Foi proposto que animais submetidos a estresse crônico mostram uma resposta ao estresse que pode ser reduzida pela ingestão de alimentos palatáveis (“comfort foods”). No entanto, uma dieta saborosa, rica em açúcar ou gordura, também pode levar a dano oxidativo e lesão neuronal. Assim, o objetivo deste estudo é verificar, em ratos machos e fêmeas, os efeitos da exposição crônica ao estresse durante o acesso livre a ração padrão e a uma dieta altamente palatável sobre o comportamento exploratório, a memória espacial e a ansiedade, bem como o estresse oxidativo e quebras do ADN em duas estruturas do sistema nervoso, hipocampo e estriado. Ratos Wistar machos e fêmeas foram submetidos ao estresse de contenção por 40 dias. A dieta era ração padrão e chocolate ad libitum. O estresse crônico induziu um comportamento do tipo ansioso em ratas fêmeas e o consumo de uma dieta palatável aumentou a atividade locomotora; uma interação também foi observada entre a dieta e estresse, pois a dieta preveniu, ao menos em parte, os efeitos do estresse sobre o comportamento nas fêmeas. Nos ratos machos, a dieta mostrou um efeito facilitador na memória espacial em dias de treinamento. Os resultados também mostraram que o estresse e a dieta induziram aumento no índice de quebras de ADN e um desequilíbrio na atividade de enzimas antioxidantes, catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), nas estruturas estudadas em ambos os sexos, além da perturbação na produção de óxido nítrico, especialmente no hipocampo de ratos machos. Medidas de estresse oxidativo no hipocampo dos ratos machos mostraram que a dieta palatável diminuiu a atividade das enzimas GPx, CAT e da razão SOD:CAT. O estresse crônico mostrou uma tendência em aumentar a produção de óxido nítrico enquanto que a dieta diminuiu. Nas fêmeas, a exposição ao estresse crônico diminuiu a atividade da SOD e a dieta aumentou o potencial antioxidante reativo total (TRAP). Na exposição ao estresse agudo, foi observado, no hipocampo dos ratos machos, que o estresse agudo aumentou as quebras de ADN e houve uma tendência de aumentar a atividade da SOD, enquanto que a dieta palatável diminuiu a atividade desta enzima. Concluindo, observou-se que ratas fêmeas parecem ter maior susceptibilidade aos efeitos do estresse, e que o acesso a uma dieta palatável foi capaz de neutralizar alguns efeitos comportamentais do estresse. No entanto, esta mesma dieta induziu um aumento do estresse oxidativo e de quebras do ADN, especialmente nos machos. Além disso, uma única exposição ao estresse por contenção apresentou, no hipocampo de ratos machos, aumento nas quebras de ADN e a dieta induziu alterações na atividade de enzimas antioxidantes. O estresse por contenção e o consumo de uma dieta palatável induziram um estado de maior susceptibilidade ao estresse oxidativo em diferentes estruturas cerebrais, considerando alterações na atividade das enzimas antioxidantes e nas quebras ao ADN e também na produção de óxido nítrico. / It has been proposed that animals subjected to chronic stress show a stress response that can be reduced by the intake of highly palatable foods (“comfort foods”). However, a palatable diet, rich in sugar or fat, can also lead to oxidative damage and neuronal injury. So, the aim of this study is to verify, in male and female rats, the effects of exposure to chronic stress during free access to regular chow and to a highly palatable diet, on exploratory, spatial memory and anxiety-like behavior, on oxidative stress and on DNA breaks in two structures of the nervous system, hippocampus and striatum. Wistar rats male and female were submitted to restraint stress for 40 days. The diet was standard chow and chocolate, ad libitum. Chronic stress induced anxiety-like behavior in female rats and the consumption of a palatable diet increased the number crossing and an interaction was also observed between diet and stress. In male rats, the diet showed a facilitatory effect on spatial memory on training days. About oxidative stress, the results showed stress- and diet-induced DNA breaks and an imbalance in the activity of antioxidants enzymes, such as CAT, GPx and SOD in the both structures, besides disturbed production of nitric oxide especially in male rats hippocampus. About oxidative stress, in the hippocampus of male rats, the palatable diet decreased GPx, CAT activities and SOD:CAT ratio and chronic stress showed a tendency to increase the production of nitric oxide, while the diet decreased it. In female rats, the exposure to chronic stress decreased SOD activity and diet incresead TRAP. Acute stress increased DNA breaks and showed a tendency to increase SOD activity. In addition, we observed that female rats appear to have higher susceptibility to the stress effects evaluated, and that access to a palatable diet was able to counteract some behavioral effects of stress. However, this same diet induced oxidative stress and increased DNA breaks, especially in males. Furthermore, a single exposure restraint stress showed increased DNA breaks in the hippocampus of male rats. Restraint stress and consumption of a palatable diet induced a state oh higher susceptibility to oxidative stress in different brain structures, considering the altered activities of antioxidant enzymes, production nitric oxide and DNA breaks.

