Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous fungal infection of evolution subacute or chronic, inflammatory lesions characterized by pyogranulomatous aspect, caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii. Adenosine deaminase (ADA) is a key enzyme in the purine metabolism, promoting the deamination of adenosine, an important anti-inflammatory molecule. The increase in ADA activity has been demonstrated in several inflammatory conditions, however, no data in the literature associated with this fungal infection. The objective of this study was to evaluate the activity of serum ADA (S-ADA) and lymphocytes (L-ADA) of rats infected with S. schenckii. We used seventy-eight rats divided into two groups. In the first experiment, rats were infected subcutaneously and in the second experiment, infected intraperitoneally. Blood samples for hematologic evaluation and activities of S-ADA and ADA-L were performed on days 15, 30 and 40 post-infection (PI) to assess disease progression. In experiment II, was observed in an acute decrease in activity of S-ADA and L-ADA (p <0.05), suggesting a compensatory mechanism in the body's attempt to protect the host from excessive tissue damage. Chronicity of the disease the rats in the experiment I and II at 30 days PI, showed an increased activity of L-ADA (p <0.05), promoting an inflammatory response in an attempt to combat the spread of the agent. Thus, it is suggested that infection with S. schenckii alters the activities of S-ADA experimentally infected rats, demonstrating the involvement of this enzyme in the pathogenesis of sporotrichosis. / A esporotricose é uma infecção micótica subcutânea de evolução subaguda ou crônica, caracterizada por lesões inflamatórias de aspecto piogranulomatoso, causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii. A adenosina desaminase (ADA) é uma enzima chave no metabolismo das purinas, promovendo a desaminação da adenosina uma importante molécula anti-inflamatória. O aumento na atividade da ADA tem sido demonstrado em várias condições inflamatórias, porém, não existem dados na literatura associados com esta infecção micótica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da ADA no soro (S-ADA) e nos linfócitos (L-ADA) de ratos infectados por S. schenckii. Foram utilizados setenta e oito ratos distribuídos em dois grupos. No experimento I, os ratos foram infectados por via subcutânea e no experimento II, infectados por via intraperitoneal. A coleta de sangue para a avaliação hematológica e atividades da S-ADA e L-ADA foram realizadas nos dias 15, 30 e 40 pós-infecção (PI), para avaliar a evolução da doença. No experimento II, foi observada na fase aguda uma diminuição na atividade da S-ADA e L-ADA (p<0.05), sugerindo um mecanismo compensatório do organismo na tentativa de proteger o hospedeiro da lesão tecidual excessiva. Com a cronicidade da enfermidade os ratos do experimento I e II aos 30 dias PI, apresentaram um aumento na atividade da L-ADA (p<0.05), promovendo uma resposta inflamatória na tentativa de combater a proliferação do agente. Assim, sugere-se que a infecção pelo S. schenckii altera as atividades da S-ADA e L-ADA de ratos infectados experimentalmente, demonstrando o envolvimento desta enzima na patogênese da esporotricose.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is an implantation mycose, caused by species complex Sporothrix spp., considered the subcutaneous mycosis with higher occurrence and importance in the Americas, this thermally dimorphic fungus induces a chronic inflammatory granulomatous response in their hosts. The cholinesterase, acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE) are the "key" enzimes signal in inflammatory and immune processes, for regulating the levels of ACh, the main neurotransmitter "cholinergic antiinflammatory pathway". The cholinesterase activity has been demonstrated in various inflammatory conditions; however, there is no evidence of his participation in sporotrichosis. The objective of this study was to report a case of feline sporotrichosis by natural infection; evaluate the activities of AChE in the lymphocytes and whole blood; evaluate the activity of BChE; cytokines (IL1, IL6, TNF, and IL-10 INFγ) and immunoglobulins (IgA, IgG, IgM, IgE) in serum of rats experimentally infected with S. schenckii. Sixty-three rats were divided into three groups, control group (CG), group by subcutaneous infection (GSC) and group by intraperitoneal infection (GIP). Blood collection for activities evaluation of cholinesterase, cytokines and immunoglobulins were held on 15, 30 and 40 