Gliomas malignos são tumores cerebrais primários, resistentes a vários tratamentos, como quimioterapia, radioterapia, indução de apoptose e cirurgia. Uma alternativa para o tratamento dos gliomas malignos é a terapia radionuclídea. Essa técnica utiliza moléculas radiomarcadas que se ligam seletivamente às células tumorais e nelas depositam dose citotóxica de radiação, provocando a morte das células doentes. A maioria dos protocolos de terapia radionuclídea para tumores cerebrais malignos envolve a administração de peptídeos marcados com radioisótopos emissores -. A substância P (SP) é um neuropeptídeo de 11 aminoácidos, da família das taquicininas, caracterizada pela sequência C-terminal Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. A SP radiomarcada com diferentes radioisótopos, inclusive Lutécio-177, tem sido descrita e proposta para tratamento in vivo de tumores. A SP é o ligante mais importante dos receptores de neuroquinina tipo 1, superexpressos em gliomas malignos. O objetivo deste trabalho foi estudar as condições de marcação de SP-DOTA com 177Lu, a estabilidade do composto marcado e suas propriedades in vitro e in vivo, a fim de desenvolver um protocolo de produção e avaliar o potencial do radiofármaco para terapia de gliomas. As condições de marcação foram otimizadas variando-se temperatura, tempo de reação, atividade de cloreto de lutécio-177 e massa de SP-DOTA e analisou-se a pureza radioquímica das preparações por meio de técnicas cromatográficas. A estabilidade da SP-DOTA-177Lu radiomarcada com baixa atividade de 177Lu foi avaliada por diferentes tempos a 2 - 8 ºC ou incubadas em soro humano a 37 ºC. A estabilidade das marcações com alta atividade de 177Lu também foi analisada na presença de ácido gentísico (6 mg/mL) adicionado após a reação de marcação. As condições de marcação em baixa e alta atividade foram submetidas à avaliação quanto à possibilidade de oxidação do resíduo de metionina, adicionando o aminoácido D-Lmetionina (6 mg/mL) ao meio de reação e posterior avaliação cromatográfica. Estudo in vitro com SP-DOTA-177Lu, radiomarcada na ausência e presença de metionina, utilizando células de glioma humano M059J e U-87 MG, verificou o efeito da oxidação da metionina sobre a ligação às células. Estudos de biodistribuição foram realizados em camundongos Nude com modelo tumoral e em camundongos Balb-c sadios. Obteve-se a maior pureza radioquímica (> 95 %) associada à maior atividade específica de SP-DOTA-177Lu quando o tempo de reação foi de 30 minutos, temperatura de 90 ºC, massa de SP-DOTA de 10 g e a atividade do 177Lu de 185 MBq. A SP radiomarcada em condições otimizadas manteve-se estável a 2 - 8 ºC e em soro humano por 4 horas. Os estudos in vitro demonstraram ligação aos receptores celulares e essa ligação mostrou-se reduzida quando o peptídeo apresenta-se em sua forma oxidada. A adição de metionina combinada com ácido gentísico preveniu a oxidação peptídica e assegurou-se a estabilidade do composto marcado, principalmente com alta atividade de 177Lu, quando se utilizou maior massa de SP-DOTA. Nos estudos in vivo, os resultados mostraram uma cinética de biodistribuição favorável do composto e capacidade de ligação às células tumorais. SP-DOTA-177Lu pode ser uma ferramenta útil para estudos in vivo devido à facilidade de preparação, alta estabilidade e afinidade pelas células tumorais. / Malignant gliomas are primary brain tumors, resistant to various treatments, as chemotherapy, radiotherapy, induction of apoptosis and surgery. An alternative for the treatment of malignant gliomas is the radionuclide therapy. This technique apply radiolabeled molecules that selectively bind to tumor cells producing cytotoxic effect by dose irradiation, and resulting in death of tumor cells. Most protocols for radionuclide therapy of malignant brain tumors involve the administration of peptides labeled with - emitting radioisotopes. The Substance P (SP) is an 11- amino acid neuropeptide, characterized by the C-terminal sequence Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. The use of SP labeled with different radionuclides including 177Lu, have been proposed for in vivo treatment of tumors. SP is the most important target of neurokinin 1 receptors, overexpressed in malignant gliomas. The objective of this work was to study conditions of radiolabeling DOTA-SP with 177Lu, the stability of labeled compound and in vivo and in vitro, to develop a protocol production and evaluate the potential of the radiopharmaceutical in the therapy of gliomas. The labeling conditions were optimized varying the temperature, reaction time, activity of lutetium-177 chloride and mass of DOTA-SP. The radiochemical purity of preparations were analyzed by chromatographic techniques. The stability of 177Lu -DOTA- SP radiolabeled with low activity of 177Lu was evaluated for different time at 2-8 °C or incubated in human serum. The stability of the labeled with high activity of 177Lu was also analyzed in the presence of gentisic acid (6 mg / mL) added after the labeling reaction. The labeled conditions in low and high activity were subjected to evaluation for the ability to cause oxidation of methionine residue, adding the D-L- methionine amino acid to the reaction medium (6 mg / mL) and subsequent chromatographic evaluation. In vitro study with 177Lu-DOTA-SP, radiolabeled in the absence and presence of methionine, using human M059J U-87 MG glioma cells and, showed the effect of oxidation of methionine on the cells binding. Biodistribution studies were performed in Nude mice with tumor model and Balb-c mice. Highest radiochemical purity (> 95%) associated with the highest specific activity of 177Lu-DOTA-SP when the reaction time was 30 minutes, temperature of 90 °C, 10 g of DOTA-SP, and the activity of 177Lu of 185 MBq. The radiolabeled SP in optimized conditions remained stable at 2-8 °C and in human serum for 4 hours. In vitro studies showed the binding to cell receptors and this binding was reduced when the peptide was presented in its oxidized form. The addition of methionine combined with gentisic acid prevented the oxidation of peptide and increased the stability of the labeled compound, particularly with high activity of 177Lu, when using larger mass of DOTA-SP. In vivo studies results showed a favorable biodistribution kinetics of the compound and ability to bind to tumor cells. 177Lu-DOTA-SP can be a useful tool for in vivo studies due to ease preparation, high stability and affinity for tumor cells.

