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Analyse des mécanismes assurant la robustesse d’un événement de transdifférenciation : rôle de l’ubiquitine ligase E3 SEL-10 / Analysis of robustness in a transdifferentiation event : role of ubiquitin ligase E3 SEL-10Delance, Cécile 17 January 2018 (has links)
Les cellules différenciées peuvent changer de destin cellulaire de manière induite ou naturelle. Afin de comprendre et connaître les acteurs et mécanismes contrôlant les processus de reprogrammation, notre laboratoire étudie le changement d'identité (ou transdifférenciation, Td) naturel d’une cellule épithéliale rectale (nommée Y) en motoneurone (nommé PDA) chez Caenorhabditis elegans. Les travaux préliminaires ont montré qu’il existe une synergie entre les modifications d’histone (jmjd-3.1 et wdr-5.1) et l’ubiquitination (sel-10). SEL-10 est une ubiquitine ligase E3 possédant un domaine Fbox et une répétition de domaines WD40. Dans cette étude, nous avons pu mettre en évidence : i) une implication du domaine Fbox, des indications sur la localisation intracellulaire de SEL-10 et un rôle inattendu du protéasome au sein de la Td. ii) un rôle de SEL-10 dans la robustesse de la Td (résistance aux stress environnementaux). iii) sel-10, jmjd-3.1 et wdr-5.1 agissent sur la transcription de gènes impliqués dans la transdifférenciation (testé par smFISH). Ainsi qu’une caractérisation du motif d’expression marqueur de Td cog-1 au cours de la redifférenciation. / Differentiated cells can change their cellular fate induced or naturally. In order to understand the mechanisms controlling reprogramming processes, our laboratory is studying the natural change in identity (or transdifferentiation, Td) of a rectal epithelial cell (named Y) and motor neuron (named PDA) in Caenorhabditis elegans.Preliminary work has shown that there is a synergy between histone modifications (jmjd-3.1 and wdr-5.1) and ubiquitination (sel-10). SEL-10 is an E3 ubiquitin ligase with a Fbox domain and WD40 repeat domain.In this study, we highlight: i) the Fbox domain involvement in the Td, indications about the intracellular localization of SEL-10 and an unexpected role of the proteasome within TD. ii) a role of SEL-10 in the robustness of the Td. iii) sel-10, jmjd-3.1 and wdr-5.1 act on gene transcription in transdifferentiation. This one was tested by smFISH and allowed the characterization of the cog-1 transdifferentiation marker expression pattern during redifferentiation.
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Analyse systématique de la localisation d'ARNm dans les cellules humaines par de nouvelles approches / Systematic analysis of the mRNA localization in human cells by new approachesChouaib, Racha 01 July 2016 (has links)
La localisation d’ARNm est un processus cellulaire post-transcriptionnel qui assure le transport de l’ARNm vers une région subcellulaire spécifique. Dans différents organismes, plusieurs ARNm ont été décrits d’être localisés, et des études systématiques ont été réalisées uniquement chez la drosophile. Afin d’analyser la localisation des ARNm dans un modèle de mammifères, nous avons développé deux approches. La première approche est une nouvelle technique, smiFISH (single molecule inexpensive Fluorescent In Situ Hybridization), qui utilise des sondes primaires non marquées et une sonde secondaire fluorescente. Cette technique, qui permet d’analyser les ARNm au niveau endogène, est flexible, résolutive et peu coûteuse. La deuxième approche est l’analyse de centaines d’ARNm dans une collection de lignées cellulaires HeLa, par l’utilisation d’un seul jeu de sondes. Ces deux stratégies ont montré qu’environ 8% des ARNm sont localisés dans les cellules HeLa, et ont permis de découvrir de nouvelles classes de localisation d’ARNm chez les mammifères, jamais décrites auparavant. En analysant les gènes de la famille des moteurs moléculaires, nous avons trouvé que six ARNm ont des localisations particulières, parmi lesquels KIF1C présente une co-localisation entre l’ARNm et la protéine, suggérant un rôle crucial dans certains processus biologiques cellulaires. / The mRNA localization is a post-transcriptional process which allows the transport of mRNA to a specific subcellular region. In different organisms, several mRNAs have been described to be localized, but systematic studies have been only performed in Drosophila. In order to analyze the mRNA localization in a mammalian model, we developed two approaches. The first approach is a new technique, smiFISH (single molecule inexpensive Fluorescent In Situ Hybridization), which uses unlabeled primary probe and a fluorescent secondary probe. This technique, which allows the analysis of mRNA at the endogenous level, is flexible and inexpensive. The second approach is the analysis of hundreds of mRNA using a collection of HeLa cell lines, with a single set of probes. Both strategies allowed us to show that about 8% of mRNA are localized in HeLa cells. In addition, we discovered new classes of mRNA localization in mammals, never described before. By analyzing the genes of the molecular motors family, we found that six mRNAs have specific localization patterns, including KIF1C for which mRNA and protein co-localize, suggesting a crucial role in certain cell biological processes.
