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Participação do receptor "toll-like"4 na resposta imune durante a esporotricose ecperimental /Sassá, Micheli Fernanda. January 2008 (has links)
Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Maria Terezinha Serrão Peraçoli / Banca: Cleni Maria Marzocchi Machado / Banca: Luciana Simon Pereira Crott / Banca: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Resumo: Os receptores "toll-like" (TLR) são importantes no reconhecimento de patógenos por um hospedeiro e conseqüentemente para a ativação da resposta imune inata. Evidências clínicas e experimentais mostram que defeitos nesses receptores ou em suas vias de sinalização deixam o hospedeiro suscetível a vários tipos de infecção. Já foi demonstrado que o TLR2 e o TLR4 estão envolvidos no reconhecimento de vários fungos, como Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus e Saccharomyces cerevisiae, entretanto não há informações disponíveis sobre a participação dos TLRs no reconhecimento do Sporothrix schenckii. O S. schenckii é um fungo termodimórfico causador da esporotricose, uma infecção micótica caracterizada pelo comprometimento da pele e tecidos subcutâneos; em algumas ocasiões, como em pacientes imunocomprometidos, pode induzir lesões em órgãos. Os mecanismos de defesa, principalmente a imunidade mediada por células, são importantes na resistência à infecção. O objetivo deste trabalho foi verificar o papel do TLR4 na resposta dos macrófagos ao S. schenckii, empregando camundongos defectivos na expressão de TLR4 (C3H/HeJ) e camundongos controle (C3H/HePas), através da avaliação de mediadores imunológicos produzidos pelas células peritoneais dos camundongos, da expressão de proteínas acessórias ao TLR4 e da avaliação da apoptose destas células durante dez semanas. A produção dos intermediários reativos do oxigênio, determinada através da técnica de redução do vermelho de fenol, revelou que os camundongos defectivos na expressão do TLR4 produziram menores concentrações de H2O2 que os camundongos TLR4 normais. Nestes, as maiores concentrações de H2O2 foram induzidas pela presença do extrato lipídico da fase miceliar do S. schenckii. No entanto, a produção de óxido nítrico (NO) e das citocinas ocorreu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Toll-like receptors (TLR) are important to pathogen recognition by a host and to the subsequent triggering of an innate immune response. Experimental and clinical evidence show that defects in TLR or in signaling pathways downstream from these receptors render hosts susceptible to various types of infection. TLR2 and TLR4 are involved in recognition of several fungi, such as Candida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus and Saccharomyces cerevisiae. However, no information is available about TLR recognition of Sporothrix schenckii. S. schenckii is a thermally dimorphic fungus, the causative agent of sporotrichosis, a mycotic infection characterized by frequent involvement of the skin and subcutaneous tissues; occasionally, it may also produce lesions of the internal organs mostly reported among immunocompromised hosts. Immune defense mechanisms, particularly cellmediated immunity have been reported to be important in infection resistance. The aim of this study was to assess the role of TLR4 in the response of macrophages to S. schenckii, using TLR4-deficient mice (C3H/HeJ) and control mice (C3H/HePas), evaluating immunological mediators produced by exudate peritoneal cells, TLR4 accessory protein expression, and apoptosis of these cells over a period of ten weeks. Reactive oxygen intermediates production was determined through phenol red oxidation method and has revealed that TLR4-defective mice produced lower levels of H2O2 than TLR4 normal mice. In these animals, higher H2O2 concentrations were seen when lipid extract obtained from S. schenckii mycelium was used. However, nitric oxide (NO) and cytokine production occurred in higher levels when cells were challenged with lipid extract from S. schenckii yeast cells, which is the morphotype found in the host during infection. NO and cytokines such as IL-1, TNF- and IL-10 production in culture supernatants were also lower... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Construção e expressão de anticorpo humanizado a partirdo anticorpo monoclonal contra proteína de 70 kDa de Sporotrix schenckii (P6E7) / Construction and expression of humanized antibody from the monoclonal antibody against the protein of 70 kDa Sporotrix schenckii (P6E7)Karla Letícia Santiago 06 September 2013 (has links)
Sporothrix shenckii é o agente etiológico da esporotricose, micose de carater crônico e de ampla distribuição mundial. No Brasil, vem crescendo o número de casos da doença, bem como a incidência de formas clínicas graves ou atípicas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um anticorpo monoclonal contra o componente antigênico proteíco de 70 kDa, secretado pelas células leveduriformes de S. schenckii, denominado anticorpo monoclonal (AcMo) P6E7. Este AcMo apresentou atividade profilática e terapêutica na esporotricose experimental, no entanto, este anticorpo possui origem murina, o que pode gerar uma resposta imunogênica quando administrado em humanos, impossibilitando sua utilização por tempo prolongado. Visando sua possível utilização no tratamento da esporotricose humana, a nossa proposta foi a humanização do AcMo P6E7 na forma de FvFc (Fv-linker- Fc) através de engenharia genética. Inicialmente construimos duas versões uma humanizada e outra quimérica do AcMo contra a fração de 70 kDa do antigeno de S. schenckii. Os anticorpos foram expressos em vetores de expressão dicistrônicos e produzidos com eficiência e estabilidade estrutural em células de mamíferos da linhagem CHO. Posteriormente, esses anticorpos foram purificados por cromatografia de afinidade e analisados quanto a sua capacidade de ligação ao fungo e função efetora. Verificamos que os FvFcs construídos foram capazes de se ligar a porção de 70 kDa do antígeno de S. schenckii. Através de ensaios de fagocitose, constatamos que os fragmentos FvFc do P6E7 humanizado e quimérico foram capazes de opsonizar as leveduras de S. schenckii aumentando, assim, o índice fagocítico em macrófagos humanos. Esses dados em conjunto, sugerem a possível utilização do anticorpo construído no tratamento da esporotricose humana. / Sporothrix shenckii is the etiological agent of sporotrichosis, a chronical fungal infection that shows a worldwide distribution. In Brazil, there is a growing number of cases of sporotrichosis, as well as the incidence of severe or atypical clinical forms. Our research group developed a monoclonal antibody (mAb) against the fungal antigenic component a protein of 70 kDa, secreted by S. schenckii yeasts called P6E7. This mAb showed prophylactic and therapeutic activity in experimental sporotrichosis, however, this antibody has murine origin, which can generate an immune response when administered to humans, precluding their use for prolonged time. For its possible use in the treatment of human sporotrichosis, our proposal is the humanization of mAb P6E7 through genetic engineering. Initially, we built two versions of the original antibody: an humanized version and a chimeric antibody both against the 70 kDa fraction from S. schenckii antigen. The antibodies were expressed in dicistronic expression vectors and were efficiently produced in mammalian cells CHO strain, showing good structural stability. Subsequently, these antibodies were purified by affinity chromatography and assayed for their binding ability to the fungus and effector function. We found that the built os FvFcs (Fv-linker- Fc) fragments were capable of binding to the 70 kDa portion of S.schenckii antigen. Through phagocytosis assays, we found that the FvFc fragments from the humanized and chimeric P6E7 were able to opsonize S. schenckii yeasts, thus increasing the phagocytic index in human macrophages. Together, These data suggest the potential use of the antibodies constructed in the treatment of human sporotrichosis.
