Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-graduação em Farmácia, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T02:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 295819.pdf: 614658 bytes, checksum: fdb9e8caeb838ce57db3754485ca2b62 (MD5) / Atualmente ocorrem aproximadamente 22000 acidentes ofídicos por ano no Brasil, sendo no estado de Santa Catarina registrados pelo Centro de Informações Toxicológicas localizado no Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina, 618 ocorrências no ano de 2009. O gênero Bothrops é responsável por aproximadamente 90% destes acidentes. Nenhum caso de ofidismo por Bothrops tem registro na literatura relativamente ao estabelecimento do chamado estresse oxidativo, somente em outros ofídios peçonhentos não pertencentes ao gênero, onde ocorrem igualmente processos inflamatórios relacionados. O presente trabalho consiste na análise do estresse oxidativo e monitoramento do status antioxidante nos processos de dano presente no sangue de pacientes vítimas de picadas com espécies do gênero Bothrops. O monitoramento dos pacientes ocorreu a partir da entrada na emergência do Hospital Universitário até 30 dias após, sendo os grupos divididos em relação ao tempo de seguinte forma: tempo 0 (t0), tempo 24 horas (t24h), tempo 7 dias (t7d) e tempo 30 dias (t30d). Foram examinadas as atividades das enzimas catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR) e glutationa S-transferase (GST), e as defesas antioxidantes não-enzimáticas, como os conteúdos de glutationa reduzida (GSH) e vitamina E. Foram dosados também os marcadores de dano, como a lipoperoxidação (níveis de TBARS), proteína carbonilada (PC) e ainda a atividade da mieloperoxidase (MPO) como marcador inflamatório. Nas determinações iniciais em relação ao grupo controle (indivíduos saudáveis) observou-se aumento da atividade das enzimas CAT, GR e GPx e a diminuição de outras como SOD e GST, e também foi verificada a depleção da concentração de GSH, enquanto nos marcadores de dano houve aumento na concentração de TBARS e diminuição da proteína carbonilada em relação ao grupo controle. Em relação aos grupos em função do tempo, não houve diferença estatística nos distintos parâmetros examinados. O conjunto de respostas dos biomarcadores de estresse oxidativo permite afirmar que o acidente ofídico promoveu um acentuado estresse oxidativo sistêmico em suas vítimas.

A superfamília das fosfolipases A2 (FLA2) é composta por proteínas dotadas de propriedades diferenciadas que as tornam capazes de apresentar distintas atividades biológicas, além de sua atividade catalítica. Esta diversidade funcional é intrigante devido à alta similaridade de seqüência primária e de estrutura entre essas proteínas. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma metodologia para a predição de atividades biológicas específicas em FLA2 de peçonha de serpentes a partir da análise de seqüências primárias. A metodologia desenvolvida compreende: a) seleção de seqüências anotadas quanto à função ou atividade biológica que desempenham; b) detecção e validação estatística de motivos de seqüência relacionados à atividade estudada; e c) construção de Modelos Ocultos de Markov (MOMs) representando cada motivo. MOM consiste em uma modelagem estatística que tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas onde se faz necessária a detecção e representação de padrões de informação; por sua base matemática robusta e formal, pode ser utilizada na automação deste tipo de processo. A metodologia foi testada para duas atividades de FLA2 de peçonha de serpente: neurotoxicidade e miotoxicidade. Para as FLA2 neurotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais três foram validados estatisticamente como sendo adequados na discriminação de seqüências neurotóxicas de não neurotóxicas. Para as FLA2 miotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais quatro foram validados. Os MOMs dos motivos validados podem ser usados na predição de atividade neurotóxica e miotóxica. As relações entre seqüência, estrutura, função e evolução das FLA2s são discutidas. Os dados obtidos foram coerentes com a hipótese apresentada por Kini (2003), da existência de diferentes sítios farmacológicos na superfície das FLA2, interagindo independente ou cooperativamente com diferentes receptores, para gerar as diversas funções biológicas observadas. Por não haver, até o momento, qualquer ferramenta automatizada para a predição de função biológica de FLA2, os resultados deste trabalho foram a base para a construção de uma ferramenta (disponível em www.cbiot.ufrgs.br/bioinfo/phospholipase) para a identificação de miotoxicidade e neurotoxicidade em FLA2.