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L'imagerie systématique de transcrits et de polysomes uniques révèle un mécanisme de transport dépendant de la protéine naissante / Systematic imaging of single transcripts and polysomes reveals a widespread transport mechanism dependent on nascent translationSafieddine, Adham 12 November 2019 (has links)
La traduction locale permet un contrôle spatial de l'expression des gènes. Dans ce travail, j'ai participé à deux cribles de localisation d'ARNm concernant plus de 1000 transcrits. Le premier était un crible double ARNm/protéine qui utilisait une approche de BAComics pour co-détecter les ARNm et la protéine pour laquelle ils codent. Le second a été réalisé à l'aide d'une nouvelle approche smFISH à haut-débit et a analysé tous les ARNm codant pour des protéines centrosomales et des régulateurs mitotiques. Le premier crible a révélé des cas de traduction locale dans divers compartiments subcellulaires, et notamment au niveau des protrusions cytoplasmiques, des centrosomes, de l’appareil de Golgi, des endosomes et des pores nucléaires, ce qui n'avait jamais été décrit auparavant. De manière remarquable, la traduction du peptide naissant était nécessaire pour le transport de nombreux transcrits localisés. De plus, j'ai montré que plusieurs ARNm (tels que ASPM et DYNC1H1) sont traduits dans des structures dédiées appelées usines de traduction.Le deuxième crible a révélé 8 transcrits localisés et traduits au niveau des centrosomes. J'ai montré que la localisation de ces 8 transcrits est régulée par le cycle cellulaire et qu'elle nécessite également la traduction du polypeptide naissant. En utilisant le gène ASPM comme modèle, j'ai visualisé des ARNm et des polysomes uniques avec les systèmes MS2 et SunTag, respectivement. Cela a révélé un transport dirigé des polysomes ASPM vers les centrosomes au début de la mitose, lorsque cet ARNm commence à être localisé. Ces données fournissent des preuves fortes d'un mécanisme de ciblage co-traductionnel dépendant de moteurs moléculaires ainsi que de la protéine naissante. Cela va à l'encontre du dogme actuel selon lequel le transport d'ARNm est un processus basé sur l'ARN et agissant sur des molécules réprimées pour la traduction. En revanche, cela suggère que des mécanismes tels que celui utilisé par le SRP sont plus répandus qu'on ne le pensait auparavant. / Local translation allows a spatial control of gene expression. Here, I participated in two mRNA localization screens imaging more than 1000 transcripts in total: (i) the first was a dual mRNA/protein screen that used a BAComics approach to co-detect mRNAs and the protein they encode; (ii) the second was done using a new high-throughput smFISH approach to screen all genes that encode centrosomal proteins and mitotic regulators. The first screen revealed cases of local translation at various subcellular compartments including cytoplasmic protrusions, centrosomes, Golgi, endosomes and the nuclear pore, which was never described before. Remarkably, translation of the nascent peptide was required for the transport of many localized transcripts. In addition, I showed that several mRNAs (such as ASPM and DYNC1H1) are translated in dedicated structures called translation factories.The second screen revealed 8 transcripts that are localized and translated at the centrosome. I showed that the localization of these 8 transcripts is regulated by the cell cycle, and that it also requires translation of the nascent polypeptide. Using the endogenous ASPM gene as a model, I imaged single mRNAs and polysomes with the MS2 and SunTag systems, respectively. This revealed a directed transport of ASPM polysomes towards centrosomes at the onset of mitosis, when this mRNA starts localizing. These data provide definitive evidence for a co-translational targeting mechanism dependent on motors as well as the nascent protein. This argues against the current dogma that mRNA transport is an RNA-based process acting on translationally repressed molecules. Instead, it suggests that SRP-like mechanisms are more widespread than previously thought.
