La première partie de ce travail est réalisé dans le but de préparer des produits pouvant jouer un rôle très important de l’imagerie cellulaire des lipopolysaccharides sur la surface des cellules bactériennes, tout en utilisant des méthodes fiables telle que la ‘’chimie click’’. Dans un premier temps, nous avons synthétisé une première génération d’outils fluorescents à base de rhodamine B et fluorescéine modifiée par une fonction oxyde de nitrile. Dans un deuxième temps nous avons cherché les meilleures conditions d’applications de la chimie click 3+2 sans cuivre, entre la fonction oxyde de nitrile et le motif saccharidique complémentaire portant une fonction vinylique. Finalement, nous avons appliquée, avec succès, la méthode click avec cuivre sur plusieurs types de bactéries portant sur leur membrane cellulaire des lipopolysaccharides ayant un motif ‘’Kdo’’ fonctionnalisé par un groupement azoture déjà synthétiser au sein de notre équipe, et une sonde fluorescente porteuse d’une fonction alcyne. Une nouvelle génération d’outils de marquage saccharidique est en cours de finalisation dans le but d’optimiser les conditions finales, tel que le dérivé de ‘’Kdo’’ fonctionnalisé cette fois-ci par des dérivées cycliques, bicycliques et aromatiques porteurs d’une fonction alcyne ou alcène, pour réaliser les derniers essais de marquage in vitro. Le stress oxydant est lié au vieillissement des cellules et à de nombreuses maladies: cardiovasculaire, cancer, diabète, Alzheimer… Il est dû à un déséquilibre entre le système oxydant / antioxydant au niveau des cellules, et se caractérise par la présence principalement de substance radicalaires réactives oxygénées. Dans le but d'identifier le taux de substances réactives oxygénées dans les cellules, le travail dans la deuxième partie de la thèse reposait sur la synthèse multi étape d'une molécule fluorescente dérivée de la coumarine. Le composé ciblé est le peroxyde d'oxygène, connu sous le nom d'eau oxygénée. Possédant un ester vinyl-boronique, notre molécule sera oxydée et réarrangée en aldéhyde conduisant à la condensation intramoléculaire avec le groupement aminé adjacent pour former un cycle indolique, libérant ainsi de la fluorescence. La recherche des conditions optimales de la dernière étape de la voie synthétique sont toujours en cours d’optimisation. Dans le futur, on cherchera les conditions optimales de la dernière étape de la synthèse de la sonde spécifique au peroxyde d’oxygène. Cette molécule est d'une importance remarquable comme sonde du stress oxydant. En réussissant cette étape, on pourra avoir en main une bibliothèque de ‘’KDO’’ fonctionnalisé afin d’avoir des résultats satisfaisants in vivo. / The first part of this work is done in order to prepare products that play a very important role in cellular imaging lipopolisaccharides on the surface of bacterial cells, while using reliable methods such as '' click chemistry ''. Initially, we synthesized the first generation of tools based fluorescent rhodamine B and fluorescein -modified nitrile oxide function. In a second step we sought the best possible applications of click chemistry 3+2 copper free, between the nitrile oxide function and the additional saccharide unit with a vinyl function. Finally, we applied successfully, the click method with copper on several types of bacteria on their cell membrane lipopolysaccharides having a pattern Kdo functionalized azide group already synthesized within our team, and a probe carrying a fluorescent alkyne. A new generation of tools saccharide marking is being finalized in order to optimize the final terms, such as derivative functionalized Kdo this time by cyclic, bicyclic and aromatic derivatives holders of an alkene or alkyne function to perform final testing of in vitro labeling. Oxidative stress is linked to cell aging and many diseases: cardiovascular disease, cancer, diabetes, Alzheimer's ... It is due to an imbalance between oxidant system/antioxidant in cells, and is characterized mainly by the presence of radical substance reactive oxygen. In order to identify the rate of reactive oxygen substances in cells, work in the second part of the thesis based on multi- step synthesis of a fluorescent molecule derived from coumarin. The target compound is oxygen peroxide, known as the name of hydrogen peroxide. Having a vinyl boronic ester, this molecule will be oxidized and rearranged aldehyde leading to intramolecular condensation with the adjacent amino group to form an indolique ring , thereby releasing fluorescence. The search for optimal conditions for the last step of the synthetic pathway is still being optimized. In the future, the optimal conditions for the last step of the synthesis of specific probe oxygen peroxide are sought. This molecule is remarkable importance as a probe of oxidative stress. By passing this step, we will have on hand a library of KDO functionalized to have satisfactory results in vivo.