Fosfolipases A2 constituem uma família de enzimas interfaciais que catalisam a hidrólise de fosfolipídios de membrana na posição sn-2. Nas fosfolipases cataliticamente ativas (FLA2 D49), o resíduo Asp49 possui um importante papel na coordenação do íon cálcio divalente que auxilia na estabilização do intermediário tetraédrico. Nesse trabalho, foram realizadas simulações por dinâmica molecular (DM) de uma fosfolipase secretada de veneno de Agkistrodon halys pallas utilizando como solventes: água, metanol e octanol. Devido à baixa afinidade do íon cálcio em ambientes aquosos, diferentes forças de restrição foram aplicadas nesse íon e mediu-se o comportamento desse, através da variação da sua distância em relação ao resíduo Asp49. Todas as simulações foram realizadas por um período de tempo de 5 ns, somando um total de 45 ns de simulação, utilizando o pacote GROMACS implementado com o campo de força GROMOS96 43a2. Os resultados mostraram uma série de mudanças conformacionais importantes na fosfolipase durante a sua aproximação à superfície da membrana, como o aumento da área acessível ao solvente e a reorientação de cadeias laterais de resíduos com importância catalítica. Os dados obtidos com as simulações foram utilizados para propor um modelo interfacial de ativação para FLA2sv. Desta forma, os principais eventos associados com a ativação de FLA2sv envolvem: a) a reorganização da alça de coordenação de cálcio na proximidade da membrana, seguida pela captura do íon Ca2+; b) a reorientação da cadeia lateral de Trp31, que irá definir um novo sítio de especificidade para a cadeia fosfolipídica; c) a redução da distância entre os resíduos His48 e Asp49, para aumentar a nucleofilicidade da His48; d) a reorientação da cadeia lateral do resíduo Lys69 concomitante com a projeção da alça-69 para o solvente, resultando no aumento da acessibilidade ao sítio ativo. Assim, esses resultados, em adição ao conhecimento bioquímico e a dados cristalográficos, abrem acesso a uma compreensão mais detalhada dos mecanismos moleculares associados com a ação de fosfolipases A2. / Phospholipases A2 (PLA2) are interfacial active enzymes that catalyze hydrolysis at the sn-2 position of membrane phospholipids. In the catalytic active PLA2 (D49 PLA2), the Asp49 residue plays a key role in the coordination of the calcium ion that assists in the stabilization of the transition state intermediary. Despite the catalytic importance of Ca2+, it has low affinity for the sPLA2 active site. Molecular dynamics simulations of a D49 svPLA2 from Agkistrodon halys pallas were performed in aqueous environment, methanol and octanol. Because of the svPLA2 low affinity for the calcium ion in aqueous systems, different restrain forces were applied on Ca2 + and evaluated with respect to ion coordination with key residues. All simulations were performed for a time period of 5 ns using the GROMACS package with GROMOS96 43a2 force field. The results have showed a series of important conformation changes of sPLA2v during its approaches to membrane surface, as the increase of the solvent accessible surface area and the reorientation of side chains of residues of catalytic importance. Analyses of the simulations data were utilized to propose an interfacial activation model for svPLA2. According, the principal events associated with svPLA2 activation involve: a) the reorganization of calcium binding loop at membrane proximity followed by the Ca2+ up take; b) side chain reorientation of Trp31, which will define a new specificity pocket for the phospholipid chain; c) reduction of the distance between His48 and Asp49, in order to increase the nucleophilicity of His48; d) side chain reorientation of Lys69 concomitant with the projection of the 69-loop to solvent resulting in an increase of the active site accessibility. These results, in addition with biochemical and crystallographic data knowledge, open access to a more detailed understanding for the molecular mechanism associated with the interfacial activation of phospholipases A2.

REYES, M. A. V. Biomarcadores precoces da injúria renal no envenenamento experimental induzido pela serpente colombiana Bothrops ayerbei em ratos. 2017. 91 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Farmacologia Pós-Graduação (posgfarmacologia@gmail.com) on 2017-08-01T18:28:59Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_mavreyes.pdf: 1865163 bytes, checksum: 5c943af5338bde1e789bb5bde2374387 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-08-02T12:19:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_mavreyes.pdf: 1865163 bytes, checksum: 5c943af5338bde1e789bb5bde2374387 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-02T12:19:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_mavreyes.pdf: 1865163 bytes, checksum: 5c943af5338bde1e789bb5bde2374387 (MD5) Previous issue date: 2017-06-14 / The snake poisoning represents a public health problem, which is characterized by several systemic pathophysiologies, among which acute renal injury (AKI) is the most important. The pathogenesis of AKI induced by Botrópico poisoning is multifactorial and tends to be associated with direct nephrotoxicity, disseminated vascular coagulation and the activity of proteolytic enzymes that act on the structures of the kidney. In the state of Cauca in Colombia the snake Botrhops ayerbei was recognized as a new species through the morphological description and molecular characterization of its venom, considering the latter as a valuable signature for the identification of species and the properties of the venom. Therefore, the purpose of this work is to characterize the renal effects of venom of B. ayerbei (VBa), the present study evaluated biochemical parameters associated with renal function, oxidative profile