A ingestão de ácidos graxos na forma de gordura proveniente da dieta tem aumentado nos últimos anos, principalmente na forma de gordura saturada. Tem sido observado que ácidos graxos saturados podem causar a liberação de citocinas em diversos tecidos e células. Além disso, em indivíduos obesos, tem se observado que há uma inflamação crônica e de baixo grau, que poderia ter entre seus causadores os ácidos graxos provenientes da dieta. Já os ácidos graxos poli-insaturados têm sido citados como sendo neuroprotetores devido a suas propriedades anti-inflamatórias e anti-apoptóticas. A barreira hematoencefálica (BHE) é um dos principais fatores que regulam a captação dos ácidos graxos no sistema nervoso central (SNC). A captação de ácidos graxos pelo cérebro é seletiva, priorizando a entrada de ácidos graxos poli-insaturados e suprimindo a entrada de ácidos graxos saturados. Além disso, a quantidade relativa de ácidos graxos no sangue pode afetar o grau de penetração desses no SNC. Existem diversas condições onde há aumento na permeabilidade da BHE e, nessas situações, o SNC pode ficar mais exposto a substâncias que normalmente não estão presentes ou estão em baixas concentrações, como os ácidos graxos saturados de cadeia longa. Dessa forma, é importante que se analise os efeitos dessas substâncias em células cerebrais. Os astrócitos são células presentes no SNC caracterizadas por expressarem e secretarem a proteína S100B e por expressarem a proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Os astrócitos captam glutamato e o metaboliza através da enzima glutamina sintetase (GS), formando glutamina, um processo importante para evitar o acúmulo de glutamato e excitotoxicidade. Essas células são muito resistentes ao estresse oxidativo devido ao seu alto conteúdo de glutationa reduzida (GSH). Em condições patológicas, os astrócitos liberam o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e a produção dessa citocina é um importante componente da resposta neuroinflamatória que está associada com muitas desordens neurológicas. Os astrócitos possuem o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE), que tem entre seus ligantes a S100B e sua ativação está envolvida na resposta inflamatória imediata. O receptor tipo toll 4 (TLR4) também está presente nessas células e ligado à resposta inflamatória. A ciclooxigenase 2 (COX-2) é uma enzima associada à inflamação e sua indução é responsável por desencadear muitas citocinas e mediadores inflamatórios presentes em diversos tipos celulares. Utilizando cultura primária de astrócitos de ratos Wistar, nós investigamos a ação dos ácidos graxos saturados e insaturados sobre parâmetros função de astrocitária, oxidativos e inflamatórios. Nosso estudo não encontrou alterações na viabilidade e integridade celular. Observamos um aumento dose-dependente na secreção de S100B nos astrócitos incubados apenas com o ácido palmítico. Não encontramos alterações para nenhum ácido graxo no conteúdo de GFAP, GSH ou captação de glutamato. Para o ácido linoleico observamos um aumento na atividade da GS e na oxidação do DCF. A secreção de TNF-α aumentou para os ácidos graxos saturados e não se alterou para os poli-insaturados. O conteúdo de COX-2, TLR4 e RAGE não foi alterado. Nossos resultados reforçam os dados de que ácidos graxos saturados, e não os insaturados, causam aumento na liberação de citocinas e podem contribuir para o processo neuroinflamatório encontrado em condições de aumento na permeabilidade da BHE. Além disso, verificamos que nem toda inflamação desencadeia aumento na secreção de S100B, visto que só tivemos esse comportamento para o ácido palmítico. Nossos resultados também reforçam o potencial terapêutico do ácido linoleico, que poderia desencadear adaptações nos astrócitos com possíveis benefícios para pacientes acometidos por patologias que envolvam a excitotoxicidade glutamatérgica. / The intake of fatty acids in the form of fat from the diet has increased in recent years, especially in the form of saturated fat. It has been observed that saturated fatty acids can cause the release of cytokines in various tissues and cells. Furthermore, in obese individuals, it has been observed a chronic and low-grade inflammation, which could have among their causers the diet fatty acids. Polyunsaturated fatty acids have been considered neuroprotective because of their antiinflammatory and antiapoptotic properties. The blood-brain barrier (BBB) is one of the major factors regulating the uptake of fatty acids in the central nervous system (CNS). The brain uptake of fatty acids is selective, prioritizing the entry of polyunsaturated fatty acids and suppressing the entry of saturated fatty acids. In addition, the relative amount of fatty acids in the blood can affect the degree of penetration of these into the CNS. There are several conditions where there is an increase in BBB permeability and in these situations the CNS may be more exposed to substances that are not normally present or are in low concentrations, such as saturated long chain fatty acids. Thus, it is important to analyze the effects of these substances in brain cells. Astrocytes are cells present in the CNS characterized by expressing and secreting the S100B protein and by expressing the glial fibrillary