L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) évolue généralement vers le développement d’une hépatite C chronique, fréquemment associée à des perturbations métaboliques, (insulinorésistance et stéatose), et de la structure hépatique (fibrose et cirrhose), favorisant le développement d’un hépatocarcinome. Le stress oxydant semble étroitement lié à la progression de ces pathologies, notamment l’insulino-résistance. Or, les mécanismes moléculaires par lesquels le VHC module le stress oxydant restent confus, ainsi que l’effet réciproque du stress oxydant sur la réplication virale. Jusqu’à récemment, la modulation de ce stress a été étudiée in vitro dans des modèles non réplicatifs du VHC ou dans des modèles d’expression ectopiques des protéines virales. Peu d’études ont encore tenté de caractériser l’effet d’une infection complète et productive dans les cellules cibles naturelles du VHC, les hépatocytes. Mes travaux de recherche ont donc consisté à étudier la modulation de la balance redox cellulaire dans un modèle d’infection complet de type HCVcc, et dans les cellules hépatocytaires Huh7.5. Cette étude a permis de caractériser le stress oxydant dans ce modèle, mais surtout d’identifier un antioxydant à activité pro-virale, la glutathion peroxydase 4 (GPx4). En effet, nous avons observé une stimulation viro-induite de l’expression et de l’activité de GPx4, seule enzyme capable de détoxifier les lipides membranaires oxydés. L’expression de cette enzyme semble nécessaire à la réplication ainsi qu’à l’infectivité virale. Son importance pour le VHC résiderait dans son activité catalytique permettant de maintenir l’intégrité des lipides cellulaires nécessaire au cycle viral / Chronic infection with Hepatitis C virus (HCV) is frequently associated with metabolic disturbances (insulin-resistance and steatosis) as well as with changes to hepatic structure (fibrosis and cirrhosis) that favor hepatocellular carcinogenesis. Insulin resistance is in particular linked to oxidative stress, which is thought to play a key role in driving disease progression. However, molecular mechanisms by which HCV regulates oxidative stress are still unclear and reciprocally, the effect of oxidative stress on viral life cycle is not well understood. Until recently, induction of oxidative stress by HCV has mainly been investigated in non replicative in vitro models or in cell systems expressing viral proteins alone. Few studies have yet investigated oxidative stress in the context of productive HCV infection. My work consisted of studying the modulation of the cellular redox system using the HCVcc infection model, based on a replicative HCV isolate and the hepatoma cell line Huh7.5. This work provided a broad characterization of how HCV induces and prevents oxidative stress and identified glutathion peroxidase 4 (GPx4) as a pro-viral antioxydant enzyme. Indeed, we observed an HCVinduced upregulation of expression and activity of GPx4. We also demonstrated that GPx4 expression is required for viral replication and infectivity. As GPx4 possesses a particular catalytic activity, which is the detoxification of oxidized membrane lipids, we investigated the impact of the accumulation of oxidized lipids on HCV replication. These studies showed that GPx4 is an important host factor for HCV life cycle by maintaining membrane lipid integrity in an oxidative cellular environment

La photosynthèse oxygénique peut être le lieu de formation des Formes Réactives de l’Oxygéne (FROs). Les FROs altèrent toutes les macromolécules de la cellule, générant ainsi un stress oxydant. Toute perturbation du métabolisme cellulaire peut conduire à ce type de stress. Les cyanobactérie sétant les premiers organismes à avoir émis de l’oxygène sur terre, elles ont du développer très tôt au cours de l’évolution des mécanismes de perception et de défense pour lutter contre ce stress. Nous nous sommes intéressés à l’étude des mécanismes qui permettent à la cyanobactérie filamentuse et diazotrophe Anabaena PCC 7120 de s’adapter à diverses conditions de stress et de carence : stress oxydant, carence en fer et en azote combiné. En réponse à une carence en azote combiné, elle différencie en 24 h des hétérocystes : cellules spécialisées dans la fixation de l’azote atmosphérique. Nous avons étudié la réponse transcriptomique globale de cette bactérie à la fois au stress oxydant et à la carence en fer et nous avons établit la connection existant entre ces deux stress. Nous avons pu identifier le régulateur transcriptionnel pleiotrope impliqué dans la perception et la signalisation du stress peroxyde et nous en avons élucidé le mécanisme d’action. Nous avons également étudié une Ser/Thr kinase qui joue un rôle important à la fois dans la réponse au stress oxydant et à la carence en azote combiné. Notre étude a montré que cette kinase pourrait être le lien moléculaire entre ces deux conditions, puisque une cible potentielle de cette kinase semble être la protéine HetR qui est le régulateur clé du processus de différenciation cellulaire. / Oxygenic photosynthesis may generate Reactive forms of Oxygéne (ROS). These reactive oxygen species can damage all the macromolecules of the cell, inducing oxidative stress. Any disruption of cellular metabolism can lead to oxidant damage. Cyanobacteria were the first organisms producing oxygen on Earth, they therefore had to develop very early during evolution the mechanisms of perception and defence to cope with this tstress. We are interested in studying the mechanisms that allow the diazotrophic filamentous cyanobacterium Anabaena PCC 7120 to adapt to various conditions of stress and stravations: oxidative stress, iron and combined nitrogen starvations. Anabaena PCC 7120 is a simple model for the study of cell differentiation. In response to combined nitrogen stravation it can differentiate heterocysts, cell specialized in molecular nitrogen fixation. We studied the global transcriptomic response of this bacterium to both oxidative stress and iron deficiency and we establish the crosstalk between these two stresses. We were able to identify the global transcriptional regulator involved in the perception and in the signaling of a peroxide stress. Its mechanism of action was elucidated. We also studied a Ser / Thr kinase that plays an important role both in the response to oxidative stress and combined nitrogen stravation. Our study showed that this kinase may be the molecular link between these two conditions, as a potential target of this kinase appears to be the HetR protein which is the key regulator of cellular differentiation process.