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Avaliação da virulência e da resposta imune de diferentes espécies de Sporothrix sp. na esporotricose experimental / Immune response and virulence evaluation from different species of Sporothrix sp. in experimental sporotrichosisJosé Roberto Fogaça de Almeida 27 November 2013 (has links)
Esporotricose é uma micose subcutânea, causada principalmente pelo fungo Sporothrix schenckii e a nova espécie Sporothrix brasiliensis. Foi relatado na literatura que os camundongos infectados com a cepa de S. schenckii M-64 produziu uma resposta imune mista, em que o soro dos camundongos infectados reagiram apenas com uma glicoproteína de 70 kDa (gp70), identificada como importante fator de virulência. Assim o presente trabalho visa avaliar a importância à virulência e eficácia do anticorpo monoclonal P6E7 em outras cepas do complexo Sporothrix. Camundongos foram infectados com as cepas de S. schenckii (1099-18 e 15383) e S. brasiliensis (5110 e 17943). Cada 7 dias, o baço e fígado foram retirados para a análise do UFC e citocinas. Foi realizado western blot com o soro dos camundongos infectados e com anticorpo monoclonal P6E7 utilizando o exoantígenos das diferentes cepas. Foi realizado protocolo de tratamento com o anticorpo P6E7 nos camundongos infectados, para a avaliação da carga fúngica no baço e no fígado. Análise de citocinas mostrou que as cepas de S. schenckii induziram uma resposta mista Th1/Th2, entretanto nos camundongos infectados com as cepas de S. brasiliensis, não foi observada produção significativa de citocinas. No western blot realizado com exoantígenos das cepas de Sporothrix sp. foi observado diferentes componentes antigênicos, quando o soro de camundongos infectados foi utilizado, porém a reação com anticorpo monoclonal contra a gp70 demonstrou que a gp70 estava presente apenas no exoantígeno da cepa mais virulenta 5110. Infecção realizada com todas as cepas demonstrou cronicidade pela análise UFC. O tratamento com o AcMo P6E7 foi eficaz no tratamento da esporotricose experimental, sendo capaz de diminuir a carga fúngica, principalmente no baço dos camundongos infectados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis, caused mainly by fungi Sporothrix schenckii and the new specie Sporothrix brasiliensis. Was reported in previous studies that mice infected with low virulent S. schenckii M-64 strain, produced a mixed immune response, where the infected mice serum reacted only with a 70 kDa glycoprotein (gp70), identified as important virulence factor. Thus, the present study aims to evaluate the virulence importance and effectiveness of monoclonal antibody P6E7 in other Sporothrix complex strains. Mice were infected with Sporothrix yeast strain of S. schenckii (1099-18 and 15383) and S. brasiliensis (5110 and 17943). Each 7 days, the spleen and liver were taken for CFU and cytokines analysis. The western blot was performed with the serum obtained from infected mice and a monoclonal antibody P6E7 using exoantigens from different strains. Was performed treatment protocol with the monoclonal antibody P6E7 on infected mice, for spleen and liver fungal burden evaluation. Cytokine analysis showed that S. schenckii strains induce a mixed Th1/Th2 response, however in the S. brasiliensis strains wasn\'t observed significant cytokine production. In western blot accomplished with the strains exoantigens was observed different antigenic components when the infected mice serum was used, however with monoclonal antibody against gp70 demonstrated that gp70 was present only in most virulent strain 5110. Infection performed with all strains demonstrated chronicity for CFU analysis. Treatment with Mab P6E7 was effective in experimental sporotrichosis, with reducing capable of fungal load, mainly in the spleen of infected mice.
