O conhecimento científico da doença meningocócica cresceu significativamente desde que a natureza epidêmica da enfermidade foi pioneiramente descrita por Vieusseux no começo do século dezenove. De fato, dois séculos depois, houve avanços revolucionários nas esferas de saúde pública, técnicas diagnósticas, antibioticoterapia, assim como nas terapias adjuvantes envolvendo modulação das cascatas de coagulação e inflamação. Além disso, terapia de suporte para manter a homeostase via monitorização do status hemodinâmico, empregos de vasopressores, transfusão de plasma e suporte respiratório. Contudo, as taxas de letalidade e morbidade desta infecção não se alteraram significativamente nas últimas três décadas. Anualmente, a Organização Mundial de Saúde estima que ocorram 1.2 milhões de novos casos da doença, resultando em 135.000 mortes. No Brasil, anualmente, há 3500 casos da doença com uma taxa de incidência igual a 2 casos por 100.000 habitantes e uma taxa de letalidade igual a 20%. No Instituto de Infectologia Emílio Ribas (IIER) há 100 casos por ano. Assim, nós observamos um amplo espectro clínico da infecção, incluindo manifestações dramáticas como purpura fulminans e complicações atípicas como peritonite. O propósito deste estudo foi avaliar as características clínicas e laboratoriais, assim como a severidade da doença nos pacientes hospitalizados no IIER entre 2003 e 2004. Assim, pacientes previamente hígidos com diagnóstico de infecção meningocócica foram incluídos neste estudo prospectivo. Durante o período de estudo um total de 91 (53 homens e 38 mulheres) pacientes foram identificados como casos confirmados de infecção meningocócica como previamente descrito em materiais e métodos. Culturas de sangue, líquor, ou biópsia de pele de 39 pacientes (43%) foram positivas para N. meningitidis. Todos pacientes tiveram o exame de contraimunoeletroforese ou teste de aglutinação do látex positivo. A idade mediana dos pacientes foi igual a 6 anos (variação, 2 a 16 anos). A letalidade foi igual a 14% (13/91) e seqüelas ou complicações clínicas ocorreram em 63% (49/78) dos sobreviventes. Todos pacientes morreram de choque séptico e o tempo mediano entre hospitalização e óbito foi igual a 24 horas (variação, 18-72 horas). Concluindo, os resultados deste estudo prospectivo criam um elo entre infecção meningocócica e uma constelação de fenômenos fisiopatológicos: hipocalemia, hipomagnesemia, hipocalcemia, hiponatremia, hipoglicemia, hiperglicemia, leucopenia, coagulopatia e plaquetopenia. Os níveis de IL-6 e IL-10 corresponderam bem com a classificação baseada em parâmetros clínicos. A letalidade foi igual a 14% (13/91) e seqüelas ou complicações clínicas ocorreram em 63% (49/78) dos sobreviventes. Uma complexa interação entre mediadores é responsável por determinar a severidade da infecção e tais observações podem ser utilizadas para identificar fatores associados com a gravidade na fase aguda da infecção meningococócica / Scientific knowledge of meningococcal infection has increased greatly since the epidemic nature of the illness was first described by Vieusseux at the dawn of the nineteenth century. In fact, two centuries later, revolutionary advances have been made in public health measures, diagnostic procedures, antimicrobial therapy, and adjunctive therapies involving modulation of the inflammatory and coagulation cascades. In addition, supportive care facilities can maintain homeostasis by monitoring hemodynamic status, administering vasoactive agents and/or plasma exchange, and providing respiratory support. However, the prognosis of and case fatality rate among patients affected by meningococcal disease have not changed significantly over the past 3 decades. The World Health Organization estimates that there are 1.2 million cases of meningococcal disease and 135,000 related deaths annually. In Brazil, 3500 cases are reported annually, with a median incidence of 2 cases per 100,000 population and a case-fatality rate of 20%. At the Emílio Ribas Institute of Infectology (ERII), the incidence of meningococcal disease is approximately 100 cases per year. Therefore, we have observed a broad range of clinical presentations of N. meningitidis infection, including dramatic manifestations as purpura fulminans and atypical complications such as peritonitis. The purpose of this study was to evaluate the clinical features, laboratory features, and the severity of meningococcal disease in patients admitted to the ERII between 2003 and 2004. Therefore, consecutive previously healthy patients with a diagnosis of meningococcal disease were included in a prospective cohort study. During the study period a total of 91 (53 males and 38 females) patients were identified as confirmed cases of meningococcal infection as previously described in material and methods. Cultures of blood, CSF, or skin biopsy specimens from 39 patients (43%) yielded N. meningitidis. All patients had positive counterimmunoelectrophoresis or latex agglutination test in blood or CSF. The median age of the patients was 6 years (range, 2 years to 16 years). The case fatality rate was 14% (13/91) and sequelae or clinical complications occurred in 63% (49/78) of the survivors. All patients died of irreversible septic shock and the median duration from the hospitalization until death was 24 hours (range, 18-72 hours). In conclusion, results from this prospective cohort study support a link between meningococcal infection and a constellation of pathophysiological phenomena: hypokalemia, hypomagnesemia, hypocalcemia, hyponatremia, hypoglycemia, hyperglycemia, leukopenia, coagulopathy, and thrombocytopenia. Both pro-inflammatory IL-6 and anti-inflammatory IL-10 corresponded well with a classification based on clinical parameters. The case fatality rate was 14% (13/91) and sequelae or clinical complications occurred in 63% (49/78) of the survivors. A complex interplay of mediators is responsible for determining severity of disease and these observations can be used to identify factors associated with severity in the acute phase of meningococcal infection

