Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / Abstract: The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / Mestre

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Animais, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-04T13:47:00Z No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-04T13:57:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-04T13:57:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ThiagoAntoniodeSouzaNascimentoSilva.pdf: 1265182 bytes, checksum: bc533b4f6609c21bd035b31047a5ae61 (MD5) / A qualidade do sêmen é influenciada por diversos fatores tais como os inerentes aos indivíduos, a frequência de coletas, o meio ambiente, a estação do ano, a temperatura, precipitação pluviométrica. Interferindo, diretamente, na qualidade das amostras criopreservadas com reflexos diretos nos índices de concepção das fêmeas inseminadas. Estudos têm demonstrado que o plasma seminal pode favorecer a viabilidade e heterogeneidade da membrana plasmática, motilidade e a fertilidade do sêmen ovino criopreservado. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar o perfil proteico do plasma seminal de carneiros com diferentes níveis de congelabilidade de sêmen e o efeito da adição de plasma seminal de carneiros de alta congelabilidade de sêmen no sêmen de carneiros de baixa congelabilidade de sêmen antes da criopreservação. No capitulo 2 observou-se uma superioridade (P<0,05) do carneiro 1 de alta congelabilidade de sêmen em relação ao carneiro 18 de baixa congelabilidade de sêmen após a descongelação e teste de termo resistência (TTR), baseado nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana e integridade de acrossoma. Na avaliação do sêmen fresco não foi observada diferença (P>0,05) em nenhum dos parâmetros analisados entre os dois carneiros. Da mesma forma para a avaliação da fertilidade em monta natural não houve diferença (P>0,05) entre os dois carneiros. Selecionados os carneiros de alta e baixa congelabilidade de sêmen foram caracterizados os perfis proteicos do plasma seminal dos mesmos, determinado por eletroforese bidimensional e a identificação das proteínas foi realizada por espectrometria de massa. Com um total de 23 spots foram identificadas com sucesso. Proteínas como RSVP14, RSVP20, clusterina, glutationa peroxidase, albumina e lipocalina foram exclusivas ou mais expressas no carneiro de alta congelabilidade. Proteínas como as espermadesina Z13, bodesina 2 foram mais expressas no carneiro de baixa congelabilidade. Essas proteínas se apresentam como potenciais marcadores para qualidade do sêmen criopreservado. No capitulo 3 com o objetivo de avaliar a adição do plasma seminal de carneiro de alta congelabilidade no sêmen de carneiros de baixa congelabilidade antes da criopreservação, observou que a adição de plama seminal de carneiros de alta congelabilidade incrementou a qualidade do sêmen criopreservado nos carneiros de baixa congelabilidade (P<0,05), após a coleta do sêmen. Avaliou-se também a forma de adicionar o plasma seminal ao sêmen após a coleta, sua concentração e forma de sua obtenção. O melhor momento para adição do plasma seminal foi ao meio de pré-diluição. Independentemente da sua concentração adicionado ao sêmen, todas as concentrações utilizadas foram superiores (P<0,05) ao tratamento controle (sem adição de plasma seminal). Com relação à sua obtenção, quando adicionado o plasma seminal proveniente de carneiro vasectomizado no sêmen após a coleta, este se mostrou (P<0,05) melhor que o tratamento controle (sem adição de plasma seminal) e de plasma seminal de carneiro inteiro. Os dados apresentados nesse trabalho evidenciam a importância do plasma seminal na criopreservação do sêmen e servem referência para o avanço da criopreservação do sêmen ovino. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The seminal quality vary with many factors like individuality, collections frequency, environment, season of the year, temperature, rainfall. Interfering, directly, in the quality of cryopreserved samples with reflex at conception indices of inseminated females. Studies have demonstrated that seminal plasma can favor the viability and heterogeneity of plasmatic membrane, motility and fertility of cryopreserved ram semen. In this way, the aim of the present work was characterize the protein profile of seminal plasma of rams with different levels of semen congelability and the effect of the addition of seminal plasma of high freezability rams semen in the low freezability semen before cryopreservation. In chapter 2, was observed a superiority (P<0.05) of ram 1 of high freezability semen in relation with ram 18 of low freezbility semen after thawed and TRT, based at motility, membrane