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Sporothrix brasiliensis: aspectos imunológicos e virulência / Sporothrix brasiliensis: immunological aspects and virulence.Luana Rossato 08 December 2017 (has links)
A esporotricose caracteriza-se como uma micose subcutânea causada por fungos dimórficos do gênero Sporothrix, capazes de acometer o homem e uma grande variedade de animais, dentre eles os felinos. A princípio, Sporothrix schenckii era a única espécie conhecida como responsável pela esporotricose. Após estudos genotípicos e fenotípicos de isolados ambientais, clínicos humanos e animais, verificou-se alta variabilidade entre os isolados e estabeleceu-se a existência de um Complexo Sporothrix. Dentro deste, a maior causadora de surtos epidêmicos, justificada por uma maior virulência e capacidade de evasão da resposta imune, é a espécie Sporothrix brasiliensis. Nesse sentido, dada a ausência de estudos direcionados a está espécie, objetivou-se avaliar a importância de receptores Toll like-2 (TLR-2) e Toll like-4 (TLR-4) na infecção por S. brasiliensis. Além disso, utilizando técnicas de proteômica, procurou-se elucidar proteínas diferencialmente expressas em S. brasiliensis quando comparado à espécie S. schenckii. Para avaliação da resposta imune utilizaram-se modelos in vitro e in vivo de infecção, e para a investigação das proteínas diferencialmente expressas, utilizou-se a técnica de proteômica Bottom-up. A investigação da resposta imune in vitro mostrou a dependência dos receptores TLR-2 e TLR-4 no desencadeamento da resposta imune. Os ensaios in vivo mostraram a importância desses receptores no controle da infecção e dependência dos mesmos na produção de citocinas, principalmente nos primeiros 14 dias de infecção. Na ausência do receptor TLR-2, houve a polarização de resposta Th17 na tentativa de controle da infecção. Quando avaliadas as diferenças entre as espécies S. brasiliensis e S. schenckii, em termos de proteínas expressas, verificou-se que S. brasiliensis expressa diferencialmente 60 proteínas. Dentre essas, 9 são relatadas na literatura, como importantes na virulência e escape imunológico dos principais fungos de importância médica. Os resultados encontrados no presente trabalho permitem concluir que reconhecimento de S. brasiliensis é dependente dos receptores TLR-2 e TLR-4. Estudos que investiguem a utilização de outras vias de sinalização como mecanismos compensatórios, bem como, o sinergismo desses receptores no contexto da infecção por S. brasiliensis são fundamentais na compreensão da fisiopatologia dessa doença. No que tange a caracterização proteica, estudos com mutantes para cada uma das proteínas descritas nesse trabalho devem ser avaliados. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by dimorphic fungi of the genus Sporothrix that affects humans and animals, predominantelly felines. Inicially, Sporothrix schenckii was the only specie associated to sporotrichosis. However, after genotypic and phenotypic studies of human and animal clinical isolates, a high variability among the isolates was found and was concluded the existence of a complex: the Sporothrix Complex. Inside the Sporothrix complex, the major cause of epidemic outbreaks, justified by a greater virulence and ability to evade the immune system, is Sporothrix brasiliensis. Concerning this, the absence of studies directed to this specific specie, the aim was to evaluate the importance of Toll like receptor-2 (TLR-2) and Toll like receptor-4 (TLR-4) during S. brasiliensis infection. In addition, was look using proteomics techniques, the proteins differentially expressed in S. brasiliensis when compared to S. schenckii. To evaluate the immune response, in vitro and in vivo tecniques were used, and for the investigation of differentially expressed proteins, the Bottom-up proteomics technique was used. The investigation of the in vitro immune response showed the dependence of TLR-2 and TLR-4 receptors on phagocytosis and the production of inflammatory mediators, such as cytokines and NO. In vivo assays showed the importance of these receptors to control the infection and their dependence on cytokine production during the first 14 days of infection. In the absence of the TLR-2 receptor, the Th17 response was polarized in an attempt to control the infection. Evaluating the differences between S. brasiliensis and S. schenckii, in terms of expressed proteins, it was verified that S. brasiliensis differentially expressed 60 proteins. Among these, 9 are reported in the literature, as important in the virulence and immune evasion among the most important medical fungi. The results found in the present study allow to conclude that S. brasiliensis recognition is dependent on TLR-2 and TLR-4 receptors. Studies investigating the use of other signaling pathways as compensatory mechanisms, as well as the synergism of these receptors in the context of S. brasiliensis infection, are fundamental to understand the pathophysiology of this disease. Regarding the protein characterization, studies with mutants for each of the proteins described in this work should be evaluated.
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Eficácia de extratos vegetais na desinfecção de superfícies contaminadas com fungos do complexo Sporothrix / Eficácia de extratos vegetais na desinfecção de superfícies contaminadas com fungos do complexo SporothrixMATOS, Caroline Bohnen de 12 February 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-02-12 / Sporotrichosis is the main domestic feline ringworm, highly relevant because it is a zoonosis involving six fungal species belonging to the Sporothrix complex. The fungal isolation of home and veterinary environments has been proven, proving to be an important source of infection for animals and humans. The search for alternative to disinfectants commonly used products is increasing, mainly by continuing reports of resistance by microorganisms. The Origanum vulgare and Rosmarinus officinalis stand out because they have proven antimicrobial activity. Given the above, the objective of the study was to evaluate the efficacy of disinfectants and plant extracts in eliminating the fungus Sporothrix complex, and report a case of multifactorial dermatitis in a dog. For this, in vitro tests were performed using the technique of direct exposure to evaluate the action of the tincture, aqueous extract and alcoholic extract of O. vulgare and R. officinalis against clinical isolates of dogs and cats with sporotrichosis. Subsequently, the plant extracts that showed better results in the direct exposure test were evaluated for the elimination of Sporothrix spp different contaminated surfaces, also using different disinfectants. As an experimental model surfaces of stainless steel, formica and ceramic tile floors, tested in quadruplicate using the technique of spray-wipe-spray were used. According to the study, the hydroalcoholic extract and tincture of O. vulgare and R. officinalis were effective in eliminating the fungus Sporothrix complex, with no difference from the area used, including showing better results when compared to commercial products used. / A esporotricose é a principal micose dos felinos domésticos, apresentando grande importância por tratar-se de uma zoonose envolvendo seis espécies fúngicas pertencem ao complexo Sporothrix. O isolamento fúngico de ambientes domiciliares e veterinários já foi comprovado, revelando-se uma importante fonte de infecção para animais e humanos. A busca de produtos alternativos aos desinfetantes utilizados normalmente é crescente, principalmente pelos constantes relatos de resistência por parte dos microrganismos. O Origanum vulgare e o Rosmarinus officinalis destacam-se por apresentarem atividade antimicrobiana comprovada. Diante do exposto, o objetivo do estudo foi avaliar a eficácia de desinfetantes e de extratos vegetais na eliminação de fungos do complexo Sporothrix, e relatar um caso clínico de dermatite multifatorial em um canino. Para isso, testes in vitro foram realizados através da técnica de exposição direta para avaliar a ação da tintura, do extrato aquoso e do extrato hidroalcoólico de O. vulgare e R. officinalis frente a isolados clínicos de cães e gatos com esporotricose. Posteriormente, os extratos vegetais que demonstraram melhores resultados no teste de exposição direta foram avaliados em relação a eliminação do Sporothrix spp de diferentes superfícies contaminadas, utilizando também diferentes desinfetantes. Como modelo experimental foram utilizadas superfícies de aço inoxidável, fórmica e piso cerâmico, testadas em quadruplicata através da técnica de spray-wipe-spray. De acordo com o estudo, o extrato hidroalcoolico e a tintura de O. vulgare e R. officinalis foram eficazes na eliminação de fungos do complexo Sporothrix, não havendo diferença em relação a superfície utilizada, inclusive apresentando melhores resultados quando comparado aos produtos comerciais utilizados.