A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica resultante da inabilidade do sistema imune em controlar uma infecção, onde a taxa de sobrevida está associada ao recrutamento de neutrófilos para o local da infecção. Tem sido demonstrado que a expressão de receptores quimiotáticos pode ser alterada durante a sepse. Neutrófilos de animais naives respondem às quimiocinas CXC, mas são irresponsivos às quimiocinas CC. Entretanto, dados do nosso laboratório mostram que a expressão de CXCR2 é reduzida na sepse, prejudicando a migração de neutrófilos para o foco da infecção. Além disso, ocorre o aparecimento do receptor CCR2 nos neutrófilos, levando à infiltração dessas células no pulmão e outros órgãos. Nesse contexto, o nosso objetivo foi investigar a possível expressão do receptor CCR5 em neutrófilos e seu papel na evolução da sepse. Demostramos que animais sham-operados expressam baixos níveis de CCR5 e altos níveis de CXCR2. Entretanto, sob a condição de sepse experimental induzida por ligação e perfuração do ceco (CLP), neutrófilos circulantes e que migraram para a cavidade peritoneal expressam altos níveis de CCR5 em paralelo com a internalização de CXCR2. Além disso, animais deficientes para CCR5 (CCR5-/-), submetidos à CLP, apresentam diminuição na taxa de sobrevida, redução na migração de neutrófilos para o foco da infecção, aumento da disseminação bacteriana, aumento no infiltrado de neutrófilos no pulmão e aumento nos níveis de marcadores de lesão do coração e rim, quando comparados com animais selvagens (WT). Adicionalmente, a incubação de neutrófilos isolados da medula óssea com LPS aumentou a expressão de CCR5 e os tornou responsivos à MIP-1? (ligante de CCR5), induzindo quimiotaxia. Também demonstramos que o receptor CCR5 possui importante papel durante a adesão de neutrófilos ao endotélio vascular para posterior migração. Em conjunto, esses resultados indicam que durante a CLP, o aumento da expressão de CCR5 em neutrófilos tem um papel protetor, visto que animais CCR5-/- sépticos apresentam reduzida migração de neutrófilos para o foco infeccioso, inflamação sistêmica acentuada e baixa taxa de sobrevivência. / Sepsis is a systemic inflammatory response resulted from the inability of the innate immune system to control infections, being the survival rate associated to the recruitment of neutrophils to the infection site. It has been demonstrated that chemokine receptors expression profile can be altered under sepsis conditions. Neutrophils from naïve mice respond to CXC chemokines, but are usually unresponsive to CC chemokines. However, data from our laboratory show that CXCR2 expression is down regulated, impairing the neutrophil migration to infection focus. In addition, CCR2 appears on the surface of neutrophils, mediating the accumulation of these cells in the lung and other organs. In this context, we aimed to investigate the possible expression of CCR5 receptor on neutrophils and its role on sepsis evolution. We showed that neutrophils from sham mice express high levels of CXCR2 and low levels of CCR5. However, during experimental sepsis, induced by cecal ligation and puncture (CLP), in parallel with CXCR2 internalization, neutrophils from the circulation or from the peritoneal cavity express higher levels of CCR5. Interestingly, deficient mice for the CCR5 receptor (CCR5-/-), undergone to CLP show decreased survival rate, reduction in the neutrophil migration to the site of infection, increase in the numbers of bacteria, increase in the neutrophil infiltration in lung and heart and increase in the levels of markers of injuries in heart and kidney, when compared to wild type mice (WT).In addition, the incubation of bone marrow derivedneutrophils with LPS enhances the expression of CCR5 and renders them responsive to CCL4 (a ligant of CCR5)-induced chemotaxis. Moreover, we demonstrated that CCR5 receptor has an important role during neutrophil adhesion to the vascular endothelium before transmigration. Together, these results indicate that during CLP-induced sepsis, the increase of the expression of CCR5 on neutrophils plays a host protective role, since CCR5-/- mice under sepsis present reduced neutrophil migration to infection focus, high systemic inflammation and low survival rate.

Sepse bacteriana é a maior causa de morbimortalidade na faixa etária pediátrica e neonatal. A detecção precoce do quadro séptico é difícil, devido os sinais iniciais da doença serem inespecíficos. A possibilidade da existência de exame laboratorial capaz de identificar precocemente quadros sépticos melhoraria o prognóstico desses pacientes. Várias proteínas de fase aguda foram estudadas como marcadores de infecção sendo a proteína C reativa (PCR) a mais utilizada. A procalcitonina (PCT), um pró-hormônio, encontra-se elevado precocemente em quadros sépticos em crianças e adultos. Estudo prospectivo com 14 crianças submetidas à cirurgia cardíaca com circulação extra-corpórea (CEC), com dosagens seriadas de procalcitonina e proteína C reativa, serviram como modelo de resposta inflamatória sistêmica sem infecção com dosagens antes da CEC, após a CEC no primeiro, segundo e terceiro dia após cirurgia, enquanto 14 crianças com sepse/choque séptico dosagens seriadas de PCT e PCR foram obtidas sequencialmente antes do tratamento antibioticoterápico e a cada dia até o terceiro dia. Em crianças sépticas a PCT demonstrou ser superior a PCR como marcador de sepse assim como para diferenciar quadros inflamatórios sistêmicos. / Bacterial sepsis is a major cause of morbidity and mortality in neonates and children. Early detection of bacterial sepsis is difficult because the first signs of this disease may be minimal or nonspecific. The availability of a laboratory test to accurately and rapidly identify septic neonates and children would be of great value in improving the outcome of these patients. Several acute-phase proteins have been used for the diagnosis of bacterial sepsis and C reactive protein (CRP) is the usual marker. It has been reported that the concentration of procalcitonin (PCT), a pro-hormone, is markedly higher in children and adults with sepsis. In a prospective study, 14 children were enrolled after cardiac surgery with cardiopulmonary bypass (CPB), these group represent the non infected children with inflammatory response. Blood samples were obtained before CPB, after CPB, on the first, second and third day after surgery. Another group with 14 children with sepsis or septic shock were enrolled, and blood samples were obtained before antibiotic start, on the first, second and third days. In septic children PCT concentration is a better diagnostic marker of sepsis and to differentiate inflammatory response than CRP.

