic processes. The 5 μm resolution was better than 40 μm for the properties estimation. However for heterogeneous sandstones or large pore size range, the resolution of 40 μm was better. μ-CT tended to subestimate the porosimeter porosity results. NMR showed greater accuracy in estimating porosity compared to μ-CT. For permeability estimative, μ-CT showed better results. The porous size distribution viewed through μ-CT agreed with NMR results. The sandstone sample with high mesoporosity had unimodal character (continuous distribution) in the NMR spectra. The sandstone samples with low mesoporosity had T2 distribution with bimodal character

Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) é uma bactéria fitopatógênica que causa de cancro cítrico em plantações no mundo inteiro. Trinta e cinco proteínas alvo foram selecionadas para estudos de proteômica estrutural a partir do genoma de Xac. As proteínas foram clonadas, expressas e testadas usando uma nova metodologia de triagem de proteínas que permite que espectros de RMN 2D 15N-HSQC sejam coletados antes da purificação da proteína em estudo. Esta abordagem possibilitou determinar quais proteínas alvo melhor se adequavam para estudos estruturais futuros por RMN e/ou cristalografia de raios X de forma rápida e eficaz. A proteína ClpS de Xac, descrita como moduladora da atividade da protease bacteriana ClpAP, foi uma das proteínas selecionadas para estudos estruturais por RMN usando esta metodologia. O assinalamento das ressonâncias da cadeia principal e das cadeias laterais desta proteína usando experimentos de tripla ressonância e dados de dinâmica e de troca H/D forneceram informações sobre a sua estrutura secundária. Um modelo tridimensional foi gerado por modelagem por homologia a partir de um homólogo de E. coli e foi validado por acoplamentos dipolares residuais (DHN ) obtidos experimentalmente. Todos os dados RMN sugerem que a região N-terminal de ClpS se apresenta desestruturada. O mapeamento por RMN da interação de ClpS com a sua parceira ClpA é também apresentado. / Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) is a phytopathogenic bacterium that causes citrus canker around the world. Thirty-five target proteins for structural proteomics studies have been selected from the Xac genome. The target proteins were cloned, expressed and tested using a novel screening methodology that allows for 2D 15N-HSQC NMR spectra to be collected prior to the purification of the target protein. This approach allowed us to determine which target proteins were amenable for future structural studies by NMR and/or X-ray crystallography in a fast and efficient manner. The ClpS protein, which has been described as a modulator of substrate specificity of the bacterial protease ClpAP, was one of the proteins selected structural studies by NMR using this methodology. Backbone and side-chain assignment derived from 3D triple resonance NMR experiments and dynamic data from hydrogen-deuterium exchange NMR experiments have provided information on the secondary structure elements of this protein. A model for Xac ClpS was generated by homology modeling from an E. coli homogue and validated using experimentally obtained DHN residual dipolar couplings. All NMR data suggest that the N-terminal region of the protein ClpS is highly unstructured. NMR mapping of the interaction of ClpS with its partner protein ClpA is also presented.