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Avaliação da capacidade imunogênica de células leveduriformes de Sporothrix schenckii inativadas em modelo murino / Evaluation of the immunogenic capacity of yeast cells of Sporothrix schenckii inactivated in a murine modelAntunes, Tatiana de ávila 10 March 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-03-10 / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis of zoonotic character, cosmopolitan
development subacute or chronic whose agent the dimorphic fungus Sporothrix
schenckii affecting man and various species of animals, especially the domestic cat,
being considered of interest to Public Healt. Considering the difficulties in the
therapeutic treatment of ringworm in this animal species, including toxicity and
the development of resistance to antifungal agents traditionally used to treat
disease the study aimed evaluate the immunogenic capacity of yeast cells of S.
schenckii inactivated both in immunoprophylaxis and immunotherapy of
sporotrichosis. We used 160 Wistar albin rats (Rattus norvegicus) at 70 days
(80 in immunoprophylaxis and 80 in immunotheraphy) were divided into four
groups that were immunized three times every 15 days. The groups were
divided as follows: G1 (control, mineral oil), G2 (Ag + incomplete freund
adjuvant), G3 (Ag + Freund's complete adjuvant) and G4 (Ag + incomplete
freund adjuvant + propolis). Preparation of the vaccine used was an isolate of
S. schenckii from yeast in the form of a case of cutaneous sporotrichosis of
domestic cat. The fungus was grown in medium liquid (Brain-Heart broth),
incubated for 10 days at 370C and kept under constant agitation to obtain the
yeast form. The culture was filtered through a double layer of sterile gauze,
centrifuged, washed twice with buffered saline (PBS), homogenized and
standardized in 108 cells of S. schenckii / ml. The cells were inactivated with
0.02% thimerosal and then emulsified with mineral oil, and vaccines packaged
in sterilized sealed and kept at a temperature of 40C throughout the
experimental period. Was used a dose of 0.1 ml/animal intramuscularly. Rats
that received the vaccine as immunoprophylaxis after the three doses were
challenged, and inoculated subcutaneously with 2X103 cells / ml of S. schenckii
in the right footpad and evaluated for 10 days. Animals treated with
immunotherapy were inoculated with the agent after 14 days and received three doses of immunogen. After the experimental period all were euthanized
and necropsy to mycological examination, histopathology and counting colony
forming units. The results were: immunoprophylaxis in the pathological
changes showed statistically significant differences (P <0.05) in the vaccinated
groups (G2, G3 and G4) compared to the control group (G1) to the point of
inoculation, with no statistical difference the evaluation of internal organs.
Immunotherapy clinical evaluation at the injection showed that there was no
statistical difference among the four experimental groups, but at the end of the
experiment the groups G1, G2, G3 and G4 had respectively 8.3%, 58.3%, 41.7
% and 50% of injuries in the process of regression and healing. In relation to
injuries in other body areas only in the last week of the experiment, the G2 and
G3 differ statistically (P <0.05) in the control group (G1). Pathological changes
were found in the internal organs of the four experimental groups, but with a
greater number of lesions in group CONT. Both in immunoprophylaxis and
immunotherapy the retroisolation of the agent and count of colony forming units
showed that there was growth of S. schenckii in the four experimental groups,
but with less frequency and quantification of CFU at the point of inoculation
and internal organs of the groups G2, G3 and G4. In histopathologic
evaluation to determine the presence of granulomas and pyogranulomas focal
and multifocal in the point of inoculation and internal organs of the four groups,
but the animals that received immunoprophylactic changes were more
restricted to the point of inoculation. The results indicate that the three vaccine
formulations (AIF ACF and AIFP) used as immunoprophylactic and
immunotherapy have not been effective for the remission of the lesions of
experimental cutaneous sporotrichosis. / Esporotricose é uma micose subcutânea de caráter zoonótico, cosmopolita de
evolução subaguda ou crônica que tem como agente etiológico o fungo dimórfico
Sporothrix schenckii afetando o homem e várias espécies de animais, principalmente
o felino doméstico, sendo considerada de interesse para a Saúde Pública.
Considerando as dificuldades terapêuticas no tratamento da micose nessa espécie
animal, incluindo toxicidade e o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos
tradicionalmente utilizados na terapia da enfermidade o estudo objetivou avaliar a
capacidade imunogênica de células leveduriformes de S. schenckii inativadas tanto
na imunoprofilaxia como na imunoterapia da esporotricose. Foram utilizados 160
ratos albinos wistar (Rattus norvergicus) com 70 dias (80 na imunoprofilaxia e 80 na
imunoterapia) sendo divididos em quatro grupos que receberam três doses do
imunógeno a cada 14 dias. Os grupos foram divididos em: G1 (controle- óleo
mineral), G2 (Ag+ adjuvante incompleto de freund), G3 (Ag + adjuvante completo de
freund) e G4 (Ag + adjuvante incompleto de freund + própolis). Para preparação da
vacina foi utilizado um isolado de S. schenckii na forma leveduriforme proveniente de
um caso de esporotricose cutânea de felino doméstico. O fungo foi cultivado em
meio líquido (Brain-Heart broth), incubado durante 10 dias a 37oC e mantido sob
agitação constante para obtenção da forma leveduriforme. A cultura foi filtrada em
dupla camada de gaze estéril, centrifugada, lavada duas vezes com solução salina
tamponada (PBS), homogeneizada e padronizada em 108 células de S. schenckii/
ml. As células foram inativadas com thimerosal a 0,02% e posteriormente
emulsificadas com óleo mineral, sendo as vacinas acondicionadas em frascos
estéreis fechados e mantidas a temperatura de 40C durante todo o período
experimental. Foi utilizada uma dose de 0,1 ml/animal por via intramuscular. Os ratos
que receberem a vacina como imunoprofilaxia após as três doses foram desafiados,
sendo inoculados por via subcutânea com 2X103 células/ml de S. schenckii e
avaliados durante 10 dias. Os animais tratados com imunoterápico foram inoculados
com o agente e após 14 dias receberam três doses do imunógeno. Após o período
experimental todos foram eutanasiados e feita necropsia para realização de análise
micológica, histopatológica e contagem das Unidades Formadoras de Colônias.