integrity and acrosomal integrity. In fresh semen evaluation wasn’t observed difference (P>0.05) in none of analyzed factors between two rams. In the same way to fertility with natural mating wasn’t difference (P>0.05) between the two rams. Selected rams of high and low freezability semen hade theirs characterized protein profile, determined by two-dimensional electrophoresis and the protein identified by mass spectrometry. A total of 23 spots were sucessfully identified. Proteins like RSVP14, RSVP20, clusterin, glutathione peroxidase, albumin e lipocalin were exclusively or more expressive in the high freezability rams semen. Proteins like espermadhesin Z13, bodhesin 2 were more expressive in the low freezability rams semen. Those proteins are like potencial markers to quality of frozen semen. In chapter 3 the aim was evaluate the addition of seminal plasma of high freezability ram semen in semen of low freezability rams semen before cryopreservation, observed that the addition of seminal plasma of high freezability semen increased the quality of cryopreserved semen of low freezability semen (P<0.05), after semen collection. Evaluated also how the seminal plasma was add to the semen after the collection, your concentration and how was obtained. The better moment to add the seminal plasma was at pre-dilution extender. Regardless of concentration, all concentration tested were higher (P<0.05) than control treatment (without seminal plasma). The seminal plasma when collected from vasectomized rams and added to semen after collection showed better (P<0.05) than control treatment (without seminal plasma) and seminal plasma from whole ram. The data presented in this work show the importance of seminal plasma in semen cryopreservation and serve as reference to advance at ram semen cryopreservation.

Introdução: Apesar do grande avanço das técnicas de reprodução humana na área da infertilidade a avaliação do homem ainda carece de maiores conhecimentos. Estima-se que a prevalência de infertilidade seja de 10 a 15% de casais em idade reprodutiva (20-40 anos), com cerca de metade dos casos com algum grau de problema de ordem masculina. Até o momento a avaliação do homem quanto à fertilidade é, em grande parte, restrita a avaliação das características do sêmen. No entanto, a avaliação seminal não consegue determinar de maneira clara e eficaz a fertilidade masculina. Entretanto até agora nenhum autor havia correlacionado os parâmetros seminais com o escore embrionário (GES) que avalia todo o desenvolvimento embrionário. Nosso estudo avaliou a relação entre os parâmetros seminais (motilidade, motilidade progressiva e concentração) como fator prognóstico para o desenvolvimento embrionário em mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV convencional ou ICSI) com estimulação ovariana. Todos os casais foram avaliados no Centro De Reprodução Humana insemine. Material e métodos: Foi realizado um estudo prospectivo (coorte) no Período de janeiro de 2009 até agosto de 2010 com casais inférteis (n=290) que foram submetidos ao primeiro ciclo de Reprodução Assistida. Realizada estimulação ovariana, punção para retirada dos oócitos, FIV convencional ou ICSI conforme o caso, cultura dos embriões. Avaliado os parâmetros seminais (concentração, motilidade e motilidade A+B) pós preparo do sêmen. Avaliado o desenvolvimento embrionário com uso de escore embrionário (GES) proposto por Fisch 2001. Foram avaliados clivagem precoce, escore embrionário total e escore embrionário médio. Resultados: Foi demonstrado, após avaliar 290 casais, que sessenta e oito por cento realizaram FIV convencional e 32% ICSI. A média de oócitos recuperados após punção folicular foi de 6,2±4,6 com taxa de fertilização de 55% e clivagem de 97%. Analisando os parâmetros seminais após preparo e sua associação com clivagem precoce houve correlação com motilidade (P=0,006) e concentração (P=0,002). Entretanto não houve correlação com porcentagem de espermatozóides classificados como A+B (P=0,075). Em relação aos parâmetros seminais e clivagem precoce no grupo da FIV convencional existe correlação para motilidade (P=0,028) e concentração (P=0,001) e no grupo da ICSI não foi significativo para nenhum parâmetro. Com relação aos parâmetros seminais e escore embrionário médio, no grupo da FIV convencional existe correlação com a motilidade (P=0,0001) e motilidade A+B (P=0,0001), no grupo da ICSI apenas com a concentração (P=0,022). Conclusão: Existe correlação dos parâmetros seminais com a clivagem precoce no grupo da FIV convencional e nenhuma correlação destes parâmetros no grupo da ICSI. Em relação ao escore embrionário médio apresenta correlações tanto na FIV convencional quanto na ICSI.

O herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4) é um herpesvírus membro da subfamília Gammaherpesvirinae, gênero Rhadinovirus que tem sido detectado em bovinos sadios e com diferentes sinais clínicos em todos os continentes. Sugere-se que este vírus está relacionado com diversas doenças do trato reprodutivo de bovinos. Dessa forma, faz-se necessária a pesquisa desse vírus em amostras biológicas com potencial utilização em biotécnicas de reprodução de bovinos, com o objetivo de reduzir sua transmissão e possíveis prejuízos econômicos advindos de sua infecção. Cento e dezenove amostras de líquido folicular de fêmeas abatidas em frigorífico e 164 amostras de sêmen de centros de inseminação artificial foram submetidas a uma reação de nested PCR para detecção do genoma do BoHV-4. Foi detectado o DNA de BoHV-4 em 2 amostras (1,68%) de liquido folicular e em 14 amostras (8,54%) de sêmen. Sete produtos foram submetidos ao sequenciamento, que revelou a semelhança dessas amostras com amostras europeias. É o primeiro relato de detecção do DNA de BoHV-4 em amostras de líquido folicular de bovinos, o que pode sugerir uma nova via de transmissão desse agente. Dessa forma, as alíquotas de sêmen destinadas à inseminação artificial e os ovários destinados a produção de embriões in vitro necessitam de um controle maior para evitar a disseminação do BoHV-4 entre os rebanhos bovinos e possíveis prejuízos econômicos associados ao vírus. / Bovine herpesvirus type 4 (BoHV-4), a member of the Gammaherpesvirinae subfamily, genus Rhadinovirus has been detected in healthy as well as diseased cattle in all continents. It is suggested that this virus is associated to several disorders of the reproductive tract of bovines, and the virus or its genome has been found in clinical and biological samples like fetuses, semen and cells of the granulosa. Given the lack of evidences on the circulation of BoHV-4 in bovines of Brazil, specifically from samples from the reproductive tract, this study aimed the detection of BoHV-4 DNA from semen and follicular fluids of bovines. One hundred and nineteen follicular fluid samples obtained from a slaughterhouse and 164 semen samples obtained in artificial insemination centers were subjected to a nested PCR for the detection of BoHV-4 DNA. BoHV-4 DNA was detected in 2 samples (1.68%) from follicular fluid and 14 (8.54%) of semen samples. Seven products were subjected to sequencing, which confirmed the identity of the PCR products and revealed the similarity of these viruses with European virus isolates. It is the first report on the detection of BoHV-4 DNA in bovine follicular fluid samples and semen in Brazil, which may suggest that the virus may be disseminating in Brazilian cattle through reproductive practices. In addition, the results found here point to the a requirement for the testing of such samples, in search for BoHV-4 DNA, in order to prevent the spread of BoHV-4 between the cattle herds and the potential economic losses associated.