A sepse é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica decorrente de um processo infeccioso, a qual acarreta alta taxa de mortalidade. Relatos da literatura tem demonstrado que pacientes e animais de experimentação que sobrevivem à sepse desenvolvem quadro de imunossupressão tardia, o qual contribui com a maior sucetibilidade destes a infecções secundárias. Nosso grupo demonstrou que as células T reguladoras (Tregs) participam ativamente do desenvolvimento desta imunossupressão. O Fator de Necrose Tumoral (TNF) é uma citocina pleotrópica responsável por diversas funções durante a resposta inflamatória, apresentando dois receptores responsáveis pelas suas atividades: o TNFR1 e o TNFR2. Foi demonstrando que o TNF exerce um importante papel na atividade de Tregs, induzindo a proliferação, estabilização do fenótipo e aumentando sua atividade imunossupressora, sugerindo que tais atividades sejam atribuidas ao TNFR2. Desta forma, nosso objetivo foi avaliar a participação dos receptores de TNF no desenvolvimento da imunossupressão pós-sepse. Para isso animais WT, TNFR1-/- e TNFR1/2 -/- foram submetidos à sepse grave, induzida por CLP e tratados com um suporte básico (reposição hidríca e antibioticoterapia). Inicialmente avaliamos a participação dos receptores de TNF na fase aguda da sepse. Demonstramos que nesta fase os receptores de TNF, principalmente TNFR1, apresentam um papel prejudicial na migração de neutrófilos, no controle do processo infeccioso e nas lesões de orgãos decorrentes da sepse. Posteriormente, os animais sobreviventes foram infectados com um dose subletal de L. pneumophila i.n 15 dias após a CLP. Avaliamos a participação dos receptores TNF na sucetibilidade à infecção secundária induzida por L. pneumophila em animais sobreviventes à sepse. Observamos que animais TNFR1-/- sobreviventes à sepse são mais suscetíveis, ao passo que animais TNFR1/2-/- sobreviventes à sepse são resitentes à infecção secundária em relação aos animais WT sobreviventes à sepse. Avaliamos então, a expansão de Tregs no baço destes animais sobreviventes à sepse e, observamos que animais TNFR1-/- apresentam aumento da expansão de Tregs, ao passo que os animais TNFR1/2-/- não apresentaram expansão de Tregs comparados ao WT. Observamos também que as Tregs apresentam maior densidade de receptores de TNF do que as células T convencionais e, que durante a sepse ocorre aumento da densidade destes receptores nas Tregs. Sugerimos então que possivelmente o TNFR1 seja um regulador negativo, enquanto o TNFR2 possa assumir um papel na regulação positiva na expansão de Tregs após a sepse, durante o desenvolvimento da imunossupressão. / Sepsis is a systemic inflammatory response syndrome resulting from infectious process, resulting in high mortality rate. It has been shown that septic mice and patients that survived from sepsis develop a late immunosuppression, which contributes to greater susceptibility to these secondary infections. Our group has shown that regulatory T cells (Tregs) actively participate in the development of this immunosuppression. The Tumor Necrosis Factor (TNF) is pleiotropic cytokine responsible for several processes in the inflammatory response. Two receptors are responsible for the various activities of TNF: TNFR1 and TNFR2. It have shown that TNF plays an important role in the activity of Tregs, inducing proliferation, stabilization of phenotype and increasing their immunosuppressive activity. The authors also suggested that these activities are TNFR2-mediated. Thus, our objective was to evaluate the role of TNF receptors in the acute phase of sepsis and also in the development of immunosuppression post-sepsis. For that, TNFR1-/ -, TNFR1/2 -/ - and WT mice were underwent to severe sepsis induced by CLP and treatment with basic support (hydration and antibiotics). Initially we evaluated the participation of TNF receptors in the acute phase of sepsis. We suggest that at this stage the TNF receptor, TNFR1 mainly exert a deleterious role in the migration of neutrophils in control of the infectious process and the tissue damage resulting from sepsis. In addition, the survivors from the septic event were intranasaly infected with L. pneumophila in the 15th day after sepsis induction. We evaluated the participation of these receptors in susceptibility to secondary infection induced by L. pneumophila in survivors from sepsis. Comparing the animals that survived from sepsis, we observed that TNFR1/2-/- , like WT mice, are not susceptible to the secondary infection, while TNFR1-/- survivors are more susceptible to it. We also observed that TNFR1-/ - animals show increased expansion of Tregs in the spleen, different of TNFR1/2-/- mice, that did not show expansion of Tregs compared to WT. We also observed Tregs have a higher density of receptors for TNF than conventional T cells, whereas during sepsis occurs increased expression of this receptor in Tregs. Altogether, the results suggest that TNFR1 is a negative regulator, whereas TNFR2 may play a role in the upregulation during expansion of Tregs, in development of sepsis-induced imunossupression.

