Im Jahr 2008 gab es weltweit 347 Millionen Diabetiker bei weiter zunehmender Inzidenz. Die beiden größten Unterformen sind mit 90 % Typ 2- und 10 % Typ 1-Diabetes (Danaei et al. 2011). Beiden Diabetesformen sind eine Dysfunktion und ein Zelltod der Betazellen durch Apoptose gemeinsam, die Betazellschädigung wird dabei über ähnliche Signaltransduktionwege vermittelt. Ein wichtiger Gegenspieler der Betazellapoptose ist der Transkriptionsfaktor CREB, der an der Regulation der Insulingentranskription beteiligt und wichtig für das Betazellüberleben ist (Oetjen et al. 1994, Jhala et al. 2003). Durch die MAP3-Kinase DLK kann die transkriptionelle Aktivität von CREB in Betazellen gehemmt werden (Oetjen et al. 2006). Als übergeordnete MAP3K kann DLK die Apoptose-regulierende MAP-Kinase JNK aktivieren und von ihr wieder aktiviert werden (Handley et al. 2007). Die bei Diabetes mellitus Typ 1 und Typ 2 vermehrt produzierten proinflammatorischen Zytokine TNF-Alpha und IL-1 Beta können ebenfalls JNK aktivieren (Mandrup-Poulsen 2003). In dieser Arbeit wurde die Wirkung von TNF-Alpha und IL-1 Beta auf die CREB-abhängige Gentranskription im Luciferase-Reporter-Assay und auf das Absterben und die Apoptose von Betazellen im MTT-Test und Immunfluoreszenz-Assay in der Betazelllinie HIT-T15 untersucht. Zusätzlich wurde untersucht, ob die Zytokinwirkung DLK-abhängig ist. Es konnte gezeigt werden, dass TNF-Alpha und IL-1 Beta die stimulierte CRE-/CREB-abhängige Gentranskription hemmen, Überexpression von DLK verstärkt diese Wirkung, bei TNF-Alpha mehr als bei IL-1Beta. Verminderung der endogenen DLK durch siRNA reduziert die TNF-Alpha- und IL-1 Beta-induzierte CREB Hemmung. Beide Zytokine konnten eine Betazellapoptose auslösen, die ebenfalls durch die DLK verstärkt wird. Bei Überexpression einer Kinase-toten DLK-Mutante konnte durch TNF-Alpha keine Apoptose induziert werden, aber durch IL-1 Beta, dies spricht dafür, dass die Wirkung von TNF-Alpha zu einem größeren Teil abhängig von der DLK ist als die Wirkung von IL-1 Beta, die zum Teil DLK-unabhängig vermittelt wird. Zusammengefasst könnte TNF-Alpha über Aktivierung von DLK und JNK und anschließend gegenseitiger Signalamplifikation beider Kinasen zu einer DLK-vermittelten Hemmung der CREB-abhängigen Gentranskription führen, eine Betazelldysfunktion und Apoptose vermitteln und zur Entstehung von Diabetes beitragen. Dagegen könnte IL-1 Beta über Aktivierung von JNK indirekt die DLK aktivieren und zu einer CREB-Hemmung führen. Die DLK scheint eine zentrale Rolle in der Zytokin-induzierten Betazellschädigung einzunehmen. Eine gewebespezifische Hemmung der DLK, wie z.B. über den Proteinkinaseinhibitor Tozasertib im Glaukommodell gezeigt (Welsbie et al. 2013), könnte daher auch einen neuen Ansatz in der Therapie des Diabetes mellitus darstellen.

O sistema NADPH oxidase humano é responsável pela geração de reativos intermediários do oxigênio e defeitos neste sistema resultam na Doença Granulomatosa Crônica (DGC). Nesta tese de doutorado, investigamos o efeito do IFN-g sobre eventos pós-transcricionais em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. Os dados obtidos sugerem que o uso do IFN-g in vitro interfere no processamento da mensagem causando aumento da expressão de transcritos do gene CYBB e NCF1 em células B-EBV de indivíduos sadios e pacientes DGC analisados. Observamos também que o IFN-g dimunui a expressão dos genes THOC4 NONO, SF3A1, SRRM1 e UPF3A e promove aumento de expressão de SRSF10, SNRPA1 e C2 em células B-EBV de paciente X-DGC secundária a defeitos de splicing. Identificamos que o IFN-g e o TNF-α aumentam a expressão das proteínas envolvidas no processo do splicing. Concluímos que o IFN-g aumenta a expressão de genes importantes para uma resposta eficiente do sistema imunológico, incluindo os do sistema NADPH oxidase, além de promover aumento da expressão de genes e de proteínas relacionados ao processo de splicing, que podem estar relacionados aos efeitos benéficos observados no uso do IFN-g em pacientes com DGC ligada ao X, ocasionada por defeitos de splicing. / The human phagocyte NADPH oxidase is responsible for the generation of reactive oxygen intermediates and defects in this system result in Chronic Granulomatous Disease (CGD). In this PhD Thesis, we investigated the effect of IFN-g on post-transcriptional events in normal individuals and patients with X-linked CGD, caused by splicing defects. The obtained data suggests that the use of IFN-g in vitro interferes in the message processing causing an increase of expression of CYBB and NCF1 gene transcripts in B-EBV cells of healthy individuals and analyzed CGD patients. We also observed that IFN-g decreases the expression of THOC4, NONO, SF3A1, SRRM1 and UPF3A, and increases the expression of SRSF10, SNRPA1 and C2 genes in cells from X-CGD patients, due to splicing defects. We identified that IFN-g and TNF-α induce expression of proteins involved in the splicing process. We conclude that IFN-g increases the expression of important genes for an effective immune response, including the NADPH oxidase system genes, and promotes augment of gene and protein expression related to the splicing process, which may be related to the beneficial effects related to the use of IFN-g in CGD patient caused by splicing defects.