and antioxidant activity, making a comparison with early biomarker of renal injury through gene transcription RT-PCR, and histopathological analysis. For this, 250-300g Wistar rats (150/14 protocol) were used, divided into three times 8, 16 and 24 hours each with two control (PBS) and treated groups (75% DVB of VBa). Thus, it was observed that poisoning by intraperitoneal inoculation of VBa promotes biochemical changes associated at the onset with direct injury of the venom on renal structures, causing an increase in plasma uric acid (8h: 1,220 ± 0,2061 μg / dL) and urinary (8h: 5,600 ± 0,230 μg / dL), followed by proteinuria (8h: 17,920 ± 0,807 μg / dL), decreased glomerular filtration rate (GFR) (8h: 0.9211 ± 0.2131 mL / min / 100g) , And increased clearance of free water (8h: -0.013 ± 0.003 mL / min), as well as increased urine osmolality (8h: 625.8 ± 33.27 Mmol / kg). An increase in urine urea concentrations (16h: 31,120 ± 1,866 μg / dL) and urinary creatinine (24h: 54,890 ± 3,360 μg / dL) was observed, with a decrease in the osmolality clearance (16h: 317.8 ± 26 , 05 Mmol / kg) and an increase in the Na + excretion fraction (16h: 4.552 ± 0.204%) and the RFG (24h: 0.7415 ± 0.0717 mL / min / 100g). (24h: 78.75 ± 3.059 μg / mg prot.) And renal cell damage was found by expression of renal biomarkers such as: renal injury-1 molecule (KIM-1) and neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). In addition, pro-inflammatory cytokines such as interleukin-18 (IL-18), interleukin-1 beta (IL-1β) and chemotactic peptide-1 for monocytes (MCP-1) were found to act as adjuvants in the injury process Thus, VBa does not alter plasma parameters associated with AKI, but causes hemorrhagic processes that affect the blood circulation with extravasation, which could cause hypovolemic and consequent decrease of RFG, followed by a regulation in the excretion of substances. Compared with the results of molecular biology, renal cell damage has been proven, and inflammatory processes that may promote renal damage have been developed. We conclude that the VBa venom promotes changes in kidney damage as demonstrated by molecular biology, and not by biochemical tests, demonstrating that the use of early biomarkers is necessary for the understanding of renal pathophysiology generated by snake poisoning. / O envenenamento ofídico representa um problema de saúde pública, que se caracteriza por causar várias fisiopatologias sistêmicas, dentre estas a lesão renal aguda (LRA) é a de maior importância. A patogênese da LRA induzida por o envenenamento Botrópicos é multifatorial e tende a ser associada à nefrotoxicidade direta, coagulação vascular disseminada e atividade de enzimas proteolíticas que atuam sobre as estruturas do rim. No estado do Cauca na Colômbia a serpente Botrhops ayerbei foi reconhecida como nova espécie através da descrição morfológica e à caracterização molecular de seu veneno, considerando esta última como uma valiosa assinatura para a identificação de espécies e as propriedades do veneno. Por conseguinte, o objeto deste trabalho é caracterizar os efeitos renais do veneno de B. ayerbei (VBa), e avaliar parâmetros bioquímicos associados à função renal, perfil oxidativo e atividade antioxidante fazendo uma comparação com biomarcador precoce de lesão renal de transcrição gênica através de RT-PCR, e o análise histopatológica. Para isto, foram utilizados ratos Wistar de 250-300g (protocolo 150/14), divididos em três tempos 8, 16 e 24 horas cada um com dois grupos de avaliação controle (PBS) e tratado (75% Dl50 do VBa). Assim, foi observado que o envenenamento por inoculação intraperitoneal do VBa, promove alterações bioquímicas associadas num começo a lesão direta do veneno sobre as estruturas renais, causando um aumento do ácido úrico plasmático (8h: 1,220 ± 0,2061 µg/dL) e urinário (8h: 5,600 ± 0,230 µg/dL), seguido por proteinúria (8h: 17,920 ± 0,807 µg/dL), diminuição do ritmo de filtração glomerular (RFG) (8h: 0,9211 ± 0,2131 mL/min/100g), e aumento do clearance de água livre (8h: -0,013 ± 0,003 mL/min), assim como também um aumento da osmolalidade urinária (8h: 625,8 ± 33,27 Mmol/Kg). Posteriormente foi encontrado um aumento nas concentrações de ureia na urina (16h: 31,120 ± 1,866 µg/dL) e creatinina urinária (24h: 54,890 ± 3,360 µg/dL), com uma diminuição do clearance de osmolalidade (16h: 317,8 ± 26,05 Mmol/Kg) e um aumento da fração de excreção de Na+ (16h: 4,552 ± 0,204 %) e o RFG (24h: 0,7415 ± 0,0717 mL/min/100g), A seguir o VBa apresentou alterações no perfil oxidativo no último tempo de avaliação com uma diminuição dos níveis de GSH (24h: 78,75 ± 3,059 µg/mg prot.) e verificou-se lesão nas células renais pela expressão de biomarcadores tais como: a molécula de injúria renal-1 (KIM-1) e a lipocalina associada à gelatinase neutrofílica (NGAL). Além disso, citocinas pró-inflamatórios como a interleucina-18 (IL-18), interleucina-1 beta (IL-1β) e o peptídeo-1 quimiotático para monócitos (MCP-1) foram encontradas aumentadas, atuando como coadjuvantes no processo de lesão renal, Desta forma, o VBa não altera parâmetros plasmáticos associados a LRA, mas causa processos hemorrágicos que repercute na circulação sanguínea com extravasamento o que possivelmente causaria hipovolemia e consequente diminuição do RFG, seguido por uma regulação na excreção de substâncias. Comparando com os resultados da biologia molecular comprovou-se dano nas células renais, e desenvolvimento de processos inflamatórios que podem promover lesão renal. Concluímos assim, que o veneno de VBa promove alterações renais comprovado por biologia molecular, e não por teste bioquímicos, demonstrando que o uso de biomarcadores precoce é necessário para o entendimento da fisiopatologia renal gerada por o envenenamento de serpentes.