Os resultados obtidos foram: na imunoprofilaxia as alterações anatomopatológicas
demonstraram diferença estatísticamente significativa (P<0,05) dos grupos
vacinados (G2, G3 e G4) quando comparados ao grupo controle (G1) em relação ao
ponto de inoculação, não havendo diferença estatística na avaliação dos órgãos
internos. Na imunoterapia a avaliação clínica no ponto de inoculação evidenciou que
não houve diferença estatística entre os quatro grupos experimentais, porém ao final
do experimento os grupos G1, G2, G3 e G4 apresentavam respectivamente 8,3%,
58,3%, 41,7% e 50% das lesões em processo de regressão e cicatrização. Em
relação a lesões em outras áreas corpóreas somente na última semana do
experimento os grupos G2 e G3 diferiram estatisticamente (P<0,05) do grupo
controle (G1). Alterações anatomopatológicas foram encontradas nos órgãos
internos dos quatro grupos experimentais, porém com um maior numero de lesões
nos animais do grupo CONT. Tanto na imunoprofilaxia quanto na imunoterapia o
retroisolamento do agente e Contagem das Unidades Formadoras de colônias
demonstraram que houve crescimento do S. schenckii nos quatro grupos
experimentais, porém com menor freqüência e quantificação de UFCs no ponto de
inoculação e órgãos internos dos grupos G2, G3 e G4. Na avaliação histopatológica
foi verificada a presença de granulomas e piogranulomas focais e multifocais no
ponto de inoculação e órgãos internos dos quatro grupos, porém os animais que
receberam imunoprofilático as alterações ficaram mais restritas ao ponto de
inoculação. Os resultados permitem concluir que as três formulações de vacinas
(AIF, ACF e AIFP) utilizadas como imunoprofilático e imunoterápico não foram
eficazes para a remissão completa das lesões de esporotricose cutânea
experimental.
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Avaliação fitoquímica, potencial antifúngico, antioxidante e citotóxico de Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum (Myrtaceae)Lazzarini, Jordana de Abreu 30 July 2015 (has links)
Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-01-15T16:50:22Z
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Previous issue date: 2015-07-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho buscou caracterizar fitoquimicamente, avaliar o potencial
antifúngico frente às principais linhagens causadoras de esporotricose no Brasil; a
atividade antioxidante e a citotoxicidade preliminar dos óleos essenciais adquirido
comercialmente (OCM) e obtido por extração no laboratório de Farmacognosia da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (OEX) e do extrato
hidroetanólico 95% (v/v), obtidos a partir das folhas de Pimenta pseudocaryophyllus
(Gomes) Landrum (Myrtaceae). O screening fitoquímico realizado com o extrato
hidroetanólico resultou na identificação de flavonoides, taninos e proantocianidinas.
A quantificação destes metabólitos secundários na droga vegetal, por
espectrofotometria UV-VIS, resultou em 18,77% de constituintes fenólicos totais,
10,69% de taninos e 0,52% de flavonoides. O perfil cromatográfico obtido por CGEM
do OEX indicou elevados teores de monoterpenos (48,83%) e fenilpropanoides
(39,08%), tendo como constituinte majoritário o eugenol (34,38%). O OCM
apresentou elevados teores de sesquiterpenos (25,64%) e fenilpropanoides
(70,05%), e também apresentou o eugenol como constituinte majoritário (66,93%).
Extrato e frações apresentaram notável atividade antioxidante pelo método de
redução do DPPH, sugere-se que a mesma seja atribuída aos altos teores de
compostos fenólicos, flavonoides e taninos encontrados. Promissores resultados de
atividade antioxidante foram encontrados para os OEX e OCM, os quais possuem
como constituinte majoritário o eugenol. Para a avaliação da atividade antifúngica
foram utilizadas as seguintes linhagens fúngicas: Sporothrix schenckii ATCC 1099-
18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 e
Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 e duas linhagens clínicas de Sporothrix
schenckii, denominadas genericamente como A e B. O OEX apresentou atividade
antifúngica frente a todas as linhagens em concentrações que variaram de 260,46 a
520,90 μg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em
concentrações acima de 520,90 μg/mL. O OCM foi capaz de inibir todas as
linhagens em concentrações que variaram de 65,52 a 260,10 μg/mL. Foi observada
atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 262,10
μg/mL. O eugenol apresentou atividade antifúngica frente a todas as linhagens em
concentrações que variaram de 34,36 a 137,48 μg/mL. Foi observada atividade
fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 137,48 μg/mL. Ao
ajustar os resultados de atividade antifúngica a 100% do constituinte majoritário
eugenol, verificou-se a existência de sinergismo entre os constituintes do OEX, que
apresentou maior atividade antifúngica (CIM=89,54 μg/mL) do que o eugenol
(CIM=136,11 μg/mL) para quatro das seis linhagens estudadas. Foi observado que
somente duas das linhagens estudadas apresentaram susceptibilidade à anfotericina
b e três linhagens foram consideradas resistentes ao cetononazol com valores de
CIM de 4,0 μg/mL. Em relação ao itraconazol, todas as linhagens estudadas foram
consideradas resistentes, com valores de CIM>128 μg/mL. Estes resultados
sugerem indícios de resistência fúngica das linhagens estudadas em relação aos
fármacos de referência empregados no tratamento da esporotricose. As
eletromicrografias das linhagens fúngicas revelaram que, tanto nos fungos expostos
aos tratamentos experimentais, quanto naqueles expostos aos fármacos de
referência, pode-se observar deformidades na estrutura fúngica quando comparadas
ao grupo não tratado. Em relação aos ensaios de citotoxicidade realizados com
fibroblasto murino (L929) pelo método de redução do MTT, o extrato não apresentou
citotoxicidade nas concentrações avaliadas (10 a 100 μg/mL), o eugenol não
apresentou citotoxicidade em concentrações menores ou igual a 125 μg/mL, o OCM
não foi tóxico em concentrações menores ou igual a 250 μg/mL. Já em relação ao
OEX concentrações inferiores ou igual a 62,5 μg/mL não apresentaram
citotoxicidade. / The purpose of this work is to carry out the phytochemical study, evaluate the
potential antifungal against the major strains causing sporotrichosis in Brazil, the
antioxidant activity and the preliminary cytotoxicity of essential oils obtained
commercially (CMO) and obtained by extraction in Pharmacognosy Laboratory of
Pharmacy Faculty of the Federal University of Juiz de Fora (OEX) and
hydroethanolic extract 95% (v/v), obtained from the leaves of Pimenta
pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum (Myrtaceae). The phytochemical screening
performed with the hydroethanolic extract resulted in the identification of flavonoids,
tannins and proanthocyanidins. The quantification of these secondary metabolites in
plant drug, by UV-VIS revealed the presence of phenolic constituents (18.77%),
tannins (10.69%) and flavonoids (0.52%). The chromatographic profile obtained by
GC-MS indicated the OEX high levels of monoterpenes (48.83%) and
phenylpropanoids (39.08%) having as a major constituent eugenol (34.38%). The
OCM had high levels of sesquiterpenes (25.64%) and phenylpropanoids (70.05%),
with as major constituent eugenol (66.93%). Extract and fractions showed notable
antioxidant activity by reduction of DPPH method, it is suggested that it be attributed
to the high concentration of phenolic compounds, flavonoids and tannins found.