Objetivos: Avaliar a eficácia do uso do rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros bem como a resposta das citocinas hematopoéticas e do sistema hematológico. Material e Métodos: Foi realizado um estudo randomizado duplo-cego. Foram incluídos recém-nascidos prematuros com menos de 5 dias de vida com diagnóstico de sepse clínica. O grupo tratamento (GT) recebeu 10 J.tg/kg/d de rhG-CSF, por via intravenosa, uma vez ao dia, por 3 dias consecutivos, e o grupo placebo (GB) recebeu o mesmo volume de placebo, também por via intravenosa, por 3 dias consecutivos. Todos os recém-nascidos foram acompanhados até o óbito ou alta hospitalar. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, contagem de leucócitos (CL), contagem absoluta de neutrófilos (ANC), relação neutrófilos imaturos/neutrófilos totais (I/T), contagem de plaquetas (CP) e concentração de hemoglobina (Hb) foram estudadas inicialmente antes da administração da primeira dose, 24 horas, 72 horas e 1 O dias após a primeira dose do tratamento e do placebo. Foi feita aspiração da medula óssea 7 dias após a primeira dose. A relação NSP /NPP (NSP = estoque de reserva medular de neutrófilos; NPP = estoque proliferativo medular de neutrófilos) e NSP foram avaliados. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre e foi obtido consentimento escrito dos pais dos pacientes. Resultados: Quarenta e quatro recém-nascidos prematuros foram incluídos no estudo, 22 em cada grupo. Não houve diferenças entre ambos os grupos em relação a: idade gestacional média (GT: 29,4 ± 3, 1; GP: 30,7 ± 2,9 semanas); média do peso ao nascer (GT: 1376 ± 491 ; GP: 1404 ± 508 g); mediana do escore de Apgar no quinto minuto de vida; mediana do escore SNAP (escore fisiológico agudo neonatal) nas primeiras 24 horas de vida (GT: 8, variação: 3 - 28; GP: 9,5, variação: O - 23); média do tempo de hospitalização (GT: 40; GP: 35 dias); mediana dos níveis de TNF-u, IL-6, GM-CSF, IIT, CP e Hb em todos os momentos estudados. Apesar da taxa de mortalidade nos primeiros 7 dias de vida ter sido 13,6% menor no GT (mortalidade nos primeiros 7 dias de vida= GT: O; GP: 3) (mortalidade dos 8 aos 28 dias de vida GT: 5; GP: 3 ), não houve diferenças estatisticamente significativa. A incidência de infecção hospitalar durante todo o tempo de internação foi significativamente menor no GT do que no GP (GT: 2; GP: 9; p < 0,03). As medianas dos níveis de G-CSF, CL e ANC foram significativamente maiores no GT do que no GP com 24 horas (GCS = GT: 2568 pg/ml; GP: 56 pg/ml, p < 0,0001; CL = GT: 15200 mm3 ; GP: 8100 mm3 p < 0,005; ANC = GT: 9522 mm3 ; GP: 4526 mm3 p < 0,005) e 72 horas após o início do tratamento (G-CSF = GT: 129 pg/ml; GP: 37,5 pg/ml p < 0,007; CL = GT: 23100 mm3 ; GP: 9250 mm3 p < 0,00002; ANC = GT: 16843 mm3 ; GP: 4703 mm3 p < 0,00002). A média NSP e a relação NSP/NPP foi significativamente maior no GT do que no GP (NSP = GT: 58,4 ± 8%; GP: 47,8 ± 11,2% p < 0,003; NSPINPP = GT: 4,2 ± 2,5; GP: 2,6 ± 1,2 p < 0,05). Conclusões: A administração de rhG-CSF no tratamento da sepse neonatal precoce em recém-nascidos prematuros pode reduzir a mortalidade nos primeiros 7 dias de vida e principalmente, a incidência de infecção hospitalar. Provoca ainda um aumento na contagem de leucócitos e na contagem absoluta de neutrófilos 24 e 72 horas após o início do tratamento, e um aumento na NSP e na relação NSPINPP 7 dias após o início do tratamento. / Objectives: To evaluate the efficacy o f the use of rhG-CSF in the treatment of early neonatal sepsis in premature infants and to asses cytokine and hematologic values in septic premature newborn infants after treatment with rhG-CSF Methods: A double blind randomized study was performed. Premature newborn infants were included in the study if they had a clinicai diagnosis of sepsis in the first 5 days of life. Treatment group (TG) received 10 j..tg/kg/day ofthe rhG-CSF IV once a day for 3 consecutive days, and the placebo group (PG) received the same volume of placebo IV as the TG for 3 consecutive days. Ali the included newboms were followed up to death or hospital discharge. TNF-a, IL-6, GM-CSF, G-CSF, leucocyte count (LC), absolute neutrophil count (ANC), immature/total neutrophil ratio (I/T), platelet count (PC), and hemoglobin concentration (Hb) were studied just before administration o f the first dose, 24 hours, 72 hours and 1 O days after the first dose o f treatment. Bone marrow aspiration was performed 7 days after the first dose oftreatment. NSP (neutrophil storage pool) and NSPINPP (neutrophil proliferative pool) ratio were evaluated. The study was approved by the ethics committee of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre and informed consent o f the parents were obatined. Results: Forty-four premature newborn infants were included in the study, twenty two in each group. Mean gestational ages (TG: 29.4 ± 3.1; PG: 30.7 ± 2.9 weeks), mean birth weights (TG: 1376 ± 491; PG: 1404 ± 508 grams), median Apgar scores in the fifth minutes of life, median SNAP (score for neonatal acute physiology) scores in the first 24 hours oflife (TG: 8, range: 3-28; PG: 9.5, range: O- 23), and mean lenght of hospital stay (TG: 40; PG: 35) were similar in both groups. Median TNF-u, IL-6, GM-CSF, I!f ratio, PC and Hb in all studied moments were similar in both groups. Although the survival rate in the first 7 days o f li f e was 13.6% higher in the TG than in the PG, there was no significant statistical difference (mortality in the first 7 days oflife TG =O; PG: 3), (mortality from 8 to 28 days oflife TG: 5; PG: 3 ). The occurrence o f nosocomial infection during the whole hospital stay was significant lower in the TGthan in the PG (TG: 2; PG: 9, p < 0.03). Median G-CSF leveis, LC, and ANC were significantly higher in the TG than in PG at 24 hours (G-CSF = TG: 2568 pg/ml; PG: 56 pg/ml, p < 0.00001; LC = TG: 15200 mm3 ; PG:8100 mm3 , p < 0.005; ANC = TG: 9522; PG: 4526, p < O. 005) and 72 hours after onset o f treatment (G-CSF = TG: 129 pg/ml; PG: 37.5, p < 0.007; LC = TG: 23100 mm3 ; PG: 9250 mm3 , p < 0.00002; ANC = TG: 16843 mm3 ; PG: 4703 mm3 , p < 0.00002). Mean NSP and NSP/NPP ratio were significantly higher in TG than in PG (NSP = TG: 58.4% ± 8%; PG: 47.8 ± 11.2%, p < 0.003; NSP/NPP ratio = TG: 4.2 ± 2.5; PG: 2.6 ± 1.2, p < 0.05). Condusions: Administration of rhG-CSF to a septic premature newborn infants may decrease the mortality in the first 7 days of life, and mainly the incidence of nosocomial infection. Also rhG-CSF administration causes an increase o f LC and ANC 24 and 72 hours after onset o f treatment, and an increase in NSP and NSP /NPP ratio 7 days after treatment.