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:02:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000008.pdf: 645663 bytes, checksum: 1fdb98e2621023f13d0c6a16004b1cbd (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde / A segurança e a eficácia da imunoterapia antienvenenamento ofídico estão intimamente relacionadas à pureza e a uma cuidadosa determinação da potência do soro (atividade biológica). A metodologia atualmente utilizada apresenta importantes limitações, as quais este trabalho objetiva contribuir. A mesma é adotada como oficial pela Farmacopéia Brasileira, tendo sido preconizada em 1996 pela Portaria nº 174/MS. Observações preliminares deste estudo identificaram, principalmente, um alto índice de invalidação de ensaios e uma baixa repetibilidade e reprodutibilidade, representado por diferenças significativas no ensaio de potência nos resultados obtidos pelo INCQS e pelos laboratórios produtores, enfatizando a necessidade de aperfeiçoar a metodologia analítica para a determinação da potência do soro antibotrópico. De acordo com as recomendações do “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, coordenado pela “Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit” da OMS em 2001, o estabelecimento de venenos e antivenenos de referência é essencial para a padronização destes ensaios e para permitir a comparação lote a lote, assim como a comparação entre laboratórios. Neste trabalho, apresentamos os resultados de um estudo interlaboratorial para o estabelecimento de veneno e antiveneno botrópico de referência, visando o aperfeiçoamento do controle da qualidade dos soros antibotrópicos, com ênfase na metodologia analítica para a determinação da potência, com a participação de todos os laboratórios brasileiros produtores de soro antibotrópico. Este estudo foi realizado em duas etapas. A primeira compreendeu a reavaliação da potência do lote nº 05 do Veneno Botrópico de Referência BRA/BOT/05, a avaliação da potência do candidato a Soro Antibotrópico de Referência Nacional BRA/ANTIBOT/01, e a avaliação da aplicabilidade de um controle da dose desafio de veneno referente a cinco vezes o valor de dose letal média (5 DL50). A segunda etapa compreenderá a comparação da metodologia de determinação da potência do Soro Antibotrópico pela determinação da Dose Efetiva Média – DE50 (Potência Absoluta) com a metodologia da Potência Relativa frente ao Soro Antibotrópico de Referência, através da determinação da potência de amostras codificadas. Esta monografia, entretanto irá tratar apenas do estabelecimento do veneno e antiveneno de referência. Os resultados obtidos permitiram a avaliação das precisões intraensaios, interensaios e interlaboratorial, a freqüência de ensaios inválidos assim como as diferentes interpretações dos laboratórios, INCQS e produtores nacionais à monografia do Soro Antibotrópico da Farmacopéia Brasileira. / Safety and efficacy of antivenom immunotherapy are closely related with purity and an accurate potency determination (biological activity) of the antivenom. The murine lethality assay, still in use, present several limitations and is not a fully validated methodology. Preliminary data shows a high incidence of invalid assays and a low repeatability and reproducibility of potency assays, evidenced by significant differences between INCQS and manufacturers, indicating the need for improvement of the analytical methodology. According to the recommendations of the “Workshop on the Standardization and Control of Antivenoms”, sponsored by the Quality Assurance and Safety of Biologicals Unit of WHO at 2001, the establishment of local venom reference preparations and standard antivenom preparations are essential to standardize these assays and to allow batch to batch comparisons as well as comparisons between different laboratories. In this work, we present the results of an interlaboratorial study - with the participation of all Brazilian manufacturers - for the establishment of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom and lot 01 of the Brazilian Reference Antivenom, looking forward the improvement of quality control of Bothrops antivenom. This study was done in two steps. The first one consisted in the potency evaluation of the lot 05 of the Brazilian Bothropic Reference Venom, the potency evaluation of the lot 01 of the Brazilian Bothropic Reference Antivenom and the evaluation of the use of a control of the challenge dose of five times the median lethal dose (5 LD50). The second step consisted on the comparison between the absolute and the relative (parallel line assay) potency evaluation of commercial Bothrops antivenom, using the Brazilian Bothropic Reference Antivenom, in a blind assay. This monograph will focus only in the establishment of Brazilian Reference Bothropic Venom and Antivenom. These results allowed us to evaluate the intra-assay; inter-assay and inter-laboratorial precision, the incidence of invalid assays, and showed that each laboratory interpret differently the Bothrops Antivenom monograph of Brazilian Pharmacopoeia.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_trugilho_ioc_dout_2009.pdf: 10986205 bytes, checksum: 7de098da6c6025322360c2bb8516382d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A proteína antiofídica DM43 isolada do soro do gambá Didelphis aurita inibe o efeito hemorrágico e a atividade proteolítica de metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs). Ao se ligar às SVMPs, o homodímero de DM43 se dissocia e cada monômero se liga a uma molécula de metaloprotease. O monômero é composto de três domínios tipo-imunoglobulina, dois dos quais são glicosilados. Para investigar a relação estrutura-função de DM43, os genes codificantes para esta proteína e para seus domínios foram clonados nos vetores pET101D/TOPO ou pET102D/TOPO; neste último, a proteína recombinante foi expressa em fusão com a tiorredoxina. Expressamos as construções obtidas em bactérias competentes da linhagem BL21 Star (DE3) de E. coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após