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Using modern microscopy and image analysis methods to study dosage compensation in C. elegansBreimann, Laura 17 February 2022 (has links)
Condensine sind essentiell für die Faltung von Chromatin und wurden auch mit der Transkriptionsregulation in Verbindung gebracht. Der zugrunde liegende Mechanismus für die Transkriptionsregulation ist jedoch unklar. Condensin DC in C. elegans ist ein gutes Modell zur Erforschung der Transkriptionsregulation durch Condensine, da es spezifisch für die Dosiskompensation der Gene auf dem X Chromosom benutzt wird. Condensin DC bindet an beide X Chromosome in C. elegans Hermaphroditen und reduziert deren Transkription um die Hälfte. In meiner Dissertation habe ich untersucht, welche Rolle ein dynamisches Binden von Condensin DC an Chromatin spielt und wie dies die Transkription während der Embryogenese reguliert.
Condensine binden dynamisch an Chromatin, um es zu komprimieren und durch Bildung von Schlaufen die Transkription zu regulieren. Mit Hilfe von „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) habe ich in adulten Darmzellen von C. elegans untersucht, welche Faktoren das dynamische Binden von Condensin DC an die X Chromosomen beeinflussen. Meine Daten zeigen, dass sowohl die ATPase-Domäne von Condensin DC, als auch eine nicht-katalytische Aktivität einer Histon-Demethylase die Bindedynamik von Condensin DC beeinflussen und damit Transkription regulieren.
Zusätzlich habe ich mit einem Mikroskopieansatz, der auf dem Nachweis von einzelnen RNA Molekülen beruht (smFISH), die Transkription von mehreren Genen untersucht, die durch Condensin DC während der Embryonalentwicklung reguliert werden. Die aus diesen Daten ermittelten Transkriptionskinetiken deuten darauf hin, dass Condensin DC vorrangig die Häufigkeit der Transkriptionsinitiation reguliert.
Zusammenfassend liefert meine Forschung neue Einblicke in die Transkriptionsregulation durch Condensine und kann als Basis für detailliertere, mechanistische Studien der Rolle von Condensinen in der Transkriptionsregulation in C. elegans und auch in anderen Organismen dienen. / Condensins are essential for chromosome compaction and have been implicated in transcription regulation. The mechanistic foundation of this regulatory function is poorly understood. A clear paradigm to address this question is the X-specific condensin DC in C. elegans, which specifically binds to and transcriptionally represses X chromosomes in XX hermaphrodites by 2-fold. In my thesis, I studied condensin DC binding dynamics to the X chromosome and how condensin DC affects transcription kinetics in single embryos.
The binding of condensins to chromatin has been described in recent microscopy-based studies as dynamic in processes including loop formation, chromatin compaction and transcription regulation. To study the dynamics of condensin DC binding, I established fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in C. elegans adult intestinal cells. With this method, I studied how the ATPase domain and different histone modifiers regulate the dynamic binding of condensin DC. I found that the ATPase domain is critical for binding of the complex and that the noncatalytic activity of a histone demethylase increases the dynamics of condensin DC binding, which is crucial for its role in transcription regulation.
To further study the mechanism of condensin DC in transcription regulation, I used an imaging approach based on widefield single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH). I obtained thousands of smFISH images for a set of condensin DC-regulated genes and extracted mature and nascent RNA counts in 3D, which I used to determine transcription burst characteristics throughout embryonic development. My data show that condensin DC regulates the frequency of transcription initiation to down-regulate X-chromosomal genes.
Taken together, my results provide new insight into condensin-mediated transcription regulation, which can be used to inform future studies on the mechanism of condensins in transcription regulation in C. elegans and other organisms.
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Single molecule characterization of the roles of long non-coding RNAs in eukaryotic transcription regulationRahman, Samir 05 1900 (has links)
Récemment, des analyses dans divers organismes eucaryotes ont révélé que l'ensemble
du génome est transcrit et produit en plus des ARNs messagers, une grande variété d’ARNs
non codants de différentes longueurs. Les ARNs non codants de plus de 200 nucleotides,
classés comme longs ARNs non codants (LARNnc), représentent la classe la plus abondante
de transcripts non codants. Les études des fonctions des LARNnc suggèrent que beaucoup
d'entre eux seraient impliqués dans la régulation de la transcription. L'objectif de ma thèse de
doctorat était d'élucider les mécanismes de la régulation transcriptionnelle médiée par des
LARNnc dans différents systèmes eucaryotes.
