Dissertaçao(mestrado)- Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Aqüicultura, Instituto de Oceanografia, 2008. / Submitted by Cristiane Silva (cristiane_gomides@hotmail.com) on 2012-07-10T00:50:00Z No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-06T16:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CarlosFrederico.pdf: 3216882 bytes, checksum: 2323f88ad7d58d3bbb5164aa5335dd23 (MD5) Previous issue date: 2008 / O linguado Paralichthys orbignyanus é um importante recurso pesqueiro do oceano Atlântico Sul e é considerado uma espécie com grande potencial para a aqüicultura. A qualidade do sêmen é uma importante variável no manejo reprodutivo de espécies cultivadas, influenciando diretamente na produção de ovos viáveis. Além disso, o conhecimento das características físicas e químicas do sêmen é um importante fator no desenvolvimento de protocolos de resfriamento e criopreservação do sêmen. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o sêmen de P. orbignyanus ao longo da estação reprodutiva e utilizar essas informações para auxiliar no processo de criopreservação do sêmen e no desenvolvimento de um protocolo de transferência de genes mediada por espermatozóides (TGME). Na primeira etapa deste estudo, amostras de sêmen de linguados selvagens foram coletadas ao longo da estação reprodutiva. Através dos resultados obtidos foi verificado que a produção de espermatozóides e a motilidade progressiva aumentam significativamente à medida que a estação reprodutiva progride para o seu final (P<0.05). A motilidade progressiva dos espermatozóides durou em média 10 min, porém o tempo total de motilidade alcançou cerca de 100 min. Com relação ao pH, a osmolalidade e a concentração dos íons K+, Cl- e Mg+ dosados no plasma seminal, assim como, para o percentual de células móveis, nenhuma diferença foi verificada ao longo da estação reprodutiva. No meio da estação foi observada uma diminuição na concentração do íon Ca2+, a qual coincidiu com o menor tempo de motilidade dos espermatozóides. A concentração de Na+ foi aumentando ao longo dos períodos monitorados, atingindo a maior concentração no fim da estação reprodutiva (P<0,05). Na segunda parte deste estudo, a criopreservação do sêmen do linguado P.orbignyanus foi realizada. Para isso, foram testadas duas soluções crioprotetoras: uma contendo glicerol diluído numa solução a base de sais e outra contendo DMSO (dimetilsulfóxido) diluído numa solução à base de sacarose. Os dados de fertilização, eclosão e viabilidade larval demonstraram que as duas soluções utilizadas são eficientes na criopreservação do sêmen do linguado. Na última etapa deste estudo, alguns fatores limitantes na TGME em peixes foram avaliados e um protocolo de incorporação de DNA exógeno pelos espermatozóides foi desenvolvido. Os resultados obtidos nesta parte do trabalho demonstraram que o plasma seminal do P.orbignyanus apresenta uma forte atividade da enzima DNase. Entretanto, a atividade dessa enzima pode ser eliminada ou diminuída lavando o sêmen com soluções contendo EDTA. Além disso,foi verificado que uma quantidade de DNA exógeno similar ou inferior a 50 ng/106 espermatozóides deve ser usada na TGME em peixes. Por último, foi demonstrado que os espermatozóides do linguado P. orbignyanus são capazes de incorporar o DNA exógeno espontaneamente após a eliminação da atividade das DNases. Isto ficou evidente através da amplificação do DNA exógeno através de PCR. Desta forma, os resultados obtidos neste estudo podem auxiliar no manejo reprodutivo dessa espécie e,conseqüentemente, na implementação de programas de melhoramento genético tanto da forma clássica através da criopreservação do sêmen dos reprodutores que apresentam as melhores características fenotípicas, como através de técnicas modernas como a TGME. / The Brazilian flounder Paralichthys orbignyanus is an important fishing resource from southern Atlantic coast of America and it has being considered for aquaculture. The sperm quality is an important variable in reproductive management of cultured species, influencing directly on the production of viable eggs. Moreover, the adequate knowledge of physical and chemical characteristics of the sperm is an important factor for developing short-term storage and cryopreservation protocols of sperm. The aim of this study was to characterize the P. orbignyanus sperm throughout the reproductive season to facilitate the sperm cryopreservation and to help in development of a sperm mediated gene transfer (SMGT) protocol. In the first part of this study, sperm samples were collected from wild flounders throughout the reproductive season. It was verified that the sperm production and the progressive motility of spermatozoa increased significantly towards the end of reproductive season (P<0.05). The mean time of progressive motility of spermatozoa was 10 min, however the total time of motility reached about 100 min. No difference was observed during the reproductive season in pH, osmolality and concentrations of K+, Cl- e Mg+ measured in seminal plasma as well as in percentage of cells motility. In the middle of the breeding season was observed a reduction in Ca+2 concentration which has