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T13:32:40Z No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T13:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Maria Angelica da Silva.pdf: 2203628 bytes, checksum: f618e74288a647b78d637d4346df2c36 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CAPES; FACEPE / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-06-25T13:08:11Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 580358 bytes, checksum: a0c8dadd8e551b397a84b1273307e0d5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-25T13:08:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 580358 bytes, checksum: a0c8dadd8e551b397a84b1273307e0d5 (MD5) Previous issue date: 2012-07-24 / Objetivou – se com este estudo verificar se a antocianina tem efeito sobre a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides de caprinos e investigar o potencial desse antioxidantes no uso de meios diluidores de criopreservação de sêmen caprino. Dez ejaculados de cada reprodutor foram obtidos e denominados partidas, onde no final do experimento foram congeladas 10 palhetas de 0,25mL de cada partida totalizando 400 palhetas congeladas de cada tratamento e controle, sendo após a diluição na proporção de 1:1 (sêmen x Bovimix) determinou-se a concentração espermática. Em seguida, o sêmen fresco foi diluído com o diluidor Bovimix® (controle); Bovimix® + 2,5% de antocinina (tratamento 1); Bovimix® +2,5% antocianina + 2,5% de ciclodextrina (tratamento 2); Bovimix® +2,5% antocianina + 2,5% de ciclodextrina (atomizado) (tratamento 3). Após as diluições finais, o sêmen foi envasado, resfriado e congelado. Após sete dias, as partidas foram descongeladas em banho - Maria a 37oC para avaliação do sêmen pós – descongelamento (motilidade espermática progressiva retilínea, vigor espermático, teste supra vital, fluorescência, e morfologia espermática). Foi verificado diferença (p<0,05) nas médias da motilidade espermática, entre os tratamento 1 (49,8±10,6%), tratamento 2 (50,2±12,1%) e o controle (40,7±12,4%), enquanto que não houve diferença (p>0,05) nos valores médios do vigor, entre os tratamentos 1 (3,5±0,4), 2 (3,5±0,4) e o controle (3,4±0,5); houve diferença (p<0,5) dos valores médios entre os tratamentos 1 (3,5±0,4) e 2 (3,5±0,4), onde o tratamento 2 apresentou um vigor espermático melhor. No teste supra vital observou–se diferença nos valores médios da porcentagem de espermatozóides vivos entre os tratamentos 1 (44,8±10,7%), 2 (45,8±13,1%) e o controle (36,9±13,3%). Em relação ao teste hiposmótico os tratamentos 1 (51,3±10,3%) e tratamento 2 (49,2±12,01%), não apresentaram diferença (p>0,05), porém diferem (p<0,05) do controle (42,4±12,1%). Nos defeitos espermáticos todos os tratamentos se mantiveram dentro dos parâmetros aceitáveis para defeitos maiores, menores e defeitos totais. Já no teste de fluorescência o controle apresentou a maior porcentagem de espermatozóides com baixa atividade mitocondrial e membrana integra (BAMI) ou membrana lesada (BAML), respectivamente (25,2±14,9%) e (50,2±16,0%) do que os tratamentos; 1 (11,3±11,2; 33,8±13,9%), 2 (15,3±11,5; 35,1±12,9%), 3 (17,6±11,7; 50,1±18,8%). Quanto aos padrões de alta atividade mitocondrial membrana integra (AAMI), o grupo controle (23,2±13,6%) obteve médias inferiores aos tratamentos 1 (51,3±18,6; 3,2±4,5%) e 2 (47,3±16,3; 2,3±4,3). Porém nos padrões de alta atividade mitocôndria e membrana lesada (AAML) não houve diferença (p>0,05) entre o controle (1,5±2,0%) e os tratamentos; 1 (3,2±4,5%), 2 (2,3±4,3%) e 3 (1,8±3,9%). A adição de antocianina proveniente do açaí ao diluente contribuiu para melhorar a preservação da integridade das membranas na congelação do sêmen Caprino. / The aim of the study was to verify whether the anthocyanin has an effect on the plasma membrane integrity of goats spermatozoa and investigate the potential use of antioxidants in diluents goats semen cryopreservation. The semen from each collection was named after player game, where at the end of the experiment were 10 frozen straws of 0.25 mL of each game totaling 400 frozen straws of each treatment and control. After dilution 1:1 (sperm x diluent ) determined sperm concentration. Then, the fresh semen was diluted with tinner Bovimix® (control); Bovimix® + 2.5% de antocinina (treatment 1); Bovimix® +2.5% antocianina + 2.5% de ciclodextrina (treatment 2 ); Bovimix® +2.5% antocianina + 2.5% de ciclodextrina (atomizado) (treatment 3). After the final dilution, the semen was submitted to