Un pontage ADN-protéine se forme lorsqu'une protéine se lie de façon covalente à l'ADN, ce qui a pour conséquence de bloquer certains processus biologiques tels que la réplication, la transcription, la réparation ou la recombinaison. Ces travaux de thèse consistent en l'étude des pontages se produisant lors d'une oxydation à un électron de l'ADN. La guanine possède le potentiel d'ionisation le plus bas parmi les composants de l'ADN; elle est donc facilement oxydée pour former un radical cation, lui-même impliqué dans la formation de nombreuses lésions oxydatives. Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence la formation d'un adduit entre la guanine et la lysine, résultant de l'oxydation à un électron d'un oligonucléotide TGT en présence d'un peptide trilysine. Le mécanisme de cette réaction est une addition nucléophile de l'acide aminé central par le groupement amine ε, en position C8 du radical cation de la guanine. L'objectif de cette thèse a été de caractériser l'adduit guanine-lysine, de le quantifier dans l'ADN isolé puis dans l'ADN cellulaire, et d'étudier son implication dans la formation des pontages ADN-protéines. Différentes espèces nucléophiles sont capables de s'additionner sur le radical cation de la guanine. Nous nous sommes intéressés au cas des polyamines endogènes, qui sont des cations organiques présents en particulier dans le noyau des cellules. Ces molécules interviennent dans la stabilisation et la condensation de l'ADN, mais elles participent également à de nombreux processus cellulaires. Le lien entre polyamines et cancer a été largement décrit. Cependant le mécanisme par lequel la perturbation de leur métabolisme est impliquée dans le processus cancérogenèse reste à ce jour peu connu.Dans un premier temps, ces lésions ont été synthétisées chimiquement, sous la forme de nucléosides modifiés, afin de les caractériser. Par la suite des méthodes de quantification de ces dommages par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem ont été développées. Ces méthodes analytiques nous ont permis de démontrer que les adduits guanine-lysine et guanine-polyamines pouvaient se former dans l'ADN isolé suite à une oxydation à un électron. Des pontages entre guanine et lysine ont été mis en évidence dans l'ADN extrait de cellules THP1 irradiées par impulsions laser à 266 nm. Nous avons ensuite développé différents modèles de pontages entre un peptide et un oligonucléotide, afin d'étudier la structure chimique du pontage, et de déterminer si celui-ci pouvait se produire entre la guanine et la lysine. Des adduits guanine-polyamines ont également été détectés dans de l'ADN extrait de spermatozoïdes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle physiologique des polyamines ainsi que de leur implication dans la fertilité masculine. / A DNA-protein crosslink (DPC) occurs when a protein becomes covalently bound to DNA. This kind of lesions seems to affect several metabolic processes, including DNA replication, transcription, repair and recombination. This PhD work deals with crosslinks which are formed through a one-electron oxidation of DNA. Guanine exhibits the lowest ionization potential among DNA components, therefore it is readily oxidized leading to the formation of a radical cation, which is involved in the formation of numerous oxidative DNA lesions. In a previous study, a crosslink between guanine moiety and a lysine residue, generated subsequently to a one electron oxidation of a TGT oligonucleotide in the presence of a trilysine peptide, has been described. The mechanism of formation of this adduct relies on the nucleophylic addition of the ε amino group of lysine onto the C8 position of the guanine radical cation. The aim of the present work was to characterize the guanine-lysine adduct and to quantify this lesion in isolated DNA and then in cellular DNA, and to investigate their implication in DNA-protein crosslinks. Several nucleophylic species are able to react with the guanine radical cation. We focused on polyamines, which are organic cations localized in the nucleus of cells at millimolar concentration ranges. These molecules are involved in stabilization and condensation of DNA, and participate also in numerous cellular processes. The relation between polyamine and cancer has been widely described. The mechanism by which dysregulation in their metabolism is related to carcinogenesis is still unknown.In the first part of this project, we focused on the synthesis and the characterization of these lesions as modified nucleosides. Subsequently, we have developed and optimized methods of quantification of these damages, using HPLC coupled with tandem mass spectrometry. Thanks to these analytical methods, we have demonstrated that guanine-lysine and guanine-polyamines adducts could be formed in isolated DNA following a one electron oxidation. Crosslinks between guanine and lysine have been highlighted in DNA extracted from THP1 cells exposed to laser pulses at 266 nm. We have then developed several crosslinks models between a peptide and an oligonucleotide, in order to investigate the chemical structure of the crosslink and determine whether it could occur between guanine and lysine. Guanine-polyamines adducts have also been detected in DNA extracted from sperm cells. These results open new prospects in the understanding of the physiological role of polyamines as well as their involvement in male fertility.

SoxR est un régulateur transcriptionnel à centre [2Fe-2S] qui induit une réponse adaptative permettant à E. coli de résister aux composés redox actifs, générateurs de stress superoxyde. En présence de composés redox actifs, le centre [2Fe-2S] de SoxR est oxydé ce qui lui permet d’activer l’expression du gène soxS codant pour un régulateur transcriptionnel activant l’expression d’une centaine de gènes. Parmi les gènes du régulon SoxRS on trouve ceux permettant de résister au superoxyde mais aussi aux antibiotiques. J’ai montré qu’en présence de phénazine méthosulfate (PMS), un composé redox actif, la machinerie de biogénèse des centres Fe-S utilisée pour la maturation de SoxR est différente suivant les conditions environnementales. En effet, en aérobie la maturation de SoxR est assurée par la machinerie SUF, alors qu’en anaérobie c’est la machinerie ISC qui intervient. J’ai également étudié l’importance de SoxR, et des machineries ISC et SUF, dans la résistance aux antibiotiques induite par la présence de PMS. J’ai montré qu’en présence de PMS, E. coli peut résister à la norfloxacine, par un mécanisme SoxR dépendent, et ceci quelque soit la machinerie de biogénèse des centres FeS présente. D’autre part, j’ai étudié l’impact des conditions environnementales, comme la teneur en CO2 dans l’atmosphère sur la capacité d’ E. coli à résister au stress oxydant. J’ai testé, expérimentalement les prédictions obtenues par un modèle d’équations différentielles permettant de simuler la concentration des ROS dans la cellule. J’ai montré que le CO2 a un effet de protection lors d’un stress au H2O2 probablement en capturant les HO• produits par la réaction de Fenton. / SoxR is a [2Fe-2S] cluster-containing transcriptional regulator that mounts the adaptive response allowing E. coli to tolerate superoxide-propagating compounds. When cells are exposed to redox cycling drugs the Fe-S cluster of SoxR undergoes a reversible univalent oxidation to yield the oxidized active protein. The only known target of SoxR is the soxS gene that is itself a transcriptional regulator activating the expression of more than 100 genes including those for superoxide and antibiotic resistance. I showed that the machinery used to mature SoxR under phenazine methosulfate (PMS) exposition, a redox cycling drug, was different depending on the environmental conditions used. In aerobiosis, the SUF machinery ensured SoxR maturation, while in anaerobiosis the ISC machinery was required. I also monitored the implication of SoxR, the ISC and SUF machineries, in antibiotic resistance induced by PMS exposition. I showed that E. coli can resist to norfloxacin under PMS exposition in a SoxR-dependent manner whatever the Fe-S cluster biogenesis machinery available. Last, I studied the impact of environmental conditions, such as atmospheric CO2 concentration, on the ability of E. coli to cope with oxidative stress. I have experimentally tested the predictions obtained by a mathematical model that simulates ROS dynamics. I showed that carbon dioxide has a protective effect on hydrogen peroxide stress likely by scavenging the radical hydroxyl produced by the Fenton reaction.