coincided with the lesser motility time of spermatozoa. The Na+ concentration increased throughout the season, reaching the highest concentration at the end of reproductive period (P<0.05). In the second part of this study, the cryopreservation of the flounder sperm was carried out. Two different cryosolutions were tested: glycerol saline and DMSO - sucrose. The results of fertilization, hatching rate and larval viability demonstrate that both solutions are efficient in the cryopreservation of the flounder sperm. In the last part of this study, some limitant factors for exogenous DNA uptake by spermatozoa were evaluated and a SMGT protocol was developed. It was observed a strong DNase activity in P.orbignyanus seminal plasma. However, it was verified that DNase activity can be eliminated or decreased washing the sperm with EDTA-containing solutions. Moreover, it was verified that an amount of exogenous DNA similar or inferior to 50 ng/106 cells should be used in fish SMGT. At last, it was demonstrated that fish spermatozoa are capable to uptake exogenous DNA spontaneously after DNase activity elimination. This was evidenced through exogenous DNA amplification by PCR. The results of the present study should help in reproductive management of this species and consequently in implementation of genetic improvement programs based not only in the sperm cryopreservation, but also using modern techniques such as SMGT.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-13T13:25:06Z No. of bitstreams: 1 Lucia Cristina Pereira Arruda.pdf: 996319 bytes, checksum: 616f336889e4a925389d4de5babc78e7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-13T13:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucia Cristina Pereira Arruda.pdf: 996319 bytes, checksum: 616f336889e4a925389d4de5babc78e7 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Ram semen was diluted (200 x 106 sperm/mL) in Tris-egg yolk (5% glycerol), added of myicetin (0.1, 10, 20, 30, 40, 100, 200, 300, 400 and 1000 nM) and frozen (-196 ° C). After thawing (37°C/30s), kinetics, iMPA, PMM, iROS, LPO, eMP and fertility in vivo (0 and 100 nM myricetin) were evaluated. The analyzes of 0, 1, 10, 100 and 1000 nM of myricetin showed: 10nM myricetin showed lower % RAP (P≤0.05), than 1000nM. Samples of control showed higher (P≤0.05) VAP than 10nM, while samples with 10, 100 and 1000nM of myicetin showed higher BCF (P≤0.05), when compared to control. Miricetin 1000nM presented higher percentage (P <0.05) of cells with LPO, than the control. For 0, 20, 30, 40, 100, 200, 300 and 400 here was no treatment effect (P>0.05) for kinetics and flow cytometry (P> 0.05), there were also no interactions between treatment and time (P> 0.05). For both there was effect of the incubation time, in some evaluated parameters, the PM, VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, percentage of cells with intact plasma and acrosomal membrane, oxidative stress and membrane stability were reduced (P <0.05) in all groups, while BCF (P <0.05) increased in all groups.. The pregnancy rate in the 100 nM myricetin group was 50% (5/10) and that of the 10% control (1/10). In the in vitro analysis, it was concluded that myricetin has no antioxidant effect on cryopreserved spermatozoa. However, it improves the pregnancy rate of inseminated sheep. / Sêmen ovino foi diluído (200 x 106 espermatozoides/mL) em Tris-gema de ovo (5% de glicerol), acrescido de miricetina (0, 1, 10, 20, 30, 40, 100, 200, 300, 400 e 1000 nM) e congelado (-196 °C). Após descongelação (37°C/30s), avaliou-se cinética, iMPA, PMM, iROS, LPO, eMP e fertilidade in vivo (0 e 100 nM miricetina). As analises de 0, 1, 10, 100 e 1000 nM de miricetina evidenciaram: miricetina 10nM apresentou menor %RAP (P≤0,05), do que 1000nM. Amostras do controle apresentaram maior (P≤0,05) VAP que o 10nM, enquanto amostras com 10, 100 e 1000nM de miricetina evidenciaram maior BCF (P≤0,05), quando comparadas ao controle. Miricetina 1000nM apresentou maior percentual (P<0,05) de células com LPO, do que o controle. Para 0, 20, 30, 40, 100, 200, 300 e 400 não houve efeito do tratamento (P>0,05) para cinética e citometria de fluxo (P>0,05), também não houve interações entre tratamento x tempo (P>0,05). Para ambos houve efeito do tempo de incubação, em alguns parâmetros avaliados a MP, VCL, VSL, VAP, LIN, ALH, porcentual de células com membrana plasmática e acrossomal intactas, estresse oxidativo e estabilidade de membrana foram reduzidos (P <0,05) em todos os grupos, enquanto que o BCF (P <0,05) aumentou em todos os grupos. A taxa de prenhez no grupo 100 nM de miricetina foi de 50% (5/10) e a do controle 10% (1/10). Nas análises in vitro, conclui-se que a miricetina não tem efeito antioxidante sobre os espermatozoides criopreservados. No entanto, melhora a taxa de prenhez de ovelhas inseminadas.