the filling, cooling and freezing. After seven days, the matches were thawed in a water bath - Maria at 37 ° C for semen evaluation post - thawing (total sperm motility, progressive straight, sperm vigor, supra vital test, fluorescence, and morphology). has shown a significant difference (p<0.05) between treatment 1 (49.8±10.6%), treatment 2 (50.2±12.1%) and control (40.7±12.4%), while there was no statistical difference (p>0.05) between the force of group 1 (3.2±0.4), 2 (3.4±0.4), and control (3.3±0.5); there was a difference between treatments (3.2±0.4) and 2 (3.4±0.4), where treatment 2 showed a better effect. In the test above was vital - difference in the percentage of live sperm between treatment 1 (44.8±10.7%), 2 (45.8±13.1%) and control (36.9±13.3%). Regarding testing a hypoosmotic treatment (51.3±10.3) and treatment 2 (49.2±12.1%), not different (p<0.05), but differ (p>0.05) from control (42,4±12.1%), in sperm defects All treatments were maintained within acceptable parameters for defects and total defects, since the fluorescent assay control had the highest percentage of sperm with low mitochondrial activity and membrane includes (Bami) or damaged membrane (BAML), respectively (14.9±25.2%) and (50.2±16.1%) of the treatments: 1 (11.3±11.2; 33.8±13.9%) , 2 (15.3±11.5; 35.1±12.9%), 3 (17.6±11.7; 50.1±18.8%). The standards mitochondrial membrane integrates high activity (AAMI), the control group (23.2±13.6%) averaged less than the first treatment (51.3±18.6; 3.2±4.5%) and 2 (47.3±16.3; 2.3±4.3%). But the standards high activity and mitochondrial membrane damaged (AAML) was not different (p>0.05) between control (1.5±2,0%) and treatments; 1 (3.2±4.5%), 2 (2.3±4.3%) and 3 (1.8±3.%). The anthocyanins additions from acai to the diluent improved the membrane integrity preservation in Caprino semen freezing.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-06-14T12:47:57Z No. of bitstreams: 1 Juliana Arandas Borba Monteiro.pdf: 831567 bytes, checksum: 0515256d8d8121fa8eba5bbaa130cfe9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-14T12:47:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Juliana Arandas Borba Monteiro.pdf: 831567 bytes, checksum: 0515256d8d8121fa8eba5bbaa130cfe9 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / The aim was to carry out a bibliographic study about the sperm and the influence of reactive oxygen species (ROS) and antioxidant therapies on ram semen cryopreservation, as wel as evaluated experimentally the effects of supplementary feeding with commercial rice oil in ram semen freezability. For the latter purpose, were used 16 crossbred sheep, with a mean weight of 35 kg and average age of 15 months, previously evaluated clinical and andrologicaly. These animals were divided into two groups according to the quality of semen, where the control group included animals with approved seminal parameters, and the treatment group for individuals with lower semen quality. The animals from treatment group were supplemented daily, by oral way, with 100 mL per day commercial rice oil (Horse Range), during 63 days. In turn, animals in the control group received 100 mL of saline solution daily, by oral way, during the same period. Semen and blood samples were obtained by artificial vagina and jugular venipuncture, respectively, at wich 21 days, where the first sample was taken immediately before treatment start (day zero D0). Semen from each breeder was subjectively evaluated and individually processed for freezing (-196 oC), while from the blood was recovered the serum, which was stored under freezing (- 4 oC). After thawing, the semen was evaluated for sperm kinematics in the computerized system (CASA), as well as for plasma membrane and acrosomal integrity in a flow cytometry. The blood serum was used for testosterone determination by electrochemiluminescence. At D0, total (MT) and progressive (MP) motility, VCL, VAP and VSL were higher (P<0.05) in control than in the treatment group. On the other hand, after 21 days of treatment (D21), VCL, VAP and VSL from treatment group were higher (P<0.05) than the control group. Similarly, after 63 days of treatment the MP, VCL, VAP, VSL and total sperm with intact acrosome were higher (P<0.05) in the treatment than in the control group. Furthermore, according comparison of each group over time, was observed that while the seminal parameters from control group decrease throughout the study (P<0.05), those from treatment group are increase (P <0.05). There