Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d'H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l'analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l'hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l'opéron hox. Lorsque j'ai débuté ce travail, 2 activateurs de l'opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l'opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l'opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d'AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j'ai montré que cette cystéine n'est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l'affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s'agit de la première fois, qu'un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J'ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d'abrB2. J'ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L'effet est également visible sur l'activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d'AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s'accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l'Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L'ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l'expression de l'hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d'un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l'hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j'ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d'éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d'H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d'élaborer des stratégies de production d'H2 efficace.

Ce travail de thèse s'inscrit dans la caractérisation des cellules radiorésistantes des cancers du sein, à l'origine des rechutes après traitement par radiothérapie. La théorie des " Cellules Souches Cancéreuses " (CSC) place une sous-population cellulaire présentant une capacité accrue à induire des tumeurs et à proliférer au centre de la résistance à l'irradiation. Au cours de ce travail, nous avons montré que seul le marqueur de CSC CD24-/low permettait de définir une sous population radiorésistante, capable de transmettre une " mémoire " de l'irradiation se traduisant par une instabilité génétique persistante dans la descendance des cellules irradiées. En outre, nous avons montré que CD24 n'est pas uniquement un marqueur, mais bien un acteur de la réponse à l'irradiation. Ainsi, CD24 contrôle la prolifération cellulaire in vitro et in vivo, ainsi que les niveaux de ROS avant et après irradiation. L'ensemble de ces propriétés aboutit à une sensibilité réduite des cellules CD24-/low à l'irradiation γ, ainsi qu'à une baisse de l'instabilité génétique. Ces résultats permettent pour la première fois d'attribuer un rôle aux CSC CD24-/low dans la transmission de l'instabilité chromosomique. De plus, en apportant des informations pour évaluer la radiorésistance intrinsèque des tumeurs mammaires, le marquage CD24 pourrait contribuer à l'amélioration des protocoles de radiothérapie.

Le "coût de la reproduction" est un concept qui définit qu'un investissement à la reproduction élevé a un prix qui se paye ultérieurement par une accélération de la sénescence. Cela peut notamment traduire des compromis entre la reproduction et d'autres fonctions physiologiques comme la défense antioxydante. Chez l'huître creuse Crassostrea gigas, la reproduction représente une fonction physiologique majeure. Dans le cadre des études effectuées pour comprendre les mortalités estivales affectant cette espèce, une corrélation négative entre effort reproducteur et survie a été observée. D'autre part, des gènes antioxydants ont été mis en évidence comme différentiellement exprimés entre les lignées d'huîtres sélectionnées pour leur résistance ou leur sensibilité aux mortalités estivales. Certaines études proposent que la susceptibilité au stress oxydant puisse représenter un coût de la reproduction participant au processus de sénescence. Dans ce contexte, nous avons analysé la capacité antioxydante des huîtres en fonction de leur investissement reproducteur. Pour cela, la technique d'ARN interférence a été utilisée pour manipuler l'effort reproducteur des huîtres. L'expression des principales enzymes antioxydantes (taux de transcrits et activités enzymatiques) et le dosage de dommages oxydatifs ont ensuite été mesurés dans différents tissus et cellules de l'organisme (branchies, gonade, hémocytes et gamètes). Les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse suggèrent que la capacité antioxydante de C. gigas est particulièrement efficace et que la reproduction seule n'est pas suffisante pour induire un stress oxydant. Cette capacité antioxydante apparaît comme tissu-spécifique voire cellule-spécifique et le métabolisme du glutathion semble jouer un rôle majeur dans cette protection. Cette grande résistance au stress oxydant contribuerait à faire de C. gigas une espèce particulièrement adaptée à la vie dans des environnements stressants.