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-06-14T13:12:29Z No. of bitstreams: 1 Thalles Cloves Maciel de Moura.pdf: 598623 bytes, checksum: 1334de126ab769ec1f7cbbe5e338795e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-14T13:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Thalles Cloves Maciel de Moura.pdf: 598623 bytes, checksum: 1334de126ab769ec1f7cbbe5e338795e (MD5) Previous issue date: 2017-08-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of the study was to investigate the effects of different concentrations of sucrose on equine semen quality after thawing. Twenty-four ejaculates were obtained from 6 Mangalarga Marchador and Campolina stallions, in which each ejaculate was divided into 5 groups: control (freezing diluent without sucrose), positive control (Botucrio®®) and three groups consisting of the freezing diluent supplemented with Saccharose at concentrations of 25 mM, 50 mM and 100 mM. The semen samples were obtained with artificial vagina, evaluated and transported (5 ºC) to the laboratory. The semen samples were diluted (200x106 sperm / mL), packed in vales and subjected to freezing. Immediately after thawing (37 ° C, 30s), the semen samples were evaluated for kinetics, plasma and acrosomal membrane integrity, membrane stability and mitochondrial membrane potential. The addition of 50 and 100 mM sucrose to the freezing diluent increased (P <0.05) the MT, MP, VCL, VSL and VAP parameters in relation to the control group. The WOB parameter of the group supplemented with 100 mM sucrose concentration was higher (P <0.05) than the control group. Higher values ​​(P <0.05) of HLA and BCF were observed in the sucrose-treated groups (25, 50 and 100 mM) compared to Botucrio®. Frozen semen in the presence of 100 mM sucrose had higher percentages (P <0.05) of spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes (PNA- / IP-), and high mitochondrial membrane potential (APMM) when compared to frozen semen without sucrose (control group), with Botucrio® (positive control). It is concluded that the addition of sucrose at concentrations of 50 and 100 mM to the milk / yolk diluent can be an efficient cryoprotectant for freezing equine semen. / O objetivo do estudo foi investigar os efeitos de diferentes concentrações de sacarose sobre a qualidade do sêmen equino pós-descongelação. Foram utilizados 24 ejaculados obtidos de 6 garanhões da raça Mangalarga Marchador e Campolina, no qual, cada ejaculado foi dividido em 5 grupos: controle (diluidor de congelação sem sacarose), controle positivo (Botucrio®®) e três grupos constituídos do diluidor de congelação suplementados com Sacarose nas concentrações de 25 mM, 50 mM e 100 mM. As amostras de sêmen foram obtidas com vagina artificial, avaliadas e transportadas (5 ºC) para o laboratório. As amostras de sêmen foram diluídas (200x106 espermatozoides/mL), envasadas em palhetas e submetidas à congelação. Imediatamente após descongelação (37 ºC, 30s), as amostras de sêmen foram avaliadas quanto a cinética, integridade das membranas plasmática e acrossomal, estabilidade de membrana e potencial de membrana mitocondrial. A adição de 50 e 100 mM de sacarose ao diluidor de congelação aumentou (P < 0,05) os parâmetros de MT, MP, VCL, VSL e VAP, em relação ao grupo controle. O parâmetro WOB do grupo suplementado com sacarose na concentração de 100 mM foi maior (P < 0,05) do que o grupo controle. Maiores valores (P < 0,05) de ALH e BCF foram observados nos grupos tratados com sacarose (25, 50 e 100 mM), em comparação ao Botucrio®. O sêmen congelado na presença de 100 mM de sacarose apresentou porcentagens maiores (P < 0,05) de espermatozoides com membranas plasmática e acrossomal intactas (PNA-/IP-), e alto potencial de membrana mitocondrial (APMM), quando comparado com o sêmen congelado sem sacarose (grupo controle), com Botucrio® (controle positivo). Conclui-se que a adição de sacarose nas concentrações de 50 e 100 mM ao diluidor à base de leite/gema pode ser um eficiente crioprotetor para congelação de sêmen equino.

Os objetivos do estudo foram: (a) avaliar a influência da suplementação de vitamina A na dieta de cachaços nos parâmetros seminais: volume, motilidade, vigor espermático, pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas ao longo do ano; (b) averiguar a variabilidade das características, em animais suplementados com vitamina A na dieta, frente às variações da temperatura nas estações do ano. A pesquisa foi desenvolvida no Laboratório de Pesquisa em Suínos, da FMVZ-USP, utilizando-se 10 machos de linhagem híbrida e distribuídos em dois tratamentos, controle (nível de 25.000 UI de vitamina A/animal/dia) e suplementado com a vitamina A (nível de 40.000 UI de vitamina A/animal/dia). O delineamento foi inteiramente casualizado, com medidas repetidas no tempo, sendo os dados analisados utilizando o programa estatístico Statistical Analysis System (SAS). As probabilidades de interações com o tempo foram determinadas pelo teste de Greenhouse-Geisser Epsilon, considerando o nível de significância de 5%. Em relação aos efeitos da vitamina A durante o período de 1 ano, verificou-se que não houve diferença entre os tratamentos para os parâmetros seminais, não encontrando-se efeito de interação tempo e tratamento. Detectou-se efeito de tempo para os parâmetros pH, concentração espermática, número total de espermatozóides, percentual de espermatozóides vivos e anormalidades morfológicas. Já na averiguação da variabilidade também não foi constatado efeito de tratamento, porém houve efeito de estação