A determinação do excesso enantiomérico (ee) em compostos quirais por ressonância magnética nuclear (RMN) foi descoberta há mais de meio século por Raban e Mislow e permanece bastante atual e importante. Uma das formas de quantificar o ee consiste em formar diastereoisômeros através de agentes quirais de derivação (AQD). AQDs com a função aldeído tem sido amplamente usados na discriminação de aminas quirais devido a fácil formação de iminas em condições brandas. Existe uma preferência pelo uso de aldeídos cíclicos como AQD, uma vez que sua menor flexibilidade conformacional favorece a diferenciação dos derivados diastereoisoméricos. Até o momento, não havia estudos de AQD utilizando compostos acíclicos. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi utilizar o terpeno acíclico (S)-citronelal como AQD para a determinação do excesso enantiomérico de aminas primárias, através da RMN de 1H e 13C. Inicialmente, nós conseguimos observar uma preferência por conformações dobradas do (S)-citronelal por NOE e pela comparação entre os deslocamentos químicos teóricos, obtidos a partir da otimização com a correção de dispersão D3, e experimentais de RMN de 1H. Em seguida, nossos resultados sugeriram que a causa do dobramento molecular do citronelal estaria baseada em interações de London e HOMO-LUMO. Após a análise conformacional do (S)-citronelal, nós reagimos este composto dentro do tubo de RMN (\"mix and shake\") com misturas racêmica e escalêmicas das aminas sec-butilamina, 1-(fenil)etanamina e anfetamina, do amino-álcool 2-aminobutan-1-ol e dos amino-ácidos metionina e fenilalanina. Em todos os casos foi possivel fazer a determinação do ee e da configuração absoluta com grande eficácia. Os resultados mostraram que a metila ligada ao centro estereogênico do (S)-citronelal é um sinal conveniente para se determinar o ee de aminas quirais por ser facilmente reconhecido no espectro, uma vez que esse sinal já faz parte do agente quiral de derivação e também por estar em uma região bastante blindada do espectro tanto no RMN de 1H como no de 13C. Com isso, a completa e minuciosa elucidação estrutural torna-se desnecessária. Posteriormente, as conformações das iminas formadas mostraram, através de estudos teórico e experimental (NOE), um dobramento molecular semelhante ao encontrado no citronelal. O motivo para esse efeito também se encontra nas interações de London e nas interações de orbitais moleculares adequadas. / The determination of enantiomeric excess (ee) in chiral compounds by nuclear magnetic resonance (NMR) was discovered more than half a century ago by Raban and Mislow and remains quite current and important. One of the ways of quantify the ee is to form diastereoisomers via chiral derivatizing agents (CDA). CDA with the aldehyde function has been widely used in discriminating chiral amines because of easy formation of the imines under mild conditions. There is a preference for the use of cyclic aldehydes as CDA since their lower conformational flexibility favors the differentiation of the diastereoisomeric derivatives. As far as we are aware, there were no studies of CDA using acylic compounds. Thus, the goal of this work was to use acylic terpene (S)-citronellal as CDA for the determination of the ee of primary amines, through 1H and 13C NMR. Initially, we observed the preference for a folded conformations of the (S)-citronellal by NOE and by comparing the theoretical chemical shifts obtained from the optimization with the D3 dispersion correction, and experimental 1H NMR. Next, our results suggested that the cause of the citronelal molecular folding could be attributed to London and HOMO-LUMO interactions. After the conformational analysis of the (S)-citronellal, we reacted this compound within the NMR tube (\"mix and shake\") with racemic and scalemic mixtures of the sec-butylamine, 1-(phenyl) ethanamine, amphetamine, 2-aminobutan-1-ol, methionine and phenylalanine. In all cases, it was possible to make the determination of the ee and absolute configuration with great effectiveness. The results showed that methyl group attached to the stereogenic center of the (S)-citronelal is a convenient signal to determine the ee of chiral amines, because it is easily recognized in the spectrum, since that signal is already part of the CDA and also for being in a fairly shielded region of the spectrum in both 1H and 13C NMR. With this, complete and rigorous structural elucidation becomes unnecessary. Subsequently, the conformations of the imines formed showed, by theoretical and experimental (NOE) studies, the same molecular folding similar to that found in citronellal. The reason for this effect is also found in the interactions of London and in the interactions of suitable molecular orbitals.