Le développement d'organismes photosynthétiques (piégeant le C02 en préservant l'eau douce et les terres cultivables sans ajout d'engrais) capables d'utiliser l'énergie solaire pour produire du dihydrogène (H2) passe par une meilleure compréhension du rôle de l'hydrogénase dans le métabolisme cyanobactérien. Le Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobatéries où j'ai travaillé durant ma thèse utilise une approche de "Biologie Intégrative" pour analyser le métabolisme qui conduit à la photo-production d’H2 chez la cyanobactérie modèle Synechocystis sp. PCC6803. Mon travail s'est focalisé sur l’analyse des réseaux de régulation amenant à la production d'H2 par l’hydrogénase bidirectionnelle à centre Ni-Fe (composée de 5 sous-unités) codée par l’opéron hox. Lorsque j’ai débuté ce travail, 2 activateurs de l’opéron hox avaient été identifiés: AbrB1 et LexA. Un article dont je suis co-premier auteur est paru (Dutheil et al. 2012 J Bact.), il décrit l'identification par l'utilisation de diverses approches d'un nouveau facteur de transcription de l'opéron hox: AbrB2 (homologue d'AbrB1). J'ai ainsi montré que l'expression de l’opéron hox était régulée négativement par AbrB2 en utilisant des fusions transcriptionnelles au gène rapporteur cat (introduites dans la souche sauvage ou dépourvues d'AbrB2) ainsi que des expériences de qRT-PCR. Par la technique de retard sur gel, nous avons confirmé une interaction directe entre AbrB2 et la région promotrice de l’opéron hox. En collaboration avec deux laboratoires du CEA, nous avons montré qu'un mutant dépourvu d’AbrB2 possède une activité hydrogénase augmentée, confirmant ainsi qu'AbrB2 est un régulateur négatif de la production d'H2.Dans un deuxième temps et en collaboration avec deux post-doc du laboratoire, nous avons mis en évidence le rôle de la cystéine unique d'AbrB2 dans le contrôle redox de son activité de régulation transcriptionnelle.Par la technique du retard sur gel,j’ai montré que cette cystéine n’est pas cruciale pour la fixation d'AbrB2 sur le promoteur hox, mais que par contre, la modification redox de celle-ci l’affecte de manière drastique. Dans le cadre de collaborations, nous avons identifié la modification post-traductionnelle qui peut avoir lieu sur la cysteine d'AbrB2 et il s’agit de la première fois, qu’un tel mécanisme de régulation est identifié pour cette famille de régulateur et chez les cyanobactéries. J’ai construit une souche portant l'allèle muté abrB2 Cys>Ser sur le chromosome et exprimé par le promoteur sauvage d’abrB2. J’ai montré grâce à cette construction et en utilisant diverses techniques (activité hydrogénase, qRT-PCR, Western blot et transcriptome) que la cystéine d'AbrB2 joue un rôle dans son activité de régulation qui est 60% moins bonne sur les 529 gènes cibles (directes ou indirectes) du régulateur muté. L’effet est également visible sur l’activité hydrogénase. Ce résultat a été complété par des tests de surexpression thermoinduite d’AbrB2 qui montrent que la mutation C34S affecte la stabilité de la protéine qui ne s’accumule pas autant que la sauvage dans les même conditions et dont la surexpression est létale. Un manuscrit dont je suis copremier auteur et décrivant ces résultats est en cours de finalisation et sera prochainement soumis à l’Intern. Journ. of Hydrogen Energy.L’ensemble de ces travaux permet de mieux comprendre les mécanismes biologiques liés à l’expression de l’hydrogénase bidirectionnelle et vont dans le sens d’un rôle important de celle-ci dans la détoxification des stress redox. La détermination des relations entre les différents régulateurs de l’hydrogénase et les possibles modifications post-traductionnelles de chacun de ces facteurs que j’ai mises en évidence traduisent une enzyme à la régulation complexe. Ces nouvelles connaissances permettent d’éclairer sous un angle nouveau la photoproduction d’H2 par les cyanobactéries et permettront peut-être d’élaborer des stratégies de production d’H2 efficace. / Developing photosynthetic organism (trapping CO2 while preserving fresh water and arable soils without adding fertilizers) able to use Sun light to produce dihydrogen (H2) is depending on a better understanding of the role of hydrogenase in the cyanobacterial metabolism. The Laboratoire de Biologie et Biotechnologie des Cyanobactéries (LBBC) where I worked during my thesis uses « Integrative Biology » approach to analyze the metabolism leading to H2 photoproduction by the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803. My work focused on analyzing the regulation network leading to H2 production by the bidirectionnal hydrogenase with Ni-Fe cluster (composed of 5 subunits) encoded by hox operon. When I started this work, two transcriptionnal activators were identified : AbrB1 and LexA. An article, of which I’m sharing first author position, is published (Dutheil et al. 2012 J Bact.), it describes the identification by different approachs of a new transcriptionnal factor of hox operon : AbrB2 (homologous to AbrB1). I showed that hox expression is negatively regulated by AbrB2 by using transcriptionnal fusion to cat reporter gene (introduced in the wild type background or the AbrB2-deleted one) and qRT-PCR experiments. By the electrophoretic mobility shift assay (EMSA) method, we confirmed a direct interaction between AbrB2 and the promoter region of hox operon. Collaborating with two CEA laboratories, we showed that a mutant lacking AbrB2 harbours an increased hydrogenase activity, validating that AbrB2 is a negative regulator of H2 production.In a second time of my thesis and colaborating with two post-doc of the laboratory, we evidenced the role of the unique cysteine of AbrB2 in redox-controlling the transcriptionnal regulator activity of the protein.Using the EMSA method, I showed that the cysteine is not crucial for AbrB2 fixing on hox promoter, but also that the redox modification occuring on this residue inhibits this same binding activity. Collaborating with other labs, we identified the post-translational modifications that may occur on AbrB2 cysteine and it is the first time that such a regulating mechanism is identified for this family of regulators and in cyanobacteria. I constructed a strand harbouring the abrB2C34S mutant allele on the chromosome and expressed by the abrB2 natural promoter. I showed with this construction and using diverse methods (hydrogenase activity, qRT-PCR, Western blot and transcriptome) that AbrB2 cysteine plays a role in its regulating activity : regulating activity is 60% less efficient towards the 529 target genes (either direct and indirect) of the mutated regulator. The effect is also seen on hydrogenase activity and hox genes. This result was completed by thermoinduced overexpression assays that show that C34S mutation of AbrB2 alters protein stability : the mutated protein accumulates less than wild type allele in the same conditions, which is lethal. A manuscript, of which I’m sharing first author position, and describing those results is being finalised and will be submitted soon to the IJHE (International Journal of Hydrogen Energy).Altogether, my results allow a better understanding of the biological mechanisms linked to bidirectionnal hydrogenase expression and agree with a possible role for hydrogenase in detoxifying redox stresses. The determination of the relationships between the different regulators of hydrogenase, and their possible post-translational modifications that I revealed, highlight an enzyme with complex regulation. This new knowledge brings an original outlook on hydrogen photoproduction by cyanobacteria and shall allow elaboration of efficient H2 production strategies.