A piometra canina é uma infecção bacteriana que acomete o útero de cadelas sexualmente maduras e gera a síndrome clínica conhecida como sepse e síndrome da resposta inflamatória sistêmica. Quando não tratada adequadamente ocorre a progressão da doença para estágios mais graves como a sepse grave e o choque séptico. Embora as alterações ocasionadas pela infecção serem conhecidas, o correto estadiamento da gravidade do quadro ainda é um obstáculo. O processo de inflamação sistêmica é complexo, o fator de necrose tumoral (TNF-&#945; e a interleucina 1&#946; (IL-1&#946) aparecem como mediadores inflamatórios centrais nos casos de sepse. Estudos recentes do DNA de pacientes em choque séptico têm demonstrado a presença de mutações ou polimorfismos que exercem grande influência na produção do TNF-&#945; e da IL-1&#946. Com exceção da avaliação sérica de lactato, a proteína C reativa (CRP) é o biomarcador mais utilizado em testes clínicos para o diagnóstico e tratamento da sepse. Os objetivos principais do estudo foram avaliar a gravidade do caso; as alterações sistêmicas e metabólicas do paciente no período pré-operatório; as concentrações plasmáticas do TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6 e CRP no momento do diagnóstico; a presença de polimorfismos na região decodificadora do TNF-&#945; e da IL-1&#946. Foram incluídas 9 cadelas sem piometra e 85 com piometra, afecção diagnosticada a partir do histórico e dos sinais clínicos identificados por meio do exame físico e ultrassonografia abdominal; e foram estratificadas para a gravidade do caso em sepse, sepse grave ou choque séptico. As variáveis clinicas e laboratoriais foram coletadas no momento do diagnóstico e confrontadas estatisticamente pelo método de comparações múltiplas. Os resultados mostraram 23 (24,4%) animais em sepse, 60 (63,82%) em sepse grave e dois (2,12%) em choque séptico. As alterações mais significativas foram observadas nos animais com sepse grave e em choque séptico e pode-se destacar a variação no tempo de preenchimento capilar, na pressão arterial, na contagem leucocitária, na albuminemia, na fosfatase alcalina, na creatinina, no pH, na CRP e na IL-6. O exame do gene da IL-1&#946; demonstrou que os animais em sepse com o alelo GG apresentam níveis séricos de IL-1&#946; mais elevados. Foi possível concluir que a estratificação da gravidade do caso para os animais em sepse grave é muito branda e não distingue os animais em estado mais grave dos menos grave dentro do mesmo grupo; que o estadiamento da gravidade poder ser realizado com avaliações corriqueiras e empregadas de forma rotineira no atendimento dos pacientes; que a proteína C reativa e a IL-6 apresentam correlação direta com a gravidade do caso; e que o polimorfismo do gene da IL-1&#946; e o tempo decorrido entre o inicio dos sintomas até que os proprietários procurassem ajuda médica foram os de maior influência sobre a gravidade do caso / Canine pyometra is a bacterial infection that affects the uterus of sexually mature bitches and generates the clinical syndrome known as sepsis and systemic inflammatory response syndrome. When not treated properly the disease progression to more severe stages as severe sepsis and septic shock occurs. Although the changes caused by the infection are known, the correct staging of the severity of the condition is still an obstacle. The process of systemic inflammation is complex, tumor necrosis factor (TNF-&#945;) and interleukin 1&#946; (IL-1&#946;) appear as central inflammatory markers in sepsis. Recent studies of DNA from patients in septic shock have shown the presence of mutations or polymorphisms that exert great influence on the production of TNF-&#945; and IL-1&#946;. Except the assessment of serum lactate, C-reactive protein (CRP) is the most widely used biomarker in clinical trials for the diagnosis and treatment of sepsis. The main objectives of the study were to evaluate the severity of the case, systemics and metabolics changes in the patient preoperatively, plasma concentrations of TNF-&#945;, IL-1&#946;, IL-6 and CRP at the time of diagnosis; the presence of polymorphisms in the decoding region of the TNF-&#945; and IL-1&#946;. In the study was included 9 bitches without pyometra and 85 bitches with pyometra, disease was diagnosed from the history and clinical signs identified through physical examination and abdominal ultrasonography; and were stratified according to the severity of the case in sepsis, severe sepsis or septic shock. The clinical and laboratory variables were collected at diagnosis and compared statistically by the method of multiple comparisons. The results showed 23 (24.4%) animals with sepsis, 60 (63.82%) in two and severe sepsis (2.12%) in septic shock. The most significant changes were observed in animals with severe sepsis and septic shock and can highlight the variation in capillary refill time, blood pressure, leukocyte count, the albumin, alkaline phosphatase, creatinine, pH, CRP and IL-6. Examination of the IL-1&#946; gene showed that animals with sepsis with GG allele have higher levels of seric IL-1&#946;. It was concluded that the stratification of the severity of the case for animals in severe sepsis is very bland and does not distinguish the animals in a more severe state of less severe within the same group; the staging of gravity can be done with ordinary ratings and employed routinely in patient care; the C reactive protein and IL-6 show a direct correlation with the severity of the case; and the polymorphism of the IL-1&#946; and the time elapsed between the onset of symptoms until the owners sought medical help were the most influence on the severity of the case