acidic protein (GFAP). Astrocytes uptake glutamate and metabolize it through the glutamine synthetase (GS) enzyme, forming glutamine, an important process to avoid the accumulation of glutamate and excitotoxicity. These cells are very resistant to oxidative stress because of their high reduced glutathione content (GSH). In pathological conditions, astrocytes release tumor necrosis factor alpha (TNF-α), and the production of this cytokine is an important component of the neuroinflammatory response that is associated with many neurological disorders. Astrocytes have the receptor for advanced glycation endproducts (RAGE), which has among its ligands S100B and its activation is involved in the immediate inflammatory response. The tolllike receptor 4 (TLR4) is another receptor present in these cells, which is also linked to the inflammatory response. The cycloxygenase-2 (COX-2) is an enzyme associated with inflammation and its induction is responsible for triggering many cytokines and inflammatory mediators in many cell types. Using astrocyte primary cultures from Wistar rats, we investigated the effect of saturated and unsaturated fatty acids on astrocytic function and oxidative and inflammatory parameters. Our study found no changes in cell viability and integrity. We observed a dose-dependent increase in S100B secretion in astrocytes incubated only with palmitic acid. We did not find alterations from fatty acids in the content of GFAP and GSH as well as uptake of glutamate. For linoleic acid, we observed an increase in GS activity and in DCF oxidation. TNF-α secretion increased to the saturated fatty acids and did not change for polyunsaturated. The contents of COX-2, TLR4 and RAGE did not change. Our results reinforce the data that saturated fatty acids, and not unsaturated, cause an increase in the release of cytokines and may contribute to the neuroinflammatory process found under conditions of increase in BBB permeability. In addition, we found that inflammation not always triggers an increase in S100B secretion, since we only had this behavior for palmitic acid. Our results also reinforce the therapeutic potential of linoleic acid, which could trigger adaptations in astrocytes with possible benefits for patients affected by pathologies involving glutamatergic excitotoxicity.

Atualmente a biodisponibilidade de doses baixas de metilmercurio (MeHg) pelo consumo de peixe é muito generalizada. Por outro lado, a vitamina A (VitA) é um nutriente essencial com uma alta presença entre os consumidores globais na dieta normal, alimentos processados e suplementos. O MeHg e um conhecido neurotóxico, mesmo em doses baixas, com a capacidade de afetar diversos órgãos e produzir efeitos deletérios na saúde, especialmente em mulheres gravidas, onde pode desencadear alterações sistêmicas e no neurodesenvolvimento após o nascimento. Adicionalmente, nosso laboratório demostrou com sucesso em modelos animais, os efeitos pró-oxidantes e alterações comportamentais produzidos pela suplementação com VitA em doses consideradas seguras. No entanto, apesar de serem conhecidos os efeitos biológicos do MeHg e da VitA de forma individual, nenhum estudo da literatura avaliou seus efeitos combinados. Então, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de uma dose baixa e ambientalmente relevante de MeHg coadministrada com uma dose de suplementação de VitA em ratas gestantes e lactantes sobre o comportamento e tecidos das mães e seus filhotes. Trinta ratas Wistar gravidas (entre 7 e 8 por grupo) foram suplementadas oralmente com azeite mineral (controle), MeHg (0,5 mg/Kg/dia) e palmitato de retinol (7500 μg RAE/Kg/dia) individualmente ou em combinação, desde o início da gestação (GD 0) até o desmame dos filhotes (DPN 21). Nem as mães nem os filhotes apresentaram alterações morfológicas, sistêmicas, toxicológicas ou metabólicas provocadas pelo tratamento de co-exposição MeHg-VitA No entanto, foram encontradas modulações de atividades enzimáticas nas enzimas glutationa- dependentes em forma tecido-específica, assim como efeitos deletérios/benéficos em termos da peroxidação lipídica. Por último, o tratamento MeHg-VitA foi capaz de alterar o processo de aprendizado associativo na etapa neonatal, sem modular o neurodesenvolvimento dos filhotes. Além disso, não produziu alterações comportamentais em idades posteriores, mas afetou a resposta de aprendizado de maneira sexo-dependente. Em conclusão, o tratamento MeHg-VitA sob nosso paradigma de exposição pode modular reações nocivas/benéficas em termos da toxicidade tanto em mães como filhotes, dependendo do tecido estudado, e produzir efeitos in vivo em combinação (MeHg+VitA) completamente diferentes dos efeitos individuais dos compostos. Nossos resultados no modelo animal mostram a importância do cuidado na alimentação de gestantes e lactantes para evitar alterações na saúde da futura criança pelo consumo inadvertido destes compostos em combinação. As respostas pró-oxidantes podem levar a efeitos a nível celular. Além disso, recomendamos mais trabalhos sobre metabolitos ativos do palmitato de retinol que podem ter efeitos benéficos durante casos de intoxicação com MeHg em doses baixas, especialmente no sistema nervoso. As implicações epidemiológicas de nossos resultados