do ano para todos os parâmetros e de temperatura para o percentual de espermatozóides vivos, pH e anormalidades morfológicas, não sendo verificado efeito para os demais parâmetros. Inferiuse com o estudo que, dada à condição metabólica diferencial dos animais híbridas, novas averiguações devem ser perseguidas para a relação nutrição e reprodução, uma vez que, os efeitos positivos da suplementação da vitamina A na espermatogênese foram evidenciados, principalmente nas características que mais se relacionam com a formação da célula espermática, as anormalidades morfológicas, percentual de espermatozóides vivos e número total de espermatozóides no ejaculado. / The objectives of the study were: (a) to evaluate the effect of vitamin A supplementation on boars? diet considering the parameters: volume, motility, spermatic vigor, seminal pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities during one year; (b) to investigate the variability founded against the temperature and seasons of the year on vitamin A supplemented animals seminal parameters. The research was developed in the Laboratory of Research in Swines, the FMVZUSP, using 10 boars of hybrid lineages. Two treatments were used having the control (level of 25.000 UI of vitamin A/animal/day) and vitamin A supplemented group (level of 40.000 UI of vitamin A/animal/day). The statistical design was random, with repeated measured in time. The analyzed data used was the statistical program Statistical Analysis System (SAS). The probabilities of the interactions in time were determined by Greenhouse-Geisser Epsilon test, considering the significant level 5%. None of the evaluated parameters was significantly different and no detected interaction in time was found treatment. In relation to the effects of the vitamin A on supplementation in one year period it wasn?t have differences among treatments on seminal parameters, and also there wasn?t interaction in time and at treatment, however for pH, spermatic concentration, total number of spermatozoa, percentage of living sperm cells and morphologic abnormalities it was detected effect on time. In relation to the variability there wasn?t treatment effect, however there was for all the parameters studied effect of the season. The effect of temperature was only for the percentage of living sperm cells, pH and morphologic abnormalities. It was concluded that at a given metabolic condition of the hybrid animals, new ascertainments must be inquired for the relation nutrition and reproduction, a time that, the positive effect of the suplementation of the vitamin in spermatogenesis had been evidenced, mainly in the characteristics that more become related with the formation of the espermática cell.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-17T10:25:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1092571 bytes, checksum: 58c49be4dd74df0158635ae605d33d22 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-17T10:25:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1092571 bytes, checksum: 58c49be4dd74df0158635ae605d33d22 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar os efeitos de diferentes crioprotetores e aditivos na criopreservação do sêmen equino sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento. Para tanto, foram designados dois experimentos (E). No E1 objetivou-se comparar o efeito do glicerol (GLIC) e da dimetilformamida (DMFA), associados ou não, sobre a viabilidade espermática in vitro pós-descongelamento, o que conferiu quatro grupos experimentais: glicerol a 5 % (GLIC), dimetilformamida a 5 % (DMFA), dimetilformamida a 3% associada ao glicerol a 2 % (DG) e o tratamento controle, composto pelo diluente comercial Botu-Crio® (BC). Já no E2 objetivou-se avaliar o efeito do congelamento de sêmen de garanhões em diluente contendo glicerol e/ou dimetilformamida, associados à antocianina (ATC) e/ou colesterol carreado por ciclodextrina (CCC). Para tanto, os ejaculados foram congelados em dez diferentes tratamentos, de acordo com as associações entre crioprotetores e aditivos. As amostras de ambos os experimentos foram avaliadas mediante teste de termo-resistência (TTR) e por meio de citometria de fluxo quanto à integridade de membrana plasmática e acrossomal, potencial mitocondrial, produção de peróxido de hidrogênio intracelular e peroxidação lipídica da membrana plasmática; a avaliação quanto à organização da bicamada lipídica só foi realizada no E1. Os melhores resultados obtidos no TTR do E1 foram referentes aos tratamentos DMFA e DG (p<0,05), que mantiveram as maiores médias de motilidade espermática total após trinta minutos de incubação a 37 oC. O potencial mitocondrial não sofreu alteração frente aos tratamentos aplicados (p>0,05). A maior proporção de células com integridade de membrana plasmática e acrossomal foi observada nos tratamentos DMFA e BC (p<0,05). A análise de organização de membrana revelou maior desorganização no tratamento GLIC (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio no tratamento DMFA e menor proporção no tratamento GLIC (p<0,05). Quanto à peroxidação da bicamada lipídica, não foram observadas diferenças entre os valores médios nos tratamentos (p>0,05). Em relação ao E2, não houveram interações entre crioprotetores e diluentes para maioria das características estudadas, sendo as comparações realizadas entre grupos de tratamentos. Entre os crioprotetores, o grupo DMFA apresentou os melhores resultados quanto à motilidade espermática durante o TTR, seguido do grupo DG (p<0,05) e dentre os aditivos os grupos CCC e AC foram superiores aos demais (p<0,05). Em relação à integridade de membrana plasmática e acrossomal, os grupos BC e GLIC apresentaram os piores resultados dentre os crioprotetores, assim como os grupos BC e ATC dentre os aditivos (p<0,05). As maiores médias obtidas quanto ao potencial mitocondrial foram referentes aos grupos DMFA e DG entre os crioprotetores, e CCC e AC entre os aditivos (p<0,05). Foi observada maior proporção de células viáveis com alta produção de peróxido de hidrogênio nos grupos DMFA e DG dentre os crioprotetores, e nos grupos CCC e AC dentre os aditivos (p<0,05). Em relação à peroxidação da membrana plasmática foi observada interação entre crioprotetores e aditivos na população de células viáveis (p<0,05), de forma a revelar melhor associação da CCC à DMFA. Diante dos resultados obtidos, concluiu-se que os tratamentos DMFA e DG apresentaram melhores condições para manutenção da viabilidade espermática in vitro, de forma que ambos podem sem utilizados como alternativa em diluidores na criopreservação de sêmen equino. Em relação ao uso da CCC, a sua associação deve ser feita preferencialmente com a DMFA. Os resultados obtidos quanto à ação da ATC não foram satisfatórios, necessitando de novos estudos quanto à concentração ideal e seus efeitos no congelamento de sêmen de garanhões. / The aim of this study was to compare the effects of different cryoprotectants and additives in cryopreservation of Mangalarga Marchador stallions semen on sperm viability in vitro post-thaw. Thus, we designed two experiments (E). In E1 we aimed to compare the effect of glycerol and dimethylformamide, associated or not, on the sperm viability post-thawing. Therefore we collected thirty ejaculates from four stallions. Each one was divided into four treatments: 5% glycerol (GLYC), 5% dimethylformamide (DMFA), an association of 2% glycerol and 3% dimethylformamide (DG) and control treatment compound by Botu-Crio®. In E2 we aimed to evaluate the effect of stallions semen freezing in diluent containing glycerol and or dimethylformamide associated with the anthocyanin (ATC) and or cholesterol loaded cyclodextrin (CCC). We collected orty-eight ejaculates of eight stallions and each one was frozen in ten different treatments, according to the associations between cryoprotectants and additives. The samples of both experiments were evaluated by thermo- resistance test (TTR) and by flow cytometry as to integrity of plasma and acrosomal membrane, mitochondrial potential, intracellular peroxide hydrogen production, lipid peroxidation and organization of the plasma membrane bilayer (only E1). The E1 best results on the TTR were related to DMFA and DG treatments (p<0.05), who maintained the highest average total sperm motility after thirty minutes of incubation at 37 ° C. Mitochondrial potential was not affected by any group (p>0.05). The highest proportion of cells with plasma and acrosomal membrane integrity was observed in DMFA and BC treatments (p<0.05). The analysis revealed the organization of membrane disruption was greater in GLIC treatment (p<0.05). We observed a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in the treatment DMFA and a lower proportion in GLIC treatment (p<0.05). As for the peroxidation of the lipid bilayer, no differences were observed between treatments (p>0.05). About E2 there were no interactions between cryoprotectants and diluents for most traits, with comparisons made between treatment groups. Among the cryoprotectants, DMFA group showed the best results on the TTR, followed by DG group (p <0.05) and among the additives CCC and AC groups were superior to the others (p <0.05). Regarding the integrity of plasma and acrosomal membrane, the BC and GLYC groups showed the worst results among cryoprotectants, as well as BC and ATC groups among the additives (p <0.05). The highest mean about mitochondrial potential were related to DMFA and DG groups among cryoprotectants, and CCC and AC between additives (p <0.05). There was a higher proportion of cells with high production of hydrogen peroxide in DMFA and DG groups from the cryoprotectants, and CCC and AC groups among the additives (p <0.05). In relation to the plasma membrane peroxidation was observed interaction between cryoprotectants and additives in the population of viable cells (p <0.05), in order to better reveal the association CCC plus DMFA. It was concluded that the DMFA and DG treatments showed better conditions for maintaining sperm viability in vitro, so both can use like alternative method for cryopreservation of stallion semen. The association with the CCC should be made preferably by with DMFA. The results related to ATC were not satisfactory, revealing with it the need for new studies about its optimal concentration and effects on semen freezing stallions.