A preparação de formulações contendo o princípio ativo 17-valerato de betametasona (VB) é amplamente difundida entre as indústrias farmacêuticas, por se tratar de fármaco antiinflamatório de escolha, no tratamento de condições em que a terapia com corticoesteróides é indicada. Muito empregado no tratamento tópico de condições alérgicas e inflamatórias dos olhos, orelhas e nariz, inalação para a profilaxia da asma e também em veterinária. Isto devido ao seu alto poder antiinflamatório, quando comparado a outros corticoesteróides, e sua falta virtual de propriedades mineralocorticóides, causando baixa retenção de sódio e, subsequentemente, de água. Conforme descrita na Farmacopéia Americana USP 32 NF 27, o princípio ativo 17-valerato de betametasona hidrolisa-se em seu isômero 21-valerato de betametasona, seu principal produto de degradação, que possui baixo poder antiinflamatório. Adicionalmente, a norma brasileira em vigência para estudos de estabilidade de medicamentos, RE n°1, de 29 de Julho de 2005, propõe condições estressantes para estudo de estabilidade de longa duração (30°C/75%UR), o que acelera a reação de hidrólise (degradação) do princípio ativo. Conhecidamente, estudos prévios mostram que formulações tópicas contendo o VB (loção, creme, solução e pomada) apresentam uma estabilidade curta. Assim, uma forma de estabilizar o VB é a complexação (inclusão), com compostos de ciclodextrina (CD). O objetivo deste projeto foi estabelecer procedimentos para a obtenção, caracterização físico-química e avaliação de estabilidade térmica do complexo sólido supracitado. Para atender este objetivo técnicas de análise térmica (calorimetria exploratória diferencial e termogravimetria), infravermelho médio com transformada de Fourier, ressonância magnética nuclear e cromatografia líquida de alta eficiência, fizeram-se necessárias. / Preparation of formulations containing the active ingredient betamethasone 17-valerate (VB) is widely defunded within pharmaceutical industry, once it concerns an anti-inflammatory drug and an option, in the treatment of conditions in which corticosteroids therapy is indicated. Often employed in topical treatment of eye, ear and nose allergic and inflammatory conditions, inhalation for asthma prophylaxes, and also in veterinary. This because its high anti-inflammatory activity, when compared to others corticosteroids, and its virtual lack of mineralocorticoids properties, causing a low sodium retention and, subsequently, of water. As described in the United States pharmacopeia USP 32 NF 27, the active ingredient betamethasone 17-valerate hydrolyses into its isomer betamethasone 21- valerate, its main degradation product, that has a low anti-inflammatory activity . Additionally, the Brazilian legislation for drug products stability study, RE n°1, July 29th 2005, introduce long therm stability study stressing conditions (30°C/75%RH), accelerating the reactive hydrolysis (degradation) for the active ingredient. Well known, previous studies show that topical formulations containing VB (lotion, cream, solution and ointment) presents a short stability. Complexation (inclusion) with cyclodextrin (CD) compounds shows a reasonable way to improve the VB stability. The project objective is to establish procedures for the obtainment, physicochemical characterization and solid complex (cited above) thermal stability evaluation. In order to achieve this objective thermal analysis techniques (differential scanning calorimetry and thermogravimetry), Fourier transformation middle infrared, nuclear magnetic resonance and high performance liquid chromatography, were needed.

Neste trabalho foram realizadas análises estruturais de dois conjuntos de vidros metafosfatos ternários relevantes em potenciais aplicações: aluminofosfatos e álcalis mistos. Para os aluminofosfatos a análise estrutural tem por objetivo verificar a existência de comportamentos preferenciais da conectividade entre os grupos fosfatos e os átomos de Al, e verificar a possível extensão a estes sistemas ternários de princípios de ligação química e ordem local inferidos em fosfatos binários, sendo os sistemas estudados K(1-x)Alx(PO3)(2x+1) e Na(1-x)Alx(PO3)(2x+1) . Para os vidros de álcalis mistos, a análise estrutural tem por objetivo identificar se existe segregação ou mistura aleatória das duas espécies de cátions, e determinar quais modificações na ordem local de cada álcali são induzidas pela troca de espécies, sendo os sistemas estudados LixNa(1-x)(PO3), KxNa(1-x)(PO3, RbxNa(1-x)(PO3), RbxLi(1-x)(PO3) e CsxLi(1-x)(PO3). As informações estruturais nestes vidros foram obtidas através de técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de estado sólido de 7Li, 23Na, 27Al, 31P, 87Rb e 133Cs. A conectividade entre a rede de fosfatos e os átomos de Al foi estudada utilizando informações a respeito da distribuição de espécies tetraédricas de fosfatos Q2m , sendo m = 0,1, 2 o número de pontes P-O-Al por tetraedro, obtidas através de RMN de 31P, e do número de coordenação médio do Al obtido através de RMN de 27Al. Da análise quantitativa da evolução das diferentes populações