ainda são desconhecidas, por tanto são requeridos mais estudos epidemiológicos de seguimento e hábitos alimentares nas populações materna e infantil ao nível mundial. / Actually, low-dose methylmercury (MeHg) bioavailability through fish consumption is ubiquitous. In contrast, vitamin A (VitA) is an essential nutrient with a high presence among global consumers in the regular diet, processed foods, and supplements. MeHg is a well-known neurotoxin, even at low doses, capable of affecting other organs and produce deleterious effects on health, especially in pregnant women, where it can unleash systemic and neurodevelopmental alterations after birth. Additionally, our lab successfully demonstrated, in an animal model, pro-oxidant effects and behavioral disturbances produced by VitA supplementation at doses considered as safe. However, although individual biological effects of the previous compounds are well known, no study in literature evaluated their effects in combination. Thus, the aim of the present work was to investigate the effects of an environmentally relevant low-dose of MeHg co-administered with a supplementation dose of VitA in pregnant and lactating rats on maternal and offspring behavior and tissues. Thirty Wistar female pregnant rats were orally supplemented with mineral oil (control), MeHg (0,5 mg/Kg/day) and retinyl palmitate (7500 μg RAE/Kg/day) either individually or in combination from the beginning of gestation (GD 0) until weaning (DPN 21). Neither dams nor their offspring presented morphological, systemic, toxicological or metabolic disturbances caused by co-exposition treatment MeHg-VitA. But, showed tissue-specific modulations of enzymatic activities in glutathione-dependent enzymes, and deleterious/beneficial effects regarding lipid peroxidation Finally, MeHg-VitA treatment was able to alter associative learning in neonatal stage, with no modulation of pup´s neurodevelopment. Also, it did not produce behavioral alterations at later age, however, affected learning response in a sex-dependent manner. In conclusion, MeHg-VitA treatment under our exposure paradigm can modulate harmful/beneficial reactions in terms of toxicity either for dams and their offspring depending of the studied tissue, and produce in vivo effects in combination (MeHg+VitA) completely differents from individual effects of the compounds. Our results in animal model shows the importance regarding the care in food consumption in pregnant and lactating, to avoid health disturbances in the future infant due to unadverted consumption of these compounds in combination. Pro-oxidant responses can lead to effects at cellular level. Furthermore, we recommend more studies regarding active metabolites of retinyl palmitate which can have beneficial effects during cases of low-dose MeHg intoxication, especially in the nervous system. Epidemiological implications of our results are still unknown, for that more follow-up and food habits epidemiologic studies are required among maternal and infant populations worldwide.

O consumo de bebidas energéticas cresce a cada ano e atinge um grupo cada vez maior de adolescentes e adultos jovens, porém, o impacto destas bebidas no desenvolvimento e na saúde ainda não tem resultados concretos. Diante do aumento no consumo de bebidas energéticas, principalmente associadas ao álcool, e considerando que o impacto toxicológico deste consumo excessivo é desconhecido, este trabalho teve por objetivo fazer uma avaliação da neurotoxicidade induzida por bebida energética, e seus principais componentes, cafeína e taurina em ratos Wistar machos. Os animais (n= 5/grupo) foram tratados em dose única para avaliação da toxicidade aguda (OECD 420) em dois experimentos. Experimento 1: os animais foram tratados por via oral com soluções contendo: água, bebida energética nas doses de 5 mL/kg (ED 5), 7,5 mL/kg (ED 7,5) e 10 mL/kg (ED 10), cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e associação de cafeína 3,2 mg/kg e taurina 40 mg/kg. Foram observados comportamentos indicativos de atividade depressora ou estimulante do SNC e manifestações autonômicas. Durante 14 dias a variação de massa corporal e letalidade foram observadas. Ao fim deste período todos os animais foram anestesiados, eutanasiados e necropsiados, sendo determinada a massa relativa dos órgãos. Os resultados revelaram sinais de toxicidade pelo aumento da ambulação, taquipnéia e alguns comportamentos associados à ansiedade, principalmente nas doses intermediárias do energético (ED 7,5). Experimento 2: Os ratos foram tratados por via oral com soluções contendo: água, energético (ED 10), álcool 20% (2 g/kg e álcool 20% (2 g/kg) associado à energético (ED 10), cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e associação de cafeína 3,2 mg/kg mais taurina 40 mg/kg. A avaliação da toxicidade aguda foi realizada conforme descrito anteriormente. Entretanto, neste protocolo os animais foram anestesiados, eutanasiados, necropsiados 24h após os tratamentos. A massa relativa dos órgãos foi determinada. Os resultados mostraram que quando o álcool foi associado ao energético ou a taurina e cafeína, os sinais de toxicidade observados foram mais intensos. Dando continuidade à avaliação da neurotoxicidade, procedeu-se a avaliação da toxicidade