post-infection (PI). The GIP, had an increase in the activity of AChE in the blood in all experimental times, the increase in lymphocytes occurred only on 30 and 40 days PI. The increase of the enzyme suggests a decrease in the levels of ACh with consequently increased IL-1, IL-6, TNF-α, INF-γ, as observed in this study. In the acute phase of infection wants an intense inflammatory response in an attempt to remove the agent. However, with the chronicity of infection if the stimulus is maintained can lead to remarkable tissue injury. Regarding the chronic process observed in GIP, 30 and 40 days PI, that IL-10 was shown to be increased, but not enough to contain inflammation, as pro cytokines, continued high levels. Conversely, what happened in the GIP, the SC group had reduced levels of IL-10 at all times PI, this decrease can lead to tissue damage by not blocking the inflammatory response. The activity of AChE in the GSC only statistically increased in lymphocytes, at 40 days PI. There was no significant activity when assessing the BChE, in both groups, except in the GSC 40 days PI. The BChE is not efficient in Ach s hydrolysis in low concentrations, but it can replace the AChE when itself is inhibited. High levels of immunoglobulins in all groups and at all times, shows the induction of humoral immune response in sporotrichosis. Thus, the increase in the AChE activity in whole blood and lymphocytes, together with high levels of serum immunoglobulins and cytokines, suggesting the involvement of cholinesterases, and in immune cell response against infection by S. schenckii. / A esporotricose é uma micose de implantação, causada pelo complexo de espécies Sporothrix spp., considerada a micose subcutânea com a maior ocorrência e importância nas Américas, esse fungo termodimórfico induz uma resposta inflamatória granulomatosa crônica em seus hospedeiros. As colinesterases, acetilcolinesterase (AChE) e butirilcolinesterase (BChE) desempenham um papel chave na sinalização de processos inflamatórios e imunes, por regular os níveis de ACh, o principal neurotransmissor da via colinérgica antiinflamatória . A atividade das colinesterases tem sido demonstrada em várias condições inflamatórias, contudo, não há evidencias de sua participação na esporotricose. O objetivo deste estudo foi relatar um caso de esporotricose felina por infecção natural; avaliar as atividades da AChE em linfócitos e no sangue total; avaliar a atividade da BChE; citocinas (IL1, IL6, TNFα, INFγ e IL10) e imunoglobulinas (IgA, IgG, IgM, IgE) no soro de ratos infectados experimentalmente por S. schenckii. Foram utilizados sessenta e três ratos distribuídos em três grupos, grupo controle (GC), grupo por infecção subcutânea (GSC) e grupo por infecção intraperitoneal (GIP). A coleta de sangue para avaliação das atividades das colinesterases, citocinas e imunoglobulinas foram realizadas nos dias 15, 30 e 40 pós-infecção (PI). No GIP, ocorreu um aumento na atividade das AChE no sangue em todos os tempos experimentais, nos linfócitos o aumento ocorreu apenas nos dias 30 e 40 dias PI. O aumento dessa enzima sugere uma diminuição nos níveis de ACh, com consequentemente aumento das IL-1, IL-6, TNFα, INFγ, como observado neste estudo. Na fase aguda da infecção deseja-se uma resposta inflamatória intensa na tentativa de eliminar o agente. Porém, com a cronicidade da infecção, se o estímulo for mantido pode acarretar marcante lesão tecidual. Com relação ao processo crônico observou no GIP, aos 30 e 40 dias PI, que a IL-10 mostrou-se aumentada, porém não sendo suficiente para conter a inflamação, pois as citocinas pró, continuaram com altos níveis. Inversamente o que aconteceu no GIP, o grupo SC obteve níveis reduzidos de IL 10 em todos s tempos PI, este decréscimo pode levar a danos teciduais pelo não bloqueio da resposta inflamatória. A atividade da AChE, no GSC só se mostrou estatisticamente aumentada nos linfócitos, aos 40 dias PI. Não houve atividade estatística significativa ao avaliar a BChE, em ambos os grupos, exceto no GSC 40 dias PI. A BChE não é eficiente em hidrolisar ACh em baixas concentrações, mas ela pode substituir a AChE na hidrolise da ACh quando a mesma estiver inibida. Os altos níveis evidenciados das imunoglobulinas em ambos os grupos e em todo os tempos, demonstra a indução da resposta imune humoral na esporotricose. Assim, o aumento na atividade da AChE em sangue total e em linfócitos, juntamente com os elevados níveis de citocinas e imunoglobulinas séricas, sugere-se o envolvimento dessa colinesterase, na resposta imune e celular frente a infecção por S. schenckii.