Gliomas malignos são tumores cerebrais primários, resistentes a vários tratamentos, como quimioterapia, radioterapia, indução de apoptose e cirurgia. Uma alternativa para o tratamento dos gliomas malignos é a terapia radionuclídea. Essa técnica utiliza moléculas radiomarcadas que se ligam seletivamente às células tumorais e nelas depositam dose citotóxica de radiação, provocando a morte das células doentes. A maioria dos protocolos de terapia radionuclídea para tumores cerebrais malignos envolve a administração de peptídeos marcados com radioisótopos emissores -. A substância P (SP) é um neuropeptídeo de 11 aminoácidos, da família das taquicininas, caracterizada pela sequência C-terminal Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. A SP radiomarcada com diferentes radioisótopos, inclusive Lutécio-177, tem sido descrita e proposta para tratamento in vivo de tumores. A SP é o ligante mais importante dos receptores de neuroquinina tipo 1, superexpressos em gliomas malignos. O objetivo deste trabalho foi estudar as condições de marcação de SP-DOTA com 177Lu, a estabilidade do composto marcado e suas propriedades in vitro e in vivo, a fim de desenvolver um protocolo de produção e avaliar o potencial do radiofármaco para terapia de gliomas. As condições de marcação foram otimizadas variando-se temperatura, tempo de reação, atividade de cloreto de lutécio-177 e massa de SP-DOTA e analisou-se a pureza radioquímica das preparações por meio de técnicas cromatográficas. A estabilidade da SP-DOTA-177Lu radiomarcada com baixa atividade de 177Lu foi avaliada por diferentes tempos a 2 - 8 ºC ou incubadas em soro humano a 37 ºC. A estabilidade das marcações com alta atividade de 177Lu também foi analisada na presença de ácido gentísico (6 mg/mL) adicionado após a reação de marcação. As condições de marcação em baixa e alta atividade foram submetidas à avaliação quanto à possibilidade de oxidação do resíduo de metionina, adicionando o aminoácido D-Lmetionina (6 mg/mL) ao meio de reação e posterior avaliação cromatográfica. Estudo in vitro com SP-DOTA-177Lu, radiomarcada na ausência e presença de metionina, utilizando células de glioma humano M059J e U-87 MG, verificou o efeito da oxidação da metionina sobre a ligação às células. Estudos de biodistribuição foram realizados em camundongos Nude com modelo tumoral e em camundongos Balb-c sadios. Obteve-se a maior pureza radioquímica (> 95 %) associada à maior atividade específica de SP-DOTA-177Lu quando o tempo de reação foi de 30 minutos, temperatura de 90 ºC, massa de SP-DOTA de 10 g e a atividade do 177Lu de 185 MBq. A SP radiomarcada em condições otimizadas manteve-se estável a 2 - 8 ºC e em soro humano por 4 horas. Os estudos in vitro demonstraram ligação aos receptores celulares e essa ligação mostrou-se reduzida quando o peptídeo apresenta-se em sua forma oxidada. A adição de metionina combinada com ácido gentísico preveniu a oxidação peptídica e assegurou-se a estabilidade do composto marcado, principalmente com alta atividade de 177Lu, quando se utilizou maior massa de SP-DOTA. Nos estudos in vivo, os resultados mostraram uma cinética de biodistribuição favorável do composto e capacidade de ligação às células tumorais. SP-DOTA-177Lu pode ser uma ferramenta útil para estudos in vivo devido à facilidade de preparação, alta estabilidade e afinidade pelas células tumorais. / Malignant gliomas are primary brain tumors, resistant to various treatments, as chemotherapy, radiotherapy, induction of apoptosis and surgery. An alternative for the treatment of malignant gliomas is the radionuclide therapy. This technique apply radiolabeled molecules that selectively bind to tumor cells producing cytotoxic effect by dose irradiation, and resulting in death of tumor cells. Most protocols for radionuclide therapy of malignant brain tumors involve the administration of peptides labeled with - emitting radioisotopes. The Substance P (SP) is an 11- amino acid neuropeptide, characterized by the C-terminal sequence Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2. The use of SP labeled with different radionuclides including 177Lu, have been proposed for in vivo treatment of tumors. SP is the most important target of neurokinin 1 receptors, overexpressed in malignant gliomas. The objective of this work was to study conditions of radiolabeling DOTA-SP with 177Lu, the stability of labeled compound and in vivo and in vitro, to develop a protocol production and evaluate the potential of the radiopharmaceutical in the therapy of gliomas. The labeling conditions were optimized varying the temperature, reaction time, activity of lutetium-177 chloride and mass of DOTA-SP. The radiochemical purity of preparations were analyzed by chromatographic techniques. The stability of 177Lu -DOTA- SP radiolabeled with low activity of 177Lu was evaluated for different time at 2-8 °C or incubated in human serum. The stability of the labeled with high activity of 177Lu was also analyzed in the presence of gentisic acid (6 mg / mL) added after the labeling reaction. The labeled conditions in low and high activity were subjected to evaluation for the ability to cause oxidation of methionine residue, adding the D-L- methionine amino acid to the reaction medium (6 mg / mL) and subsequent chromatographic evaluation. In vitro study with 177Lu-DOTA-SP, radiolabeled in the absence and presence of methionine, using human M059J U-87 MG glioma cells and, showed the effect of oxidation of methionine on the cells binding. Biodistribution studies were performed in Nude mice with tumor model and Balb-c mice. Highest radiochemical purity (> 95%) associated with the highest specific activity of 177Lu-DOTA-SP when the reaction time was 30 minutes, temperature of 90 °C, 10 g of DOTA-SP, and the activity of 177Lu of 185 MBq. The radiolabeled SP in optimized conditions remained stable at 2-8 °C and in human serum for 4 hours. In vitro studies showed the binding to cell receptors and this binding was reduced when the peptide was presented in its oxidized form. The addition of methionine combined with gentisic acid prevented the oxidation of peptide and increased the stability of the labeled compound, particularly with high activity of 177Lu, when using larger mass of DOTA-SP. In vivo studies results showed a favorable biodistribution kinetics of the compound and ability to bind to tumor cells. 177Lu-DOTA-SP can be a useful tool for in vivo studies due to ease preparation, high stability and affinity for tumor cells.