was no significant difference (P> 0.05 ) between the experimental groups with respect to serum testosterone concentration, regardless of evaluation time. Thus, it is concluded that oral administration of rice oil acts positively on the kinematics parameters and acrosomal integrity of ram semen subjected to cryopreservation, and that it not influence the plasma levels of testosterone. / Neste trabalho objetivou-se avaliar os efeitos da alimentação suplementar com óleo de arroz comercial na congelabilidade do sêmen ovino, onde foram utilizados 16 ovinos mestiços, com peso de 35 kg e idade de 15 meses, em média, previamente submetidos à avaliação clínico-andrológica. Os animais foram separados em dois grupos experimentais, de acordo com a qualidade do sêmen, onde o grupo controle foi formado por animais aprovados quanto aos parâmetros seminais e o grupo tratamento por indivíduos com qualidade de sêmen inferior. Os animais do grupo tratamento foram suplementados diariamente, por via oral, com 100 mL por dia de óleo de arroz comercial (Gama Horse), durante 63 dias. Os animais do grupo controle receberam diariamente 100 mL, por via oral, de soro fisiológico durante o mesmo período. Colheitas de sêmen e sangue foram realizadas por vagina artificial e venopunção da jugular, respectivamente, a cada 21 dias, tendo sido a primeira colheita realizada imediatamente antes do início do tratamento (dia zero: D0). O sêmen de cada reprodutor foi avaliado subjetivamente e processado individualmente para a congelação (-196 oC), enquanto que da amostra de sangue foi recuperado o soro, o qual foi armazenado sob congelação (- 4 oC). Após descongelação, o sêmen foi avaliado quanto à cinética espermática no sistema computadorizado (CASA), bem como a integridade de membrana acrossomal e plasmática com fluorocromos no citômetro de fluxo. O soro sanguíneo foi utilizado para a dosagem de testosterona por eletroquimioluminescência. No D0, as motilidades total (MT) e progressiva (MP), VCL, VAP e VSL foram maiores (P<0,05) no grupo controle do que no grupo tratamento. Por outro lado, aos 21 dias de tratamento (D21), os valores de VCL, VAP e VSL do grupo tratamento foram superiores (P<0,05) aos do grupo controle. Da mesma forma, aos 63 dias de tratamento a MP, VCL, VAP, VSL e total de espermatozoides com acrossoma íntegro foram maiores (P<0,05) no grupo tratamento do que no grupo controle. Além disso, por meio da comparação de cada grupo ao longo do tempo, pode-se constatar que, enquanto os parâmetros seminais do grupo controle diminuíram ao decorrer do estudo (P<0,05), os do grupo tratamento aumentaram (P<0,05). Não foi observada diferença (P>0,05) entre os grupos experimentais com relação à concentração sérica de testosterona, independente do tempo de avaliação. Assim, conclui-se que a administração oral de óleo de arroz age positivamente sobre os parâmetros cinéticos e de integridade do acrossoma de espermatozoides de carneiros submetidos à criopreservação, e que não influencia os níveis séricos de testosterona.

Submitted by Caroline Falcao (caroline.rfalcao@ufpe.br) on 2017-04-10T17:37:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-10T17:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) 2012-Tese-MariaAngelicaSilva.pdf: 2202931 bytes, checksum: 9e64864a364b4356fa6e0609d9ae8aeb (MD5) Previous issue date: 2012 / Os papilomavirus bovino (BPV) são oncovirus com DNA circular dupla fita e usualmente espécie-específico. Embora o BPV cause doenças de importância veterinária, o conhecimento sobre sua diversidade e biologia ainda é limitado. Esse trabalho objetivou estudar a biologia e diversidade da infecção por BPV em lesões cutâneas de bovinos e sítios não epiteliais de bovinos e equinos. No capítulo I, buscou-se avaliar a diversidade de PV em lesões cutâneas. Foram encontrados os BPV 1, 2, 3, 6 e o Papilomavírus associado ao sarcóide felino (FeSarPV) e a presença de co-infecções. No capítulo II, foram avaliados mecanismos etiopatogênicos em lesões papilomatosas induzidas por BPV. Foi observada a expressão da oncoproteína E5 em todos os fibropapilomas analisados e uma superexpressão da conexina 26 nos fibropapilomas, comparado com o tecido normal. No capítulo III, foi verificada a presença do DNA de BPV em espermatozoide e líquido seminal de sêmen comercial de touros e seu efeito na função espermática. O DNA do BPV2 foi encontrado em todas as amostras avaliadas, porém sem causar redução na função espermática. No Capítulo IV, foi avaliada a presença