L'acide arachidonique (AA, C20 :4, n-6) et l'acide docosahexaènoïque (DHA, C22 :6, n-3) sont présents en quantités importantes dans les membranes phospholipidiques. Lors d'un stress oxydant, ces acides gras polyinsaturés sont métabolisés en composés de structure tetrahydrofuranique appelés isofuranes (IsoFs) pour l'AA et neurofuranes (NeuroFs) pour le DHA. Nous nous sommes intéressés à la synthèse de ce type de composés afin d'accéder à de nouveaux biomarqueurs du stress oxydant. Dans ce même objectif, nous nous sommes également penchés sur la synthèse de potentielles structures analogues dérivant de l'acide adrénique (AdA, C22 :4, n-6), que nous avons nommées dihomo-isofuranes (dihomo-IsoFs). / Arachidonic acid (AA, C20 :4, n-6) and docosahexaenoïc acid (DHA, C22 :6, n-3) are phospholipidic membranes polyinsaturated fatty acids. During and oxidative stress, these are metabolized into tetrahydrofuran-containing compounds, known as isofurans (IsoFs) for AA and neurofurans (NeuroFs) for DHA. We were interested in the total synthesis of these compounds in the aim of getting access to novel biomarkers of the oxidative stress. Towards the same goal, we envisaged the total synthesis of potential analog structures coming from adrenic acid (AdA, C22 :4, n-6), that we named dihomo-isofurans (dihomo-IsoFs).

Les complications cardiovasculaires au décours du syndrome métabolique ou le diabète, sont une conséquence directe de l'installation d'un stress oxydant, dont la progression est associée à une augmentation de la production de radicaux libres et des composés de dégradation des molécules biologiques, parallèlement à une diminution des défenses antioxydantes. Ces pathologies, enjeux important de santé publique, suscitent la recherche de méthodes de prévention ou de traitement. Dans ce contexte notre 1er objectif a été de développer deux modèles chez le rat, mimant les conditions du syndrome métabolique et du diabète, le premier par administration d'un régime ou d'une boisson riches en fructose, le deuxième étant induit par voie chimique. Notre 2ème objectif a été de préparer des extraits riches en phycocyanines d'un antioxydant naturel, la spiruline, et de les évaluer dans ces deux modèles expérimentaux. Les résultats ont montré l'effet bénéfique de la spiruline sur la diminution de la glycémie, l'amélioration de l'insulinémie et du profil lipidique, ainsi que sur le renforcement des défenses antioxydantes et l'amélioration de la récupération fonctionnelle du myocarde après ischémie/reperfusion. Notre 3ème objectif a été de d'évaluer la capacité antioxydante et cardioprotectrice de nouveaux dérivés polyphénoliques. Une trentaine de nouveaux flavonols ont été isolés au Laboratoire, les meilleurs résultats ont été obtenus avec ceux portant un groupement ionisable en C6, et des groupements méthoxy en C3' et C5', apportant une meilleure solubilité et une plus faible cytotoxicité. / Cardiovascular disorders related to metabolic syndrome or diabetes are a direct consequence of the installation of oxidative stress, which progress is associated with free radicals overproduction and increase of biomolecules degradation, in parallel with lowered antioxidant defenses. These pathologies represent a considerable public health problem, and research to improve prevention and treatment is strongly encouraged. In this context, our 1st objective was to develop two models in vivo, mimicking on rats metabolic syndrome and diabetes conditions, one by administration of a fructose-enriched diet or drink, the second being chemically induced. Our 2nd objective was to prepare phycocyanine-rich extracts of spirulina, a natural antioxidant, and to evaluate their properties on the two experimental animal models. Results showed the beneficial effect of spirulina on glycemia decrease, insulinemia improvement and lipid profile, accompanied by and increase of the antioxidant defenses and an improvement of myocardial functional recovery after ischaemia/reperfusion. Our 3rd objective was of to evaluate the antioxidant and cardioprotective capacities of new polyphenol derivatives. Around thirty new flavonols have been isolated in our Laboratory; best results were obtained with molecules bearing an ionizable group in C6 position, and methoxy groups in C3' and C5', leading to better solubility and lower cytotoxicity. Finally, the 4th objective was to quantify the therapeutic and cardioprotective potential of hybrid compounds, associating an antioxidant pattern with an antidiabetic molecule.