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Banca: José Antônio Dell'Aqua Júnio / Banca: Rubens Paes de Arruda / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a adição do plasma seminal autólogo ao sêmen criopreservado de jumentos, aliado a lavagem uterina pós-inseminação artificial influencia nos índices de fertilidade em jumentas. Para isso, dois experimentos foram realizados: No experimento I foram analisados os parâmetros de cinética espermática pelo método computer assisted sperm analysis (CASA), análise da integridade de membrana plasmática e acrossomal (MPAI), peroxidação lipídica (PERO) e teor de espécie reativa de oxigênio intracelular (EROS) pela técnica de citometria de fluxo, de 15 ejaculados de 3 jumentos, diluídos em INRA-96®(IC - INRA, IMV Technologies, France) - Rota et al., (2012) ou em BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brasil), com e sem adição de plasma seminal (PS) após a descongelação. Os resultados do CASA foram semelhantes para os 2 diluentes (P>0,05), no entanto o BC proporcionou uma maior integridade de MPAI além da PERO menor que o IC, resultando em menor EROS (P<0,05). A adição do PS reduziu os parâmetros do CASA (p<0,05), porém sem ação na MPAI e PERO (p>0,05). No experimento II, avaliou-se a influência da adição do PS autólogo na pós-descongelação e sua associação à lavagem uterina (L) pós-inseminação artificial (IA), na fertilidade de jumentas. Foram utilizados 86 ciclos de 33 jumentas, divididas em 8 grupos: G1) BC + PS + L e G2) IC + PS + L foram testados mediante inseminações em 14 ciclos cada; G3) BC + L e G4) IC + L foram testadas em 11 ciclos cada, todas as L foram feitas 10 horas após a IA; G5) BC + PS e G6) IC + PS foram empregados em 8 ciclos cada, e o G7) BC e G8) IC foram avaliados em 10 ciclos cada. Verificou-se que o PS não influiu na fertilidade de jumentas (p = 0,6582) contudo a L,10 h pós-IA, interferiu positivamente na taxa de prenhez (p = 0,0097) elevando de 0% (G7 e G8) para 42,9% (G1 e G2) / Abstract: The aim of this study was to evaluate whether the addition of autologous seminal plasma to frozen donkey semen, coupled uterine flushing after artificial insemination influence on fertility rates in jennies. Two experiments were conducted: experiment I, the parameters of sperm kinetics were analyzed by using computer assisted sperm analysis (CASA), analysis of plasma membrane integrity and acrosome (MPAI), lipid peroxidation (PERO) and reactive species content intracellular oxygen (ROS) by the technique of flow cytometry, 15 ejaculated 3 donkeys, diluted in INRA-96® (IC - INRA, IMV Technologies, France) -. Rota et al, (2012) or BotuCrio® (BC - Botupharma, Botucatu, Brazil), with and without addition of seminal plasma (SP) after thawing. The results were similar for CASA to 2 extenders (P> 0.05), however BC provided greater MPAI integrity beyond smaller PERO than the IC, resulting in lower EROS (P <0.05). The addition of PS reduced the parameters of CASA (P <0.05), but no action on the MPAI and Pero (P> 0.05). Experiment II, evaluated the influence of the addition of autologous SP in post-thaw and its association with uterine lavage (L) pos-IA, in the fertility jennies. 86 cycles of 33 jennies were used, divided into 8 groups: G1) BC + SP + Land G2) IC + SP + L, were tested by 14 cycles each; G3) BC+L and G4) IC+ L, were tested on each 11 cycles, all L were made 10 hours after AI; G5) BC + SP and G6) IC + SP were used in 8 cycles each, and the G7) BC and G8) IC were evaluated in 10 cycles each. It was found that the SP, had no effect on fertility jennies (p = 0.6582) however L 10 h post-IA, increased pregnancy rate (p = 0.0097) increasing from 0% (G7 and G8) to 42.9% (G1 and G2) / Mestre

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-02-03T21:24:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ViabilidadeDoseFracionada.pdf: 4826930 bytes, checksum: 95407621be9a7a160f86369721745af8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-04T16:54:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ViabilidadeDoseFracionada.pdf: 4826930 bytes, checksum: 95407621be9a7a160f86369721745af8 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-04T16:54:02Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_ViabilidadeDoseFracionada.pdf: 4826930 bytes, checksum: 95407621be9a7a160f86369721745af8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Considerando a baixa concentração espermática necessária para promover a fecundação de oócitos na FIV, objetivou-se com este trabalho avaliar a qualidade da dose de sêmen bovino criopreservada após o seu fracionamento em duas partes visando um maior aproveitamento da mesma em programa de PIV. O experimento foi realizado utilizando 110 doses de sêmen congeladas em palhetas de 0,25 mL proveniente de 10 touros, que foram divididas em etapas: Uma dose representou o grupo controle, 5 foram destinadas para o grupo de descongelação direta (DD) e 5 para o grupo de descongelação indireta (DI). As doses foram fracionadas em duas partes, formando para cada grupo dois subgrupos, unidade da esfera (UE) e unidade do álcool polivinílico (UAP). O primeiro subgrupo teve análise imediata; e o segundo foi analisado após 24h de armazenamento em N2. Os dados foram analisados por estatística descritiva, teste de Kruskal-Wallis e SNK (P < 0,05), apresentando motilidade e vigor: DI- imediata: 48,8% / 2,4; DI-24h: 54,2% / 2,5; DD-imediata: 67,8% / 3,0; DD-24h: 69,6% / 3,0; Controle: 70% / 3,0. Para lesão de acrossoma e integridade da membrana: DI- imediata: 24,3% / 40,5%; DI-24h: 36,2% / 44,3%; DD-imediata: 12,8% / 63,6%; DD-24h: 12,6% / 59,0%; controle: 11,9% / 57,5%. Média de concentração espermática: DI- imediata: 6,1×106 DI-24h: 7,2×106; DD- imediata: 8.2×106; DD-24h: 7.8×106 espermatozóide/fração de dose. Deste modo para o fracionamento da dose de sêmen bovino criopreservado o melhor método de descongelação foi