Sporotrichosis is a cosmopolitan mycosis whose etiological agent is the fungus Sporothrix schenckii, affecting humans and several animals, especially felines. The most frequent form of the mycosis is the lymphocutaneous. The disseminated forms are less frequent and have been described mainly among immunocompromised patients. The Sporothrix schenckii is accidentally introduced in the human or animal body through wounds caused by thorns, wood splinters or any sharp object contaminated by the fungus. Cat as domestic animals may transmit sporotrichosis to humans through scratches and/or bite due to the large amount of yeast found in the lesions and the possibility of these animals carry the agent under nails and oral cavity. The infection activates an immune and inflammatory response, modulated by purinergic signaling, which involves extracellular purines, purinergic receptors and ectoenzymes. The purines are an important class of extracellular molecules which by interacting with specific receptors on the cell surface signaling pathways that mediate many important biological effects. The signaling induced by these molecules is directly correlated to the activity of enzymes on the surface of the cell membrane, the ectoenzymes. The objective of this study was to evaluate the influence of sporotrichosis in the activity of ectoenzymes in platelets and its thrombus regulatory process. For this study, male Wistar rats were divided into 3 groups, where each group consisted of 10 animals (control, infected with clinical isolate of systemic action of Sporothrix schenckii and infected with clinical isolate of lymphocutaneous action of Sporothrix schenckii). After 28 days, blood was collected and the activity of certain ectoenzymes in platelets as well as the profile of platelet aggregation. The only change was observed in NTPDase activity, with an increase in ATP and ADP hydrolysis in platelets from rats experimentally infected with clinical isolate of lymphocutaneous action of Sporothrix schenckii. This change may be contributing to the reduction of extracellular ADP, which is responsible for the uncontrolled activation of platelets and trigger thrombogenic processes. Thus, it could also be protecting the body against the formation of thrombi and nodular lesions present in sporotrichosis. Then it is suggested that the purinergic system is involved in hemostasis and tromborregulação during infection by Sporothrix schenckii, avoiding excessive platelet aggregation and therefore the formation of thrombus. / A esporotricose é uma micose cosmopolita que tem como agente etiológico o fungo Sporothrix schenckii, que afeta o homem e várias espécies de animais, especialmente, os felinos. A forma linfocutânea da micose é a mais freqüente, já as formas disseminadas, são menos freqüentes e têm sido descritas principalmente entre pacientes imunocomprometidos. O Sporothrix schenckii é introduzido acidentalmente no organismo humano ou animal através de ferimentos causados por espinhos, farpas de madeira ou por qualquer objeto pontiagudo contaminado pelo fungo. Como o felino é um animal doméstico, pode transmitir a esporotricose ao homem, através da arranhadura e/ou mordedura, devido à grande quantidade de leveduras encontradas nas lesões e a possibilidade destes animais carrearem o agente nas unhas e cavidade oral. A infecção ativa uma resposta imune e inflamatória, modulada pela sinalização purinérgica, a qual envolve purinas extracelulares, receptores purinérgicos e ectoenzimas. As purinas representam uma importante classe de moléculas extracelulares, que ao interagirem com receptores específicos na superfície