e expressão de BPV em sangue de bovinos sadios e afetados por papilomatose. Os BPV 1 e 2 foram encontrados em animais assintomáticos e com papilomatose assim como sua expressão. No Capítulo V, foi verificada a presença e expressão de BPV em sêmen fresco de touros saudáveis. O DNA de BPV2 foi encontrado em 35% das amostras e a expressão das proteínas E2 e E5 foi verificada em 55% das amostras de sêmen positivas para BPV2. No capítulo VI foi investigada a presença e expressão genes de BPV em células do sangue e sêmen de cavalos saudáveis por PCR e RT-PCR. Os BPV 1 e 2 foram encontrados no sangue de 20% dos cavalos avaliados e no sêmen 35% dos animais. A expressão da oncoproteína E5 foi verificada em 36% das amostras de sangue e em sêmen positivas para o BPV. No Capítulo VII, foram comparados dois sistemas de detecção de BPV por PCR, um com primers tipo específico e outro com primers consenso em lesões cutâneas e fuidos de bovinos. Os primers tipo específico para detecção de BPV mostraram-se mais sensíveis do que os primers consenso, além disso, através destes foi verificada a alta prevalência de co-infecções nas amostras estudadas. Porém, os primers consenso, amplificaram alta diversidade de BPV, e prováveis novos tipos de BPV nas amostras estudadas. Desta forma, os trabalhos oriundos desta tese, permitiram descrever a diversidade de BPV nas lesões cutâneas de bovinos do Brasil e um de seus prováveis mecanismos de ação, além disso, contribuem para fortalecer a hipótese de que os BPV são capazes de infectar tecidos não-epiteliais, através da verificação da presença e expressão de genes virais em células sanguíneas e do sêmen de bovinos e equinos. Os resultados obtidos nesta tese vêm contribuir para o melhor conhecimento de ferramentas moleculares que podem ser empregadas nos estudos de presença e caracterização do BPV nos diversos tecidos bovinos. / Bovine papillomavirus (BPV) are double-stranded circular DNA oncovirus and usually species-specific. Although BPV causes diseases of veterinary importance, knowledge about their biology and diversity is still limited. This study investigated the natural history of BPV infection in cattle and cutaneous epithelial sites of cattle and horses. In Chapter I, we sought to evaluate the diversity of PV in cutaneous lesions. We found BPV 1, 2, 3, 6 and papillomavirus associated with feline sarcoid (FeSarPV) and co-infections. In Chapter II, we detected the BPV DNA in sperm and seminal fluid of trade bull semen and its effect on sperm function. The DNA of BPV2 was found in all samples, without causing a reduction in sperm function. In Chapter III, we evaluated etiopathogenic mechanisms of BPV induced lesions. We observed the expression of E5 oncoprotein in all analyzed fibropapillomas and an overexpression of connexin 26 in fibropapillomas compared to normal tissue. In Chapter IV, we evaluated the presence and expression of BPV in blood of healthy and affected cattle by papillomatosis. The BPV 1 and 2 were found in asymptomatic and papillomatosisaffected animals as well as its expression. In Chapter V, we detected the presence and expression of BPV in fresh semen of healthy bulls. BPV2 DNA was found in 35% of samples and the expression of E2 and E5 proteins was found in 55% of BPV2- positive semen. In Chapter VI was investigated the presence and expression of BPV genes in blood and semen cells of healthy horses by PCR and RT-PCR. BPV 1 and 2 were found in 20% of blood horses and in 35% of semen evaluated. Expression of E5 oncoprotein was found in 36% of blood and semen samples positive for BPV. In Chapter VII, we compared two PCR methods for BPV detection in skin lesions and fluids: the use of BPV type-specific and consensus primers. The type-specific primers for detection of BPV were more sensitive than consensus primers and could detect co-infection of BPV in the samples. Consensus primers amplified a high diversity of BPV, and probable new BPV types in the samples studied. Thus, this thesis allowed describing the diversity of BPV in the skin lesions of Brazillian cattle and one of its possible mechanisms of action and also contributes to strengthen the hypothesis that BPV may infect non-epithelial sites, by verifying the presence and expression of viral genes in blood and semen cells of cattle and horses. The results obtained in this thesis contribute to a better understanding of molecular tools that can be employed in studies of presence and characterization of BPV in various bovine tissues.