Dans mon premier projet, j'ai étudié le rôle d'un long ARN non codant antisens dans la
régulation transcriptionnelle du gène PHO84, codant un transporteur de phosphate à haute
affinité, chez S. cerevisiae. Des études antérieures ont montré que la suppression d’une
proteine de l’exosome Rrp6 entraîne une augmentation de l'expression antisens et la répression
de PHO84. Il a été suggéré que la perte de Rrp6 entraîne une stabilisation antisens au locus
PHO84, entraînant le recrutement de l'histone de-acétylase Hda1 et la répression de PHO84.
Cependant, le mécanisme par lequel Rrp6p régule la transcription de PHO84 n’était pas
connu. En combinant des méthodes à l’échelle de cellule unique, des approches biochimiques
et génétiques, nous avons montré que les niveaux d'ARN antisens sont régulés principalement
lors de l'élongation par le complexe Nrd1-Nab3-Sen1, qui nécessite Rrp6 pour un recrutement
efficace à l`extrémité 3`de PHO84. De plus, nous révélons l'expression anticorrelé du sens et
de l'antisens, En résumé, nos données suggèrent que la transcription antisens régule le seuil
d'activation du promoteur PHO84.
Dans mon second projet, j'ai étudié les rôles des ARNs dérivés des amplificateurs
(ARNa) dans la regulation de la transcription. En utilisant les cellules de cancer du sein MCF7
comme système modèle, nous avons cherché à déterminer comment les ARNa induits par
l'oestrogène (E2) participent à la régulation de la transcription médiée par le recepteur
d’oestrogène (ERα) au niveau de l'allèle unique. À l'aide de l’hybridation fluorescente à
l’échelle de molécule unique (smFISH), nous avons révélé qu`après induction d'E2, les ARNa
sont induits avec une cinétique similaire à celle des ARNm cibles, sont localisés
exclusivement dans le noyau, principalement associés à la chromatine, et sont moins
abondants que les ARNm. De manière surprenante, nous avons constaté que les ARNa sont
rarement co-transcrits avec leurs loci cibles, indiquant que la transcription active des gènes ne
nécessite pas la synthèse continue ou l'accumulation d'ARNa sur l'amplificateur. En outre, en
utilisant des mesures de la distance à sous-diffraction, nous avons démontré que la cotranscription
des ARNa et des ARNm se produit rarement dans une boucle amplificateurpromoteur.
De plus, nous avons révélé que la transcription basale d'ARNa n'exige pas ERα ou
l'histone méthyltransférase MLL1 qui active l'amplificateur par la mono-méthylation H3K4.
Dans l'ensemble, nos résultats ont montré que les ARNa peuvent jouer un rôle lors de
l'activation du promoteur, mais ne sont pas nécessaires pour maintenir la transcription de
l'ARNm ou pour stabiliser les interactions amplificateur-promoteur. / Transcription is the initial step in gene expression and is subject to extensive
regulation. Recently, analyses in diverse eukaryotes have revealed that in addition to protein
coding genes, transcription occurs throughout the noncoding genome, producing non-coding
RNAs of various lengths. Non-coding RNAs longer than 200 nucleotides, classified as long
non-coding RNAs (lncRNAs), represent the most abundant class of non-coding transcripts,
whose functions however are poorly understood. Recent studies suggest that many lncRNAs
might have roles in transcription regulation. The goal of my PhD thesis was to elucidate the
mechanisms of lncRNA mediated transcription regulation in different eukaryotic systems.
For my first project, I investigated the role of an antisense long noncoding RNA in
transcription regulation of the high-affinity phosphate transporter gene PHO84 in the
unicellular eukaryote S. cerevisiae. Previous studies showed that deletion of the nuclear
exosome component Rrp6 results in increased antisense expression and repression of PHO84.