Q2m com a concentração de Al, juntamente com o número de coordenação médio do Al, foi possível verificar a existência de comportamentos preferenciais na organização estrutural: tetraedros fosfatos compartilham um vértice único (oxigênio não-ponte) com os poliedros de coordenação do Al. Esta organização de médio alcance é mantida até uma determinada concentração de Al, onde todo tetraedro forma uma ponte P-O-Al . A distribuição das espécies Q2m resultante é do tipo binária em função da concentração de Al: { Q20, Q21 } até concentrações intermediárias e { Q21, Q22 } para concentrações altas. Para os metafosfatos de álcalis mistos, o comportamento do desvio químico de 23 Na e 133Cs revela um efeito sistemático de aumento/decréscimo no tamanho do ambiente de coordenação ao redor dos álcalis em função da substituição. O ambiente de O dos álcalis de menor raio iônico resulta comprimido quando ocorre a substituição deste por uma espécie de raio iônico maior, e vice-versa. Com relação à distribuição dos álcalis na rede vítrea, as evoluções dos desvios químicos em função da substituição excluem a possibilidade de segregação dos álcalis ou separação de fase. A análise do acoplamento dipolar homonuclear de 23 Na, através da medida do segundo momento, revelou que a mistura de Na com o segundo álcali não é aleatória, existindo uma maior probabilidade de um Na ter outro Na como próximo vizinho. A correlação entre o grau de não-aleatoriedade na dispersão do Na e o incremento na magnitude do efeito de álcalis mistos na condutividade DC dos metafosfatos de Rb-Na, K-Na e Li-Na sugere que os fenômenos estão fundamentalmente relacionados. Esta seria a primeira evidência de vínculo entre uma propriedade estrutural da distribuição dos álcalis e o efeito de álcalis mistos de uma propriedade dinâmica. / In this work, the structure of two ternary metaphosphate glass systems was analyzed: aluminum-phosphates and mixed-alkali. The aim of the study in aluminum-phosphates is to determine the existence of preferential structural connectivities between phosphate groups and Al, and to verify the possible extension to these ternary glasses of principles of structural organization valid in binary phosphates. The aluminum metaphosphates studied here were K(1-x)Alx(PO3)(2x+1) and Na(1-x)Alx(PO3)(2x+1) . In mixed-alkali metaphosphates the goal of the structural analysis is the identification of the way in which alkali cations are distributed in the glass network (segregation versus random mixture), and to determine what kind of modification in the local order around the alkalis are induced by the substitution of species. The mixed-alkali metaphosphate studied here were LixNa(1-x)(PO3), KxNa(1-x)(PO3, RbxNa(1-x)(PO3), RbxLi(1-x)(PO3) and CsxLi(1-x)(PO3). The structural information was obtained using solid-state Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques of 7Li, 23Na, 27Al, 31P, 87Rb and 133Cs. The connectivity between the phosphate groups and Al was analyzed studying the populations of phosphate species Q2m, with m=0,1,2 being the number of P-O-Al bridges per tetrahedron, obtained using 31P-NMR, and considering the average coordination number of Al obtained by 27Al-NMR. Through the quantitative analysis of the evolution of the Q2m population with the Al concentration, it was possible to identify the existence of a preferential structural behavior: phosphate tetrahedra share only one common corner (non-bridging oxygen) with the coordination polyhedra around Al. This medium-range organization can be sustained up to a certain concentration of Al, to the point where every phosphate establishes a P-O-Al bridge. The resulting distribution of Q2m species can be identified as binary, as a function of the Al content: { Q20, Q21} up to intermediate concentrations and { Q21, Q22} for higher concentrations. In the mixed-alkali metaphosphates, the behavior of the 23Na and 133Cs chemical shift reveals a systematic increase/decrease in the average size of the coordination environment around the alkalis as a function of the substitution. The O environment around cations with the smaller ionic radius is compressed as this species is substituted by another alkali with bigger ionic radius, and vice-versa. With respect to the alkali distribution in the glass network, the observed evolution of the chemical shift as a function of the cation substitution excludes the possibility of segregation of alkalis or phase separation. The analysis of the 23Na homonuclear magnetic dipolar coupling, through the measurement of the second moment, revealed that the mixture at atomic scale of Na with the second alkali is not random, having a higher probability of a Na being close to other Na than to other alkali. The correlation between the degree of non-random dispersion of Na and the increment in the magnitude of the mixed alkali effect in the dc conductivity of Rb-Na, K-Na and Li-Na metaphosphates indicates a fundamental connection between both phenomena. This may be the first evidence of a relation between a structural property of the alkali distribution and the mixed alkali effect of a dynamical property.