L’arthrose est une maladie dégénérative de l’articulation caractérisée par une dégradation du cartilage, une inflammation de la membrane synoviale et un remodelage de l’os sous-chondral. En conditions physiologiques, les chondrocytes, seul type cellulaire du cartilage, sont en hypoxie (≈ 2% d’oxygène). Le cartilage étant un tissu avascularisé, il existe un gradient de concentration en oxygène au sein des différentes couches du cartilage. Lors du développement de l’arthrose, la dégradation du cartilage provoque une rupture de ce gradient, exposant ainsi les cellules des couches profondes à des concentrations en oxygène beaucoup plus élevées et induisant des modifications de leur métabolisme, ce qui induit leur dysfonction. Le syndrome métabolique est défini par un ensemble de perturbations glucidiques, lipidiques et vasculaires menant au développement de maladies cardiovasculaires et au diabète de type 2. Récemment, un lien entre arthrose et syndrome métabolique a été suggéré, introduisant une notion d’arthrose métabolique. Au cours de cette étude, nous nous sommes intéressés au lien entre arthrose, syndrome métabolique et stress oxydant induit par de fortes concentrations de glucose. Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié les effets in vitro de 25 mM de glucose sur une lignée de chondrocytes humains immortalisés (T/C28a2), en hypoxie (2% d’oxygène) et en normoxie (21% d’oxygène). Nous avons montré que le glucose à 25 mM induisait la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) et de l’azote, l’activation de la caspase 3, la production d’interleukine 6 (IL-6), la diminution de l’activité lysyl oxydase (LOX), qui est impliquée dans les liaisons de pontage des fibres de collagène et d’élastine, ainsi que l’activation du système thiorédoxine (Trx). Ce dernier est un système de défense anti-oxydant endogène composé de la thiorédoxine, de la thiorédoxine réductase (TR) et de Txnip, qui intervient dans le maintien de l’homéostasie cellulaire en réduisant les protéines oxydées, contrôlant ainsi l’environnement redox des cellules. Les effets du glucose 25 mM ont été observés dans les deux conditions d’oxygène étudiées, cependant la réponse cellulaire en normoxie était plus précoce qu’en hypoxie. Nous avons également pu mettre en évidence un rôle de régulateur négatif de la Trx-1 sur la production d’IL-6 faisant intervenir la voie de signalisation p38MAPK. Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés aux effets de l’apport exogène de resvératrol sur les modifications induites par le glucose à 25 mM. Le resvératrol (3,4’,5-trihydroxystilbène) est un polyphénol de la famille des stilbènes, connu pour ses multiples propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires, anti-diabétiques et anti-cancer. Nous avons pu observer que le resvératrol à 25 μM était capable de diminuer les effets délétères provoqués par le glucose à 25 mM. Cependant, la biodisponibilité du resvératrol est très limitée, empêchant son utilisation en thérapeutique humaine. Par conséquent, dans la troisième partie de cette étude, nous nous sommes intéressés au développement de nouvelles formulations galéniques de resvératrol (nano-émulsions (NE)) et à leurs effets sur un modèle de cellules endothéliales aortiques bovines (BAEC), sur les T/C28a2 ainsi que sur des chondrocytes humains en culture primaire provenant de cartilage de patients arthrosiques. Nous avons montré qu’une des NE permettait d’augmenter le passage intracellulaire de resvératrol dans les deux modèles étudiés et d’en potentialiser les effets protecteurs contre un stress oxydant. Cette NE s’est également montrée efficace dans le rétablissement de l’activité LOX dans les cellules de patients arthrosiques. En conclusion, nous avons montré que le glucose à 25 mM avait des effets délétères sur les chondrocytes de la lignée T/C28a2 et que l’apport exogène de resvératrol permettait de lutter contre ses effets. (...) / Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disease characterized by cartilage degradation, inflammation of synovial membrane and subchondral bone remodelling. Under physiological conditions, chondrocytes - the only cell type found in cartilage - are under hypoxia (around 2% of oxygen). As cartilage is an avascular tissue, an oxygen gradient is established from the superficial to the deeper layers. During OA development, cartilage degradation is responsible for a break in this gradient; consequently, cells from the deepest layers are exposed to higher oxygen concentrations inducing modifications in cell metabolism leading to their dysfunction. Metabolic syndrome (MetS) is defined by a cluster of factors (impairment of