Atualmente os gliomas representam cerca de 81% dos tumores cerebrais malignos, com aumento na incidência tanto em crianças, como em adultos acima dos 45 anos. Um número elevado de receptores neuroquinina tipo 1 (NK-1) estão expressos em células de glioma, estando a ligação da Substância P (SP) a esses receptores, envolvida no desenvolvimento e progressão desse tipo de tumor. A SP quelada ao DOTA (SP-DOTA), radiomarcada, vem sendo testada para utilização na terapia de gliomas, sendo o lutécio-177 (177Lu), devido a seu menor alcance tecidual, o radioisótopo mais indicado para tumores localizados em áreas críticas do cérebro. No entanto, estudos indicam a necessidade da adição de um excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica da SP-DOTA-177Lu, visando aumentar a estabilidade e a capacidade de ligação às células tumorais. Para superar esse desafio, surge a perspectiva da utilização de um novo análogo da SP, com estrutura modificada, para prevenir a oxidação peptídica. Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi estudar a marcação de um novo análogo da SP com 177Lu e caracterizar suas propriedades in vitro e in vivo, visando a obtenção de um radiofármaco inédito e com potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais e realizar estudos preliminares de marcação deste novo análogo com Ítrio-90 (90Y). O novo análogo foi obtido pela troca do aminoácido metionina (Met) pelo aminoácido norleucina (Nle) na posição 11 da cadeia peptídica da SP, sendo esses peptídeos denominados respectivamente SP(Met11)-DOTA e SP(Nle11)-DOTA. Após análise da oxidação peptídica dos dois peptídeos, os parâmetros da radiomarcação da SP(Nle11)-DOTA, com 177LuCl3, foram estudados para determinar a melhor condição de marcação. As estabilidades in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu sob refrigeração (2-8°C), no freezer (-20°C) e em soro humano (37°C) foram determinadas após radiomarcação com alta atividade, quanto ao uso de agentes estabilizantes e após diluição. A SP(Nle11)-DOTA também foi radiomarcada com 90Y, utilizando-se a condição padrão determinada, sendo a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y sob refrigeração (2-8°C) e em freezer (-20°C), avaliada após radiomarcação com alta atividade e quanto a utilização de agente estabilizante. A capacidade de ligação in vitro às células tumorais (U-87 MG e M059J) e a biodistribuição in vivo em camundongos BALB/c sadios foram determinadas para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu e comparadas à SP(Met11)-DOTA-177Lu. A ligação às proteínas plasmáticas e a biodistribuição em camundongos Nude com modelo tumoral também foram avaliadas. Os resultados obtidos na análise da oxidação peptídica comprovaram a importância da adição de excesso de metionina para prevenção da oxidação peptídica e indicaram uma alta estabilidade da SP(Nle11)-DOTA, durante e após o processo de radiomarcação. A adição de 148 MBq (4 mCi) da solução de 177LuCl3 em HCl 0,05N à 10 μg de SP(Nle11)-DOTA diluída em tampão acetato de sódio 0,4 M pH 4,5 seguida pela incubação a uma temperatura de 90ºC por 30 minutos, sob agitação de 350 rpm foi definida com condição padrão de marcação. O congelamento (-20°C), o uso de agentes estabilizantes e a diluição apresentaram-se como métodos efetivos para garantir uma alta estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-177Lu, após a marcação com alta atividade. Bons resultados também foram observados para a marcação da SP(Nle11)-DOTA com 90YCl3 e para a estabilidade in vitro da SP(Nle11)-DOTA-90Y, após congelamento (-20°C) e quando utilizado ácido gentísico como estabilizante. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa especificidade pelas células tumorais, principalmente pelas células de glioma humano M059J, sugerindo que a substituição do aminoácido metionina por norleucina na posição 11 não compromete a capacidade de ligação da SP(Nle11) às células tumorais. Uma baixa porcentagem de ligação às proteínas plasmáticas e um rápido clareamento sanguíneo foram observados para a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, sendo esse radiofármaco eliminado preferencialmente por via renal. A SP(Nle11)-DOTA-177Lu apresentou uma boa estabilidade in vivo e se mostrou incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo seu uso indicado por injeção intratumoral ou intracavitária. O estudo de biodistribuição em animais com modelo tumoral, mostrou que esse radiofármaco se liga às células tumorais por ligações receptor específicas. Com base nesse dados conclui-se que a SP(Nle11)-DOTA-177Lu, apresenta-se como um radiofármaco inédito que devido às suas propriedades in vitro e in vivo favoráveis, apresenta potencial aplicação na terapia de tumores cerebrais, representando uma nova possibilidade dentro do limitado arsenal terapêutico para esse tipo de tumor. / Currently gliomas represent about 81% of malignant brain tumors with increased incidence in children and in adults over 45 years. A large number of type 1 neurokinin receptor (NK-1) are expressed in glioma cells, being the binding of substance P (SP) to these receptors, involved in the development and progression of this tumor type. The SP conjugated at DOTA chelator (SP-DOTA), radiolabeled, have been tested for use in the treatment of gliomas, and the lutetium-177 (177 Lu), due to its lower tissue range, has been the most suitable radioisotope for tumors located in critical areas brain. However, studies indicate the necessity of adding an excess of methionine to prevent the peptide SP-DOTA-177Lu oxidation in order to increase the stability and capacity to bind to tumor cells. To overcome this challenge, there is the prospect of using a new analog of SP with a modified structure, to