Objectifs : Comparer les effets de la plongée à l'air et en apnée sur la vasodilatation d'origine endothéliale et le stress oxydant. Ensuite, tenter de prévenir la dysfonction endothéliale post-plongée par une supplémentation en antioxydants. Méthodes : La fonction endothéliale des grosses artères est évaluée par la dilatation flux-dépendante (FMD) et celle des petites par pléthysmographie. Les concentrations plasmatiques de monoxyde d'azote (NO) furent évaluées en mesurant les nitrites/nitrates par colorimétrie. Les effets de 30g de chocolat noir furent testés en supplémentation 1h30 avant la plongée à l'air et 1h avant l'apnée. Résultats : La FMD diminue dans les 2 types de plongée. Le taux de NO est inchangé après la plongée à l'air alors qu'il augmente après l'apnée. En eau froide, le taux de NO se voit réduit chez les plongeurs en apnée. Lorsque le chocolat noir est administré en supplémentation à des plongeurs, la FMD est augmentée aussi bien après la plongée à l'air qu'en apnée. Le NO augmente après la plongée à l'air alors qu'il ne change pas après l'apnée. Conclusion : En apnée comme en plongée à l'air, la diminution de la FMD suggère qu'elle est liée à un stress oxydant puisqu'elle est prévenue par le chocolat noir. Le chocolat noir est un bon moyen préventif pour la dysfonction endothéliale aussi bien en plongée à l'air qu'en apnée. L'absence de variation du NO suggère que la diminution de la FMD est la conséquence d'une activité du système nerveux autonome et/ou d'une altération du muscle lisse vasculaire. Les mécanismes observés en plongée sont un bon modèle pour la personne âgée où du stress oxydant et une dysfonction endothéliale sont également retrouvés.

Les formes réactives de l'oxygène (FRO) ont un rôle bien établi dans l'oncogénèse et le fonctionnement des cellules tumorales en augmentant les capacités de prolifération et d'invasion cellulaire. Les FRO présentent une moindre toxicité dans les cellules normales où le niveau de stress oxydant est bas et les systèmes d'oxydoréduction opérationnels. Une modulation pharmacologique de l'équilibre d'oxydoréduction permet d'améliorer l'efficacité des molécules cytotoxiques qui agissent sur les FRO. L'activité anti tumorale de la chimiothérapie étant médiée en partie par le stress oxydant, nous nous sommes dans un premier temps intéressé aux variations du stress oxydant lors d'un traitement par le sorafenib (Nexavar©), un inhibiteur de tyrosine kinases. Nous avons mis en évidence une activité anti tumorale du sorafenib liée à l'augmentation de la production d'anion superoxyde par les cellules. Ce phénomène nous a permis d'identifier un marqueur prédictif d'efficacité du sorafenib, le dosage des Produits d'Oxydation Avancée des Protéines (AOPP), dans le sérum des patients cirrhotiques développant un carcinome hépatocellulaire. Sachant que l'efficacité anti tumorale des chimiothérapies conventionnelles passe en partie par l'induction de FRO, nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps au mangafodipir, un modulateur du stress oxydant, qui est connu pour augmenter l'index thérapeutique des agents cytotoxiques in vivo. Le mangafodipir diminue les effets toxiques du stress oxydatif dans des cellules non tumorales et potentialise l'activité anti tumorale de l'oxaliplatine. Ces données nous ont conduits à explorer in vivo et in vitro le mécanisme de la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine et le rôle protecteur du mangafodipir. Nous avons ainsi observé dans un modèle murin que le mangafodipir prévient la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine au niveau de la gaine de myéline. Nous avons confirmé ces résultats chez l'homme lors d'une étude de phase II. Compte tenu des taux plus élevés de FRO dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales, plusieurs stratégies ont été proposées pour cibler sélectivement les tumeurs sans endommager les tissus sains avec des modulateurs du stress oxydant. Notre troisième axe de travail a eu pour objectif d'identifier et de valider de nouvelles molécules liées à la modulation des FRO. Cette étude a été réalisée dans le cadre d'un projet du programme Européen Pierre et Marie Curie (International Training Network 7-FP7-2007-1-1-ITN201114), au sein du réseau REDCAT. Cette collaboration a permis de concevoir et de synthétiser de nouveaux agents thérapeutiques, les organochalcogenes. Nous avons mis en évidence in vitro et in vivo le potentiel anti tumoral de cette nouvelle classe thérapeutique et principalement celui du composé LAB027. Le LAB027 présente une activité anti tumorale seul ou associé à l'oxaliplatine. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'envisager l'évaluation précoce de l'efficacité du sorafenib par un marqueur du stress oxydant, les AOPP, de mettre en évidence l'effet anti-neurotoxique d'un mimétique de la superoxyde dismutase, le mangafodipir et d'identifier une nouvelle classe médicamenteuse en oncologie, les organochalcogènes. Ces optimisations thérapeutiques permettent d'envisager une meilleure prise en charge des malades traités par chimiothérapie afin d'optimiser l'efficacité des traitements utilisés en oncologie.