o direto, uma vez que apresentou os melhores resultados em todos os parâmetros analisados. / Given the low sperm concentration necessary to promote the fertilization of oocytes in FIV, this paper aims at evaluating the quality of dose of bovine semen cryopreserved after its splitting into two parts to make better use of it on the PIV program. The experiment used 110 doses of frozen semen in pallets of 0.25 mL from 10 bulls, which were divided into stages: A dose represented the control group, five were assigned to the group of direct thawing (DT) and 5 for the group of indirect thawing (IT). Doses were fractionated into two parts, forming two subgroups for each group, the unit sphere (UE) and polyvinyl alcohol unit (PAU). The first subgroup analysis was immediate, and the second was analyzed after 24h storage in N2. Results were obtained through descriptive statistics, Kruskal-Wallis and SNK (P <0.05), motility and force: immediate Indirect thawing: 48.8% / 2.4, IT-24: 54.2% / 2.5, immediate direct thawing: 67.8% / 3.0, direct thawing-24: 69.6% / 3.0, Control: 70% / 3.0. For acrosome injury and membrane integrity: immediate Indirect thawing: 24.3% / 40.5%, indirect thawing- 24: 36.2% / 44.3%, immediate direct thawing: 12.8% / 63.6%, DT -24h: 12.6% / 59.0%, control: 11.9% / 57.5%. Average sperm concentration: DI-immediate: 6.1 × 106 DI-24: 7.2 × 106, DD-immediate: 8.2 × 106, DD-24: 7.8 × 106 sperm / dose fraction. Thus for the fractionation of the dose of bovine semen cryopreserved best thawing method was straightforward, since it showed the best results in all parameters.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T19:43:53Z No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T19:44:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T19:44:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2016-08-05 / Os métodos de seleção espermática são utilizados com o objetivo de isolar uma maior população de espermatozoides morfologicamente melhor, além de permitir a capacitação destes, incrementando a taxa de embriões produzidos in vitro. Entre os métodos de seleção, o mais utilizado comercialmente na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é o método de Gradiente Descontínuo de Percoll® (GDP). No entanto, apesar da praticidade desta técnica, a etapa de centrifugação é prejudicial, sendo responsável por danos estruturais as células espermáticas, bem como a diminuição da motilidade e da taxa de recuperação, interferindo assim, nas taxas de fecundação in vitro (FIV). Este estudo objetivou avaliar a centrifugação com amortecimento utilizando uma solução de iodixanol durante a seleção espermática para a PIV de embriões bovinos. No experimento I, o sêmen foi descongelado e dividido em quatro grupos, e os espermatozoides submetidos a separação espermática pelo método de GDP com ou sem a solução colóide; sendo o amortecimento testado na primeira (C1), segunda (C2) ou ambas centrifugações (C1-2). Em seguida, foram avaliadas a taxa de recuperação, a cinética espermática, e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). No experimento II foi avaliada a taxa de fecundação e a cinética de desenvolvimento embrionário dos grupos C e C1, que foram os tratamentos que demonstraram os melhores resultados para a cinética espermática, taxa de recuperação e análise bioquímica no primeiro experimento. Neste estudo, o grupo com amortecimento obteve um aumento na taxa de fecundação e clivagem, quando comparado ao grupo controle (60,5 vs 48,55 e 80,0 vs 64,7%, respectivamente). Com base nestes resultados foi possível concluir que o uso de 9 uma solução de amortecimento durante a etapa de centrifugação para a seleção espermática permitiu a preservação da cinética e da integridade da membrana dos espermatozoides, sem reduzir a taxa de recuperação. Adicionalmente, foi demonstrado pela primeira vez que o uso da centrifugação com amortecimento incrementa, não apenas a taxa de fecundação e clivagem, mas também o número de embriões que clivam mais cedo. / In order to optimize bovine in vitro fertilization (IVF), sperm selection methods have been used to isolate sperm subpopulations with high fertilizing capacity for use in animal breeding. Among the methods of sperm selection, the most common method used is the Discontinuous Percoll® Gradients (DPG). However, again despite the practicality of this technique, the centrifugation step is harmful, accounting for structural damage in sperm and decrease in motility and sperm recovery rate, as well as interfering with in vitro fertilization rates. This study aimed to evaluate the cushioned centrifugation using an iodixanol solution on sperm selection for in vitro production (IVP) of bovine embryos. In experiment I, the thawed semen was divided into four groups and the sperm subjected to the separation method by discontinuous Percoll® gradients with and without a colloid solution, where the cushioning was tested in the first (C1), second (C2), and both centrifugations (C1-2). Then, the recovery rate, sperm kinetics, and production of reactive oxygen species (ROS) were evaluated. Experiment II evaluated the fertilization rate and embryonic development kinetics of C and C1 groups; who were the treatments that have shown the best results for motion kinetics, recovery rate, and biochemical analysis in Experiment I. In this assay, the group with cushioning obtained an increase in the fertilization and cleavage rate when compared with the control (60.5 vs 48.55 and 80.0 vs 64.7%, respectively). With this study, we can conclude that the use of a cushion solution during centrifugation on sperm selection had preserved the motion properties of spermatozoa and the 11 integrity of the sperm membrane without lowering the recovery rate. Furthermore, it was demonstrated for the first time that the use of cushioned centrifugation increases not only the cleavage rate but the number of embryos previously cleaved.