glucose and lipid metabolism, vascular dysfunctions…) leading to cardiovascular diseases and type 2 diabetes development. Recently, a link between OA and MetS has been suggested, introducing a notion of metabolic OA. We have focused our study on the link between OA, MetS and oxidative stress induced by high glucose concentrations. In the first part of this study, we have determined the in vitro effects of 25 mM glucose on an immortalized human chondrocyte cell line (T/C28a2), under hypoxia (2% oxygen) and normoxia (21% oxygen). We demonstrated that 25 mM glucose induced radical oxygen species (ROS) and nitric oxide production, caspase 3 activation, interleukin 6 (IL-6) production, decrease in lysyl oxidase (LOX) activity (involved in type II collagen crosslinks), and activation of the thioredoxin (Trx) system. Trx system is an endogenous anti-oxidant system, composed by thioredoxin, thioredoxin reductase (TR) and Txnip; it is involved in cellular homeostasis by reducing oxidized proteins, thereby controlling cellular redox environment. Effects of 25 mM glucose have been observed under both oxygen conditions; nevertheless, cellular response under normoxia underwent earlier than under hypoxia. We have also highlighted Trx-1 as a negative regulator of IL-6 production through p38MAPK signalling pathway. In the second part of this study, we have focused our work on the effects of the addition of an exogenous antioxidant, i.e. resveratrol, on the modifications induced by 25 mM glucose. Indeed, resveratrol (3,4’,5-trihydroxystilbene) is a polyphenol of the stilbene family, known for its multiple anti-inflammatory, anti-oxidative, anti-diabetes and anti-cancer properties. We have observed that 25 μM resveratrol was able to decrease deleterious effects induced by 25 mM glucose. However, resveratrol bioavailability is very low, avoiding its use in human therapeutic strategy. Consequently, in the third part of this study, we have developed new galenic formulations of resveratrol, i.e. nano-emulsions (NEs) and determined their effects on a bovine aortic endothelial cells (BAEC) model, on T/C28a2 cells and also on primary cultures of human chondrocytes from osteoarthritic cartilages. One of our NEs was able to increase resveratrol intracellular passage in both cellular models, and to increase the protective effects of resveratrol against oxidative stress. This NE was also efficient in the normalization of LOX activity in osteoarthritic chondrocytes. To conclude, we have demonstrated that 25 mM glucose induced deleterious effects on chondrocytes of the T/C28a2 cell line, and that an exogenous supply in resveratrol allowed to counteract these effects. Development of a new galenic formulation of resveratrol opens new interesting prospects in human therapeutic strategy against OA associated with MetS.

Les mécanismes impliqués dans les adaptations du phénotype métabolique musculaire au cours de l’exercice physique restent imparfaitement connus. Nous nous sommes intéressés au concept d’hormèse mitochondriale qui se définit comme un stress métabolique activant les voies de signalisation menant à une activation mitochondriale.En première partie, nous avons validé l’utilisation d’un nouveau système de mesure des échanges gazeux chez le rat au cours de différents exercices sur tapis roulant, et démontré que pour une vitesse de course sous maximale, un exercice en descente sollicite le système cardiovasculaire de façon modérée sans altérer la fonction mitochondriale musculaire, ni augmenter la production de radicaux libres oxygénés.En deuxième partie, nous avons montré qu’un découplage mitochondrial provoqué par un traitement des rats au 2,3-dinitrophénol (DNP) pendant 3 semaines engendre des adaptations métaboliques menant à l’augmentation de la masse mitochondriale du muscle squelettique. Ces animaux ont une capacité à l’exercice diminuée, malgré une augmentation de leur VO2max.Pour finir, nous avons montré qu’un préconditionnement par l’exercice protège la mitochondrie musculaire squelettique des effets délétères de l’ischémie-reperfusion. L’exercice semble activer le métabolisme via un phénomène d’hormèse mitochondriale permettant la protection musculaire. En conclusion, cette thèse nous montre d’une part l’importance de la mitochondrie (aspect quantitatif mais surtout qualitatif) en terme de limitation à l’exercice, et d’autre part nous suggère que l'optimisation du fonctionnement mitochondrial pourrait être une bonne garantie pour pouvoir lutter efficacement contre les stress, notamment oxydatifs, auxquels l'organisme est soumis en (quasi)permanence. / The mechanisms regulating the metabolic phenotype adaptations in