purificação e reenovelamento por diálise, os espectros de dicroísmo circular (CD) na região do ultravioleta distante indicaram uma mistura de \03B1-hélices e folhas \03B2 pregueadas para os domínios recombinantes expressos em fusão com a tiorredoxina. A identidade das proteínas recombinantes foi confirmada, tanto por immunoblotting com anticorpo policlonal contra DM43, quanto por espectrometria de massas (MS/MS). Entretanto, nenhum dos domínios recombinantes, isolados ou combinados, foi capaz de inibir a atividade proteolítica da jararagina, uma metaloprotease de Bothrops jararaca. Ao contrário, os domínios fusionados com a tiorredoxina foram degradados quando incubados com esta SVMP. Estes resultados podem indicar que a glicosilação é funcionalmente importante e/ou que a conformação nativa multidomínio é necessária para a atividade biológica deste inibidor. Para melhor entender seus requisitos estruturais, estudamos a DM43 nativa após degradação proteolítica. Sob condições nativas, a digestão limitada de DM43 com tripsina ou quimotripsina gerou vários fragmentos, mas nenhum peptídeo ativo contra a SVMP foi obtido. Sob condições desnaturantes, a digestão extensiva de DM43 pela endoproteinase Lys-C produziu peptídeos menores. Mesmo sem atividade biológica contra a jararagina, três destes peptídeos foram capazes de interagir com esta SVMP. Após sequenciamento por MS/MS, cada peptídeo foi localizado em um domínio diferente de DM43. Estes resultados parecem sugerir a participação conjunta dos três domínios na interação com as SVMPs / The antiophidic protein DM43 isolated from Didelphis aurita serum inhibits the hemorrhagic effect and the proteolytic activity of snake venom metalloproteinases (SVMPs). Upon SVMP addition, DM43 homodimer dissociates and one subunit binds to one SVMP. The 43 kDa monomer is composed of three immunoglobulin-like domains, two of which are glycosylated. To investigate the structure-function relationship in this protein, the genes encoding DM43 and its domains were separately cloned into pET101D/TOPO or pET102D/TOPO vector, this last with the fusion partner thioredoxin. The obtained constructions were expressed in BL21 Star (DE3) competent E. coli cells as inclusion bodies. After purification and dialysis refolding, circular dichroism (CD) spectra in the far UV region of the recombinants domains with fusion partner indicated the presence of folded proteins with both alpha-helix and beta-sheet. The identities of the recombinant proteins were confirmed by immunoblotting with polyclonal antibodies against serum DM43 and by mass spectrometry (MS/MS). However, none of the domains either isolated or in combination, were able to inhibit the proteolytic activity of jararhagin. In contrast, thioredoxin-fused domains were readily digested by this SVMP. These results may indicate that glycosylation is functionally important for DM43 and/or that a multidomain native conformation is necessary for the biological activity of the inhibitor. To better understand its structural requirements, serum DM43 was studied after proteolytic degradation. Under native conditions, limited digestion of DM43 by trypsin or chymotrypsin generated various fragments, but no active peptide against SVMP was obtained. Extensive digestion of denatured DM43 by Lys-C endopeptidase produced smaller peptides. Even though not able to neutralize the proteolytic activity of jararhagin, three DM43 Lys-C peptides were able to bind to SVMP. After sequencing by MS/MS, each peptide was localized to one DM43 domain. Taken together, these results seem to reinforce the participation of all three domains of DM43 in the interaction with SVMPs

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T13:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os componentes de venenos de serpentes são importantes ferramentas para a pesquisa científica, desenvolvimento de drogas, e para o diagnóstico de várias doenças. Descrevemos a montagem de novo e análise do transcritoma da glândula de veneno de uma serpente amplamente distribuída no Brasil a Bothrops neuwiedi. Com base em 9.500.000 sequências identificamos várias sequências inteiras codificantes de toxinas. A mais abundante expressão foi de transcritos de metaloproteinases de veneno de serpentes (SVMPs), que apresentou o maior percentual de sequências mapeadas em um transcriptoma de referência (34,40 %), seguido por lectinas tipo C (25,20 %), fosfolipases A2 (14,20%) e serino-proteinases (7,51 %). Devido à importância fisiopatológica no envenenamento e seu potencial uso como um modelo para o desenvolvimento biotecnológico de fármacos, as SVMPs tornaram-se o principal alvo deste estudo, para o qual realizamos análises filogenéticas com o objetivo de contribuir para uma melhor compreensão da biodiversidade e dos mecanismos moleculares subjacentes a evolução destas proteínas, e também contribuir para a descoberta de novos compostos com potencial ação terapêutica / The snake venom’s components are sources of drug and physiological research tools for diagnosis of several diseases. We describe the de novo assembly and analysis of the venom-gland transcriptome of a widly distributed snake in Brazil (Bothrops neuwiedi). Based on 9.500.000 reads of quality-filtered, we identified several full-length toxin-coding sequences. The most highly expressed group of toxin was the SVMPs (snake venom metalloproteinase), which accounted for the highest percentage of reads to the reference transcriptome (34.40%), followed by C-type lectins (25.20%), phospholipases A2 (14.20%) and serine proteinases (7.51%). Due to pathophysiological importance in the poisoning and its potential use as a model for biotechnology development, the snake venom metalloproteinases (SVMP) became the main target in this study. Therefore we performed phylogenetic analyzes of the SVMPs in order to contribute to a better understanding of the biodiversity of these proteins underlying molecular and evolutionary mechanisms, and contribute to the discovery of new compounds with have potential in therapeutics.