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000426212-Texto+Completo-0.pdf: 638472 bytes, checksum: ea98899a1819c8c97f6081d821d52bc4 (MD5) Previous issue date: 2010 / Sepsis is a syndrome caused by uncontrolled systemic inflammatory response of the individual, which represents a serious epidemiological problem worldwide. Since inflammatory cytokines represent a central part in the septic shock pathogenesis. The aim of this study was to investigate the effect of two drugs, Nacetylcysteine (NAC), a thiol-compound precursor of glutathione and fructose-1,6- bisphosphate (FBP), a high energy glycolytic metabolite, in the treatment of experimental sepsis. by evaluating the immunomodulatory effect (in vitro) and therapeutic (in vivo), in order to obtain alternative drugs for the treatment of septic shock. The experimental model chosen for the in vitro study was to culture of peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy humans through gradient centrifugation. T-Lymphocytes were stimulated for 96 h with phytohemagglutinin, being isoled from NAC used in concentrations of 1,5,10,15 mM or associated with 1. 25 mM FBP were tested. The results suggest that either NAC itself or association with FBP inhibits cellular proliferation, acting as potent immunomodulatory agents, suggesting their use in inflammatory diseases. For in vivo experiments, we used male Wistar rats that were divided into five experimental groups: (i) normal control (not induced), (ii) septic control (induced using a capsule with non sterile fecal content and E. coli (1,5 x 109 CFU), (iii) induced and treated with FBP (500 mg/kg IP), (iv) induced and treated with NAC (150 mg/kg IP), (v) induced and treated with the combination of FBP (500 mg/kg IP) with NAC (150 mg/kg IP).In attempting to explain the possible mechanism of action, mainly the results of the septic group and treated with NAC, complete blood analysis, biochemical measurements were performed, besides the verification of tissue oxidative stress. Were also performed blood cultures and in the different groups in order to check whether there was induction septic. Our results show that NAC prevented the mortality of animals after septic induction. These data confirm the validity of the use of NAC in the treatment of sepsis, possibly due to its property to be a precursor to glutathione, by their hepatoprotective ability and possible renal protection. Our data also show that the synergistic action with FBP does not improve the picture, and this can be partly explained by heightened activation of the immune (defense) or a decrease of hepatic glutathione. / A sepse é uma síndrome complexa ocasionada pela resposta inflamatória sistêmica descontrolada do indivíduo, que representa um grave problema epidemiológico em todo mundo. Sendo que, as citocinas inflamatórias representam o papel central na patogênese do choque séptico. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito de duas drogas, N-acetilcisteína (NAC), um tiol-composto precursor da glutationa e a Frutose-1,6-bisfosfato (FBP), um metabólito glicolítico de alta energia, no tratamento da sepse experimental, através da avaliação do efeito imunomodulador (in vitro) e efeito terapêutico (in vivo), com o intuito de se obter drogas alternativas para o tratamento do choque séptico. O modelo experimental escolhido para o estudo in vitro, foi à cultura de células mononucleares do sangue periférico isoladas de humanos saudáveis através de gradiente de centrifugação, Os linfócitos T foram estimulados durante 96 h com fitohemaglutinina, sendo utilizadas concentrações isoladas de NAC nas concentrações de 1, 5, 10 e 15 mM e associadas à FBP na concentração de 1,25 mM. Os resultados sugerem que tanto a NAC como sua associação com a FBP inibem a proliferação celular, agindo como potentes agentes na imunomodulação, sugerindo o uso destas contra doenças inflamatórias. Para a experimentação in vivo, utilizaram-se ratos Wistar machos, divididos em cinco grupos experimentais: (i) controle normal (não induzidos); (ii) controle séptico (induzidos com uma cápsula com conteúdo fecal não estéril e E. coli (1,5 x 109 C. F. U. ); (iii) induzidos e tratados com FBP (500 mg/kg I. P. ); (iv) induzidos e tratados com NAC (150 mg/kg I. P. ); (v) induzidos e tratados com a associação da FBP (500 mg/kg I. P. ) com NAC (150 mg/kg I. P. ).Na tentativa de se explicar o mecanismo de ação, principalmente o resultados do grupo séptico e tratado com NAC, foram realizadas análises hematológicas, dosagens bioquímicas, além da verificação do estresse oxidativo tecidual. Também foram realizadas hemoculturas, a fim de se verificar se houve indução séptica. Nossos resultados sugerem que a NAC impediu a mortalidade dos animais após a indução séptica. Estes dados comprovam a validade do uso da NAC no tratamento da sepse, possivelmente pela sua propriedade de ser um precursor da glutationa, pela sua capacidade hepatoprotetora e possível proteção renal. Nossos dados também demonstram que a ação sinérgica com FBP não melhora o quadro, esta em parte explicada pelo aumento do TBARS renal e pela diminuição da glutationa hepática.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430781-Texto+Completo-0.pdf: 5344417 bytes, checksum: ac9d8005af7e08aa4f34ebcea8bacac1 (MD5) Previous issue date: 2010 / The aim of this research was to determine the role in the modulation of inflammation of Fructose-1,6-bisphosphate, in experimental C. albicans-induced sepsis, and in COX-2, IL-6 and NF-Kappa B gene expression, NOx production and expression of iNOS in macrophages. Intratracheal sepsis model was performed in CF-1 mice, using fluconazole-resistant and -susceptible strains of C. albicans. FBP (500mg/Kg) was administered to mice at the time of operation in Sepsis + FBP Group. Five to six animals from each group were killed 24h, 5 days, and 10 days after the sepsis induction. Blood was taken for assessment of complete hematological profile and cytokine assay (IL-6 and MCP-1). The rest of the mice were observed for mortality. In order to determine the possible anti-inflammatory mechanism of FBP, a series of transfections in RAW macrophages using COX-2, IL-6 and NF-Kappa B promoters has been conducted. The NO production by macrophages and iNOS expression in RAW has been determined. We also investigate the regions of COX-2 promoter gene that mediate the inductive effects of zymosan. Transient transfections with a series of COX-2 promoter–mutation constructs were performed to further elucidate the effects of zymosan on COX-2 transcription. Mortality decreased significantly in groups that received FBP in C. albicans susceptible to fluconazole group. All cytokine and hematological indexes of FBP group were similar to sepsis group, with exception of platelets count. FBP significantly prevented the decrease in platelets count. FBP does not seem to act in the transcription of COX-2, IL-6, and NF-Kappa B. FBP reduced amounts of NOx levels in BAL fluid through the inhibition of expression of iNOS. Exposure to zymosan (50 g/mL for 24 h) markedly enhanced the relative luciferase activity in RAW 264. 