It was suggested that the loss of Rrp6 results in antisense stabilization at the PHO84 locus,
leading to recruitment of the histone de-acetylase Hda1 and repression of PHO84. However,
most of the mechanistic details of how Rrp6p functions in regulating PHO84 transcription
were not understood. Combining single cell methods with biochemical and genetic
approaches, we showed that antisense RNA levels are regulated primarily during
transcriptional elongation by the Nrd1-Nab3-Sen1 complex, which requires Rrp6 for efficient
recruitment to the 3’end of PHO84. Furthermore, we reveal anti-correlated expression of sense
and antisense, which have distinct modes of transcription. In summary, our data suggest a
model whereby antisense transcriptional read-through into the PHO84 promoter regulates the
activation threshold of the gene.
For my second project, I investigated the roles of enhancer derived RNAs (eRNAs).
eRNAs are lncRNAs transcribed from enhancers that have been suggested to regulate
transcription through different mechanisms, including enhancer-promoter looping, RNA
polymerase elongation, and chromatin remodeling. However, no coherent model of eRNA
function has yet emerged. Using MCF7 breast cancer cells as a model system, we sought to
determine how estrogen (E2) induced eRNAs participate in estrogen receptor alpha (ERα)
mediated transcription regulation at the single allele level. Using single molecule fluorescent
in situ hybridization (smFISH), we revealed that upon E2 induction eRNAs are induced with
similar kinetics as target mRNAs, but are localized exclusively in the nucleus, mostly
chromatin associated, and are less abundant than mRNAs. Surprisingly, we found that eRNAs
are rarely co-transcribed with their target loci, indicating that active gene transcription does
not require the continuous synthesis or accumulation of eRNAs at the enhancer. Furthermore,
using sub-diffraction-limit distance measurements, we demonstrated that co-transcription of
eRNAs and mRNAs rarely occurs within a closed enhancer-promoter loop. Moreover, we
revealed that basal eRNA transcription does not require ERα or the histone methyltransferase
MLL1, which activates the enhancer through H3K4 mono-methylation. Altogether, our
findings showed that eRNAs may play a role during promoter activation, but are not required
to sustain mRNA transcription or stabilize enhancer-promoter looping interactions.
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Modeling synchronization effects in the yeast cell cycleSchlichting, Julia Katharina 03 April 2019 (has links)
Saccharomyces cerevisiae ist ein bekanntester Modellorganismen in der Systembiologie, der häufig zur Untersuchung des mitotischen Zellzyklus eukaryotischer Zellen verwendet wird. Des Zellzyklus wird durch Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) und CDK-Inhibitoren (CKI) reguliert. Der wichtigste Kontrollpunkt innerhalb des Zellzyklus reguliert den Übergang von der G1 in die S Phase und wird START genannt. Im dieser Arbeit verwenden wir einen stochastischen Modellierungsansatz, um die Auswirkungen verschiedener Synchronisationsmethoden auf den Zellzyklus zu untersuchen. Um Modellparameter zu schätzen, kombinieren wir Phasen aufgelöste mRNA-Verteilungen unsynchronisierter Einzelzellen und Protein-Zeitreihen synchronisierter Zellpopulationen. Somit können wir mRNA-Dynamiken für ausgewählte Synchronisationsmethoden vorhersagen. In einem zweistufigen Optimierungsansatz unterscheiden wir zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Die Parameterschätzung basiert auf der Maximum-Likelihood-Methode. Die Phasen aufgelösten mRNA-Verteilungen wurden mithilfe der smFISH-Technik für SIC1, CLN2 und CLB5 gemessen. Die Protein-Zeitreihen wurden mithilfe von Western Blots für entsprechenden Proteine gemessen. Die gemessenen Moleküle sind die Hauptregulatoren des G1-S Phasenübergangs, welche die Komponenten unseres Zellzyklusmodells darstellen. Durch die erfolgreiche Integration von qualitativ unterschiedlichen Datentypen in der Parameterschätzung konnten wir eine systematische Analyse von Synchronisationseffekten auf den Zellzyklus durchführen. Der zeitlicher Ablauf des Zellzyklus ist dabei maßgeblich beeinflusst. Die stärksten zeitlichen Veränderungen weist die Synchronisation mit alpha-Faktor auf. Elutrierte Zellen sind den unsynchronisierten Zellen trotz verlängerter G1 Phase am ähnlichsten. Wir zeigen in dieser Arbeit, dass synchronisierte Zellpopulationen unzureichend sind, um Rückschlüsse auf den Zellzyklus unsynchronisierter Zellen zu ziehen. / cell cycle, G1/S transition, stochastic modeling, parameter estimation, smFISH, singel cells, Western blotting, cell populations Saccharomyces