Promising results of antioxidant activity were found for the OEX and OCM, which
have as major constituent eugenol. For evaluating the antifungal activity the following
fungal strains were used: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii
IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 and Sporothrix brasiliensis IPEC
17943 and two clinical strains, known generically as A and B. The OEX showed
activity antifungal against all strains at concentrations ranging from 260.46 to 520.90
μg/mL. It was observed fungicidal activity against all strains at concentrations above
520.90 μg/mL. The OCM was able to inhibit all strains at concentrations ranging from
65.52 to 260.10 μg/mL. It was observed fungicidal activity against all strains at
concentrations above 262.10 μg/mL. The eugenol showed antifungal activity against
all strains at concentrations ranging from 34.36 to 137.48 μg/mL. It was observed
fungicidal activity against all strains at concentrations above 137.48 μg/mL. By
adjusting the results of antifungal activity to 100% of major constituent eugenol, it
was found that there is synergy between the constituents of the OEX, with the
highest antifungal activity (MIC = 89.54 μg/mL) than eugenol (MIC = 136.11 μg/mL)
for four of the six strains studied. It was noted that only two of the studied strains
were susceptible to amphotericin B and three strains were considered resistant
cetononazol with MIC values of 4.0 μg/mL. Compared to itraconazole, all the strains
studied were considered resistant with MIC values> 128 μg/mL. The micrographs
revealed that the fungal strains in both fungi exposed to the experimental treatments,
as those exposed to the reference drug, one can observe fungal deformities in
structure when compared to the untreated group. In relation to the cytotoxicity assays
performed with murine fibroblasts (L929) by the MTT reduction method, the extract
showed no cytotoxicity at concentrations tested (10 to 100 μg/mL), eugenol showed
no cytotoxicity at concentrations less than or equal to 125 μg/mL, OCM was not toxic
at concentrations less than or equal to 250 μg/mL. In relation to the OEX
concentrations below or equal to 62.5 μg/mL showed no toxicity.
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La chromoblastomycose et la sporotrichose à Madagascar : actualités épidémiologiques, cliniques et diagnostiques / Chromoblastomycosis and sporotrichosis in Madagascar : epidemiological, clinical and diagnostic updatesRasamoelina, Tahinamandranto 29 October 2018 (has links)
La chromoblastomycose (CBM) et la sporotrichose (SPT) sont des infections fongiques chroniques des tissus sous-cutanés. Elles touchent surtout les membres, après blessure végétale ou souillure tellurique. Les principaux agents fongiques responsables de CBM appartiennent aux genres Fonsecaea et Cladophialophora tandis que Sporothrix est à l’origine de la SPT. A Madagascar, les études menées entre 1955 et 1994 ont montré une prévalence de la CMB à 0,5/100 000 habitants faisant considérer ce pays comme le premier foyer mondial. Depuis, aucune donnée n’a permis d’actualiser ces observations. Malgré les nombreux cas de SPT observés par les médecins, son épidémiologie à Madagascar n’a jamais été décrite.L'objectif général était d'évaluer l’incidence actuelle de ces mycoses à Madagascar. Les objectifs spécifiques étaient de caractériser les espèces fongiques responsables et de mettre en place un réseau clinico-biologique pérenne permettant une gestion adaptée des patients et l’utilisation de méthodes moléculaires pour l’identification des souches.Une étude prospective conduite entre mars 2013 et juin 2017 a donné lieu à des consultations dans les régions ou dans le service de dermatologie de l’hôpital universitaire d’Antananarivo et a permis d’inclure des patients présentant des lésions sous-cutanées chroniques. Les méthodes conventionnelles de diagnostic mycologique ont été complétées par des méthodes moléculaires (PCR, séquençage, MALDI-TOF-MS). Les cas ont été classés au cours de réunions de concertation clinico-biologique.Au total, 148 patients d’âge moyen de 41 ans avec une prédominance d’hommes (75,0%) ont été inclus : 63 cas de SPT (42,5%) et 50 cas de CBM (33,8%) ont été confirmés. L’incidence annuelle de le CBM a été estimée à 0,38/100 000 habitants dans la région Sava au Nord où les cas prédominent avec au niveau du district Anosibe An’Ala (à l’Est) une incidence maximale de 1,12/100 000. Alors que la CBM était prédominante dans le Nord-Est, l'Est et le Sud de l'île, étonnamment, la SPT était presque exclusivement localisée sur les hautes terres centrales. L’incidence globale moyenne de SPT était de 0,17/100 000 habitants dans les hauts plateaux et de 0,07/100 000 pour l’ensemble de Madagascar. Pour la SPT, le risque est plus élevé chez les jeunes (< 18 ans) et les formes cutanéo-lymphatiques des membres supérieurs sont les plus fréquentes. Pour la CBM, le risque de contamination est élevé chez les agriculteurs et les professions de services et la majorité des lésions (82,9%) était localisée au niveau des membres