7 macrophages transfected with COX-2 luciferase promoter constructs. Deletion on the CCAAT-enhancer binding protein (C/EBP) and nuclear factor kappa B (NF-kappa B) binding site resulted in an important decrease in reporter gene activity and a deletion of NF-kappa B and C/EBP with mutation of the cyclic adenosine monophosphate response element (CRE) and/or activator protein-1(AP-1) totally abolished the COX-2 activity induced by zymosan. / O objetivo deste estudo foi determinar o papel da Frutose-1,6-bisfosfato na modulação do processo inflamatório na sepse induzida por C. albicans, na expressão de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B e na produção de NO e expressão de iNOS em macrófagos. Um modelo de sepse intratraqueal foi realizado em camundongos CF-1 utilizando cepas de C. albicans sensíveis e resistentes ao fluconazol. FBP(500mg/kg) foi administrada aos animais no momento no momento da indução no grupo Sepse+FBP. Cinco a seis animais de cada grupo foram mortos 24h, 5dias e 10 dias após a indução de sepse. O sangue foi coletado para a realização do perfil hematológico completo e para o ensaio das citocinas (IL-6 e MCP-1). O restante dos animais foram utilizados para dados de mortalidade. A fim de determinar o possível efeito anti-inflamatório da FBP, uma série de transfecções utilizando promotores dos genes COX-2, IL-6 e NF-Kappa B foram realizados em células RAW. A produção de NO em macrófagos e a expressão de iNOS em RAW também foi realizada. Investigamos ainda as regiões do promotor do gene da COX-2 que realizam a mediação dos efeitos do zymosan. Transfecções transientes com uma série de contruções com mutações na região promotora da COX-2 foram realizadas para elucidar os efeitos do zymosan na transcrição da COX-2. A mortalidade diminuiu significativamente nos animais que receberam FBP após indução no grupo C. albicans sensível ao fluconazol. As citocinas e os índices hematológicos foram similares ao grupo sepse, com exceção da contagem de plaquetas. A FBP previne significativamente o decréscimo do número de plaquetas. A FBP parece não atuar na transcrição de COX-2, IL-6 e NF-Kappa B. A FBP reduziu os níveis de NO no lavado bronco-alveolar através da inibição da expressão de iNOS.A exposição ao zymosan (50μg/ml por 24h) marcadamente aumenta a atividade relativa de luciferase em macrófagos RAW transfectados com o promotor da COX-2. Deleções nos sítios de ligação C/EBP e NF-Kappa B resultam em um importante decréscimo na atividade do gene repórter e uma deleção no sítio NF-Kappa B e C/EBP com mutações nos sítios CRE e/ou AP-1 anula a atividade da COX-2 induzida por zymosan.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000391320-Texto+Completo-0.pdf: 471273 bytes, checksum: c2ed17923e23797f5ce8bb0432ca133d (MD5) Previous issue date: 2007 / Objetivo: Investigar se há associação entre as variantes polimórficas 896A>G (Asp299Gly) e 1196C>T (Thr399Ile) do gene que codifica para o toll like receptor 4 (TLR4) e a suscetibilidade a sepse e às disfunções orgânicas em pacientes com condições críticas de saúde. Pacientes e Métodos: Foram selecionados para este estudo 107 pacientes com sepse secundária a infecção por bactérias Gramnegativas, internados na unidade de tratamento intensivo geral (UTI) do Hospital São Lucas da PUCRS, admitidos de março de 2002 a dezembro de 2005. O grupo controle foi constituído por 111 amostras de DNA de doadores voluntários oriundos da mesma população gaúcha. A disfunção orgânica dos pacientes sépticos foi avaliada durante a primeira semana após admissão na UTI, através do escore SOFA, e foram consideradas as ocorrências de choque séptico e óbito. Os genótipos das variantes polimórficas 896A>G e 1196C>T foram determinados por análise de fragmentos de restrição dos produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR). Após, foi analisada a freqüência da distribuição dos genótipos e dos alelos entre os grupos de pacientes e de indivíduos saudáveis. Resultados: A freqüência de heterozigotos 896AG foi significativamente mais elevada entre pacientes sépticos (26%; 28/107) do que entre indivíduos saudáveis (10%; 11/111) (P=0,002; OR=3,22, CI95%: 1,43-7,38), da mesma forma como foi mais elevada se comparados pacientes com choque séptico (24%; 18/74) e saudáveis (P=0,008; OR=2. 92, CI95%: 1,20-7,17). Correspondentemente, houve maior freqüência do alelo 896G entre pacientes sépticos (13%; 28/214) que controles (5%; 11/222) (P=0,003; OR=2,89, CI95%: 1,33- 6,36), e entre pacientes com choque séptico (14%; 18/148) que indivíduos saudáveis (P=0,011; OR=2,66, CI95%: 1,15-6,23). Pacientes 1196CT+1196TT apresentaram escores SOFA médios mais altos (8. 12±3. 89) que pacientes 1196CC (6. 82±3. 52) (Mann-Whitney test, P=0,007). Portadores do alelo 1196T apresentaram durante a primeira semana de internação na UTI significativamente mais casos de escores SOFA ³ 7 (69%; 49/71) que homozigotos 1196CC (49%; 304/626) (Chi-square test, P=0,043; OR=1. 62, CI95%:0. 99-2. 67). Nós observamos que a herança de qualquer tipo de alelo não interfere nas taxas de mortalidade dos pacientes. Conclusão: As variantes polimórficas -896A>G e 1196C>T do TLR4 podem estar associadas com a uma maior suscetibilidade ao desenvolvimento de disfunções orgânicas graves e sepse nos pacientes críticos.