Le cancer du sein est une maladie impactant le système immunitaire dont le rôle évolue au cours de la tumorigénèse, allant de la détection et l'élimination des cellules transformées (immunosurveillance) à la promotion du développement tumoral (immunosubversion). Les efforts déployés pour définir de nouvelles stratégies thérapeutiques ont révélé que rétablir l'immunité anti-tumorale chez les patientes permettrait d'améliorer leur pronostic. Durant ma thèse, nous avons mis en évidence l'existence de signaux activateurs et inhibateurs des pDC dans les cancers du sein, qui confèrent aux pDC un rôle dans l'immunosurveillance et dans l'échappement immunitaire du cancer du sein respectivement. Nous avons ainsi montré que le TGF-beta et le TNF-alpha sont impliqués dans l'inhibition fonctionnelle des TApDC en réprimant l'expression et l'activation d'IRF-7. Dans un second temps, nous avons montré i) la présence de complexes [ADN-LL37] produits par les neutrophiles dans les tumeurs et capables d'induire la production d'IFN-alpha par les pDC, ii) l'expression des gènes associés aux IFN-I dans les tumeurs de sein et iii) un rôle majeur de la voie des IFN-I dans l'immunosurveillance des tumeurs mammaires chez la souris. De plus, des données préliminaires chez la souris suggèrent que les pDC participent à l'immunosurveillance anti-tumorale in vivo. Les travaux présentés dans ce manuscrit apportent de nouvelles données sur le rôle des pDC dans l'immunosurveillance des cancers du sein et ouvrent sur de nouvelles stratégies d'immunothérapie anti-tumorale ciblant les pDC / Breast cancer are disease impacting immune system whose play role during tumorigenesis, to detect and eliminate malign cells (immunosurveillance) or promote tumoral development (immunosubversion). Efforts to define new therapeutic strategies revealed that restoring anti-tumor immunity in patients would improve their prognosis. During my thesis, first, we demonstrated the existence of stimulatory and inhibitory signals of pDCs in the breast, which give the pDCs a role in immunosurveillance and immune escape of breast cancer, respectively. We showed that TGF-beta and TNF-alpha are involved in the functional inhibition of TApDC repressing IRF-7 expression and activation. Secondly, we showed i) the presence of [DNA LL37] complex produced by neutrophils in tumors that can induce the production of IFN-alpha by pDCs, ii) the expression of type I IFN associated genes in breast tumors and iii) a major role of IFN-I pathway in immunosurveillance of mammary tumors in mice. In addition, in mice, preliminary data suggest that pDC could play a role in anti-tumor immunosurveillance in vivo. The work presented in this thesis provide new data on the role of pDCs in immunosurveillance of breast cancers, and open new anti-tumor immunotherapy strategies targeting pDCs

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen stellen eine Gruppe von chronischen, häufig in Schüben verlaufenden Erkrankungen mit rezidivierenden Entzündungen des Gastrointestinaltraktes dar. Es konnte gezeigt werden, dass eine gestörte Barrierefunktion einen wichtigen Schritt für die Pathogenese darstellt und dass das Zytokin Tumornekrosefaktor alpha (TNF) eine entscheidende Rolle dabei spielt. Die Rolle der kleinen GTPase RhoA bei der TNF-induzierten Barrieredysfunktion ist aufgrund der Komplexität der Signalwege nicht vollständig verstanden. Daher sollte der Einfluss von RhoA und der RhoA Effektorkinase PKN auf diese Prozesse in vitro mit Hilfe eines induzierbaren Expressionssystems untersucht werden, welches die kontrollierte Expression einer konstitutiv aktiven (KA) RhoA- und PKN-Mutante sowie einer dominant negativen (DN) PKN-Mutante ermöglichte. Die Induktion der KA RhoA Expression führte zu einer Störung der epithelialen Barriere. Eine simultane Interferon-gamma und TNF-Behandlung resultierte ebenfalls in einer gestörten Barrierefunktion, welche in KA RhoA Zellen weniger stark ausgeprägt war. Die TNF-Behandlung führte zu einer Aktivierung von PKN, weshalb dieses Protein ein Kandidat für die Vermittlung dieser Effekte darstellte. Inhibition von PKN mit Inhibitoren oder der Expression der