Le premier objectif de cette thèse était de déterminer les effets isolés et combinés de l'alpha thalassémie, des polymorphismes inducteurs (QTLs) de l'HbF et du génotype G6PD dans un contexte d'évolution naturelle de la drépanocytose (Etudes 1 et 2). L'étude 1 a permis d'évaluer pour la première fois les fréquences alléliques de ces gènes modificateurs chez 301 enfants sénégalais SS. Contrairement aux autres populations africaines, le Variant Betica de la G6PD était majoritaire par rapport au variant A(-). De plus, 12% de notre cohorte avait un déficit en G6PD combiné à une absence d'alpha-thalassémie. Ces patients-là seront à privilégier pour la réalisation d'un Doppler transcrânien. Les résultats obtenus dans l'étude 2 nous ont permis de conclure que l'alpha-thalassémie et les QTLs de l'HbF sont interdépendants et ne doivent pas être étudiés séparément pour une prédiction clinique précise. En effet, une combinaison d'alpha-thalassémie avec au moins 2 QTLs de l'HbF est nécessaire pour retarder de manière significative la première complication de la maladie. Cependant, une alpha-thalassémie homozygote, même associée à 3 à 6 QTLs de l'HbF, augmente la fréquence des CVO pendant l'enfance. Par conséquent, une alpha-thalassémie hétérozygote avec au moins deux QTL HbF constituerait le génotype le plus favorable relativement à la survenue des CVO. Le deuxième objectif de cette thèse était d'étudier les interrelations entre le stress oxydant (phénotype et génotype) et la sévérité clinique de la maladie (Etudes 3 à 4). La drépanocytose est caractérisée par un stress oxydatif élevé pouvant expliquer une partie des manifestations cliniques. Nos résultats ont montré que l'alpha-thalassémie homozygote semble diminuer le stress oxydatif, ce qui contribuerait à son effet protecteur sur certaines complications du sous-phénotype hémolytique. En outre, les patients qui ont le moins d'hospitalisations et de CVO semblent présenter une meilleure défense antioxydante (activités catalase et GPx augmentées). Dans l'étude 4 nous avons étudié 4 SNPs de gènes du stress oxydant (rs4880 du gène SOD2, rs207454 du gène XO, rs233322 du gène MPO et rs35652124 du gène NFE2L2). Le SNP rs4880 aurait un effet favorable au niveau biologique (réticulocytose moindre, activité GPx augmentée) mais sans traduction clinique associée. Il en est de même pour rs233322 qui serait associé à une hémolyse et à un stress oxydatif (AOPP) plus importants. En revanche, une tendance à un effet protecteur de rs207454 vis-à-vis de certaines complications (hospitalisations, ostéonécrose, sepsis, STA) a été observée. Notre travail contribue à la compréhension de l'impact des gènes modificateurs dans la drépanocytose. Il pourrait donc permettre, via une sélection positive des patients à risque, d'améliorer la prise en charge de la maladie dans les pays où les traitements de fond (hydroxyurée, doppler transcrânien, échanges transfusionnels) ne peuvent être proposés à tous / The primary objective of this thesis was to determine the isolated and combined effects of alpha-thalassemia, inductors polymorphisms (QTLs) of HbF and genotype G6PD in a context of natural progression of sickle cell disease (Studies 1 and 2). Study 1 was undertaken to evaluate for the first time the allelic frequencies of these modifiers genes in 301 Senegalese SS children. Unlike other African populations, the G6PD Betica Variant was predominant over the A (-) variant. In addition, 12% of our cohort had G6PD deficiency combined with no alpha-thalassemia. These patients will be favoured for the realization of a transcranial doppler. The results obtained in Study 2 allowed us to conclude that alpha thalassemia and QTLs of HbF are interdependent and should not be studied separately for accurate clinical prediction. Indeed, a combination of alpha thalassemia with at least 2 QTLs of HbF is required to significantly delay the first complication of the disease. However, a homozygous alpha thalassemia, even associated with 3 to 6 QTLs of HbF, increases the frequency of CVOs during childhood. Therefore, a heterozygous alpha-thalassemia with at least two QTL HbFs would be the most favourable genotype for the occurrence of CVOs. The second objective of this thesis was to study the interrelationships between oxidative stress and the clinical severity of the disease (Studies 3 to 4). Sickle cell disease is characterized by high oxidative stress that may explain some of the clinical manifestations. Our results showed that homozygous alpha-thalassemia appears to reduce oxidative stress, which would contribute to its protective effect on certain complications of the hemolytic sub-phenotype. In addition, patients with the least hospitalization and CVO appear to have better antioxidant defense (catalase and GPx activities increased). In Study 4 we studied 4 SNPs of oxidative stress genes (rs4880 of the SOD2 gene, rs207454 of the XO gene, rs233322 of the MPO gene and rs35652124 of the NFE2L2 gene). The rs4880 SNP would have a favourable effect on the biological level (less reticulocytosis, increased GPx activity) but without associated clinical translation. The same is true for rs233322, which is associated with greater haemolysis and oxidative stress (AOPP). On the other hand, a tendency to a protective effect of rs207454 for some complications (hospitalizations, osteonecrosis, sepsis, STA) was observed. Our work contributes to the understanding of the impact of modifiers genes in sickle cell disease. It could therefore, through a positive selection of at-risk patients, improve the management of the disease in countries where the basic treatments (hydroxyurea, transcranial doppler, blood transfusion) cannot be offered to all