É bem estabelecido que respostas imunes possam ser influenciadas pelo sistema nervoso. O neuropeptídeo, peptídeo liberador de gastrina (GRP) tem sido detectado na produção e liberação de citocinas, em modelo animal e em humanos com doenças inflamatórias e sabe-se que o antagonista do receptor de GRP, RC-3095 modula a resposta de citocinas pro-inflamatórias em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) molhando a sobrevivência em modelo animal de sepse induzida por ligação e perfuração cecal (CLP). Neste contexto, neste estudo avaliamos o efeito modulatório de GRP em modelos animais de doenças inflamatórias agudas: injúria pulmonar associada à pleurisia induzida por carragenina e sepse induzida por CLP e adicionalmente, em pacientes sépticos através da correlação dos seus níveis com o desfecho clínico. Para esta proposta, no Capítulo 1 avaliamos em pleurisia induzida por carragenina os seguintes parâmetros: migração celular, atividade da lactato desidrogenase, conteúdo de proteínas totais, concentração de nitrito/nitrato e níveis de TNF-α e IL- β no exsudato pleural e atividade da mieloperoxidade e marcadores de dano oxidativo em lipídios e proteínas no tecido pulmonar. Assim, o RC-3095 exibiu significante ação anti-inflamatória através da inibição do influxo de leucócitos e bloqueio da mieloperoxidade, conteúdo de nitrito/nitrato e níveis de citocinas. Além disso, os resultados mostraram que RC-3095 exerce ação contra o dano oxidativo em lipídios e proteínas, bem como o aumento na viabilidade celular. Isto sugere que RC- 3095 tem propriedades anti-inflamatórias que podem estar relacionadas com a redução do dano oxidativo. No Capítulo 2, entretanto, nós seguimos no modelo animal de sepse onde buscamos o entendimento do papel protetor que exerce o RC-3095. Vários estudos sugerem o envolvimento de TLR-4 como um importante elemento de defesa do hospedeiro durante a infecção, e importantes eviências indicam que esses receptores também possuem um papel na patofisiologia da sepse, onde camundongos deficientes de TLR-4 não apresentam falência na migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse polimicrobiana induzida por CLP letal, e como conseqüência, foram mais resistentes para sepse que controles. Nossos resultados indicam que este efeito protetor pode ser atribuído para uma atenuação de sinalização de TLR-4 em cultura de células RAW 264.7 estimuladas por LPS e tecido pulmonar em ratos CLP, levando a uma diminuição de citocinas proinflamatórias as quais a via de ativação de GRPR mostra seletividade como verificado no Capítulo 3, possibilitando a explicação dos baixos níveis de citocinas pro-inflamatórias em pacientes sépticos tratados com RC-3095. Esta atenuação favorece a infiltração de neutrófilos, resultando na diminuição de bacteremia preservando o controle da infecção no local melhorando o desfecho da sepse. Nossos resultados ainda mostram que níveis plasmáticos de GRP podem predizer o desfecho na sepse, mas não em pacientes SIRS sugerindo que GRP exerce funções diferenciais nas duas condições e sugere que o antagonismo de GRPR modula a inflamação incontrolada por agir em respostas mediadas por TLR-4 e funcionalidade imunoregulatória. Em conclusão, os presentes resultados indicam que o antagonista de GRPR exerce um papel na inflamação aguda e pode ser utilizado como uma nova terapia alternativa para sepse bacteriana Gram-negativa. / It is well established that immune responses may be influenced by the nervous system. The neuropeptide gastrin-releasing peptide (GRP) has been detected on the production and release of cytokines, both in animal models and humans with inflammatory diseases and reported that the GRP receptor antagonist RC-3095 modulates the response of proinflammatory cytokines in activated macrophages by lipopolysaccharide and improved the survival in an animal model of sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP). Within this context, in this work we evaluate the GRP modulatory effect in animal models of acute inflammatory illnesses: lung injury associated with carrageenan-induced pleurisy, and in CLP-induced sepsis and additionally in septic patients through the correlations of its levels with the clinical outcome. For this purpose, in Chapter 1 we evaluated in carrageenan-induced pleurisy the following parameters: cell migration, lactate dehydrogenase activity, total protein content, nitrite/nitrate concentration, TNF-α and interleukin-1β (IL-1β) levels in pleural exudates; myeloperoxidase activity and lipid and protein oxidative damage markers in lung tissue. Thus, RC-3095 exhibited pronounced anti-inflammatory actions by inhibition of leukocyte influx and blockade of myeloperoxidase, nitrite/nitrate content and cytokine levels. Moreover, the results showed that RC-3095 elicits action against oxidative damage in lipids and proteins, as well as increases cell viability. These suggest that RC-3095 has anti-inflammatory properties that can be related with the reduction of oxidative damage. In Chapter 2, however, we follow the animal model of sepsis where we search the agreement of the protective role that RC-3095 exerts. Increasing evidences suggest the evolvement of TLR-4 as an important element of host defense during an infection, a growing body of evidence indicates that these receptors also may play a role in the pathophysiology of sepsis where TLR-4 defective mice did not present failure of neutrophil migration to the peritoneal cavity during polymicrobial sepsis induced by lethal CLP, and as consequence, they were more resistant to sepsis than controls Our results further indicate that this protective effect can be attributed to an attenuation of TLR-4 signaling in RAW 264.7 cell culture stimulated by LPS and lung tissue in CLP rats, leading to a decrease of release of proinflammatory cytokines which the pathway of activation of GRPR shows selectivity as verified in Chapter 3, and can additionally explain the lower levels of the proinflammatory cytokine in RC-3095-treated septic patients. This attenuation favors neutrophil infiltration, resulting in decreased bacteremia preserving the control of infection in situ improving sepsis outcome. Our finding still show that plasma GRP levels could predict outcome in sepsis but not SIRS patients suggesting that GRP plays different roles in the two conditions and suggest that GRPR antagonism modulates uncontrolled inflammation by targeting TLR-4-mediated responses and immunoregulatory functionality. Taken together, the present results indicate that a GRPR antagonist plays a role in acute inflammation and could be developed as a new alternative therapy for Gram-negative bacterial sepsis.