celular, sinalizam vias de grande importância que medeiam diversos efeitos biológicos. A sinalização induzida por estas moléculas correlaciona-se diretamente à atividade de enzimas localizadas na superfície da membrana celular, as ectoenzimas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da esporotricose na atividade de ectoenzimas em plaquetas e seus processos tromborregulatórios. Para este estudo, foram utilizados ratos Wistar machos divididos em 3 grupos (controle, infectado com isolado clínico de ação sistêmica de Sporothrix schenckii e infectado com isolado clínico de ação linfocutânea de Sporothrix schenckii), onde cada grupo foi constituído por 10 animais. Após 28 dias, foi coletado o sangue e determinadas as atividades das ectoenzimas em plaquetas, assim como o perfil de agregação plaquetária. A única alteração observada foi na atividade da NTPDase, com aumento na hidrólise de ATP e ADP nas plaquetas dos ratos experimentalmente infectados com o isolado clínico de ação linfocutânea de S. schenckii. Esta alteração pode estar contribuindo para a redução de ADP extracelular, o qual é responsável pela ativação descontrolada de plaquetas e desencadeamento de processos trombogênicos. Desta forma, poderia também estar protegendo o organismo contra a formação de trombos e lesões nodulares, presentes na esporotricose. Sugere-se então, que o sistema purinérgico está envolvido no processo de hemostasia e tromborregulação durante a infecção por Sporothrix schenckii, evitando a excessiva agregação plaquetária e consequentemente, a formação de trombos.

Sporothrix schenckii, the causative agent of sporotrichosis, is a relatively rare infection. Local infection usually occurs through direct inoculation of the organism through the skin; disseminated disease is rarely seen. This article describes a case of disseminated sporotrichosis in a middle-aged man without the commonly seen risk factors for dissemination.

Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.

A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A Esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica causada pelo fungo Sporothrix schenckii. A transmissão zoonótica pode ocorrer depois de arranhões ou mordidas de animais, principalmente gatos, roedores e tatus. Até o momento, nenhuma vacina esta em uso para esporotricose ou para qualquer infecção fúngica de importância médica, indicando a necessidade de ampliar a investigação neste campo e explorar novas alternativas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da radiação gama em leveduras de S. schenckii, visando a sua atenuação, para aplicação posterior de leveduras radioatenuadas no desenvolvimento de uma vacina destinada a imunização de gatos e cães. As leveduras S. schenckii foram cultivadas em meio sólido BHI (Infuso Cérebro e Coração) suplementados com tiamina e na temperatura de 36oC. As culturas foram irradiadas com doses variando de 1,0 a 9,0 kGy. Após cada dose foram avaliados a capacidade reprodutiva, a viabilidade, e o metabolismo de síntese de proteínas. A avaliação da virulência foi realizada pela inoculação das leveduras irradiadas em camundongos Balb/c imunossuprimidos e posterior recuperação de unidades formadoras de colônias (UFCs). A integridade do DNA, a ocorrência de apoptose e de alterações ultraestruturais também foram analisada nas leveduras radioatenuadas. Os resultados mostraram uma redução de 6 ciclos log10 no número de UFCs recuperadas na dose de 6,0 kGy e a partir de 8,0 kGy não foram recuperadas UFCs. A análise de viabilidade indicou que as leveduras permaneceram viáveis até a dose de 9,0 kGy, a maior dose testada. As leveduras