L'insuffisance rénale chronique (IRC) demeure un problème de santé publique du fait de l'augmentation de sa prévalence. Malgré l'amélioration de la prise en charge, le taux de mortalité reste plus élevé comparé à la population générale. Parmi les causes de décès, les maladies cardiovasculaires, d'origine multifactorielle (élargissement et hypertrophie des artères, athérosclérose, calcifications vasculaires et valvulaires) sont au premier plan. A côté des facteurs de risque classiques, des facteurs non traditionnels, liés aux perturbations métaboliques de l'IRC, ont été mis en évidence, comme l'inflammation, la malnutrition, le stress oxydant, les anomalies du métabolisme minéralo-osseux. La meilleure connaissance de la physiopathologie de la vasculopathie de l'IRC permet d'émerger de nouveaux biomarqueurs pour stratifier le risque cardiovasculaire chez l'IRC.OBJECTIFS-METHODOLOGIE GENERALE : Nous avons réalisé une approche biochimique pour explorer trois composantes du risque cardiovasculaire chez l'IRC : stress oxydant, perturbations qualitatives des HDL (high-density lipoprotein) et métabolisme minéralo-osseux.RESULTATS : Dans une première publication la production d'anion superoxyde a été évaluée, via une méthode de chemoluminescence, en fonction du stade de l'IRC. Alors que la surproduction de formes réactives de l'oxygène est bien connue au stade 5d et peut être liée à la procédure dialytique, il existe peu de données aux stades précoces. Notre étude a porté sur 136 patients IRC non dialysés des stades 1à 5. Les résultats montrent que la production de FRO est assurée aux stades 4 et 5. Un bas débit de filtration glomérulaire (MDRD<30ml/min/1.73m2), l'inflammation (fibrinogène >3.7g/l) et des taux anormaux d' HDL (<1.42mM et >1.75mM) apparaissent comme les principaux déterminants du stress oxydant chez l'IRC non dialysé.Alors que dans la population générale, un taux bas de HDL est reconnu comme un facteur de risque important, nous avons montré (publication 1) que des taux anormaux de HDL, bas comme hauts, étaient indépendamment associés au stress oxydant chez les sujets IRC. Dans une deuxième publication, nous avons précisé la composition des HDL en se basant sur d'éventuelles modifications qualitatives des protéines associées à la structure des lipoprotéines. Une étude protéomique a été réalisée chez 7 patients hémodialysés versus 7 sujets sains. Nous avons retrouvé 40 protéines exprimées différemment sur les 122 identifiées, dont l'apoCII, l'apoCIII qui sont significativement augmentées et la transferrine abaissée. Ces protéines interviennent dans de nombreuses fonctions comme la réponse inflammatoire, l'activation du complément, la régulation de l'oxydation des lipoprotéines, l'homéostasie des cations.Dans une troisième publication, l'épuration du FGF23, phosphatonine impliquée dans les anomalies du métabolisme minéralo-osseux, été étudiée chez l'hémodialysé chronique en fonction de la techniques de dialyse (hémodialyse (HD) high flux versus hémodiafiltration on line (OL-HDF)). Notre étude a porté sur 53 patients dans le groupe HD et 32 patients dans le groupe OL-HDF. Dans les deux groupes le taux de FGF23 en post-dialyse est significativement plus bas qu'en pré-dialyse. Cependant, le taux de réduction, la clairance et le KT/V du FGF23 sont significativement plus bas dans le groupe OL-HDF.CONCLUSION-PERSPECTIVES : Chez l'IRC, avec l'appariation de facteurs de risque non traditionnels, de nouveaux biomarqueurs ont émergés dans la stratification du risque cardio-vasculaire. Ces biomarqueurs peuvent devenir des bioacteurs et représenter de nouvelles cibles d'action et de prévention de l'atteinte cardio-vasculaire chez l'IRC. La complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués, nous incite à proposer des approches multimarqueurs. Actuellement des études biocliniques se poursuivent en mettant en place des cohortes régionales de patients aux stades 1 à 5 et de patients incidents en dialyse. / BACKGROUND: Chronic kidney disease (CKD) is a public health problem because of its increasing prevalence. Despite care improvements, the mortality rate remains higher compared to general population. Among causes of death, cardiovascular diseases with multifactorial origins (enlargement and hypertrophy of arteries, atherosclerosis, vascular and valvular calcifications) are in the foreground. Besides the traditional risk factors, non-traditional factors associated with metabolic disorders in CKD were bring out, such as inflammation, malnutrition, oxidative stress, mineral and bone disorder. A better knowledge of vasculopathy physiopathology in CKD allows the emergence of new biomarkers to stratify cardiovascular risk in CKD.AIMS-METHODOLOGY: We performed a biochemical approach to explore three components of cardiovascular risk in CKD: oxidative stress, qualitative alterations of HDL (high-density lipoprotein) and mineral and bone disorder.RESULTS: In a first publication, the superoxide anion production, according to the stage of CKD, was assessed using a chemiluminescence method. While the overproduction of reactive oxygen species is well known at the 5d stage of CKD and may be related to the dialysis procedure, there are few data in the early stages. Our study included 136 non-dialysis patients at stages 1 to 5 of CKD. Results showed an enhanced superoxide production at the pre-dialysis phase, stages 4 and 5 of CKD. Reduced glomerular filtration rate (MDRD <30 ml / min / 1.73m2), inflammation (fibrinogène≥3.7g / l) and abnormal levels of HDL (<1.42mM and ≥1.75mM) appears as main determinants of oxidative stress in non-dialysis CKD patients.While in general population, a low HDL rate is recognized as an important risk factor, we showed (publication 1) that abnormal levels of HDL, low as high, were independently associated with oxidative stress in CKD subjects. In a second publication, we have defined the HDL composition based on qualitative changes in the structure of proteins associated with lipoproteins. A proteomic study was performed in 7 patients on hemodialysis versus 7 healthy subjects. We found 40 proteins differently expressed on the 122 identified, including apoCII, apoCIII which are significantly increased and transferrin lowered. These proteins are involved in many functions such as inflammatory response, complement activation, regulation of lipoprotein oxidation and homeostasis cations. In a third publication, the removal of FGF23, phosphatonin involved in mineral and bone metabolism, was studied in chronic hemodialysis according to the dialysis techniques (high flux hemodialysis (HD) versus on line hemodiafiltration (OL- HDF)). Our study included 53 patients in the HD group and 32 patients in the OL-HDF group. In both groups the rate of FGF23 in post-dialysis was significantly lower than in pre-dialysis. However, rate of reduction, clearance and KT / V of FGF23 were significantly lower in the OL-HDF group.CONCLUSION-PROSPECTS: In the IRC, with the appearance of non traditional risk-factors, new biomarkers have emerged in the stratification of cardiovascular risk. These biomarkers can become bioactors and represent novel targets of action and prevention in the cardiovascular disease in CKD. The complexity of the involved physiopatholological mechanisms, leads us to propose multimarkers approaches. Currently bioclinical studies continue with the constitution of regional cohorts of patients at stages 1 to 5 of CKD and incident dialysis.