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-29Bitstream added on 2014-06-13T19:17:43Z : No. of bitstreams: 1 martins_jla_me_botfmvz.pdf: 366556 bytes, checksum: 5564f8a57d5ae434024a1843feeb124b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A análise dos efeitos da refrigeração sobre a congelabilidade da célula espermática da cauda do epidídimo de gatos domésticos foram avaliados nesse experimento. Após prévia refrigeração a 5O C por 24 horas alíquotas de sêmen foram submetidas a criopreservação e posteriormente descongeladas para análise morfofuncional. 15 animais foram submetidos a orquiectomia de conveniência e seus epidídimos foram manipulados para obtenção de amostras que foram suspensas em meio TE (TRIS/Equex/Gema de Ovo), analisadas, refrigeradas e congeladas. Amostras referentes ao grupo controle foram congeladas imediatamente após a colheita. A analise morfofuncional consistiu em motilidade, vigor, morfologia espermática e Integridade de membrana. Após a descongelação os resultados dos grupos controle e trabalho foram analisados estatisticamente e observou-se que não existe diferença estatística para nenhuma das variáveis analisadas. Embora tenha sido observada diferença estatística entre os momentos pós-colheita e pós-refrigeração por 24 horas para as variáveis motilidade, vigor, integridade de membrana e defeitos primários, nenhuma variável diferiu entre as amostras congeladas pós-colheita e as amostras congeladas pós-refrigeração prolongada. Tais resultados demonstram que um transporte refrigerado a 5O C por 24 horas não interfere sobre a congelabilidade de sêmen do epidídimo de gatos domésticos. Do ponto de vista da conservação tais resultados abrem portas para um melhor fluxo de gametas de espécies selvagens para centrais de biotecnologia permitindo um melhor aproveitamento e conservação deste material. / The present study analyzed the effect of cooling on sperm cells obtained from the epididymis tail from domestic cats in respect to their capability for freezing. The treatment group had their samples submitted to freezing after being cooled at 5° C during 24 hours, and th~ control group samples were frozen immediately after collection, Samples from both groups were then thawed and submitted to mo rphofunctiona I analysis. Fifteen animais were submitted to a convenient routine orchiectomy and their epididymis were processed to obtain a semen samples which were suspended in TE medium (TRIS/Equexl egg yolk). The samples were then analyzed, coo,led and frozen. The morphofunctional analysis consisted of sperm motility, vigor, morphology and membrane integrity. After thawing, the semen samples from treatment and control groups were analyzed and no statistic difference was found among ali variables described above.

As biotécnicas da reprodução na espécie equina avançaram na última década, tanto em conhecimento agregado por pesquisas como também pela demanda do mercado. No entanto, na espécie equina machos com subfertilidade são diagnosticados frequentemente com elevado número de espermatozoides com alterações morfológica e/ou imóveis. A utilização apenas de células viáveis para realizar o processo de resfriamento busca evitar perda de material (diluente) e produção de metabólitos tóxicos aos espermatozoides viáveis. O objetivo deste estudo foi utilizar a separação espermática (lã de vidro e centrifugação com Androcoll®) pré-resfriamento para incrementar a viabilidade do sêmen de garanhões pôneis refrigerados a 5ºC durante 48h. Os parâmetros motilidade, funcionalidade de membrana (HOST), viabilidade espermática (CFDA/PI), atividade mitocondrial e morfologia espermática foram avaliados no sêmen fresco e refrigerado (24 e 48h). A utilização da filtração por lã de vidro ou Androcoll® pré-resfriamento do sêmen equino selecionou espermatozoides com maior motilidade, funcionalidade de membrana, viabilidade espermática e atividade mitocondrial. Adicionalmente, a filtração por lã de vidro proporcionou refrigerar sêmen com elevado número de células morfologicamente normais sem perdas significativas de espermatozoides pelo processo de filtração. Tanto a técnica de lã de vidro como a centrifugação com Androcoll® mostraram-se eficientes em separar ejaculados com maior viabilidade para o resfriamento. Já a técnica de lã de vidro apresenta-se como uma técnica de baixo custo e de fácil execução para ser aplicada tanto para pequenos, ou grandes volumes de sêmen. / The reproduction biotechnologies in equine species have advanced in the last decade both in aggregate knowledge by research as well as the market demand. However, it in the equine species often with male subfertility where the ejaculate has a high number of sperm with morphological and / or property changes. The use of only viable cells to perform the cooling process seeks to avoid loss of material (diluent) and production of toxic metabolites to viable sperm. The aim of this study was to use the sperm separation (glass and spin wool with Androcoll®) pre-cooling to increase the viability of semen chilled ponies stallions at 5 ° C for 48 hours. We evaluated the motility parameters, membrane functionality (HOST), sperm viability (CFDA / PI), mitochondrial activity and morphology in fresh and chilled semen (24 and 48h). The use of filtration glass wool or Androcoll® pre-cooling of equine semen selected sperm with higher motility, functionality membrane, sperm viability and mitochondrial activity. In addition to filtration through glass wool afforded cooling semen with a high number of morphologically normal cells without significant losses of spermatozoids the filtration process. Both glass wool technique as centrifugation with Androcoll® were efficient in separating ejaculated more viability for cooling. Already glass wool technique presents itself as a low cost and simple technique to be applied to both small or large volumes of semen.