Manguezais são ecossistemas localizados na confluência de terra e mar, característicos de áreas tropicais e subtropicais, cobrindo cerca de 18,1 milhões de hectares do planeta. A grande biodiversidade encontrada nestes ambientes ressalta a importância da busca por conhecimentos à seu respeito, como o estudo sobre novos princípios ativos derivados de microrganismos endofíticos presentes nas plantas de manguezais. Desta forma, o propósito do presente trabalho foi determinar a diversidade genética da comunidade de fungos endofíticos presentes em folhas e ramos das principais espécies arbóreas de manguezais de Cananéia e Bertioga (situados no estado de São Paulo, Brasil), e avaliar o potencial biotecnológico destes fungos em relação à produção de antibióticos contra os patógenos humanos Staphylococcus aureus e Escherichia coli, e contra o fitopatógeno Xanthomonas axonopodis citri . Os resultados da primeira etapa do trabalho, que envolveu o isolamento e a caracterização de fungos endofíticos filamentosos, mostraram que a comunidade fúngica associada às plantas de manguezais é formada por pelo menos 35 gêneros diferentes, sendo que os gêneros mais frequentes foram Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum e Xylaria. Grande parte dos gêneros encontrados neste trabalho é de fungos de solo, indicando que eles estão adaptados às condições adversas dos manguezais. Os resultados mostraram que, dentre as linhagens produtoras de antibiótico, 29,41% pertencem ao gênero Diaporthe, o qual apresentou maior frequência na comunidade fúngica estudada. Após a avaliação de 344 fungos quanto ao potencial de atividade antimicrobiana, foi selecionada a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum, um endófito de folha de Laguncularia racemosa, para elucidação da estrutura química do seu antibiótico purificado. Por meio das técnicas de Ressonância Magnética Nuclear e de Espectrometria de Massas o antibiótico foi identificado como ácido 3-hidroxipropiônico o qual apresentou atividade frente aos patógenos humanos Staphylococcus aureus e Salmonella tiphy. A estrutura química deste antibiótico foi modificada por meio de reação química de esterificação de Fischer-Speier para avaliar a relação da estrutura química e atividade biológica deste composto. O produto final da reação química de esterificação do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico não apresentou atividade antimicrobiana, indicando que o grupo hidroxila removido na reação é importante na atividade farmacológica desse composto. Além disso, a linhagem 41.1(1) de D. phaseolorum foi transformada geneticamente pelo sistema Agrobacterium tumefaciens, visando a obtenção de transformantes deficientes para produção de antibiótico e, com isso, a identificação de genes relacionados com a via de biossíntese do antibiótico ácido 3-hidroxipropiônico. A análise das sequências que flanqueiam o T-DNA, obtidas por TAIL-PCR, mostraram que os genes interrompidos nos transformantes estão relacionados com proteínas de domínios conservados envolvidos com diferentes funções como: translação de proteínas, homeostase do íon orgânico Mg2+, transporte intracelular, migração, adesão e proliferação celular e outras funções celulares. A caracterização da biblioteca de agrotransformantes constitui uma ferramenta importante para o estudo da biologia molecular de fungos que produzem compostos bioativos por meio do seu metabolismo secundário. / Mangroves are ecosystems situated beyond land and sea. They are more frequently found in tropical and subtropical areas englobing around 18.1 millions of hectares in the planet. The great biodiversity found in these ecosystems shows the importance of researching them, including studies regarding new compounds derived from endophytic fungi that inhabit these ecosystems. Therefore, the goal of this study was to determine the genetic diversity of the fungal endophytic community found in leaves and branches of the main arboreal species from mangrove of Cananéia and Bertioga (situated in São Paulo state, Brazil), and to evaluate the biotechnological potential of these fungi concerning the production of antibiotics against the human pathogens Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and against the phytopathogen Xanthomonas axonopodis citri . The results of the first part of this work, including the isolation and characterization of the filamentous endophytic fungi, showed that the mangrove