prevent peptide oxidation. In this context, the aim of this work was study the labeling of a new analog of SP with 177Lu and characterize their properties in vitro and in vivo, in order to obtain a novel radiopharmaceutical with potential application in brain tumor therapy, and perform preliminary studies labeling of this new analog with yttrium-90 (90Y). The new analog was obtained by replacement of the amino acid methionine (Met) by the amino acid norleucine (Nle) at position 11 of the peptide chain of SP, and these peptides were called SP(Met11)-DOTA and SP(Nle11)-DOTA respectively. After analysis of the oxidation for the two peptides, the radiolabeling parameters of the SP(Nle11)-DOTA with 177LuCl3 were studied to determine the best labeling condition. The SP(Nle11)-DOTA was also radiolabeled with 90Y, using standard condition, and the stability in vitro of the SP(Nle11)-DOTA-90Y assessed under refrigeration (2-8 °C) and under freezing (-20° C), after radiolabeling with high activity and use of stabilizing agent. The stabilities in vitro of the SP (Nle11)-DOTA-177Lu under refrigeration (2-8 °C), under freezing (-20 °C) and in human serum (37 °C) were determined after radiolabeling with high activity, with use of stabilizing agents and after dilution. The ability of in vitro binding to tumor cells (U-87 MG and M059J) and the biodistribution in vivo in healthy BALB/c mice were determined for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11) and compared to 177Lu-DOTA-SP(Met11). The plasma protein binding and biodistribution in Nude mice with tumor model were also evaluated. The results obtained from analysis of oxidation for the two peptides confirmed the importance of adding excess methionine to prevent peptide oxidation and indicated a high stability of the DOTA- SP(Nle11), during and after the radiolabeling process. The addition of 148 MBq (4 mCi) of 177LuCl3 solution in 0.05N HCl at 10 μg DOTA-SP(Nle11) diluted in 0.4 M sodium acetate buffer pH 4.5 followed by incubation at a temperature of 90 °C for 30 minutes under constant agitation to 350 rpm was defined as standard labeling condition. The freezing (-20 °C), the use of stabilizing agents and the dilution were presented as effective methods to ensure high stability in vitro 177Lu-DOTA-SP(Nle11), after labeling with high activity. Good results were also observed for labeling DOTA-SP(Nle11) with 90YCl3 and for stability in vitro of the 90Y-DOTA-SP(Nle11) after freezing (-20 °C) and when gentisic acid was used as a stabilizer. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good specificity to tumor cells, particularly human glioma cells (M059J), suggesting that substitution of the amino acid norleucine for methionine at position 11 does not compromise the capacity of SP(Nle11) binding to tumor cells. A low percentage of plasma protein binding and rapid blood clearance were observed for the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), being this radiopharmaceutical preferably eliminated by the kidney. The 177Lu-DOTA-SP(Nle11) showed good stability in vivo and inability to cross the blood brain barrier, being its use indicated through intratumoral or intracavitary injection. The biodistribution studies in animals with tumor model showed that the radiopharmaceutical binds to the tumor cells by specific receptor binding. Based on this data was concluded that the 177Lu-DOTA-SP(Nle11), can be presented as a novel radiopharmaceutical that due to its favorable properties in vitro and in vivo, presents a potential application in the therapy of brain tumors, representing a new possibility within the limited therapeutic options for this type of tumor.

Nossa hipótese é de que os efeitos pró-inflamatórios iniciais da ativação do receptor ativado por protease 2 (PAR2) na articulação temporomandibular (ATM) sejam mediados por mecanismos neurogênicos. A análise por imunofluorescência revelou um alto grau de imunorreatividade ao PAR2 em aferentes primários trigeminais da ATM. Além do mais, a imunorreatividade ao PAR2 também foi observada na camada íntima da sinóvia, além de co-localizar com o marcador neuronal PGP9.5 e o neuropeptídeo substância P. A injeção intra-articular de agonistas PAR2 na ATM induziu um aumento dependente da dose no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e indução de alodinia mecânica. O bloqueio farmacológico de receptors NK1 inibiu o aumento no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e alodinia induzido pela ativação do PAR2. Em conclusão, a ativação do PAR2 é pró-inflamatório na ATM, via mecanismos neurogênicos envolvendo receptores NK1, sugerindo que o PAR2 é um importante componente da resposta imunológica inata na ATM. / We hypothesised that the early pro-inflammatory effects of proteinase-activated receptor 2 (PAR2) activation in the temporomandibular joint (TMJ) are mediated by neurogenic mechanisms. Immunofluorescence analysis revealed a high degree of neurons expressing PAR2 in retrogradely labelled trigeminal ganglion neurons. Furthermore, PAR2 immunoreactivity was observed in the lining layer of the TMJ, co-localizing with the neuronal marker PGP9.5 and substance P-containing peripheral sensory nerve fibres. The intra-articular injection of PAR2 agonists into the TMJ triggered a dose-dependent increase in plasma extravasation, neutrophil influx and induction of mechanical allodynia. The pharmacological blockade of NK1 receptors abolished PAR2-induced plasma extravasation and inhibited neutrophil influx and mechanical allodynia. We conclude that PAR2 activation is pro-inflammatory in the TMJ, through a neurogenic mechanism involving NK1 receptors. This suggests that PAR2 is an important component of innate neuro-immune response in the TMJ.