Environ 5% des patientes sont diagnostiquées chaque année avec un cancer du sein d’emblée métastatique et 20 à 30% des cancers du sein localisés évoluent vers un stade secondairement métastatique. Les bénéfices de l’activité physique pendant les traitements chez les patientes avec un cancer du sein localisé ont largement été démontrés mais la littérature est limitée dans le cancer du sein métastatique. Ce travail de thèse a permis d’évaluer les effets potentiels de l’activité physique chez des patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique à travers trois études.L’étude observationnelle StoRM a montré une association du niveau d’activité physique recueilli par questionnaire à une meilleure survie des patientes HER2. L’étude interventionnelle ABLE a mis en évidence la faisabilité d’une intervention en activité physique avec une montre connectée dans cette population avec un excellent taux d’adhérence (96%), l’intérêt et la volonté des patientes pour les programmes d’activité physique ainsi qu’une amélioration fonctionnelle. L’intervention a contribué au un maintien de la qualité de vie, de la fatigue et du niveau d’activité physique malgré les traitements et l’avancée de la maladie. De potentiels biomarqueurs prédictifs d’une progression tumorale ont été identiés. L’étude MUST a montré que l’antioxydant SOD et de la force isométrique d’extension du quadriceps semblent prévenir la sarcopénie et une association entre le statut sarcopénie et le risque de toxicités a été confirmé. Ce travail de thèse représente une première étape dans l’analyse des effets de l’activité physique auprès de patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique. L’activité physique semble être bénéfique dans cette population, mais ces résultats nécessitent d’être confirmés dans une étude à plus grande échelle. Ces résultats préliminaires soulignent l’importance de proposer des interventions adaptées en activité physique aux patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique dès le diagnostic pour poursuivre un mode de vie actif le plus longtemps possible / Approximately 5% of patients are diagnosed with metastatic breast cancer each year and 20 to 30% of localized breast cancers become secondarily metastatic. Benefits of physical activity during treatment in patients with localized breast cancer have been widely demonstrated, but the literature is limited in metastatic breast cancer. This thesis work assessed the potential effects of physical activity in patients with metastatic breast cancer through three studies.The StoRM observational study showed an association between the level of physical activity collected by questionnaire with an improvement of survival for HER2 patients. The ABLE intervention study highlighted the feasibility of a physical activity intervention with an activity tracker in this population with an excellent adherence rate (96%), patients' interest and willingness to participate in physical activity programs and functional improvements. The intervention contributed to maintaining quality of life, fatigue and physical activity levels despite treatment and disease progression. Potential biomarkers predictive of tumor progression have been identified. The MUST study showed that the antioxidant SOD and quadriceps isometric extension force appear to prevent sarcopenia and an association between sarcopenia status and toxicity risk was confirmed. This thesis work represents a first step in analyzing the effects of physical activity on patients with metastatic breast cancer. Physical activity appears to be beneficial in this population, but these results need to be confirmed in a larger scale study. These preliminary results highlight the importance of providing appropriate physical activity interventions for patients with metastatic breast cancer at the time of diagnosis in order to maintain an active lifestyle as long as possible

Le syndrome métabolique (SM) est défini comme l'association de troubles favorisant les risques cardiovasculaires et le développement d'un diabète de type 2. Une personne atteinte de SM doit présenter au moins 3 critères sur les 5 suivants : une obésité abdominale; un taux élevé en triglycérides ; un faible taux en cholestérol HDL ; une hypertension et une hyperglycémie. Le SM est caractérisé par une dysfonction endothéliale, qui est définie par une diminution de la production de monoxyde d'azote (NO), et l'augmentation d’espèces réactives de l’oxygène, comme l'anion superoxyde (O2-), participant au stress oxydant. Dans notre étude, nous avons émis l’hypothèse que les exosomes pouvaient participer à la dysfonction endothéliale chez ces patients. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires de petite taille (entre 30 à 100 nm), formées à partir du compartiment endo-lysosomal et libérées par la plupart des cellules. Suite à leur libération, elles peuvent interagir avec des cellules cibles et servir ainsi de vecteurs d'information biologique. Il a été montré que les exosomes pouvaient être impliqués dans de nombreuses pathologies. Ainsi, nous avons montré que les patients atteints de SM présentent un taux d’exosomes circulants augmenté, dont la taille est diminuée. De plus, les exosomes provenant de patients SM diminuent la production de NO dans les cellules endothéliale, qui s’accompagne d’une augmentation de l’O2-mitochondriale. Chez la souris, les exosomes de patients SM induisent une diminution du relâchement vasculaire. Les exosomes pourraient ainsi participer au développement de la dysfonction endothéliale chez les patients atteints de SM et pourraient être de biomarqueurs intéressants pour cette pathologie. / Metabolic syndrome (MetS) is defined as the combination of metabolic disorders leading to cardiovascular diseases and the development of type 2 diabetes. To be diagnosed with MetS, a person must present at least 3 of the following 5 metabolic risk factors: (i) abdominal obesity, (ii) high triglyceride levels,(iii) low HDL cholesterol levels, (iv) hypertension and (v) hyperglycaemia. MetS is characterized by endothelial dysfunction, which is defined by a decreased nitric oxide (NO) production, and an increased in reactive oxygen species such as superoxide (O2-), involved in oxidative stress. In our study, we hypothesized that exosomes could participate in the endothelial dysfunction observed in MetS patients. Exosomes are nanoscaled (30-100nm) extracellular vesicles produced from the endolysosomal compartment and released by most of the cells of the organism. Following their release, they can interact with their target cells and be considered as biological information carriers. Exosomes have been shown to be involved in many pathologies. Thus, we have shown that MetS patients displayed an increased circulating rate of exosomes whose sizes were decreased. In addition, we have observed that exosomes from MetS patients induced (i) a decrease of NO production in endothelial cells, and (ii) an increase in mitochondrial O2-. Furthermore, the exosomes originating from MetS patients induced a decrease invascular relaxation in mice. Thus, the exosomes could participate in the development of endothelial dysfunction in MetS patients and could be considered as biomarkers of interest for this pathology.