fungal community is made up of at least 35 different genera, from which the most frequent are Diaporthe, Fusarium, Trichoderma, Colletotrichum and Xylaria. Most of the fungal genera found in this study come from soil, which suggests that they are adapted to the adverse conditions of mangroves. The results show that among the antibiotic-produncing strains, 29.41% belong to the genus Diaporthe, which was the most frequently found in the studied fungal community. After the analysis of 344 fungi regarding the antibiotic activity potential, a strain of D. phaseolorum (a leaf endophyte of Laguncularia racemosa) was selected to unveil the chemical structure of their purified antibiotic. The nuclear magnetic resonance and the mass spectrometry techniques allowed the identification of the antibiotic as 3-hidroxypropionic acid, which displayed activity against the pathogens Staphylococcus aureus and Salmonella tiphy. The chemical structure of this antibiotic was modifyed by the chemical reaction of Fischer-Speier sterification in order to evaluate the chemical structure and biological activity of this compound. The final product of the chemical reaction of 3-hidroxipropionic acid sterification had no antibiotic activity, which suggests that the hydroxil group removed from the reaction is important to the pharmachological activity of this compound. Additionally, the strain 41.1(1) of D. phaseolorum was genetically transformed by the Agrobacterium tumefaciens system, in order to generate antibioticdeficient transformants, which would help to identify genes related to the biosynthesis pathway of the 3- hidroxypropionic acid antibiotic. The TAIL-PCR analysis revealed that the interrupted genes in the tranformants are related to proteins from conserved domains involved in different functions such as protein translation, Mg2+ ion homeostasis, intracellular transport, migration, adhesion and cellular proliferation and other cellular functions. The characterization of the agrotransformants library is an important tool to unveiling the molecular biology of fungi that produce bioactive compounds by the secondary metabolism.

Neste trabalho foi desenvolvido um estudo sobre a precessão livre de onda contínua (CWFP-continuous wave free precession), uma condição especial da precessão livre no estado estacionário (SSFP), e algumas aplicações. Os resultados experimentais, e de simulações, mostraram que este sinal é atingido após a passagem por dois estágios iniciais. O primeiro é dependente da não homogeneidade do campo magnético, relacionado a razão Tp/T2*. O segundo, o qual é chamado de estado quasi-estacionáio, é dependente ambos os tempos de relaxação do sistema em estudo, T1 e T2. Este segundo estágio é responsável por levar a magnetização do estado de equilíbrio térmico a um estado verdadeiramente estacionário. Tendo como informação a amplitude da magnetização no estado de equilíbrio térmico e no estado verdadeiramente estacionário, e também do decaimento do sinal durante o estado quasi-estacionário, é possível determinar, rápida e simultaneamente, ambos os tempos de relaxação do sistema, fazendo um único experimento. Esse método oferece aplicações interessantes para o estudo de processos dinâmicos, propostas também neste trabalho. Foi possível verificar que o sinal de CWFP pode ser utilizado para acompanhar cinética de reações, e também variações de viscosidade do meio, por exemplo, em reações de polimerização, associadas à mobilidade molecular em função de mudanças estruturais. Um método para avaliar a condutividade térmica de elastômeros foi proposto, com o fornecimento de resultados quantitativos muito próximos daqueles encontrados na literatura, e que utilizam outros métodos. A dependência do sinal de CWFP com a freqüência de offset também permitiu realizar um estudo, com aplicação em RMN de alta resolução, sobre a supressão de sinal de solvente. Os resultados demonstraram que é necessário fazer alguns ajustes na largura de pulsos, juntamente com o ciclo de fases, para minimizar as anomalias de intensidade e de fase dos sinais no espectro transformado. Essa técnica foi aplicada em espectroscopia ‘in vivo’, a qual permite resolver, por exemplo, problemas como a determinação de açúcares em frutas, onde o sinal é bastante próximo do intenso sinal da água. / In this work a study of the continuous wave free precession (CWFP), a special condition of the steady-state free precession (SSFP), and