L'apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l'homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl'apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d'identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l'exécution de l'apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L'ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d'inhiber la fonction transporteur et d'activer la fonction pore d'ANT pourinduire l'apoptose. Il existe quatre isoformes d'ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d'ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d'ANT4 dans des cellules cancéreuses et l'intérêt d'ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l'expression de protéines anti-apoptotiques, l'adaptation auxstress cellulaires et l'activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l'aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l'apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l'apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d'espèces activées del'oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l'augmentation des EAO suite au déclenchement d'un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d'induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d'une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d'induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance.

La dureté du grain de blé est un des paramètres fondamentaux de la texture de l'albumen. Ce caractère, essentiel pour la valeur d'utilisation des farines, est fortement lié à l'absence ou à la modification des puroindolines. Afin de mieux comprendre la fonction biologique de ces protéines dans le grain de blé (Triticum aestivum L.), nous avons étudié à quatre stades de développement du grain la localisation subcellulaire des puroindolines par immunocytochimie et les protéomes dans deux lignées de blé quasi-isogéniques pour la dureté. Dès la fin de la cellularisation de l'albumen, les puroindolines sont localisées sur la face interne des membranes vésiculaires et dans les corps protéiques en formation, structures dans lesquelles s'accumulent les protéines de réserve du grain. L'analyse par AFFFF (Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation) des deux lignées Hard et Soft, qui diffèrent essentiellement par l'absence du gène Pina dans la lignée Hard, a montré une corrélation entre la dureté et la taille des polymères de protéines de réserve. L'analyse protéomique des fractions albumines/globulines et amphiphiles des grains en développement a révélé une augmentation des protéines de la machinerie de repliement et de réponse au stress dans la lignée Hard, par rapport à la lignée Soft. Les deux approches méthodologiques utilisées semblent également mettre en évidence une cinétique de développement du grain raccourcie dans la lignée Hard. Ces observations suggèrent que les puroindolines interagissent avec les protéines de réserve du grain et suivent le même routage cellulaire. Elles pourraient être impliquées dans les mécanismes de repliement et d'assemblage des prolamines.