subcrônica dos energéticos e dos padrões(cafeína e taurina) (OECD 407). Os animais (n= 10/grupo) foram tratados por via oral durante 28 dias com ED 5, ED 7,5, ED 10, cafeína 3,2 mg/kg, taurina 40 mg/kg e a associação de cafeína 3,2 mg/kg + taurina 40 mg/kg. Demonstrou-se que nos testes de memória (OX Maze e reconhecimentos de objetos) os grupos tratados com cafeína e taurina isoladamente ou em associação tiveram um melhor desempenho nos parâmetros avaliados. Estes resultados são independentes de alterações na atividade locomotora, avaliada através do teste de Rota Rod e atividade locomotora espontânea. No 290 dia após o início dos tratamentos os animais foram eutanasiados e medidos os biomarcadores do estresse oxidativo (atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e a produção de espécies reativas através da medida de diclorofluoresceína (DCFH) e conteúdo de tióis) nas estruturas córtex pré-frontal, hipocampo e estriado. Os resultados obtidos com a associação de cafeína e taurina foram os mais relevantes demonstrando que houve diminuição da atividade de enzimas antioxidantes com consequências. Em todos os testes foi evidente que a associação de cafeína e taurina, mesmo nas concentrações presentes na maior dose de energético, diferiu dos efeitos da administração apenas do energético. Considerando que os efeitos dos energéticos são normalmente associados à presença de cafeína e taurina, sugere-se que os resultados podem estar relacionados com a presença de outros componentes nos energéticos, que interferem na modulação dos efeitos causados apenas pela associação de cafeína e taurina. / Consumption of energy drinks is growing every year and reaches a growing number of teenagers and young adults, however, the impact of these drinks in the development and health does not have concrete results. Due to the increase in the consumption of energy drinks, mainly associated with alcohol, and considering that the toxicological impact of this excessive consumption is unknown, to aim of this study was to evaluate the neurotoxicity induced by energy drink, and its main components, caffeine and taurine in male Wistar rats. The animals (n= 5/group) were treated in a single dose for evaluation of acute toxicity (OECD 420) in two experiments. Experiment 1: The animals were treated by oral route with water (control), energy drink in doses of 5 mL/kg (ED 5), 7.5 mL/kg (ED 7,5) and 10 mL/kg (ED 10), caffeine 3.2 mg/kg, taurine 40 mg/kg and the combination of 3.2 mg/kg caffeine and 40 mg/kg taurine. It were observed indicative behaviors of depressant or stimulant activity of the CNS and autonomic manifestations. During 14 days the body weight change and mortality were observed. At the end of this period all animals were anesthetized, euthanized and necropsied, and determined the relative organ weights. The results showed signs of toxicity by increased ambulation, tachypnea, and some behaviors associated with anxiety, especially in intermediate energy dose (ED 7.5). Experiment 2: The rats were orally treated with water (control), energy (ED 10), 20% alcohol (2 g/kg) and ethanol 20% (2 g/kg) associated with the energy drink (ED 10), caffeine 3.2 mg/kg, taurine 40 mg/kg and the combination of 3.2 mg/kg caffeine and 40 mg/kg taurine. The assessment of acute toxicity was performed as described above. However, in this protocol, the animals were anesthetized, euthanized, necropsied 24 after the treatments. The relative organ weights were determined. The results showed that when ethanol was associated to the energy drink or taurine and caffeine, the signs of toxicity were more intense. Continuing evaluation of neurotoxicity was carried out to evaluate subchronic toxicity of energy drink and components (caffeine and taurine) (OECD 407). The animals (n= 10/group) were treated orally for 28 days with ED 5, ED 7,5, ED 10, caffeine 3,2 mg/kg , taurine 40 mg/kg, and the combination of caffeine 3,2 mg/kg + taurine 40 mg/kg. It has been shown that in the memory tests (OX Maze and recognition of objects), the groups treated with caffeine and taurine alone or in combination had a best performance in the evaluated parameters. These results are independent of changes in locomotor activity as measured by Rota Rod test and spontaneous locomotor activity. In 29th day after the start of treatment, the animals were euthanized and oxidative stress biomarkers such as the activity of antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), the total thiol content and the production of reactive species were measured in the prefrontal cortex, hippocampus and striatum. The results obtained with the combination of caffeine and taurine were the most relevant, demonstrating that there was decreased activity of antioxidant enzymes. In all tests it was evident that caffeine and taurine mixture, even at the same concentration present in the largest amount of energy drink, differed from the effects of the administration of energy drink only. Whereas the effects of energy are usually associated with the presence of caffeine and taurine, it is suggested that these results may be related to the presence of other components in energy drink, which interfere with the modulation of the effects caused by the combination of caffeine and taurine only.