cerevisiae is a famous model organism in systems biology to study the mitotic cell cycle in eukaryotic cells. The cell cycle is a highly controlled process which is regulated by cyclins, cycline-dependent kinases (CDK) and cyclin-dependent kinase inhibitors (CKI). The main kinase involved in cell cycle regulation is Cdc28. START is the most important check point and controls the G1 to S phase transition. At this point, cells decide if they enter a new cell division cycle or not. In this study, we analyze influences of different synchronization methods on the cell cycle and differences between unsynchronized and synchronized cells by using a stochastic modeling approach. We combine phase-resolved mRNA distributions of unsynchronized single cells and protein time courses of synchronized cell populations to estimate model parameters and to predict synchronization specific mRNA dynamics. Parameter estimation is based on a maximum likelihood approach and performed in a 2-step-optimization in which we differentiate between mRNA and protein level. We measured phase-resolved mRNA distributions of mRNA species SIC1, CLN2 and CLB5 by smFISH and protein time courses of protein species Sic1, Cln2 and Clb5 by Western blotting. These molecules are key regulators of the G1 to S phase transition and represent components of our cell cycle model. By integrating qualitatively different data types in parameter estimation, we come up with a systematic analysis of synchronization effects on the cell cycle. Cell cycle timing is mainly responsible for differences between unsynchronized and synchronized cells and is mostly affected in alpha-factor synchronized cells. Ignoring the prolongation of the G1 phase, elutriated cells are most similar to unsynchronized cells. We show that synchronized cell populations are insufficient to derive general cell cycle behavior of unsynchronized cells.
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Quantification of DNA Microballs Using Image Processing Techniques / Kvantifiering av DNA-mikrobollar med hjälp av bildbehandlingsteknikerTedros, Yosef Werede January 2023 (has links)
I detta examensarbete användes olika bildbehandlingstekniker för detektion och kvantifiering av DNA-mikrobollar, mer specifikt rolling circle amplification-produkter, på mikroskopibilder. Avsikten med detta arbete var att hjälpa Countagen AB utforska pipelines för bildbehandling för sin produkt där de analyserar utfallet av genredigeringsförsök på ett billigare och snabbare sätt än dagens konventionella sekvenseringsmetoder. Två olika metoder för objektdetektion användes i detta arbete. Big-FISH, som bygger på Laplacian of Gaussian och detektion av lokala maxima, samt LodeSTAR, en single-shot, self-supervised djupinlärningsmodell. Förbehandling av bilder var också en central del av detta projekt. DeepSpot, en djupinlärningsmodell för framhävning av punkter, användes för att framhäva mikrobollarna så att de lätt kunde upptäckas, och en top-hat-transform användes för att filtrera bort bakgrunden från bilderna. De olika metoderna utvärderades på ett dataset med manuellt annoterade bilder, en spädningsserie av prover samt prover med samma koncentration. Detta för att få värden på precision, recall och F1-score samt mäta hur robust modellen är när det gäller att detektera punkter. Den modell som presterade bäst var LodeSTAR, med en F1-score på 83% på det annoterade datasetet. / In this thesis project, different image processing techniques were utilized for the detection and quantification of DNA microballs on fluorescence microscopy images. These microballs consisted of rolling circle amplification products, of regions of interest. This was done to aid Countagen AB in exploring image processing pipelines for their product where they analyze gene editing efficiency in a cheaper and faster manner than today's conventional sequencing methods. Two different object detection methods: Big-FISH, which builds on Laplacian of Gaussian and local maxima detection, and LodeSTAR, a single-shot, self-supervised deep learning model, were evaluated for this task of detection and quantification. Image preprocessing was a central part of this project. DeepSpot, a deep learning model for spot enhancement was used to highlight the microballs, and a white top-hat transform was applied to the images for background subtraction. The different methods were evaluated on a test set of manually annotated images, a dilution series of samples, and samples with the same concentration to obtain precision, recall, and F1 scores, as well as gauge the robustness of the model in detecting spots. The best-performing model was LodeSTAR, with an F1-score of 83% on the test set.