ALBUQUERQUE, Polianna Lemos Moura Moreira. Manifestações clínicas e fatores de risco para comprometimento da função renal em pacientes vítimas de acidentes com serpentes peçonhentas. 2013. 86 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T15:49:05Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_plmmalbuquerque.pdf: 2822402 bytes, checksum: acedb62b2537fc1e4a83d9d0ddfb8aa7 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-05-11T15:51:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_plmmalbuquerque.pdf: 2822402 bytes, checksum: acedb62b2537fc1e4a83d9d0ddfb8aa7 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-11T15:51:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_plmmalbuquerque.pdf: 2822402 bytes, checksum: acedb62b2537fc1e4a83d9d0ddfb8aa7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Introduction: Envenomation by venomous snakes is a neglected disease in tropical countries. Acute kidney injury (AKI) is one of the main causes of morbidity and mortality in these cases. The aim of this study was to investigate the occurrence of AKI by snake bites, to evaluate the clinical manifestations and classify the AKI and the involved risk factors. Methods: A retrospective study was conducted with patients victims of snakebites admitted to a reference center. Patients with and without AKI were compared, and AKI was defined according to the RIFLE and AKIN criteria. Statistical analysis was performed by the program SPSS and it was considered significant p<0.05. Results: A total of 276 patients were included, with 83.7% (n= 230) male and 85.5% (n= 146) from rural área. AKI was observed in 15.2% of cases. The mean genus involved in the accidents was Bothrops (82.2%). Mean age of patients with AKI was higher than in patients without AKI (43±20 vs. 34±21 years, p=0.015), respectively. Time between the accident and the medical care was higher in the AKI group (25±28 vs. 14±16h, p=0.034), as well as the time between the accident and the administration of antiofidic sera (30.7±27 vs. 15±16h, p=0.01) and the length of hospital stay (9.1±7.7 vs. 3.2±2.2 days, p<0.01), respectively. Patients with AKI were classified as “Risk” (28.5%), “Injury” (11.9%) and “Failure” (57.1%), and as AKIN1 (35.7%), AKIN2 (7.1%) and AKIN 3 (57.1%). The mean values of creatinine and urea at admission and during hospital stay were higher in the worst stages of RIFLE and AKIN. Potassium at admission was higher in RIFLE-F and AKIN 3 (p=0.045). Hemoglobin was lower in patients classified within the worst staged of RIFLE and AKIN (p=0.041; p=0.042). Hemodialysis was required for 30% of cases, and complete renal function recovery was observed in 54.8% of cases. There were 4 deaths, of whom no one had AKI. Risk factors for AKI were hemorrhagic abnormalities (p=0.036, OR=6.718, 95% CI 1.067–25.661) and a higher lenght of hospital stay (p=0.004, OR=1.69, 95% CI 1.165–2.088). Conclusion: AKI is an importante complication of these acidentes, with low mortality, but with high morbidity, that can lead to partial renal function recovery. / Introdução. O envenenamento por serpentes peçonhentas é uma das doenças negligenciadas dos países tropicais. A lesão renal aguda é uma das principais causas de morbidade e mortalidade nestes casos. O objetivo deste estudo foi investigar a ocorrência de LRA por acidentes ofídicos, avaliar as manifestações clínicas e classificar a LRA e os fatores de risco envolvidos. Metodologia. Foi realizado estudo retrospectivo com pacientes vítimas de picadas de cobras atendidos em um centro de referência. Foram comparados os pacientes com e sem LRA, definida de acordo com RIFLE e AKIN. A análise estatística foi realizada pelo programa SPSS e foi considerado significativo p<0,05. Resultados. Foram incluídos 276 pacientes, 83,7% (n= 230) do sexo masculino e 85,5% (n= 126) procedente de zona rural. LRA foi observada em 15,2% dos casos. O principal gênero envolvido foi Bothrops (82,2%). A média de idade dos pacientes com LRA foi maior do que naqueles sem LRA (43±20 vs. 34±21 anos, p=0,015, respectivamente). O tempo entre o acidente e o atendimento médico foi maior no grupo com LRA (25±28 vs. 14±16h, p=0,034), o tempo entre o acidente e a administração de soro antiofídico (30,7±27 vs. 15±16h, p=0,01) e o tempo de internação (9,1±7,7 vs. 3,2±2,2 dias, p<0,01, respectivamente). Os pacientes com LRA foram classificados como “Risk” (28,5%), “Injury” (11,9%) e “Failure” (57,1%), e como AKIN1(35,7%), AKIN2 (7,1%) e AKIN3 (57,1%). As médias dos valores de creatinina e ureia à admissão e durante a internação foram maiores para os piores estádios do RIFLE e do AKIN. Potássio na admissão foi maior no RIFLE-F e AKIN3 (p= 0,045). A hemoglobina foi menor nos pacientes classificados dentro dos piores estádios do RIFLE e AKIN (p=0,041; p=0,042). Hemodiálise foi necessária em 30% dos casos, e recuperação completa da função renal foi observada em 54,8% dos casos. Houve quatro óbitos, nenhum com LRA. Os fatores de risco associados à LRA foram alterações hemorrágicas (p=0,036, OR = 6,718, IC95% 1,067 – 25,661) e um maior tempo de internamento (p=0,004, OR = 1,69, IC95% 1,165 – 2,088). Conclusão. A LRA é uma importante complicação desses acidentes, indicando baixa mortalidade, porém, alta morbidade, podendo levar a melhora parcial da função renal.