Tese de mestrado integrado. Engenharia Metalúrgica e de Materiais. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-26Bitstream added on 2014-08-13T18:01:15Z : No. of bitstreams: 1 000733095_20141006.pdf: 458818 bytes, checksum: 5c6dc7bade9ad320ceb2ea1f2092fd78 (MD5) / As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do axônio, área ... / As lesões de nervos periféricos representam um grande desafio para a medicina. Inúmeras técnicas visam solucionar a regeneração do nervo periférico. Os protocolos de recuperação funcional destes nervos são diversos e os resultados nem sempre apresentam soluções que promovam a regeneração da via motora e sesitiva. Com o advento da engenharia tecidual, a partir da diferenciação de células-tronco, surgiu uma nova alternativa terapêutica para a regeneração de nervos. O objetivo deste trabalho é estudar a regeneração de nervo mediante tubulização por enxerto de veia autóloga e verificar se o uso da combinação de células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) e plasma rico em plaquetas (PRP) na tubulização do nervo fibular comum altera a morfologia e fisiologia deste nervo e de músculos inervados por ele. Os animais foram divididos em seis grupos, sendo três controles e três experimentais. O G1 (n=10) representou o controle inicial. Os grupos G2, G3 e G4 (n=20) representaram os Grupos Experimentais e receberam, após ressecção do segmento nervoso, enxerto de veia jugular externa de 20 mm tubulizando os dois cotos do nervo, sendo que G2 não recebeu preenchimento, G3 foi preenchido com PRP, G4 foi preenchido com PRP e células tronco, G5 (n=10) representou o controle final e o G6 (n=20) representou o controle de desnervação. Foram obtidas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (CTM-TA) do mesmo animal, com caracterização fenotípica, utilizando CD90 e CD44 identificando a expressão média de 86,5%. As CTM-TA foram expandidas em cultura e aplicadas na concentração de 5x106 por animal. O índice funcional foi avaliado pela marcha, testes eletrofisiológicos de latência e amplitude e ainda foi realizada a análise morfométrica das fibras nervosas, observando o diâmetro mínimo da fibra, diâmetro mínimo do axônio, área das fibras, área do ...

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-01-25Bitstream added on 2014-08-13T18:00:47Z : No. of bitstreams: 1 000753547.pdf: 1042146 bytes, checksum: 0db9bf11a46d9526baff398477f7f28a (MD5) / Introdução: Apesar das rigorosas campanhas contra o fumo em muitos países, estimase que 1,25 bilhões de adultos sejam tabagistas e a projeção é de uma nova epidemia que pode levar a 1 bilhão de mortes tabaco-relacionadas durante o século 21. Os danos causados pelo tabagismo afetam principalmente o sistema respiratório, entretanto, também é considerado um importante fator de risco para doenças cardiovasculares. Sabe-se que a intensidade do fumo e sua cronicidade contribuem para um agravamento dos prejuízos causados pelo tabagismo, e que a cessação do tabagismo torna-se um marco crucial para evitar tais progressões assim como para reduzir a morbimortalidade por doenças tabaco-relacionadas. Objetivos: Esta dissertação teve como objetivos: avaliar o efeito da exposição aguda ao fumo na modulação autonômica de tabagistas adultos e investigar a influência da condição tabagística e da idade nesta resposta, além de avaliar o efeito da cessação tabagística no transporte mucociliar e na frequência de exacerbações em tabagistas com doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)... / Introduction: Despite stricter antismoking campaigns in several countries, is estimated to 1.25 billion adults are smokers and the projection is a new epidemic that may lead to 1 billion tobacco-related deaths during the 21st century. Damages caused by smoking mainly affect the respiratory system, however, it is also considered an important risk factor for cardiovascular disease. It is known that the smoking intensity and its chronicity contribute to a worsening of impairment caused by smoking, and that smoking cessation becomes a crucial milestone to avoid these progressions as well as to reduce morbimortality due to tobacco-related diseases. Aims: This Master’s thesis aimed to evaluate the acute smoke exposure effect in the autonomic modulation of adult smokers and to investigate if the smoking status and age influence in this response, and to evaluate the smoking cessation effect on mucociliary clearance and in exacerbation frequency of smokers with chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Methods: For the first aim, we evaluated heart rate variability (HRV) of adults smokers, participants of the smoking cessation program at FCT/UNESP, in smoke and recovery from this exposure moments (30 minutes after smoking)...