skeletal muscle during physical exercise is still unknown.We studied the mitochondrial hormesis phenomenon that could be defined as a metabolic stress activating the signaling pathways leading to a mitochondrial stimulation (mitochondrial biogenesis).In the first part, we validated the utilization of a new system determining the gas exchange in rat during a treadmill exhaustive exercise. We showed that a submaximal downhill exercise activate moderately the cardiovascular system, without mitochondrial functional impairments and without any augmentation of the systemic ROS production. In the second part, we showed that a mitochondrial uncoupling following a dinitrophenol treatment during 3 weeks in rats induced some metabolic adaptations leading to a higher mitochondrial mass in skeletal muscle. The exercise capacity of these animals is reduced whereas the maximal oxygen consumption is higher.In the last part, we showed that a preconditioning protocol with an acute exercise protected the skeletal muscle mitochondria from the deleterious effects of ischemia-reperfusion. This exercise seems to activate the muscular metabolism via a phenomenon of mitochondrial hormesis activation, allowing an efficient muscular protection.In conclusion, this thesis shows the importance of the mitochondria in terms of qualitative and quantitative aspects and shows the participation of this organelle in the exercise limitation. Moreover, these works suggest that the optimization of the mitochondrial function could be a good guarantee in order to efficiently fight against oxidative stress at the level of the whole organism.

La reperméabilisation par thrombolyse, angioplastie ou chirurgie cardiaque des artères coronaires au décours d’un épisode d’ischémie myocardique est à l’origine d’une réduction spectaculaire de la morbi-mortalité de l’insuffisance coronaire aiguë. Elle est cependant la cause de lésions supplémentaires. La recherche de nouvelles approches cardioprotectrices complémentaires des méthodes de reperfusion actuelles est donc indispensable pour réduire les conséquences de l’ischémie myocardique. La découverte de puissants mécanismes cardioprotecteurs endogènes qui consistent en de brefs épisodes d’ischémie-reperfusion (IR) réalisés avant l’ischémie (pré-conditionnement ischémique, PCI) ou lors de la reperfusion (post-conditionnement ischémique) a permis de déterminer les mécanismes intervenant dans l’établissement des lésions d’IR. Le rôle prépondérant de la mitochondrie et l’augmentation de la perméabilité de ses membranes notamment via l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP) a pu être mis en évidence.Depré et al. (2001) ont décrit une stratégie cardioprotectrice novatrice : la surexpression de la protéine Hsp22 chez la souris protège le myocarde de l’infarctus et induit l’hypertrophie de ce dernier. Cette protéine est en effet capable d’activer des acteurs clés de la survie cellulaire notamment la voie des NO synthases qui est fortement impliquée dans le processus de PCI.Dans un premier temps, nous avons étudié les effets d’Hsp22 sur les fonctions mitochondriales et analysé le rôle du NO dans ces effets à l’aide d’un modèle murin sur-exprimant Hsp22 dans le myocarde. Nous avons montré qu’à l’état basal, la sur-expression d’Hsp22 augmente la production mitochondriale de NO, ce qui stimule la phosphorylation oxydative et s’accompagne de l’augmentation de la production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) par le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale. Cette sur-expression réduit également la capacité maximale des complexes I et III à produire des ERO et limite l’ouverture du mPTP. Après anoxie, la sur-expression d’ Hsp22 exacerbe la diminution de phosphorylation oxydative par un mécanisme dépendant du NO et réduit la surproduction d’ERO par la chaîne respiratoire. Ces caractéristiques sont semblables à celles conférées par le PCI. La protéine Hsp22 induit donc au niveau mitochondrial des modifications qui pourraient participer à son effet cardioprotecteur. Une étude sur un modèle d’IR in vivo a permis de confirmer qu’Hsp22 limite fortement la taille de l’infarctus et de montrer que cet effet est associé à une réduction de l’atteinte des fonctions mitochondriales après IR. Les ERO sont des médiateurs clés dans le PCI mais également dans le développement de l’hypertrophie myocardique et du vieillissement prématuré. Or, Hsp22 stimule la production d’ERO mitochondriales, induit une hypertrophie myocardique et un effet cardioprotecteur similaire au PCI. Nous avons donc étudié le rôle des ERO dans les effets induits par Hsp22. Nos résultats ont montré qu’Hsp22 active les