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não invasivo que demonstrou tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clinica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor. O presente, estudo visa examinar os efeitos da MOB na disfunção locomotora, na força muscular, nas alterações morfológicas no nervo isquiático e nas alterações moleculares induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos Wistar. Para analisar a disfunção locomotora utilizamos o índice funcional do nervo Isquiático (IFC). Para analisar a força muscular, o sistema Biopac System. A ultraestrutura do nervo foi analisada pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão e as alterações moleculares por meio de ensaios de Western blot. Ao finalizarmos os tratamentos com MOB os animais foram eutanasiados e os tecidos como, nervo isquiático, gânglios das raizes posteriores (DRG L4-L6) e Susbtância Cinzenta Periaquedutal (PAG) foram retirados. Os DRG´s foram processados pela técnica de Western Blot para a detecção da substância P (SP), receptor de potencial transitório vanilóide tipo I (TRPV1) e receptores opióides dos tipos µ (MOR), δ (DOR) e k (KOR). Com relação a PAG, analisamos somente os receptores opióides por Western Blot. Nossos resultados demonstraram uma reverção da disfunção locomotora induzida pela CCI após a MOB e aumentou 172% a força do músculo tibial anterior nos animais tratados quando comparado com os animais do grupo CCI. Nossos estudos sobre a ultraestrutura do nervo isquiático demonstraram intenso processo de degeneração Waleriana após a CCI e regeneração após a MOB. Podemos sugerir um papel importante da MOB na modulação da expressão da SP e do TRPV 1. Sobre os receptores DOR e KOR no DRG, não encontramos alterações estatísticas entre os grupos, mas observamos um aumento da expressão de MOR após a MOB. Na PAG, nós observamos uma diminuição de DOR e KOR no grupo CCI e aumento após a MOB. Por outro lado, não encontramos alterações estatíticas para o receptor MOR. Baseado nestes achados, podemos sugerir que a MOB reverte a disfunção locomotora, aumenta a força muscular, induz a regeneração do nervo isquiático, modula a SP e TRPV 1 e aumentou a expressão de MOR no DRG´s. Sugerimos ainda que, a analsegia induzida pela técnica de MOB possa ter um envolvimento também com o sistema inibitório descendente de dor resultando na inibição da transmissão do estímulo nociceptivo aferente e assim, diminuindo a dor neuropática devido influência da MOB sobre os opióides na PAG. / Neural mobilization technique (MOB) is a noninvasive method that demonstrated to be effective in reducing pain sensitivity in both clinical and research study. The present study aims to examine the effects of MOB in locomotors dysfunction, muscle strength, morphological changes in sciatic nerve and molecular changes induced by chronic constriction (CCI) of the sciatic nerve in Wistar rats. To analyze locomotors dysfunction we used the Sciatic nerve functional index (SFI). To analyze muscle strength, was used Biopac System. The nerve morphology was analyzed using electron microscopy and molecular changes through western blot assays. After MOB treatments, animals were euthanized and tissues such as, sciatic nerve, the posterior root ganglions (DRG L4-L6) and substance periaqueductal gray (PAG) were removed. The DRG were processed by western blot for detection of substance P (SP), transient receptor potential vanilloid type I (TRPV1) and opioids receptors (MOR, DOR, KOR). Regarding PAG, we analyze only opioids receptors. Our results demonstrated a full reversal of locomotors dysfunction-induced by CCI after MOB treatment and an increase of 172% on maximal tetanic muscle strength in animals treated with MOB when compared to the CCI group. Our studies on photomicrography of sciatic nerve showed an intense Wallerian degeneration process in CCI animals and an intense regeneration of myelinated fibers. In western blot assays, we identified, in DRG, an increase of SP and TRPV1 expression after CCI and a decrease of optical density after MOB treatment. Regarding opioid receptor, we did not identify statistical changes on DOR and KOR in DRG, but we observed an increased expression of MOR in CCI after MOB treatment group. In PAG analyses, we observed a decrease in DOR and KOR expression after MOB treatment when compare with CCI animals. On the other hand, we did not identify any changes on MOR receptor. Based on our findings, we suggest that treatment with neural mobilization technique it is able to reverses the locomotors dysfunction and increases maximum tetanic force of the tibialis anterior muscle after CCI. Furthermore, the same treatment was also able to induce a severe regeneration in the sciatic nerve after treatment. Still, we can suggest an important role of MOB in modulating SP and TRPV 1 expression. We suggest that antinociceptive effect induced by MOB technique can also be involved with descending pain inhibitory system resulting in inhibition of the transmission of afferent nociceptive stimulus and thereby reducing neuropathic pain because of the influence of MOB opioids in the PAG.

Submitted by MARJORIE DE OLIVEIRA GALLINARI null (marjo_oliveira@hotmail.com) on 2016-05-20T00:08:43Z No. of bitstreams: 1 Versão final - Diessertação!.pdf: 4298608 bytes, checksum: d78e89bc5d747df80a571cc21dbf5c26 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-05-23T19:19:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gallinari_mo_me_arafo.pdf: 4298608 bytes, checksum: d78e89bc5d747df80a571cc21dbf5c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-23T19:19:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gallinari_mo_me_arafo.pdf: 4298608 bytes, checksum: d78e89bc5d747df80a571cc21dbf5c26 (MD5) Previous issue date: 2016-05-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da hidrocortison e do acetaminofeno na inflamação e na expressão de neuropeptídeos por meio da análise histopatológica e imunoistoquímica. Para tanto, 63 ratos foram divididos em 3 lotes de estudo (n=21) de acordo com a terapia de combate à dor: LI- controle, LII- administração