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000443581-Texto+Parcial-0.pdf: 2098354 bytes, checksum: 0b5ec85f1b50d0c42f83f9793d9e1af5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Lateral amyotrophic sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterized by the selective loss of both lower and upper motoneurons in the spinal cord, brain stem and motor cortex. Loss of motoneurons leads to progressive paralysis, and death in 2 to 5 years. Treatment is based on symptomatic measures and pharmacological therapy available is not curative. Thus, it is of great importance to develop new therapeutic strategies to manage this disease. Alternatively, stem cells to replace could be used to replace degenerating neurons or to stop/delay neuronal death. The aim of this study was to verify if bone marrow mononuclear cells (BMMC) have therapeutic potential in transgenic mice superexpressing SOD1G93A. These animals’ phenotypic and physiopathological characteristics mimic those of ALS. Seventy-day-old or 110-day-old mice were administered with 107 BMMC in the tail vein. BMMC were obtained from C57BL/6-EGFP or SOD1G93A donors. Control animals received saline. In order to determine disease onset and progression, animals were evaluated in the Rotarod test, by electromyography and had their body weight measured. Survival was also evaluated. Tissue samples were collected for PCR analysis of cell migration. Additional groups of animals were euthanized at 120-days-old for histological analysis and the alkaline comet assay. Our results indicate that EGFPBMMC transplantation in 70-day-old mice (pre-symptomatic) mice prolong survival, preserve motor function and preserve motoneurons in the ventral horn of the spinal cord. However, for mSOD1BMMC the observed effect is intermediary. Furthermore, in 110-day-old (symptomatic) mice, only EGFPBMMC prolonged survival. This effect was more discrete than the one observed for pre-symptomatic-treated animals. Finally, systemically administered BMMC migrate into the spinal cord where fragments of their DNA were identified by PCR. There were no differences between the experimental groups in the electromyographical evaluation or DNA integrity measured by the alkaline comet assay. Our results suggest that BMMC have therapeutic potential in ALS since we observed improved motor performance and prolonged survival in animals that received the transplant. Nonetheless, outcomes were better when intervention was early and the transplanted cells did not express the mutated SOD1. Thus, our data represent a step forward in making cell-based therapy available for ALS patients. However, questions associated to the time of intervention and the source of the cells should be carefully addressed. / A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma perda seletiva de neurônios motores na medula espinhal, tronco encefálico e córtex motor. A perda de motoneurônios dá início a uma paralisia progressiva, levando o paciente a óbito em 2 a 5 anos. O tratamento se baseia principalmente em medidas sintomáticas e a terapia farmacológica existente não é curativa. Assim, é de máxima importância o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Como alternativa, existe a perspectiva do uso de células-tronco para substituir neurônios em degeneração, ou impedir/retardar o processo de morte neuronal. O objetivo deste estudo foi verificar se as células mononucleares da medula óssea (CMMO) apresentam potencial terapêutico em camundongos transgênicos que superexpressam SOD1G93A. Estes animais apresentam características fisiopatológicas e fenotípicas que se assemelham à ELA. Aos 70 dias (pré-sintomático) ou 110 dias (sintomático) de vida os animais receberam 107 CMMO pela veia da cauda. Camundongos C57BL/6-EGFP ou SOD1G93A foram utilizados como doadores. Animais controle receberam solução salina. Para determinar a idade em que os animais passam a apresentar sintomas da doença e diferenças na progressão, foram utilizados o teste motor do Rotarod, eletroneuromiografia e o peso corporal dos animais. A sobrevida dos animais também foi analisada. Após a eutanásia foram coletadas amostras para avaliação da migração celular por PCR. Grupos adicionais de animais foram tratados conforme previamente descrito e eutanasiados aos 120 dias de vida para avaliação histológica e ensaio do cometa alcalino. Nossos resultados indicam que o transplante intravenoso de EGFPCMMO aumenta a sobrevida de animais tratados aos 70 ou aos 110 dias de vida. Quando a intervenção é feita no período pré-sintomático, o aumento da sobrevida é acompanhado de preservação da função motora e de motoneurônios do corno ventral da medula espinhal. Entretanto, quando as células transplantadas são mSOD1CMMO, o efeito observado nos mesmos parâmetros é apenas intermediário. Além disso, quando o transplante ocorre no período sintomático, somente as EGFPCMMO promovem aumento na sobrevida, embora discreto. A perda de função motora e a progressão não se modificam. Finalmente, embora as células tenham sido administradas sistemicamente, migram para a medula espinhal, onde foram identificados fragmentos de seu DNA.Não foram identificadas diferenças entre os grupos na avaliação por eletroneuromiografia, nem da integridade de do DNA avaliada pelo ensaio do cometa alcalino. Nossos resultados até o momento sugerem que a fração mononuclear da medula óssea tem potencial terapêutico no tratamento da ELA, uma vez que verificamos melhora de desempenho motor e aumento de sobrevida em animais submetidos ao transplante. Apesar disso, os desfechos são mais favoráveis quando o tratamento é precoce e as células não expressam a mutação da SOD1 desencadeadora da ELA. Assim, nossos dados representam avanço na disponibilização do tratamento com células-tronco para pacientes com ELA, mas questões relacionadas ao período de intervenção e fonte das células devem ser cuidadosamente avaliadas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439149-Texto+Completo-0.pdf: 1490829 bytes, checksum: bd616615ee5265db0a960d6f77c8581d (MD5) Previous issue date: 2012 / Glioblastoma multiforme (GMB) is the most malignant and common type of all astrocytic tumours. Current standard treatment for GBM patients involves maximum surgical