principales sources d’ERO cellulaires dans le myocarde aboutissant à un stress oxydant. Cet effet est associé à une forte réduction de la durée de vie des animaux sur-exprimant Hsp22 et à l’apparition de marqueurs de vieillissement prématuré dans le myocarde. Un traitement antioxydant permet de réduire cette sur-production d’ERO ainsi que l’hypertrophie myocardique et de rétablir l’espérance de vie des animaux transgéniques. Enfin, l’effet cardioprotecteur induit par Hsp22 est maintenu avec l’âge et n’est pas dépendant des ERO.En conclusion, l’effet cardioprotecteur durable induit par Hsp22 est associé à une protection des fonctions mitochondriales NO dépendante mais s’accompagne d’un stress oxydant responsable de l’hypertrophie myocardique et de la réduction de la durée de vie. Un traitement antioxydant est capable d’inhiber les effets délétères induits pas Hsp22 sans affecter son effet cardioprotecteur. / Development of reperfusion strategies such as thrombolysis, angioplasty and cardiac surgery to restore blood flow after myocardial ischemia is responsible for a spectacular reduction in deleterious consequences resulting from acute coronary syndrome. However reperfusion itself causes supplementary lesions. Research for new complementary cardioprotective strategies is needed to reduce the impact of myocardial ischemia. The discovery of powerful intrinsic cardioprotective processes consisting in repeated short cycles of ischemia-reperfusion (IR) before the ischemic episode (ischemic preconditioning) or at the moment of the reperfusion (ischemic postconditioning) has allowed to analyze the mechanisms involved in IR lesions and highlighted a crucial role of mitochondria and more particularly of the increase in its membrane permeability via the opening of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP). Dr C. Depré et al. (2001) demonstrated that the over-expression of Hsp22 protein coding gene which induced myocardial hypertrophy protected from myocardial infarction. The mechanism of this innovative cardioprotective strategy is not fully understood but Hsp22 promotes the activation of cellular survival pathways such as the NO synthase pathway which is also involved in ischemic preconditioning (Depré et al., 2006).The goal of the first part of our study was to evaluate the effects of Hsp22 on mitochondrial functions and the role of NO in these effects using a transgenic mouse model overexpressing Hsp22 in the heart. Our results showed that Hsp22 overexpression increases mitochondrial NO production which stimulated oxidative phosphorylation in basal state. This was accompanied by an increased in reactive oxygen species (ROS) production by mitochondrial respiratory chain complex I. This overexpression also reduced the maximal capability of complex I and III to produce ROS production and limited mPTP opening. After anoxia, Hsp22 overexpression increaseed oxidative phosphorylation inhibition by a NO-dependent mechanism and limited the burst of ROS production from the respiratory chain.. Thus, Hsp22 modulates mitochondrial functions and this could participate to its cardioprotective effect as these characteristics replicate those of ischemic preconditioning. In the next step, we confirmed that Hsp22 overexpression highly reduced infarct size in an in vivo model of IR and showed that this was associated with a better preservation of mitochondrial functions.As ROS are key mediators of preconditioning but also of myocardial hypertrophy and aging and Hsp22 stimulates mitochondrial ROS production, induces a myocardial hypertrophy and a cardioprotective effect replicating preconditioning, we explored the role of ROS in Hsp22-induced effects in the last part of the study. Our results showed that Hsp22 overexpression activated major cellular sources of ROS leading to myocardial oxidative stress. This was associated with an extensive reduction of lifespan and the appearance of aging markers in the myocardium of young transgenic mice. Antioxidant treatment reduced the overproduction of ROS induced by Hsp22, decreased myocardial hypertrophy and restored lifespan in Hsp22 overexpressing mice showing the role of ROS in these effects. Finally, the cardioprotective effect induced by Hsp22 was maintained in old mice and was not dependent of ROS production. In conclusion, long-lasting cardioprotective effect induced by Hsp22 is associated with a NO-dependent preservation of mitochondrial functions and an oxidative stress responsible for myocardial hypertrophy and reduced lifespan. Antioxidant treatment is able to inhibit deleterious consequences of Hsp22 overexpression without affecting its cardioprotective effect.