tópica de hidrocortisona por 10 minutos, depois do tratamento clareador e LIII- administração via oral de acetaminofeno 30 minutos antes do tratamento clareador com peróxido de hidrogênio a 35% e depois de 12 em 12 horas. Em todos os grupos de estudo, na maxila esquerda foi realizado o tratamento clareador placebo e a maxila direita recebeu a 3 aplicações de 15 minutos de um gel clareador a base de peróxido de hidrogênio a 35%, totalizando 45 minutos de contato do gel clareador com substrato dentário. Os momentos de eutanásia dos animais foram imediatamente após, 24 e 48 horas após o tratamento clareador. Posteriormente à eutanásia dos animais, as peças foram processadas e o primeiro molar de cada maxila foi analisado histopatologicamente quanto ao grau de inflamação e por análise de imunoistoquímica para verificarmos a presença dos neuropeptídeos SP e CGRP. Os dados obtidos foram submetidos ao teste estatístico não paramétrico Kruskal Wallis seguido do teste de Dunn para comparações individuais, sendo observado na análise histopatológica total desorganização celular, extensas áreas de necrose nos grupos clareados, e o grupo que recebeu tratamento com otosporim apresentou melhores resultados. Na análise imuno-histoquimica, obteve imunomarcação positiva em todos os grupos, inclusive controle, porém nos grupos clareados a imunomarcação foi mais forte, sendo que o grupo que recebeu tratamento com otosporim apresentou os melhores resultados. Conclui-se que o uso da hidrocortisona após tratamento clareador minimiza os efeitos colaterais deste procedimento estético. / The aim of this study was to evaluate the influence of hydrocortisone and acetaminofen substances in inflammation and neuropeptide expression by histopathologic and immunohistochemical analysis. For this, 63 rats were divided into 3 batches of study (n = 21) according to combat pain therapy: Li control LII- topical administration of Otosporin® for 10 minutes after the bleaching treatment and administration route LIIIoral Tylenol® 30 minutes before the bleaching with hydrogen peroxide at 35% and then 12 for 12 hours. In all study groups in left maxilla was performed treatment whitener placebo and right jaw received three applications of 15 minutes a whitening gel 35% hydrogen peroxide base, totaling 45 minutes of contact of the whitening gel dental substrate. The times of the animals were euthanized immediately after 24 and 48 hours after the bleaching treatment. After the euthanasia of animals, the pieces were processed and the first molar of each jaw was analyzed histologically the degree of inflammation and analysis of immunohistochemistry to verify the presence of the neuropeptides SP and CGRP. The data were submitted to statistical nonparametric Kruskal Wallis test followed by Dunn's test for individual comparisons, being observed on histopathologic total cellular disorganization analysis, extensive areas of necrosis in whitened groups, and the group that received treatment with Otosporin® showed better results. In immunohistochemical analysis, obtained positive immunostaining in all groups, including control, but the whitened immunostaining groups was stronger, and the group that received treatment with Otosporin® showed the best results. We conclude that the use of Otosporin® after bleaching treatment minimizes the side effects of this cosmetic procedure. / FAPESP: 2015/01366-4

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Introdução: Estudos sugerem que o CO2 promova estimulo dos efeitos fisiologicos como, vasodilatacao, formacao de colageno e fibras elasticas. A Inflamacao Neurogenica (IN) e um dos primeiros eventos da cicatrizacao em resposta a um estimulo nociceptivo na pele, onde ha liberacao de neuropeptideos (NPÆs) pro-inflamatorios secretados por terminacoes nervosas, sendo lancados na fase inflamatoria da cicatrizacao. Entretanto nao ha estudos que relacionem a injecao de CO2 com a IN. Objetivo: investigar a injecao de Dioxido de Carbono (CO2) na secrecao dos neuropeptideos Peptideo Relacionado ao Gene da Calcitonina (CGRP) e Substancia P (SP) em pele de ratos. Metodos: foram utilizados 56 ratos Wistar-EPM distribuidos em dois grupos, um para analise de CGRP e outro de SP. Cada grupo foi subdividido em 4 subgrupos: controle, controle agulha, injecao de CO2 e injecao de ar atmosferico, contendo 7 animais respectivamente em cada subgrupo. As analises das amostras de pele parcial foram feitas por Western Blotting (WB). Resultados: No grupo SP houve uma diminuicao na quantidade de neuropeptideos no subgrupo 3 SP-CO2 e no subgrupo 4 SP -ar; no grupo CGRP, houve uma diminuicao da quantidade de neuropeptideos pro-CGRP (15 kDa) no subgrupo 3 CGRP-CO2 e no subgrupo 4 CGRP- ar; nao houve diminuicao da quantidade de CGRP (5 kDa).Conclusao: A injecao de CO2 e de ar atmosferico em pele de ratos diminuiu a quantidade de neuropeptideos SP e pro-CGRP (15 kDa) / Introduction: The Carbon Dioxide (CO2) infusion is a non surgical technique where the carbon gas is inject in the subcutaneous tissue. On the literature there are studies that suggest that the gas promotes stimulus of the physiological effects, such as circulation improvement, tissue oxygenation, collagen and new elastic fibers formation. Effects that possibly occur after the needle perforation, generating an inflammatory response, aiming to destroy, dilute or block the aggressor agent once the Neurogenic Inflammation (NI) is one of the first cicatrization events that happen. In response to a skin nonciceptive stimulus, there is the release of proinflammatory cutaneous neuropeptides (NP’s), substances that are produced by the brain cells from dorsal root ganglia and secreted by the skin nervous terminations, and are launched on the inflammatory phase of the cicatrization. Objective: to investigate the Carbon Dioxide (CO2) injection on the neuropeptides secretion of the Peptide related to the Calcitone (CGRP) and the P Substance (CSP) in rats skin. Method: there were used 56 Wistar-EPM rats divided into two groups, one for CGRP analysis and the other for SP. Each group was subdivided in 4 sub groups: control, needle control CO2 injection and air injection, each group with 7 rats. The partial skin sample analysis was done by Western Blotting (WB). Results: regarding the presence of the neuropeptides on the rats skin, on the SP group there was a decrease on the amount of the neuropeptides on the subgroup 3 and on the subgroup 4, Air injection; on the CGRP subgroup, there was a decrease on the amount of neuropeptides pro-CGRP, CO2 injection and also on the subgroup 4, Air injection; on the CGRP group, there was a decrease on the amount of neuropeptides there was proCGRP (15kDa) on the subgroup 4, injection of CO2. On the subgroup 4 there wasn’t any decrease on the amount of the effective GCRP (5 kDa). Conclusion: The CO2 and the Air injection in rats skin produces a decrease on the amount of SP neuropeptides and pro-CGRP (15 kDa). / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2475.pdf: 1572607 bytes, checksum: 64043b30c1df210d393c4540c2d88933 (MD5) Previous issue date: 2009-05-29 / Universidade Federal de Minas Gerais / The locus coeruleus (LC) has been suggested as a CO2 chemoreceptor site in mammals. Substance P (SP) has been used as a marker of respiratory neurons and it plays an important role in compensatory responses to hypercapnia in several sites of the central nervous system. Neurokinin-1 (NK-1) receptor immunoreactive (NK1Rir) neurons and processes are widely distributed within the LC. Thus, the present study assessed the role of NK-1 receptors in the LC in the cardiorespiratory and thermal responses to hypercapnia. To this end, substance P-saporin conjugate (SPSAP; 2μM) was injected in the LC to kill NK1R-ir neurons, or IgG-SAP as a control in male Wistar rats. The animals that the drug reached the fourth ventricle (4ºV) were considered as a 4ºV group. Pulmonary ventilation (VE, body plethysmograph), mean arterial pressure (MAP), heart rate (HR) and body core temperature were measured followed by 60 min of hypercapnic exposure (7% CO2). To verify the correct placement and effectiveness of the chemical lesions, immunohistochemistry for NK1R was performed. In addition, tyrosine hydroxylase (TH) immunoreactivity was performed to verify if noradrenergic neurons were eliminated. Fluoro-Jade technique was used to evaluate neuronal degeneration. A reduced NK1R (72% of reduction) and TH immunoreactivity (66% of reduction) was observed seven days after the injections of SP-SAP in the LC and an intense Fluoro-Jade staining, showing the effectiveness of the lesion. Focal lesions of NK1R-ir did not affect basal ventilation in the SP-SAP in LC and SP-SAP in 4ºV groups. Hypercapnia caused an increase in pulmonary ventilation in all groups, which was a result of increases in respiratory frequency (fR) and tidal volume (VT), SP-SAP treatment in the LC and in the fourth ventricle attenuated the hypercapnic ventilatory response (30% and 20%, respectivally), due to a reduction in the VT. SP-SAP in the LC and SP SAP in the 4ºV 11 lesion did not affect MAP, but caused an increase in HR in both groups. The results suggest that NK1R-ir neurons in the LC modulate hypercapnic ventilatory response but play no role in breathing control under resting conditions. Additionally, NK1R-ir neurons seem to play no role in body temperature and MAP regulation in resting conditions and during hypercapnia, but modulate HR during CO2 exposure. This modulation may be due to a change in the noradrenaline release. / O locus coeruleus (LC) é considerado uma região quimiorreceptora a CO2/pH em mamíferos. A substância P (SP) tem sido usada como marcador de neurônios respiratórios, pois possui importante função nas respostas compensatórias a hipercapnia em muitas áreas do sistema nervoso central. Neurônios e processos imunorreativos a receptores neurocinina 1 (NK-1) estão amplamente distribuídos dentro do LC. Portanto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a participação de receptores NK-1 no LC nas respostas cardiorrespiratórias e termorreguladoras à hipercapnia. Para este fim, foi injetado o conjugado SP-Saporina (SP-SAP; 2μM) no LC de ratos Wistar para lesar neurônios que expressam esses receptores, ou IgGSAP como controle. Os animais em que as injeções atingiram o quarto ventrículo (4ºV) foram considerados como grupo 4ºV. A ventilação pulmonar (VE, pletismografia de corpo inteiro), pressão arterial média (PAM), freqüência cardíaca (FC) e temperatura corporal (Tc) foram medidas por 60 min de exposição à hipercapnia (7% CO2). Para verificar a correta localização e efetividade da lesão química realizou-se a imunohistoquímica para receptores NK-1. Além disso, imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH) foi realizada para averigüar se neurônios noradrenérgicos foram lesados. A técnica de Fluoro-Jade foi também utilizada para avaliar a neurodegeneração. Observou-se a redução da imunorreatividade para receptores NK-1 (72% de lesão dos neurônios) e redução da imunorreatividade para neurônios noradrenérgicos (66% dos neurônios noradrenérgicos) sete dias após injeções de SP-SAP no LC e intensa marcação na técnica de Fluoro-Jade mostrando a efetividade da lesão. Lesões seletivas de neurônios que expressam receptores NK-1 no LC não afetaram a ventilação basal, o mesmo foi observado com os animais em que a injeção atingiu o 4ºV. A hipercapnia causou aumento da ventilação pulmonar 9 em todos os grupos decorrente do aumento da freqüência respiratória (fR) e volume corrente (VC). Entretanto, o tratamento com SP-SAP no LC e no 4ºV promoveu atenuação da resposta ventilatória (30% e 20%, respectivamente), devido à diminuição do VC. A lesão com SP-SAP no LC e no 4ºV não afetou a PAM, entretanto promoveu aumento na FC em ambos grupos. Os resultados sugerem que os neurônios que expressam receptores NK-1 no LC modulam a resposta ventilatória à hipercapnia, porém não possuem papel tônico na ventilação em condições basais. Além disso, esses neurônios não participam da regulação da temperatura e da PAM em normocapnia e hipercapnia, mas modulam FC durante exposição ao CO2. Essa modulação pode ser devida a alteração na liberação de noradrenalina.