ARRUDA, Alcinia Braga de Lima. Estudo das atividades das cabenegrinas A-I e A-II frente aos efeitos hematológicos e histológicos induzidos pelo veneno total e frações da serpente Bothrops neuwiedi em camundongos Swiss. 2011. 167 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-24T12:03:50Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_ablarruda.pdf: 10435377 bytes, checksum: 81ca29dffc77bef3b7c2f8ee6da4146b (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-30T14:15:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_ablarruda.pdf: 10435377 bytes, checksum: 81ca29dffc77bef3b7c2f8ee6da4146b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-30T14:15:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_ablarruda.pdf: 10435377 bytes, checksum: 81ca29dffc77bef3b7c2f8ee6da4146b (MD5) Previous issue date: 2011 / The venom of the Bothrops neuwiedi provokes an action mainly of the hemorrhagic, proteolytic and coagulant type. When inoculated, the venom cause primarily a local action, and secondarily a systemic action. The systemic effects of poisoning include changes in various systems such as hematological, cardiovascular, liver, urinary, respiratory, immune, digestive and nervous. The mechanisms that cause the changes are complex and the various toxic components of the venom may act directly or indirectly on the cells. This study aimed first to investigate possible histological and hematological caused by the whole venom and by the phospholipase A2 and lectin C fractions from Bothrops neuwiedi snake, at 2, 4, 8, 16 and 24 hours intervals in mice, and then evaluate the cabenegrins A-I and A-II in the neutralization of the biological activities of the snake whole venom, analyzing its anti-ophidian potential for possible complementation of serum therapy. We studied the actions of the whole venom and of the phospholipase A2 and lectin C fractions on the hematological system, evaluating the hemogram, the myelogram and the splenogram, at different times. The hemogram was performed by the Sysmex-Roche blood cell counter model KX-21N; the myelogram was performed through the differential and morphological count of bone marrow cells using slides obtained after cytospin (using Cytological Centrifuge model Incibrás); and the splenogram, by quantifying and morphology of the cells in "imprint" of the spleen. After the hematological study, the kidneys, spleen, liver and heart were subjected to histological analysis. All studied parameters were analyzed by the ANOVA test and by the nonparametric Kruskal-Wallis exact test, with p<0.05. The results showed that main quantitative changes in the hematological cells, using the whole venom and the phospholipase A2 and lectin C fractions were: slight increase in erythrocytes and hematocrit, leukocytosis and thrombocytopenia, with repercussion in the peripheral blood; increase of erythroid and myeloid cells in myelogram and increase in myeloid cells in the splenogram. These changes were more evident two and four hours after the poisoning. The histological changes in the kidneys, spleen, liver and heart were characterized mainly by congestion, interstitial edema, hemorrhage, hydropicdegeneration and inflammatory process. When animals were treated with cabenegrins it was detected that these could not revert the quantitative changes of the spleen cells caused by the whole venom. However, all dilutions of cabenegrins AI and A-II were able to inhibit the thrombocytopenia and the increase of myeloid cells in the myelogram, and reverse all the histological changes found in all the studied organs. The treatment with cabenegrins also showed that the cabenegrins A-I (in the 2.5:1 dilution) and the cabenegrins A-II (in the 2.5:1 and 5:1 dilutions) neutralized the changes in the differential count, i.e., these cabenegrins decreased the number of segmented neutrophils, reflecting in the total number of neutrophils. These results suggest that the cabenegrins AI and A-II may be used in the future as an adjunctive treatment of treatment of snake accidents caused by Bothrops neuwiedi. / A serpente Bothrops neuwiedi possui veneno que tem ação principalmente do tipo pró-coagulante, hemorrágica e proteolítica. O veneno da Bothrops neuwiedi quando inoculado, possui ação primariamente local e secundariamente sistêmica. Os efeitos sistêmicos do envenenamento compreendem alterações em diferentes sistemas como: hematológico, cardiovascular, hepático, urinário, respiratório, imunológico, digestório e nervoso. Os mecanismos que ocasionam tais alterações são complexos e os vários componentes tóxicos dos venenos podem agir direta ou indiretamente nas células. Este trabalho teve como objetivo investigar as possíveis alterações hematológicas e histológicas induzidas pelo veneno total e pelas frações fosfolipase A2 e lectina C da serpente Bothrops neuwiedi, nos tempos 2, 4, 8, 16 e 24 horas