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Characterising (pre-)mrnp organisation at different stages of gene regulation using single-molecule microscopyAdivarahan, Srivathsan 07 1900 (has links)
Les ARNm sont des molécules centrales pour la régulation des gènes, aidant à convertir l'information génétique stockée dans l'ADN en protéines fonctionnelles. En tant que polymère simple brin, mesurant des centaines à des milliers de nucléotides, les ARNm peuvent former des structures secondaires et tertiaires étendues formant des particules appelés ribonucléoprotéines messagères (RNPm) en s’assemblant avec des protéines. L'organisation 3D des (pré-)RNPm influence de nombreux aspects de leur métabolisme, incluant la régulation de leur maturation, de leur export et de leur traduction dans le cytoplasme. Malgré leur importance, notre compréhension de l'organisation structurelle des (pré-)RNPm in vivo, et des principes qui la régissent est minime.
Au cours de ma thèse, j'ai analysé l'organisation des (pré-)mRNP en développant une vision centrée sur l'ARN. Pour cela, j'ai mis en place une approche combinant l'hybridation in situ d'ARN monomoléculaire (smFISH) avec la microscopie à illumination structurée (SIM) et l'ai utilisée pour étudier l'organisation des mRNP dans le noyau et le cytoplasme. Nos résultats suggèrent que l'organisation (pré-)mRNP varie à différents stades de sa vie. Nous montrons que l'empaquetage (pré-)mRNP commence de manière co-transcriptionnelle, avec des introns organisés en conformations compactes. Cette organisation est modifiée au cours de la transcription au fur et à mesure que la polymérase se déplace le long du gène, assemblant finalement un intron avec les extrémités à proximité l’une de l’autre, d'une manière dépendante du spliceosome, suggérant que l'organisation co-transcriptionnelle des introns pourrait être critique pour déterminer son excision. Une fois libérés, les mRNP ont une organisation linéaire compacte dans le nucléoplasme et éventuellement une conformation en tige. L'organisation d’un mRNP dans le cytoplasme est influencée par sa traduction. Alors que la traduction ouvre les mRNP, la séparation des extrémités de l'ARNm, l'inhibition de la traduction et la libération de ribosomes, ou le recrutement dans les granules de stress, donnent aux mRNP une structure très compacte. Fait intéressant, nous trouvons rarement des ARNm avec les extrémités 5' et 3' à proximité, ce qui suggère que la traduction en boucle fermée n'est pas un état universel pour tous les ARNm en cours de traduction. Ensemble, nos résultats fournissent une image essentielle de l'organisation du mRNP dans les cellules et souligne le rôle important de la conformation du RNPm dans la régulation de la traduction et de la maturation d’une RNPm. / mRNAs act as the central molecules in gene regulation, helping convert the genetic information stored in the DNA to functional proteins. As a single-stranded polymer, hundreds to thousands of nucleotides in length, mRNAs can form extensive secondary and tertiary structures and, together with proteins, are packaged into assemblies called messenger ribonucleoproteins (mRNPs). The 3D organisation of (pre-)mRNPs influences many aspects of what happens to them, including regulating their processing, export and translation in the cytoplasm. Despite their significance, our understanding of the structural organisation of (pre-)mRNPs in vivo is minimal, as is our comprehension of the principles that govern it.
During my PhD, I have developed an RNA-centric view on (pre-)mRNP organisation. For this, I have established an approach combining single-molecule RNA in situ hybridisation (smFISH) with structured illumination microscopy (SIM) and used it to study mRNP organisation in the nucleus and cytoplasm. Our results suggest that (pre-)mRNP organisation is altered at various stages during its lifetime. We show that (pre-)mRNP packaging starts co-transcriptionally, with introns organised into compact conformations. This organisation is altered during the course of transcription as the polymerase travels along the gene, finally assembling an intron with the ends in proximity in a spliceosome dependent manner, suggesting that co-transcriptional intron organisation could be critical in determining its excision. Once released, mRNPs have a compact linear organisation in the nucleoplasm and possibly a rod-like conformation. mRNP organisation in the cytoplasm is influenced by its translational status. While translation opens up mRNPs, separating the ends of the mRNA, translation inhibition and release of ribosomes, or recruitment to stress granules result in mRNPs having a highly compact structure. Interestingly, we rarely find mRNAs with the 5’ and 3’ ends in proximity, suggesting that closed-looped translation is not a universal state for all translating mRNAs. Together, our results provide a unique and essential view of mRNP organisation in cells and reveal important insight into the role of mRNP conformation in regulating translation and mRNP processing.
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