Nossa hipótese é de que os efeitos pró-inflamatórios iniciais da ativação do receptor ativado por protease 2 (PAR2) na articulação temporomandibular (ATM) sejam mediados por mecanismos neurogênicos. A análise por imunofluorescência revelou um alto grau de imunorreatividade ao PAR2 em aferentes primários trigeminais da ATM. Além do mais, a imunorreatividade ao PAR2 também foi observada na camada íntima da sinóvia, além de co-localizar com o marcador neuronal PGP9.5 e o neuropeptídeo substância P. A injeção intra-articular de agonistas PAR2 na ATM induziu um aumento dependente da dose no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e indução de alodinia mecânica. O bloqueio farmacológico de receptors NK1 inibiu o aumento no extravasamento plasmático, influxo de neutrófilos e alodinia induzido pela ativação do PAR2. Em conclusão, a ativação do PAR2 é pró-inflamatório na ATM, via mecanismos neurogênicos envolvendo receptores NK1, sugerindo que o PAR2 é um importante componente da resposta imunológica inata na ATM. / We hypothesised that the early pro-inflammatory effects of proteinase-activated receptor 2 (PAR2) activation in the temporomandibular joint (TMJ) are mediated by neurogenic mechanisms. Immunofluorescence analysis revealed a high degree of neurons expressing PAR2 in retrogradely labelled trigeminal ganglion neurons. Furthermore, PAR2 immunoreactivity was observed in the lining layer of the TMJ, co-localizing with the neuronal marker PGP9.5 and substance P-containing peripheral sensory nerve fibres. The intra-articular injection of PAR2 agonists into the TMJ triggered a dose-dependent increase in plasma extravasation, neutrophil influx and induction of mechanical allodynia. The pharmacological blockade of NK1 receptors abolished PAR2-induced plasma extravasation and inhibited neutrophil influx and mechanical allodynia. We conclude that PAR2 activation is pro-inflammatory in the TMJ, through a neurogenic mechanism involving NK1 receptors. This suggests that PAR2 is an important component of innate neuro-immune response in the TMJ.

A técnica de Mobilização Neural (MOB) é um método não invasivo que demonstrou tanto na pesquisa básica, como na pesquisa clinica ser eficaz na redução da sensibilidade à dor. O presente, estudo visa examinar os efeitos da MOB na disfunção locomotora, na força muscular, nas alterações morfológicas no nervo isquiático e nas alterações moleculares induzida pela constrição crônica (CCI) do nervo isquiático de ratos Wistar. Para analisar a disfunção locomotora utilizamos o índice funcional do nervo Isquiático (IFC). Para analisar a força muscular, o sistema Biopac System. A ultraestrutura do nervo foi analisada pela técnica de microscopia eletrônica de transmissão e as alterações moleculares por meio de ensaios de Western blot. Ao finalizarmos os tratamentos com MOB os animais foram eutanasiados e os tecidos como, nervo isquiático, gânglios das raizes posteriores (DRG L4-L6) e Susbtância Cinzenta Periaquedutal (PAG) foram retirados. Os DRG´s foram processados pela técnica de Western Blot para a detecção da substância P (SP), receptor de potencial transitório vanilóide tipo I (TRPV1) e receptores opióides dos tipos µ (MOR), δ (DOR) e k (KOR). Com relação a PAG, analisamos somente os receptores opióides por Western Blot. Nossos resultados demonstraram uma reverção da disfunção locomotora induzida pela CCI após a MOB e aumentou 172% a força do músculo tibial anterior nos animais tratados quando comparado com os animais do grupo CCI. Nossos estudos sobre a ultraestrutura do nervo isquiático demonstraram intenso processo de degeneração Waleriana após a CCI e regeneração após a MOB. Podemos sugerir um papel importante da MOB na modulação da expressão da SP e do TRPV 1. Sobre os receptores DOR e KOR no DRG, não encontramos alterações estatísticas entre os grupos, mas observamos um aumento da expressão de MOR após a MOB. Na PAG, nós observamos uma diminuição de DOR e KOR no grupo CCI e aumento após a MOB. Por outro lado, não encontramos alterações estatíticas para o receptor MOR. Baseado nestes achados, podemos sugerir que a MOB reverte a disfunção locomotora, aumenta a força muscular, induz a regeneração do nervo isquiático, modula a SP e TRPV 1 e aumentou a expressão de MOR no DRG´s. Sugerimos ainda que, a analsegia induzida pela técnica de MOB possa ter um envolvimento também com o sistema inibitório descendente de dor resultando na inibição da transmissão do estímulo nociceptivo aferente e assim, diminuindo a dor neuropática devido influência da MOB sobre os opióides na PAG. / Neural mobilization technique (MOB) is a noninvasive method that demonstrated to be effective in reducing pain sensitivity in both clinical and research study. The present study aims to examine the effects of MOB in locomotors dysfunction, muscle strength, morphological changes in sciatic nerve and molecular changes induced by chronic constriction (CCI) of the sciatic nerve in Wistar rats. To analyze locomotors dysfunction we used the Sciatic nerve functional index (SFI). To analyze muscle strength, was used Biopac System. The nerve morphology was analyzed using electron microscopy and molecular changes through western blot assays. After MOB treatments, animals were euthanized and tissues such as, sciatic nerve, the posterior root ganglions (DRG L4-L6) and substance periaqueductal gray (PAG) were removed. The DRG were processed by western blot for detection of substance P (SP), transient receptor potential vanilloid type I (TRPV1) and opioids receptors (MOR, DOR, KOR). Regarding PAG, we analyze only opioids receptors. Our results demonstrated a full reversal of locomotors dysfunction-induced by CCI after MOB treatment and an increase of 172% on maximal tetanic muscle strength in animals treated with MOB when compared to the CCI group. Our studies on photomicrography of sciatic nerve showed an intense Wallerian degeneration process in CCI animals and an intense regeneration of myelinated fibers. In western blot assays, we identified, in DRG, an increase of SP and TRPV1 expression after CCI and a decrease of optical density after MOB treatment. Regarding opioid receptor, we did not identify statistical changes on DOR and KOR in DRG, but we observed an increased expression of MOR in CCI after MOB treatment group. In PAG analyses, we observed a decrease in DOR and KOR expression after MOB treatment when compare with CCI animals. On the other hand, we did not identify any changes on MOR receptor. Based on our findings, we suggest that treatment with neural mobilization technique it is able to reverses the locomotors dysfunction and increases maximum tetanic force of the tibialis anterior muscle after CCI. Furthermore, the same treatment was also able to induce a severe regeneration in the sciatic nerve after treatment. Still, we can suggest an important role of MOB in modulating SP and TRPV 1 expression. We suggest that antinociceptive effect induced by MOB technique can also be involved with descending pain inhibitory system resulting in inhibition of the transmission of afferent nociceptive stimulus and thereby reducing neuropathic pain because of the influence of MOB opioids in the PAG.