irradiadas mantiveram a capacidade de síntese de proteínas, porém esta foi reduzida significarivamente na dose de 9,0 kGy, quando avaliada 24 horas após a irradiação. Os ensaios de virulência utilizando leveduras irradiadas com as doses de 7,0 e 9,0 kGy mostraram que não houve recuperação de UFCs dos órgãos dos camundongos imunossuprimidos, indicando que as células estavam atenuadas. O ensaio de integridade do DNA mostrou que com 7,0 kGy o DNA das leveduras estava fragmentado. Nesta mesma dose foi verificada uma diferença discreta, mas significativa, na ocorrência de apoptose entre as células irradiadas e controles 24 horas após a irradiação. Através da microscopia eletrônica de transmissão foram verificadas alterações ultra-estruturais nas leveduras irradiadas com 7,0 kGy. Duas horas após a irradiação as principais alterações verificadas foram a vacuolização e a perda de homogeneidade do citoplasma. Após 24 horas, além destas alterações o citoplasma se mostrou retraído e freqüentemente se descolando da parede celular. Nossos resultados indicaram que para as leveduras do S. schenckii, foi possível encontrar uma dose absorvida em que o agente tem comprometida sua capacidade reprodutiva e perde a virulência, mantendo a sua viabilidade, uma condição desejável para o desenvolvimento de uma vacina radioatenuada. / Sporotrichosis is a subacute or chronic infection caused by the fungus Sporothrix schenckii. Zoonotic transmission can occur after scratches or bites of animals, mainly cats, rodents, and armadillos. Up to the moment, no approved vaccine was reported for S. schenckii or to any important pathogenic fungi infection in humans, indicating the need to expand the research in this field and to explore new alternatives. The aim of this study was to evaluate the effects of gamma radiation on the viability, metabolic activity and reproductive ability of S. schenckii yeast cells for further studies on the development of a vaccine for immunization of cats and dogs. The culture of S. schenckii, in solid medium, was irradiated at doses ranging from 1.0 to 9.0 kGy. After each dose the reproductive capacity, viability and protein synthesis were estimated. The results showed that a reduction of 6 log10 cycles in the number of colonies was achieved at 6.0 kGy and after 8.0 kGy no colonies could be recovered. The viability analysis indicated that yeast cells remained viable up to 9.0 kGy. The results of protein synthesis analysis showed that the yeast cells, irradiated up to 9.0 kGy, were able to synthesize proteins. But this ability was significantly reduced with 9.0 kGy, 24 h after irradiation. The virulence assays using yeast irradiated with doses of 7.0 and 9.0 kGy showed no CFUs recovery from tissues of immunosuppressed mice, indicating that the cells were attenuated. The DNA integrity test showed that the DNA of 7.0 kGy irradiated yeast cells was fragmented. At the same dose was verified a discrete but significant increase in the apoptose occurrence in relation to controls 24 hours after the irradiation. By transmission electron microscopy were observed ultrastructural changes in yeast irradiated with 7.0 kGy. Two hours after irradiation the major changes were the vacuolization and the loss of homogeneity of the cytoplasm. After 24 hours, apart from these changes, the cytoplasm was often retracted and sometimes taking off from the cell wall. Our results indicated that for the yeast cells of S. schenckii, it was possible to find an absorbed dose in which the fungus loses the virulence, while maintaining the viability, a desirable condition for the development of a radioattenuated yeast vaccine.

Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. / Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. / FAPESP: 2008/55975-8 / TEDE

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotricosis is an acute or subacute mycotic infection caused by the Sporothrix complex species. The disease was already described in humans and in several animal species, mostly in cats, horses and dogs. Based on several outbreak reports in the literature, the species more predominant in cats of the Southeast and South regions of Brazil is S. brasiliensis. The transmission to humans include the occupational and the zoonotic forms. The presentation form more often seen in cats is multiple skin and mucosal lesions. The diagnostic methods include the isolation and identification of the agente in culture, the histopathology, the cytology, the intradermal sporotrichin test, the immunohistochemistry technique, and the polymerase chain reaction (PCR). The histopathological diagnosis is based on the morphological characteristics of the fungus and the respective inflammatory reaction. The main objectives of this retrospective study were to characterize the histomorphological and histochemical aspects of sporotrichosis in 10 cats, and also to evaluate epidemiological and clinical aspects, and gross findings obtained from the biopsy and necropsy protocols of the archives of the Laboratório de Patologia Veterinária of the Universidade Federal de Santa Maria. The disease affected mostly male mongrel cats, and was mostly observed in the cutaneous disseminated form. Gross lesions were characterized by cutaneous nodules (ulcerated or not) and by ulcerated masses or plaques. By histopathology, there were a relationship between the fungal load and two patterns of inflammatory response. The first pattern was characterized by high fungal load, and most yeasts were inside of numerous macrophages with abundant, many times vacuolated cytoplasm. The amount of neutrophils ranged from mild to moderate in this pattern. The second pattern was characterized by numerous epiteliod cells and many neutrophils. The fungal load was low and most yeasts were observed in the extracellular space. The yeasts were round, oval or cigar-shaped. Several histochemical techniques, such as Grocott s silver stain, periodic Schiff acid, and Alcian blue were utilized and they made it easier to visualize, to characterize the morphology, and to quantify the organisms. The Giemsa stain allowed visualizing the agent, but it not allowed to sharply highlight them from other intralesional components. Organisms were negative for melanin granules through the Fontana-Masson stain in all cases. The histomorphological and histochemical study allowed demonstrating determinant fungal characteristics to the establishment of the diagnosis by means of this diagnostic tool. / Esporotricose é uma infecção fúngica subaguda ou crônica, causada por espécies do complexo Sporothrix. A doença já foi descrita em humanos e em diversas espécies animais, mas ocorre com maior frequência em gatos, cavalos e cães. Baseado em vários relatos de surtos na literatura, a espécie mais predominante em gatos das regiões Sul e Sudeste do Brasil é S. brasiliensis. As formas de transmissão para humanos incluem a ocupacional e a zoonótica. A forma de apresentação mais frequente em gatos é de múltiplas lesões de pele e mucosas. Os métodos de diagnóstico compreendem o isolamento e identificação do agente em cultura, a histopatologia, a citologia, o teste intradérmico da esporotriquina, a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) e a reação em cadeia de polimerase (PCR). O diagnóstico histopatológico é realizado observando-se as características morfológicas do fungo e a respectiva reação inflamatória. Os principais objetivos deste estudo retrospectivo foram caracterizar os aspectos histomorfológicos e histoquímicos da esporotricose em 10 gatos, além de avaliar os aspectos epidemiológicos, clínicos e os achados macroscópicos obtidos dos protocolos de biópsias e necropsias dos arquivos do Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria. A doença afetou predominantemente gatos machos, sem raça definida e na forma cutânea disseminada. As lesões macroscópicas caracterizaram-se como nódulos cutâneos (ulcerados ou não) e como massas e placas ulceradas. Na histopatologia observou-se uma relação entre a quantidade de leveduras observada e dois padrões de resposta inflamatória. O primeiro padrão caracterizou-se por numerosas leveduras encontradas, na sua maioria, no interior de numerosos macrófagos com citoplasma abundante e muitas vezes vacuolizado. A quantidade de neutrófilos variava de leve a moderada e havia infiltrado geralmente leve de linfócitos e plasmócitos. O segundo padrão caracterizava-se por leve quantidade de leveduras observadas geralmente livres no espaço extracelular, numerosas células epitelioides e infiltrado predominantemente acentuado de neutrófilos. As leveduras eram redondas, ovais ou alongadas (em forma de charuto). Foram utilizadas várias técnicas histoquímicas como a impregnação pela prata de Grocott, ácido periódico de Schiff e azul Alciano que facilitaram a visualização, caracterização da morfologia e quantificação dos organismos. A coloração de Giemsa permitiu a visualização do agente, porém não permitiu destacá-los dos debris celulares. Os organismos foram negativos para grânulos de melanina pela coloração de Fontana-Masson em todos os casos. O estudo histomorfológico e histoquímico permitiu demonstrar características fúngicas determinantes para o estabelecimento do diagnóstico de esporotricose através dessa ferramenta diagnóstica.