inférieurs. Sur le plan mycologique, 63 Sporothrix schenckii, 7 Cladophialophora carrionii, 29 Fonsecaea sp dont 22 F. nubica ont été identifiés. Pour le genre Fonseceae, l’identification de l’espèce nubica remplace l‘espèce pedrosoi initialement proposée pour les isolats malgaches et souligne l’importance de l’identification moléculaire pour une classification précise des espèces.Cette première étude sur la SPT humaine à Madagascar a permis d’actualiser les données épidémiologiques mondiales et de classer Madagascar avec un niveau endémique modéré alors qu’il était considéré comme faible jusque-là. La CBM persiste à une incidence élevée et comparable à celle décrite jusqu’en 1994, illustrant l’absence de contrôle de cette mycose dans le pays. La constitution d’un réseau clinico-biologique local stable et les nouveaux outils diagnostics mis en place dans ce travail (PCR et le MALDI-TOF MS), vont faciliter la conduite de programmes de surveillance et de contrôle alors que l’OMS a récemment classé la CBM en maladie tropicale négligée. Une enquête environnementale est en cours pour détecter les sources de contamination dans l’environnement. Le réseau mis en place permettra dans un futur proche de nouvelles études thérapeutiques (nouveaux schémas thérapeutiques) ou génétique (facteurs d’hôtes) sur la CBM et SPT mais également sur d’autres mycoses endémiques et encore négligées à Madagascar / Chromoblastomycosis (CBM) and sporotrichosis (SPT) are chronic subcutaneous or cutanéo-lymphatic infections found mostly in tropical and subtropical regions. Studies carried out by the Institut Pasteur of Madagascar between 1955 and 1994 provided an inventory of the number of cases of CBM and identified this country as the leading focus of this mycosis worldwide. Mean incidence was estimated at about 0.5/100,000 inhabitants at the time. No new data have been obtained to update the epidemiological situation. About SPT, only sporadic cases have been reported in Madagascar, due to the absence of specific surveillance. CBM is usually caused by dematiaceous fungi, principally Fonsecaea spp. and Cladophialophora spp. The causal agent of SPT is Sporothrix schenckii, a dimorphic hyphomycete.The objectives of this study was to update the data on epidemiology and to evaluate the current burden of these two fungal infections. In addition, we aimed to set up a durable local bio-clinical network and to implement molecular tools to ensure reliable species identification (PCR, sequencing, mass spectrometry).A prospective study, involving the recruitment of patients with suspect lesions was undertaken from March 2013 to June 2017. Patients were included in the dermatology department of the univerity hospital of Antananarivo and through field campaigns in rural areas. Clinical samples were collected and analyzed with conventional mycological methods and molecular tools. Classification of the cases was achieved by the confrontation of mycological and clinical features.Among the 148 patients (mean age 41; male 75.0%): 63 SPT cases (42.5%) and 50 CBM cases (33.8%) were diagnosed. The highest annual incidence of CBM was estimated at 0.38/100,000 inhabitants in the Sava region located to the north. At the district level, the peak incidence was 1.12/100,000 at Anosibe An’Ala, eastern part of the country. Whereas CBM predominated at the periphery of the island, SPT was surprinsgly concentrated in the highlands where the mean incidence was 0.17/100,000 inhabitants. The incidence in the whole country was 0.07/100,000. SPT likelihood of infection was higher in young (<18 years) and the cutaneo-lymphatic forms of the upper limbs were the most frequent. For CBM, farmers and service workers were at high risk and the lesions were mostly (82.9%) located to the lower limbs. The mycological analyses revealed 63 strains of Sporothrix schenckii, 7 of Cladophialophora carrionii, 29 of Fonsecaea sp including 22 F. nubica. F. nubica identification corrected the one of F. pedrosoi previously found in Madagascar, highlighting the need for a molecular analysis of the strains.This is the first study describing human SPT in Madagascar. The SPT burden can now be considered as moderate instead of low as it was described before. It reveals an unexpected concentration of the patients in the central highlands. CBM burden was found at a high level, regrettably similar to the one described 20 years ago, showing the lack of control of this infection. The implementation of a durable bio-clinical network and of the new molecular tools (PCR et le MALDI-TOF MS) developed in this work will easy the development of surveillance programs, especially as the WHO recently added CBM in the neglected tropical diseases list. The network that was built for this work will be used for further therapeutic trials on new schedules of treatment, new drugs or new formulations as well as genetic studies about predisposing factors of CBM and SPT and others deep fungal infections that are still neglected in Madagascar. Yet, an environmental survey is ongoing to describe the sources of contamination.