L’utilisation excessive de pesticides engendre des pollutions et des dégradations importantes de l’environnement y compris sur les écosystèmes aquatiques. L’activité viticole ne fait pas exception à cette règle, et c’est pour cette raison que ce travail de thèse s’est intéressé aux réponses adaptatives ou délétères aux premiers stades de vie de poissons exposés à trois produits phytosanitaires utilisés en viticulture ainsi qu’à leur mélange et à des échantillons environnementaux. La thèse s’intéresse aux stades précoces de développement de la truite arc-en-ciel, mais également à la lignée cellulaire de foie de truite RTL-W1. Les embryons de truite ont été exposés au cuivre, au glyphosate et au chlorpyrifos seuls ou en mélange. Une autre partie de ce travail a consisté à étudier les effets toxiques des échantillons environnementaux d’eau et de sédiment provenant d’un cours d’eau, La Livenne, à proximité de parcelles viticoles. Toutes les expériences ont été faites en conditions contrôlées de laboratoire. Les réponses induites par ces expositions ont été mesurées à différents niveaux d’organisation biologique : au niveau moléculaire, phénotypique et comportemental pour l’étude in vivo (larves de la truite arc-en-ciel) ; et l’analyse des effets cytotoxiques de l’induction des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des dommages à l’ADN pour l’étude in vitro (lignée RTL-W1). Les résultats de ce travail ont montré que l’exposition aux pesticides individuels, ou en mélange, chez les larves de truites arc-en-ciel n’a pas produit d’effets létaux aux concentrations testés. En revanche, ces substances ont provoqués différents effets sub-létaux, selon le composé et les concentrations étudiés, dont des effets tératogènes, des perturbations du comportement natatoire, des effets génotoxiques et l’expression différentielle de gènes cibles. Le cuivre s’est avéré le plus toxique provoquant un échec d’éclosion important. Des effets cytotoxiques et une production d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) ont été observés sur cellules de truite exposées à des extraits d’eau de rivière. Par ailleurs, des effets comportementaux ont été observés sur les larves de truites exposées pendant 48 h à des sédiments et de l’eau de la Livenne. En conclusion, ces travaux de thèse ont mis en évidence des effets sub-létaux sur les cellules et les stades précoces de développement de truite arc-en-ciel exposés à des concentrations environnementales de pesticides utilisés en viticulture. / The excessive use of pesticides generates significant pollution and degradation of the environment, including aquatic ecosystems. The viticultural activity is not an exception for this rule, and this is why the aim of this work is to study the adaptive or deleterious responses in the early life stages of fish exposed to three phytosanitary products used in viticulture as well as to their mixture and environmental samples. The thesis focuses on the early stages of development of rainbow trout, but also on the trout liver cell line RTL-W1. Trout embryos were exposed to copper, glyphosate and chlorpyrifos alone or as a mixture. Another part of this work consisted in studying the toxic effects of environmental samples of water and sediment coming from a river, La Livenne, close to vineyard plots. All experiments were done under controlled laboratory conditions. The responses induced by these exposures were measured at different levels of biological organization: at the molecular, phenotypic and behavioral level for the in vivo study (rainbow trout larvae); and the analysis of cytotoxic effects and induction of reactive oxygen species (ROS) and DNA damage for the in vitro study (RTL-W1 line). The results of this work showed that exposure to individual or mixed pesticides in rainbow trout larvae did not produce lethal effects at the tested concentrations. In contrast, these substances caused different sub-lethal effects, depending on the compound and concentrations studied, including teratogenic effects, swim behavior disturbances, genotoxic effects, and differential expression of target genes. Copper was found to be the most toxic causing a major hatching failure. Cytotoxic effects and production of reactive oxygen species (ROS) were observed on trout cells exposed to river water extracts. In addition, behavioral effects were observed on trout larvae exposed for 48 h to sediments and Livenne water. In conclusion, these thesis studies revealed sub-lethal effects on cells and early stages of development of rainbow trout exposed to environmental concentrations of pesticides.