Les stéroïdes sexuels ne sont pas impliqués uniquement dans la reproduction, ils sont également actifs dans le système nerveux où ils exercent des effets neuroprotecteurs. La mitochondrie a un rôle central dans la synthèse de l’énergie cellulaire et le contrôle du stress oxydant. Ces fonctions mitochondriales seraient une cible potentielle des effets des stéroïdes sexuels dans le cerveau. Deux approches ont été développées au cours de ce travail de thèse : une approche physiologique avec l’étude de l’influence des stéroïdes endogènes sur la fonction mitochondriale cérébrale et une approche thérapeutique en utilisant le modèle expérimental de l’ischémie cérébrale et du traitement par la progestérone. Pour analyser l’influence des stéroïdes endogènes, nous avons comparé le fonctionnement de la phosphorylation oxydative (consommation d’oxygène ou « respiration » et activités enzymatiques) ; le niveau du stress oxydant (pool de glutathion mitochondrial et inactivation oxydative de l’aconitase mitochondriale) et les taux cérébraux de stéroïdes dans des groupes de souris mâles et femelles soit jeunes adultes intactes ou gonadectomisées (3 mois) ; soit âgées (20 mois). Nous avons montré que la respiration NADH-dépendante est plus importante et que le stress oxydant mitochondrial est moins important chez les femelles que chez les mâles jeunes. Cette différence n’existe plus chez les souris âgées et est abolie après ovariectomie mais pas après orchidectomie, ce qui démontre l’influence des stéroïdes ovariens. Les taux cérébraux importants de prégnènolone et de progestérone chez les souris jeunes femelles par rapport aux jeunes mâles pourraient être impliqués dans le dimorphisme sexuel observé.Les modifications de la respiration mitochondriale induites par l’ischémie cérébrale sont également différentes entre les mâles et les femelles dans notre modèle. La respiration NADH-dépendante est diminuée dans les deux sexes, mais la respiration FADH2-dépendante est diminuée spécifiquement chez les femelles. Le stress oxydant mitochondrial est augmenté dans les deux sexes. L’administration de progestérone permet de restaurer la respiration FADH2-dépendante chez les femelles et la respiration NADH-dépendante ainsi que le pool de glutathion mitochondrial dans les deux sexes. Ce travail a permis de mettre en évidence des différences de fonctionnement mitochondrial cérébral chez les souris mâles et femelles jeunes et d’identifier la phosphorylation oxydative et le stress oxydant mitochondrial comme cibles d’action des effets neuroprotecteurs de la progestérone lors de l’ischémie cérébrale. / Besides the reproduction control, sex steroids also act on nervous system and exert neuroprotective effects. The mitochondria are centrally involved in cellular energy synthesis and oxidative stress regulation and constitute a potential target of steroids effects on brain. The aim of our study was twofold: (1) to study the influence of endogenous steroids on brain mitochondrial function in physiological conditions ; (2) to determine the effects of progesterone on mitochondrial function when used as therapeutic agent in an experimental model of cerebral ischemia. To analyze the influence of endogenous sex steroids, the oxidative phosphorylation system (oxygen consumption or “respiration” and enzymatic activities) and mitochondrial oxidative stress (glutathione pool and mitochondrial aconitase oxidative inactivation) were analyzed in brain mitochondria of young adult male and female mice (3-month-old), intact and after gonadectomy, and of aged male and female mice (20-month-old). Our results showed that young adult females have lower oxidative stress and a higher NADH-linked respiration rate as compared to young adult males. This sex difference was suppressed by ovariectomy but not by orchidectomy and no longer existed in aged mice. Concomitant analysis of brain steroids suggest that the major male/female differences in brain pregnenolone and progesterone levels may contribute to the sex differences observed in brain mitochondrial function.We have also shown that the decrease of brain mitochondrial respiration induced by ischemia is different according to sex in our experimental model. The NADH-linked respiration decreased after ischemia in males and female but a decrease of FADH2-linked respiration only occurred in females. Ischemia induced oxidative damages in both males and females. Progesterone restored NADH-linked respiration in both sexes and FADH2-linked respiration in females. Progesterone also preserved mitochondrial glutathione pool in both sexes. Our findings point to a sex difference in brain mitochondrial function of young male and female mice and identify the oxidative phosphorylation system and the mitochondrial oxidative stress as targets of the neuroprotective effects of progesterone.

Ce travail de thèse s’inscrit dans la caractérisation des cellules radiorésistantes des cancers du sein, à l’origine des rechutes après traitement par radiothérapie. La théorie des « Cellules Souches Cancéreuses » (CSC) place une sous-population cellulaire présentant une capacité accrue à induire des tumeurs et à proliférer au centre de la résistance à l’irradiation. Au cours de ce travail, nous avons montré que seul le marqueur de CSC CD24-/low permettait de définir une sous population radiorésistante, capable de transmettre une « mémoire » de l’irradiation se traduisant par une instabilité génétique persistante dans la descendance des cellules irradiées. En outre, nous avons montré que CD24 n’est pas uniquement un marqueur, mais bien un acteur de la réponse à l’irradiation. Ainsi, CD24 contrôle la prolifération cellulaire in vitro et in vivo, ainsi que les niveaux de ROS avant et après irradiation. L’ensemble de ces propriétés aboutit à une sensibilité réduite des cellules CD24-/low à l’irradiation γ, ainsi qu’à une baisse de l’instabilité génétique. Ces résultats permettent pour la première fois d’attribuer un rôle aux CSC CD24-/low dans la transmission de l’instabilité chromosomique. De plus, en apportant des informations pour évaluer la radiorésistance intrinsèque des tumeurs mammaires, le marquage CD24 pourrait contribuer à l’amélioration des protocoles de radiothérapie. / This work focuses on the characterization of radiation-resistant breast cancer cells, responsible for relapse after radiotherapy. The “Cancer Stem Cells” (CSC) theory describes a radiation-resistant cellular sub-population, with enhanced capacity to induce tumors and proliferate. In this work, we show that only the CSC marker CD24-/low defines a radiation resistant cell population, able to transmit the “memory” of irradiation, expressed as long term genomic instability in the progeny of irradiated cells. We show that CD24 is not only a marker, but is an actor of radiation-response. So, CD24 expression controls cell proliferation in vitro and in vivo, and ROS level before and after irradiation. As a result, CD24-/low cells display enhanced radiation-resistance and genomic stability. For the first time, our results attribute a role to CD24-/low CSCs in the transmission of genomic instability. Moreover, by providing informations on tumor intrinsic radiation-sensitivity, CD24- marker could help to design new radiotherapy protocols.