em camundongos Swiss e avaliar as cabenegrinas A-I e A-II na neutralização das atividades biológicas do veneno total da serpente Bothrops neuwiedi analisando seu potencial antiofídico para possível complementação da soroterapia. Foram estudadas as ações do veneno total, fosfolipase A2 e lectina C sobre o sistema hematológico, avaliando o hemograma, mielograma e esplenograma em diferentes tempos. O hemograma foi realizado pelo contador de células sanguíneas Sysmex-Roche, modelo KX-21N, o mielograma através da contagem diferencial e morfológica das células da medula óssea através de lâminas obtidas após citocentrifugação (centrífuga citológica modelo Incibrás) e o esplenograma através da quantificação e morfologia das células em “imprint” do baço. Após o estudo hematológico, rins, baço, fígado e coração foram submetidos à análise histológica. Todos os parâmetros estudados foram analisados pelo teste de ANOVA e pelo teste não-paramétrico exato de Kruskal-Wallis, com p< 0,05. Os resultados mostraram que as principais alterações quantitativas nas células hematológicas com o uso do veneno total e as frações lectina C e fosfolipase A2 da serpente Bothops neuwiedi foram: discreto aumento do número de hemácias e no hematócrito, leucocitose e plaquetopenia no sangue periférico; aumento das células eritróides e mielóides no mielograma e aumento das células mielóides no esplenograma. Estas alterações foram mais evidentes nos tempo de duas e quatro horas após o envenenamento. As alterações histológicas no baço, rins, coração e fígado, caracterizaram-se principalmente, por congestão, edema intersticial, hemorragia, degeneração hidrópica e processo inflamatório. Quando os animais foram tratados com as cabenegrinas, foi verificado que estas não conseguiram reverter às alterações quantitativas das células no baço provocadas pelo veneno total. Porém, as cabenegrinas A-I e A-II em todas as diluições utilizadas foram capazes de inibir a plaquetopenia, reduzir o aumento da concentração de células mielóides no mielograma e reverter todas as alterações histológicas encontradas em todos os órgãos estudados. Também foi visto que a cabenegrina A-I na diluição 2,5:1 e as cabenegrinas A-II nas diluições 2,5:1 e 5:1 neutralizaram as alterações na contagem diferencial, ou seja, as referidas cabenegrinas diminuíram o número de neutrófilos segmentados, refletindo também no número de neutrófilos totais. Estes resultados sugerem que as cabenegrinas A-I e A-II poderão no futuro ser utilizadas como coadjuvantes no tratamento do acidente provocado pela serpente Bothrops neuwiedi.

A superfamília das fosfolipases A2 (FLA2) é composta por proteínas dotadas de propriedades diferenciadas que as tornam capazes de apresentar distintas atividades biológicas, além de sua atividade catalítica. Esta diversidade funcional é intrigante devido à alta similaridade de seqüência primária e de estrutura entre essas proteínas. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de uma metodologia para a predição de atividades biológicas específicas em FLA2 de peçonha de serpentes a partir da análise de seqüências primárias. A metodologia desenvolvida compreende: a) seleção de seqüências anotadas quanto à função ou atividade biológica que desempenham; b) detecção e validação estatística de motivos de seqüência relacionados à atividade estudada; e c) construção de Modelos Ocultos de Markov (MOMs) representando cada motivo. MOM consiste em uma modelagem estatística que tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas onde se faz necessária a detecção e representação de padrões de informação; por sua base matemática robusta e formal, pode ser utilizada na automação deste tipo de processo. A metodologia foi testada para duas atividades de FLA2 de peçonha de serpente: neurotoxicidade e miotoxicidade. Para as FLA2 neurotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais três foram validados estatisticamente como sendo adequados na discriminação de seqüências neurotóxicas de não neurotóxicas. Para as FLA2 miotóxicas, foram detectados seis motivos conservados, dos quais quatro foram validados. Os MOMs dos motivos validados podem ser usados na predição de atividade neurotóxica e miotóxica. As relações entre seqüência, estrutura, função e evolução das FLA2s são discutidas. Os dados obtidos foram coerentes com a hipótese apresentada por Kini (2003), da existência de diferentes sítios farmacológicos na superfície das FLA2, interagindo independente ou cooperativamente com diferentes receptores, para gerar as diversas funções biológicas observadas. Por não haver, até o momento, qualquer ferramenta automatizada para a predição de função biológica de FLA2, os resultados deste trabalho foram a base para a construção de uma ferramenta (disponível em www.cbiot.ufrgs.br/bioinfo/phospholipase) para a identificação de miotoxicidade e neurotoxicidade em FLA2.