Les populations humaines sont exposées à de très nombreux polluants. Il apparaît donc essentiel d'évaluer la toxicité de ces molécules au sein des compartiments récepteurs. En milieu urbain, de nombreux polluants (principalement hydrocarbures et métaux lourds) s'accumulent sur les surfaces imperméables (routes, toitures, parkings, bâtiments…). Ils sont remis en suspension et drainés par les eaux de pluie jusque dans les bassins d'infiltration. Ces structures ont été construites afin de réinfiltrer les eaux de ruissellement dans les nappes phréatiques sous-jacentes et de les détoxifier. Ces molécules toxiques sont capturées et accumulées au niveau des sédiments fins constitutifs des bassins, où elles peuvent atteindre des concentrations très élevées. Malgré cette forte contrainte, quelques rares invertébrés vivent dans les sédiments pollués des bassins d'infiltration, ce qui sous-entend des adaptations métaboliques, physiologiques et/ou comportementales spécifiques. L'un des plus répandus est l'oligochète aquatique Limnodrilus hoffmeisteri. Ce ver tubificidé construit des galeries (activité de bioturbation) dans les sédiments où il favorise l'activité des microorganismes sur la minéralisation de la matière organique et le recyclage des nutriments. Cette espèce présente donc un rôle essentiel dans le fonctionnement des bassins d'infiltration, et donc sur la qualité de l'eau des nappes phréatiques. Elle est aujourd'hui considérée à la fois comme une espèce sentinelle de l'état de santé de son biotope et comme un ingénieur des écosystèmes. Le premier objectif de ce travail de thèse a été de mettre en évidence les réponses écophysiologiques permettant à L. hoffmeisteri de survivre dans ces biotopes particulièrement anthropisés. Pour cela, nous avons exposé/élevé cet organisme pendant 1, 3 ou 6 mois dans des sédiments pollués issus de 3 bassins d'infiltration et un sédiment issu d'un milieu non urbanisé (sédiment témoin très peu pollué), en laboratoire. Nous avons ensuite analysé sur ce ver la survie, la consommation d'oxygène, l'état des réserves énergétiques, les concentrations de métaux lourds bioaccumulés, le stress oxydant engendré par les polluants (niveau de peroxydation lipidique) et enfin les mécanismes de protection associés (activités des principales enzymes antioxydantes). Le deuxième objectif a été de déterminer l'impact des polluants urbains sur les métabolismes aérobie et anaérobie chez L. hoffmeisteri. Pour cela, nous avons mesuré différents paramètres témoignant de l'activité mitochondriale (activités de la chaîne respiratoire mitochondriale et de l'ATP synthétase) ainsi que les concentrations des principaux produits terminaux du métabolisme anaérobie chez des vers exposés aux mêmes sédiments (4) pollués ou témoin. Cette étude a démontré que les contaminants induisent une transition partielle du métabolisme aérobie vers les voies anaérobies suite à un dysfonctionnement mitochondrial, et a aussi révélé que certains produits terminaux du métabolisme anaérobie (succinate et propionate) constituent des marqueurs pertinents de la pollution urbaine. Enfin, le troisième objectif de cette thèse a été d'évaluer l'impact d'une pollution d'origine anthropique sur l'activité d'ingénierie de L. hoffmeisteri (i.e. sur son rôle dans le fonctionnement des bassins d'infiltration). Pour cela, nous avons mesuré pendant 1 mois le comportement de fouissage de ce ver bioturbateur par tomographie aux rayons X dans des microcosmes contenant des sédiments pollués ou non. De plus, des mesures régulières des flux de nutriments, d'oxygène dissous, de CO2 et de CH4 au cours de l'expérimentation ont permis d'évaluer l'influence du taux de contamination sur le recyclage des nutriments dans nos systèmes expérimentaux. Ces mesures ont été effectuées à la fois dans des systèmes colonisés par L. hoffmeisteri, mais aussi dans des systèmes sans faune, afin de quantifier précisément le rôle de ces organismes ingénieurs / Human populations are exposed to numerous pollutants. It is now necessary to evaluate the toxicity of urban contaminants in receptor ecosystems. In anthropized areas, many pollutants (mainly hydrocarbons and heavy metals) accumulate on the impervious surfaces (roads, parks, buildings, rooftops…). During a rainfall event, these compounds are re-suspended and drained up to stormwater infiltration basins. These structures were built to detoxify and to infiltrate runoff water to underlying groundwater. Toxic compounds are captured and accumulated in the fine sediment layer of the infiltration basins, where their concentrations may achieve important concentrations. Despite this harsh constraint, a few invertebrates inhabit stormwater basin sediments and have developed specific metabolic, physiological and/or behavioural adaptations. One of the most spread is the oligochaeta Limnodrilus hoffmeisteri. This tubificid worm burrows galleries (bioturbation activity) in sediments where it enhances the organic matter mineralization and the nutrients recycling. This species has an essential role in the infiltration basin functioning and on groundwater quality. L. hoffmeisteri is considered both as a sentinel species of ecosystem health and an engineer species. The first aim of this work was to highlight the ecophysiological responses that allow L. hoffmeisteri to survive in these harsh conditions. We exposed this organism during 1, 3 or 6 months to polluted sediments (from 3 infiltration basins), under laboratory conditions. Then, we measured the survival, the oxygen consumption, the energy body stores, the oxidative stress induced by urban pollutants (through the lipid peroxidation level), and the antioxidant defence mechanisms (the activity of the antioxidant enzymes) in L. hoffmeisteri. The same analyses were realized on worms incubated 1 to 6 months in a sediment from a non-urbanized environment (considered as a low-polluted/control sediment). The second objective of the present work was to determine the impact of urban pollutants on aerobic and anaerobic metabolisms in L. hoffmeisteri. We measured several mitochondrial parameters (the mitochondrial respiratory chain activity and the ATP production rate) and anaerobic end product concentrations in worms exposed to the 4 same sediments (polluted or not). This study demonstrated that urban pollutants induced a shift from aerobic to the anaerobic metabolism, linked to a mitochondrial dysfunctioning. Moreover, this study also showed that two anaerobic end products (succinate and propionate) constitute relevant biomarkers of urban pollution. Lastly, the third goal of this thesis was to evaluate the impact of an anthropic pollution on the engineering activity of L. hoffmeisteri (i.e. its role in the infiltration basin functioning). To this end, we measured during 1 month the burrowing activity of this tubificid worm using X-ray tomography, in microcosms containing slightly or highly polluted sediments. We measured nutrients fluxes, dissolved oxygen, CO2 and CH4 concentrations during the experiment to determine the influence of the pollution rate on nutrients recycling. These measurements were also realized in microcosms with or without worms, to quantify the functional role of engineer organisms