Le sélénium est reconnu comme un micronutriment important pour l'homme et les animaux. Plusieurs études ont montré qu'une supplementation en sélénium dans le régime alimentaire pourrait être bénéfique contre les cancers du foie, du colon, du pancréas et de la prostate. Le mécanisme anti-carcinogène du sélénium se produit au niveau systémique, cellulaire et nucléaire. Ces processus peuvent également impliquer le système immunitaire et ne doivent pas être interprétés par un seul mécanisme. Jusqu'à présent son mécanisme d'action est encore inconnu. L'objectif de cette étude était d'étudier l'effet des composés du sélénium, à faibles concentrations, sur la capacité de réparation de l'ADN dans les cellules du cancer de la prostate LNCaP (p53 compétentes). Ce travail est divisé en trois parties. La première partie du travail a été consacrée à étudier l'effet des deux composés du sélénium (SS et SM) sur les propriétés cytotoxiques et génotoxiques de différents stress oxydatifs et non oxydatifs. Les résultats ont montré qu'un prétraitement avec une faible dose en Se stimulait la synthèse des sélénoprotéines, et protègait contre la toxicité et les dommages oxydatifs à l'ADN induites par les UVA ou H2O2, mais pas par MMS ou UVC. La deuxième partie a été consacrée à l'influence de la supplementation en sélénium sur la capacité de réparation de l'ADN. Notre travail a clairement montré l'augmentation de l'efficacité d'excision de certaines glycosylases que n'est pas nécessairement corrélée à une augmentation de l'expression génique et /ou protéiques. Enfin, la troisième partie de notre travail a été dédiée à l'optimisation de la technique Host Cell Reactivation (HCR) qui nous a permis d'étudier la capacité de réparation de l'ADN in cellulo, afin de cibler les partenaires impliqués dans la voie de signalisation affectées par la supplémentation en sélénium. En conclusion, nous pourront penser que le mécanisme d'action du sélénium est représenté par un délicat équilibre entre l'activation et la répression de l'activité de certaines protéines qui induit des changements conformationnels plus ou moins directement impliqués dans la réparation de l'ADN et la progression de la croissance cellulaire. / Selenium was recognized as an important micronutrient for both humans and animals. Several studies showed that increased selenium in the diet might be beneficial against liver, colon, pancreas and prostate cancer. The anticarcinogenic actions of Se occur at the systemic, cellular and nuclear level. These actions may also involve the immune system and thus cannot be interpreted by a single mechanism. Until now its mechanisms of action are not well understood. The objective of this study was to investigate the effect of selenocompounds at low doses on DNA repair capacity in the p53-proficient LNCaP prostate cancer cells. This work is divided into three parts. The first part of the work was devoted to study the effect of two selenocompounds (SS and SM) on the cytotoxic and genotoxic properties of various oxidative and non oxidative stresses. The results showed that low doses of Se pre-treatment stimulates selenoprotein synthesis, protects against toxicity and oxidative DNA damage induced by UVA or H2O2 but not by MMS or UVC. The second part of our investigation was devoted to the influence of selenium supplementation on DNA repair capacity. Our work clearly showed an increase in excision efficiency of the glycosylases activity that was not necessarily correlated with an increase of gene expression and/or protein levels. Finally, the third part of our work was devoted to the optimization of Host Cell Reactivation assay (HCR) to study the DNA repair capacity in cellulo, in order to target the partners involved in the signalling pathway affected by selenium supplementation. In conclusion, we could image that the mechanism of action of selenium is represented by a delicate balance between activation and repression of protein activity that induces conformational changes of several proteins more or less directly involved in DNA repair and progression of cell growth.