some applications, was developed. The experimental results, together with simulated ones, have shown that the CWFP signal is attained after two previous stages. The first one is dependent on the non-homogeneity of the magnetic field, related to Tp/T2* ratio. The second, which is called quasi-stationary state, is dependent of both relaxation times, T1 and T2. This second stage allows leading the magnetization in the thermal equilibrium to a truly stationary state. The information of the signal amplitude in the thermal equilibrium and in the steady state, and also the signal decaying during the quasistationary state, allows the fast and simultaneous determination of the relaxation times, performed in a single experiment. This method offers interesting applications for studying dynamical processes, also proposed in this work. It was possible to verify that the CWFP signal can be used to monitor kinetics of reactions, which variations of viscosity are involved, for example, in polymerization reactions, always associated to structural changes. A method for evaluating thermal conductivity in elastomers was proposed, with results in accordance to the literature, which uses other methods. The dependence of the CWFP signal with the offset frequency has permitted to study an application to the High-Resolution NMR, about the solvent suppression. The results demonstrated that it is necessary to perform some adjustments in the pulse width, together the phase cycle, to minimize some phase and intensity anomalies of the frequency-domain signal. This technique was applied in ‘in vivo’ spectroscopy, which can solve, for example, problems with the determination of the sugar content in fresh fruits, where the sugar signal is very close to the intense signal of the water.

Palicourea marcgravii St. Hil. (Rubiaceae) vulgarmente conhecida como \"erva de rato\" é uma planta tóxica brasileira de grande interesse econômico na pecuária, por provocar, em bovinos, convulsões, arritmias cardíacas e \"morte súbita\" em elevado número de animais. No presente trabalho, as folhas dessecadas e moídas de P. marcgravii foram extraídas com etanol 95 %, a temperatura ambiente, por percolação; o extrato resultante foi fracionado por partição com acetato de etila e butanol saturado com água. Os resíduos obtidos foram testados \"per os\" em ratos, buscando-se investigar nos mesmos, a presença do princípio ativo tóxico. O resíduo aquoso foi o único que produziu convulsões e morte dos animais. A existência do monofluoroacetato (MF A) no resíduo aquoso foi comprovada biologicamente através do paralelismo entre as retas refetentes às funções dose/porcentagem de letalidade e dose/latência para a 1ª convulsão que foram construídas para o resíduo aquoso e padrão de referência (monofluoroacetato de sódio). O MFA foi também identificado quimicamente através da RMN19F e da cromatografia em camada delgada. Os resultados obtidos comprovaram a presença de MF A nas folhas de P.marcgravii, responsabilizando-o pelos efeitos tóxicos produzidos. Também foram levantadas algumas hipóteses na tentativa de explicar a sintomatologia dos animais intoxicados. / Palicourea marcgravii St. Hil. (Rubiaceae) is one of the most economica1ly important poisonous plants for Brazilian livestock, since it induces not only seizures, cardiac arrythmias, but also \"sudden death\" of large number of the intoxicated animals. ln the present paper, the dissected and grounded leaves of P.marcgravii were extracted with ethanol 95 %, at room temperature, by percolation; the resultant extract was fractionized by partition in ethyl acetate and butanol saturated with water. The obtained residues were administered \"per os\" to rats, trying to look for the presence of the active toxic principIe. The aqueous residue was the only that induced seizures and death to the animals. The presence of monofluoroacetate (MFA) in the aqueous residue was biologica1ly confirmed by the correlation shown in the sodium monofluoroacetate and the aqueous residue dose-response and dose effect curves. MFA was also identified through NMR19F and thin layer chromatography. The obtained results confirmed the presence of MF A in the P.marcgravii leaves; they also suggest that the toxic effects induced by this plant are a consequence of the presence of MFA in its leaves. Further, some hypothesis were also perfomed, in an attempt to better explain the symptoms induced by the plant leaves.