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Influência do tolueno como contaminante dos solos na imunopatogenia de Sporothrix schenckii /Téllez Martínez, Damiana January 2018 (has links)
Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A esporotricose é uma micose subcutânea emergente que acomete animais e humanos, causada por espécies patogênicas do fungo Sporothrix schenckii senso lato. A doença, distribuída em todo o mundo, é mais freqüente na América Latina e países como Brasil, Uruguai, Peru e Colômbia constituem áreas endêmicas. No Brasil, a doença tornou-se um problema de saúde em razão do aumento de casos, manifestando-se com uma intrigante transmissão zoonótica por gatos. Os fatores ambientais extremos modificam a fisiologia dos microrganismos, permitindo sua sobrevivência e induzendo mudanças na virulência dos fungos patógenos com incidência direta no sistema imune. O tolueno encontra-se dentre os principais contaminantes dos solos como consequencia dos derramamentos de gasolinas, resíduos da indústria, dentre outras fontes de poluição, porém, o efeito deste contaminante sobre a virulência do fungo S. schenckii ainda não foi elucidado. Neste estudo foi avaliado o crescimento e a virulência de S. schenckii quando exposto ao tolueno. O fungo sobreviveu a 0,01 e 0,10% (vol/vol) de tolueno, sendo a população reduzida até 17,5 e 5,4%, respectivamente. O consumo de tolueno na concentração 0,01% mostrou uma redução de 26% após 48 horas. As enzimas superóxido dismutase e catalase nos fungos expostos ao tolueno foram altamente expressas, o qual permitiu uma maior remoção das espécies reativas de oxigênio intracelular nos fungos expostos, e uma menor sensibilidade à exposição de H2O2 sendo que resistiram at... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor
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Óleos essenciais como alternativa inovadora para o tratamento da esporotricoseLima, Rebeca Mól 24 January 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-01-24 / A esporotricose é uma micose subcutânea de evolução subaguda a crônica capaz de afetar seres humanos e animais. Distribuída mundialmente, possui maior prevalência nas áreas de clima tropical e temperado, sendo a micose subcutânea mais comum na América do Sul. Seus agentes etiológicos são fungos do complexo Sporothrix schenckii, saprófitas e dimórficos, encontrados no ambiente. No Brasil, o aumento exponencial dos casos em humanos e animais vem sendo observado nas últimas décadas. Nos arredores do estado do Rio de Janeiro, já é observada uma epidemia de origem zoonótica. Aliado a isso, o tratamento desta micose vem sendo motivo de preocupação. O alto custo e toxicidade dos medicamentos, o tempo prolongado de tratamento, e o surgimento de linhagens resistentes aos fármacos de escolha justificam a demanda crescente pela descoberta de novos fármacos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo identificar os componentes dos óleos essenciais de Myrtus communis L. e Thymus vulgaris L., investigar seus potenciais antifúngicos in vitro frente às principais linhagens causadoras de esporotricose no Brasil, e determinar a citotoxicidade preliminar dos óleos essenciais. Os óleos essenciais de mirta e tomilho foram obtidos comercialmente. O perfil cromatográfico obtido por CG para os dois óleos indicou elevados valores de monoterpernos, 87,1% para a mirta e 98,8% para o tomilho, tendo como componentes majoritários o 1-8 cineol e o timol, respectivamente. Para a avaliação da atividade antifúngica foram utilizadas as seguintes linhagens fúngicas: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 e Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 e duas linhagens clínicas de Sporothrix schenckii, denominadas genericamente como A e B. O óleo essencial de mirta apresentou atividade antifúngica frente a todas as linhagens em concentrações que variaram de 31,25 a 62,5 µg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 62,5 µg/mL. O óleo essencial de tomilho foi capaz de inibir todas as linhagens em concentrações que variaram de 125 a 250 µg/mL. Foi observada atividade fungicida frente a todas as linhagens em concentrações acima de 250 µg/mL. A anfotericina B e o itraconazol foram utilizados como fármacos de referência. Para estes foi observado que somente duas das linhagens estudadas apresentaram susceptibilidade à anfotericina B e ao itraconazol, todas as linhagens estudadas foram consideradas resistentes, com valores de CIM > 16 µg/mL. Estes resultados sugerem indícios de resistência fúngica das linhagens estudadas em relação aos fármacos de referência empregados no tratamento da esporotricose. As microscopias eletrônicas de varredura das linhagens fúngicas revelaram que, tanto nos fungos expostos aos tratamentos experimentais, quanto naqueles expostos aos fármacos de referência, deformidades na estrutura fúngica quando comparadas ao grupo não tratado foram observadas. Em relação aos ensaios de citotoxicidade realizados com queratinócitos humanos (HACAT) pelo método de redução do MTT, os óleos não apresentaram citotoxicidade nas concentrações equivalentes a seus valores de CIM. / Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis with subacute to chronic evolution that can affect humans and animals. Distributed worldwide, it is more prevalent in tropical and temperate climates, being the most common subcutaneous mycosis in South America. Its etiological agents are fungi of the Sporothrix schenckii complex, saprophytic and dimorphic, found in the environment. In Brazil, the exponential increase in cases in humans and animals has been observed in recent decades. In the surroundings of the state of Rio de Janeiro, an epidemic of zoonotic origin is already observed. Allied to this, the treatment of this mycosis has been cause of concern. The high cost and toxicity of the drugs, the prolonged treatment time, and the emergence of resistant strains on drugs of choice justify the growing demand for the discovery of new drugs. In this context, the present study aims to identify the components of the essential oils of Myrtus communis L. and Thymus vulgaris L., to investigate their antifungal potentials in vitro against the main sporotrichosis strains in Brazil, and to determine the preliminary cytotoxicity of essential oils. The essential oils of myrtle and thyme were obtained commercially. The chromatographic profile obtained by GC for the two oils showed high values of monoterpere, 87.1% for myrtle and 98.8% for thyme, with 1-8 cineole and thymol, respectively. The following fungal strains were used: Sporothrix schenckii ATCC 1099-18, Sporothrix schenckii IPEC 15383, Sporothrix brasiliensis ATCC 5110 and Sporothrix brasiliensis IPEC 17943 and two clinical strains of Sporothrix schenckii, referred as A and B. Myrtle essential oil showed antifungal activity against all strains at concentrations ranging from 31.25 to 62.5 μg / mL. Fungicidal activity against all strains was observed at concentrations above 62.5 μg / mL. Thyme essential oil was able to inhibit all lineages at concentrations ranging from 125 to 250 μg / ml. Fungicidal activity was observed against all strains at concentrations above 250 μg / mL. Amphotericin B and itraconazole were used as standard drugs. For these, it was observed that only two of the studied strains showed susceptibility to amphotericin B and itraconazole, all strains studied were considered resistant, with MIC values > 16 μg / mL. These results suggest evidence of fungal resistance of the lines studied in relation to the reference drugs used in the treatment of sporotrichosis. Scanning electron microscopy of fungal lines revealed that, both in the fungi exposed to the experimental treatments and in those exposed to the reference drugs, deformities in the fungal structure when compared to the untreated group were observed. In relation to the cytotoxicity assays performed with human keratinocytes (HACAT) by the MTT reduction method, the oils did not present cytotoxicity at concentrations equivalent to their MIC values.
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