La consommation de polyphénols, micronutriments largement répandus dans lesaliments d'origine végétale, a été associée à la diminution du risque de développement denombreuses pathologies telles que maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénérativesou cancers. Cet effet des polyphénols s'explique en partie par leurs propriétés antioxydanteset anti-inflammatoires. Du fait de leur faible absorption au niveau de l'intestin grêle, lespolyphénols sont présents en grande quantité dans le côlon où ils peuvent exercer cespropriétés. L'inflammation intestinale fait interagir le système immunitaire intestinal avecde nombreux facteurs environnementaux et est fréquemment associée à une augmentationdu stress oxydant via la production d'espèces réactives de l'oxygène par les cellulesimmunitaires. De nombreuses études ont montré, sur des modèles animaux d'inflammationintestinale, les effets protecteurs de certains polyphénols. La verveine odorante (Aloysiatriphylla (L'Hérit.) Britton) est une plante médicinale connue pour ses vertus thérapeutiquesdigestives et anti-spasmodiques et couramment consommée en infusion. L'infusé deverveine odorante contient de grandes quantités de polyphénols (acides phénoliquescomplexes et dérivés de flavones) et ses propriétés antioxydantes ont été mises en évidenceaussi bien in vitro qu'in vivo.L'objectif de cette thèse a donc été d'évaluer l'effet d'une consommation préventived'un infusé de verveine odorante à dose nutritionnelle (40 g/l et 4 g/l) sur le développementd'une inflammation intestinale modérée chez le rat. Des rats Wistar ont consommé commeboisson l'infusé de verveine seul pendant deux semaines puis associé à un agentinflammatoire, le sulfate de dextran sodique (DSS), à 4% pendant 7 ou 9 jours. L'effet de laverveine a été évalué sur différents paramètres cliniques (diarrhée, saignements rectaux,poids corporel), marqueurs de l'inflammation (longueur du côlon, score histologique,activité myéloperoxydase, cytokines) et du stress oxydant (peroxydation lipidique,glutathion, défenses antioxydantes enzymatiques). Les cellules immunitaires ont étéidentifiées dans le sang ainsi que dans les structures lymphoïdes secondaires par cytométrieen flux. Enfin l'étude du métabolisme des polyphénols en situation inflammatoire ou non aété initiée par l'analyse de l'excrétion urinaire des dérivés polyphénoliques.Lors d'une inflammation de 7 jours, la consommation préventive d'infusé deverveine à 40 g/l et 4 g/l retarde l'apparition de diarrhée et de saignements rectaux, limite larétraction du côlon et la diminution de la prise de poids des rats. Malgré l'absence d'effetsur l'activité myéloperoxydase, l'infusé à 40 g/l atténue les altérations histologiques de lamuqueuse colique induites par l'inflammation. L'infusé à 4 g/l stimule l'activité de lasuperoxyde dismutase et réduit la peroxydation lipidique. Les deux infusés modulent lespopulations de cellules immunitaires dans les structures lymphoïdes secondaires (ganglionsmésentériques et plaques de Peyer), en particulier les lymphocytes B et les lymphocytes Tcytotoxiques. L'excrétion urinaire des polyphénols de la verveine est faible et n'est pasaffectée par l'inflammation. Lors d'une inflammation de 9 jours, les deux infusés limitentl'augmentation d'activité de la myéloperoxydase. Seul l'infusé à 40 g/l limite la rétractiondu côlon, stimule l'activité de la glutathion réductase et diminue les taux d'IL-6 et deTNF-α. Ainsi, nous avons montré qu'une consommation préventive d'un infusé de verveineodorante offre des effets protecteurs lors de l'inflammation intestinale en agissant àdifférents niveaux. L'exploration des voies de signalisation impliquées pourrait permettre demieux comprendre les effets protecteurs de cette boisson de consommation courante.

L'obésité et le diabète de type 2 s'accompagne généralement d'un stress oxydant chronique, participant à l'installation et la progression du diabète, mais également à l'apparition de nombreuses complications dont les macro- et micro-angiopathies. Certains aliments, comme les fruits et légumes naturellement riches en molécules anti-oxydantes, représentent ainsi un réel potentiel de prévention dans ce contexte. Cette étude s'est intéressée au pouvoir anti-oxydant des fruits et légumes. Nous avons démontré que la majorité des fruits et légumes doivent leur capacité anti-radicalaire a des composés polaires. Leur étude par une méthode séparative (HPLC) couplée à une détection spécifique de capacité anti-radicalaire, a permis de révéler quelles sont les molécules réellement actives. Le chou rouge a été révélé comme aliment à fort potentiel anti-oxydant, de par la présence de nombreuses cyanidines dotés de capacités anti-radicalaires. L'étude in vitro sur un modèle cellulaire (RINm5F) a confirmé l'action anti-radicalaire des polyphénols des fruits et légumes. L'extrait de chou rouge a ainsi permis la suppression du stress oxydant induit par un hyperinsulinisme. Enfin, une étude in vivo, sur le modèle de rat diabétique, a permis de confirmer les effets anti-oxydants et anti-diabétiques du chou rouge, même lorsque sa consommation est associée à un régime hypercalorique. Cependant, le chou rouge doit être associé à une alimentation équilibrée afin d'être bénéfique à long terme.