Ácidos graxos são moléculas hidrofóbicas essenciais para a composição da estrutura física celular, para o metabolismo energético dos seres vivos e também para os caminhos de sinalização molecular no proteoma celular. No caso de deficiência no ácido graxo docosahexaenóico (DHA) e do ácido eicosapentaenoico (EPA) temos a depressão e a mudança do comportamento. O transporte destas moléculas hidrofóbicas no citosol celular é realizado por uma família de proteínas capazes de se ligar a esses ácidos graxos de maneira seletiva, com alta afinidade e de forma reversível. Esta família de proteína é conhecida como FABP, ou proteínas ligantes de ácido graxo. Para realizar esta função, as FABP possuem características únicas tanto na sua estrutura tridimensional quanto na dinâmica experimentada pelos vários elementos estruturais. Diversos trabalhos identificaram regiões relevantes e, com mutações realizadas em resíduos específicos, caracterizaram o mecanismo como a proteína interage com ligantes e com a bicamada lipídica para a realização da sua função, identificando um processo multi-estágio na interação com a bicamada lipídica. Contudo, a não realização de mutações em todos os resíduos da proteína pode deixar não-identificados regiões ou resíduos da proteína também envolvidos na sua função. Além disso, nunca foi caracterizado o que ocorre com os resíduos e com a estrutura da FABP quando a proteína está complexada com uma bicamada lipídica. No presente trabalho, escolhemos a B-FABP para estudar a interação com ligantes e o complexo proteína-membrana desta família de proteínas. Para isto, as técnicas de ressonância magnética nuclear 15N-HSQC e eletrônica (RMN e RPE) foram utilizadas para acompanhar mudanças estruturais e dinâmicas ocorridas quanto de interações moleculares. Com a técnica de RPE e o uso de derivados de ácidos graxos marcados com radicais nitróxidos, monitoramos o sítio de ligação da molécula de ácido graxo e suas alterações quando na presença do surfactante SDS. No caso de RMN, foi usada em proteínas marcadas isotopicamente com 15N na presença de bicelas isotrópicas de DMPC: DHPC na razão igual a um (q = 1), em uma concentração lipídica (CL) de 4%. Nossos resultados além de identificar os mesmos resíduos já conhecidos na interação da FABP com modelos de membrana, também encontrou novos resíduos nunca antes associados à superfície de contato da FABP com a bicamada lipídica. / Fatty acids are hydrophobic molecules essential to the cell structure, to the energetic metabolism of living organisms and to the molecular signaling pathways in the cell proteome. Depression and behavior alteations are two common consequences of deficiencies in docosahexanoic (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) acids. The transport of such hydrophobic molecules in the cytosol is the main function of a family of proteins capable of making a selective, high affinity, and reversible binding of fatty acids. This family of proteins is known as FABPs (fatty acid binding proteins). To perform their function, FABPs have unique features in both their tridimensional structure and in the dynamics experienced by the several structural elements. Many reports have identified regions that are relevant to function and, through point mutations of specific residues, have characterized the mechanism used by the protein to bind its ligand and also to interact with lipid bilayers. However, the point mutation strategy relies heavily on the choice of residues such that missing residues can lead to the lack of identification of important elements involved in protein function. Moreover, the characterization of the protein-bilayer complex still deserves a more detailed investigation. In this work, we study the B-FABP protein in terms of its interaction with ligands as well as a membrane model system. We made use of magnetic resonance techniques, nuclear (NMR) and electronic (EPR), to probe structural and dynamical changes occurring upon intermolecular interaction. EPR and spin labeled fatty acids allowed us to monitor the ligand binding site in the protein structure and also its alterations in the presence of the surfactant SDS. NMR HSQC was used to gain information on the conformational changes of isotopically labeled protein in the presence of biceles made of DMPC:DHPC (q = 1 and lipid concentration CL of 4%). Our results confirmed relevant functional residues that had been previously identified and also pointed to new residues that had not been implicated as part of the contact surface before, thus widening our understanding of FABP-bilayer interaction.