resection of the tumour, followed by radiotherapy and chemotherapy, usually containing the alkylating agent Temozolomide (TMZ). Despite this aggressive combination therapy, the survival rate of GBM patients is still low. This work consisted in investigating the cytotoxic effects of Akt-inhibition by MK-2206 with irradiation (RT) and TMZ on in vitro human malignant glioma. Seven malignant glioma cell lines were cultured and tested for clonogenic survival, invasion inhibition, tumour spheroid growth and proliferation. The Akt-inhibitor MK-2206 and TMZ were added at different time treatments and in varying doses. Cultures were irradiated with single dose and with fractionated γ-irradiation. Cellular modulation of Akt and p-Akt were assessed by Western blot analysis. MK-2206 reduced the levels of phospho- Akt key protein in the PI3Kinase-Akt pathway, decreased cell survival, and inhibited invasion, proliferation and cell growth. The combination of MK-2206 and RT lead to enhanced inhibition of cell proliferation and invasion, which is not observed with RT alone. The radioenhancing effect of MK-2206 was most striking in inhibition of spheroid volume growth by fractionated RT; the radiosensitizing effect of MK-2206 was stronger than that of TMZ. MK-2206 enhanced the in vitro effects of RT and TMZ in terms of decreased cell survival, invasion, proliferation and growth in malignant glioma. Effects could be ascribed to inhibition of PI3K-Akt pathway. / O Glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais maligno e mais comum de todos tumores astrocíticos. O tratamento atual para pacientes de GBM envolve máxima remoção cirúrgica, seguida de radio e quimioterapia, normalmente com o agente alquilante Temozolamida (TMZ). Apesar da agressividade da terapia combinada, o tempo de sobrevivência dos pacientes ainda é baixo. Este trabalho procurou investigar os efeitos citotóxicos do inibidor de Akt MK-2206 em combinação com irradiação (RT) e TMZ em um painel de células de gliomas humanos. Sete linhagens de glioma foram cultivadas e testadas em ensaio de sobrevivência clonogênica, inibição de invasão, e modelos de proliferação e crescimento de volume em esferóides. O inibidor MK-2206 e TMZ foram adicionados em diferentes tempos de tratamento e diferentes doses. As culturas foram irradiadas com doses únicas ou em terapias fracionadas com irradiação γ. A modulação celular de Akt e fosfo-Akt foi checada via Western Blot. O composto MK-2206 reduziu a fosforilação da proteína chave Akt na via PI3K, diminuindo a sobrevivência celular e inibindo invasão, proliferação e crescimento celular. A combinação de MK-2206 com RT levou a uma maior inibição de invasão e proliferação, o que não é observado somente com a RT. O efeito radiosensível de MK-2206 foi ainda maior na inibição do volume dos esferóides em terapia combinada com RT fracionada, sendo ainda maior do que o efeito combinado com TMZ. MK-2206 aumentou os efeitos in vitro de RT e TMZ em termos de redução de sobrevivência celular, invasão, proliferação e crescimento celular em gliomas malignos. Os efeitos podem ser atribuídos a inibição da via PI3KAkt.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000426061-Texto+Completo-0.pdf: 815660 bytes, checksum: a63907607c66f42025ef148afc7c6471 (MD5) Previous issue date: 2010 / The neurotrophic factor known as BDNF has attracted considerable attention in the scientific literature, due to its involvment in critical processes related to the development and regulation of the nervous system. However, many aspects of this molecule are still unknown, while others have only been investigated in humans and model organisms. In this context, bioinformatic tools can be very useful to perform comparative analyses focusing on evolutionary, structural and functional aspects of this protein. This study aimed to characterize the patterns of conservation and variability in this molecule through the comparison of coding sequences in different mammalian lineages, as well as to investigate structural aspects by constructing a novel 3D model of a BDNF homodimer that is consistent with experimentally validated data. Our results revealed very interesting patterns of conservation and variability in different lineages, including strong evidence for the occurrence of negative natural selection (indicating constraints to evolutionary change implying functional relevance) in both the mature and the pro domains. In addition, we observed evidence of positive selection (induction of changes that are likely adaptive) in different lineages, in every case directly affecting the pro domain. These results indicate that the pro domain presents great functional relevance, and highlight the importance of focusing research efforts on this portion of BDNF. / O fator neurotrófico conhecido como BDNF tem atraído considerável atenção na literatura científica, pelo seu envolvimento em processos cruciais de desenvolvimento e regulação do sistema nervoso. Entretanto, muitos aspectos desta molécula são ainda desconhecidos, enquanto outros foram investigados apenas em humanos e organismos-modelo. Neste contexto, ferramentas de bioinformática podem ser muito úteis para realizar análises comparativas enfocando aspectos evolutivos, estruturais e funcionais. Este projeto objetivou uma caracterização de padrões de conservação e variação desta molécula através da comparação das seqüências codificantes deste gene em diferentes linhagens de mamíferos, assim como uma investigação de aspectos estruturais através da construção de um modelo 3D do BDNF consistente com dados experimentais. Os resultados revelam padrões bastante interessantes de conservação e variação de sequência em diferentes linhagens, incluindo fortes evidências da ocorrência de seleção natural negativa (indicando restrição à mudança devido à relevância funcional) tanto no domínio maduro como no domínio pro. Além disso, observou-se evidência de seleção positiva (indução de mudanças possivelmente adaptativas) em diferentes linhagens, em todos os casos afetando diretamente o domínio pro. Estes resultados indicam que o domínio pro apresenta grande relevância funcional, e salientam a importância de focar esforços de investigação experimental nesta porção do BDNF.