DN Mutante führten zu einer Aggravierung der TNF-induzierten Barrieredysfunktion, welche durch eine Verringerung des transepithelialen elektrischen Widerstandes und eine erhöhte Ionenpermeabilität charakterisiert war. Diese Veränderungen wurden von einer Erhöhung des Myosin Leichtketten und NF-kappaB p65-Phosphorylierungsniveaus sowie von morphologischen Veränderungen begleitet. Im Gegensatz dazu konnten diese Veränderungen durch die Expression der KA PKN Variante abgeschwächt bzw. verhindert werden. Diese Ergebnisse liefern Hinweise auf eine potenzielle Rolle der RhoA Effektorkinase PKN bei der Modulation der TNF-induzierten Barrieredysfunktion in intestinalen Epithelzellen. / Inflammatory bowel diseases are relapsing systemic inflammatory diseases of the gastrointestinal tract associated with high morbidity and costs. A plethora of studies demonstrated that impaired intestinal barrier function is a key step in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases and that the cytokine tumor necrosis factor alphpa (TNF) is of pivotal importance for this effect. Although the small GTPase RhoA has been implicated in the control of tight junction function, its role in TNF induced barrier dysfunction is not entirely understood due to the complexity of its downstream signaling pathways. Therefore, the contribution of RhoA and its effector kinase PKN on TNF induced barrier dysfunction was investigated in vitro. An inducible expression system that allowed the doxycyline controlled expression of a constitutively active (CA) RhoA and PKN mutant as well as a dominant negative (DN) PKN mutant was generated. Induction of CA RhoA expression led to an impaired epithelial barrier. Simultaneous Interferon-gamma and TNF treatment also resulted in barrier perturbation, but this defect was attenuated when CA RhoA was expressed. As treatment with TNF resulted in activation of the RhoA effector kinase PKN, this protein constitutes a candidate molecule for the mediation of these effects. Inhibition of PKN by inhibitory compounds as well as expression of a dominant negative PKN mutant aggravated TNF-induced barrier dysfunction, characterized by a decline in transepithelial electrical resistance and increased ion permeability. These alterations were accompanied by an increase in myosin light-chain and NF-kappaB p65 subunit phosphorylation level as well as morphological changes of the tight junctions. Conversely, expression of a CA PKN mutant attenuated or prevented these changes. These results provide support for a potential role of the RhoA effector kinase PKN in modulating the barrier disrupting effects of TNF in the intestinal epithelium.

L'inflammation anténatale et l'hypoxie sont connues pour être les principaux phénomènes associés aux lésions cérébrales périnatales. La modulation de la cytokine pro-inflammatoire tumor necrosis factor-[alpha] (TNF-[alpha]), ses récepteurs (TNFR1 et TNFR2) et la TNF-[alpha] converting enzyme (TACE) pourrait être impliqués dans la genèse des lésions cérébrales périnatales entraînant la PC. Le stade de développement du système nerveux central (SNC) semble être un facteur déterminant dans le contrôle de la production intra-cérébrale du système du TNF-[alpha]. Afin d'étudier le rôle potentiel des membres du système du TNF dans la physiopathologie des lésions cérébrales périnatales, nous avons développé un modèle animal combinant l'inflammation anténatale, induite par le lipopolysaccharide (LPS), et l'hypoxie-ischémie (HI) post-natale chez le rat lewis. Les résultats démontrent que l'HI seule induit une augmentation significative de l'ARNm du TNF-[alpha] intra-cérébral pendant les huit premières heures suivant l'HI, mais le LPS seul ou combiné avec l'HI n'entraîne pas de modification comparativement aux animaux témoins. L'expression protéique cérébrale post-natale du TNF-[alpha] diminue significativement lors de l'exposition anténatale au LPS seul ou combinée à l'HI, comparativement à l'HI seule. De plus, aucune variation dans la synthèse protéique du TNF-[alpha] n'a été observée entre les cerveaux foetaux (pré-natal) exposés ou non anténatalement au LPS. Tout comme le TNF-[alpha], l'expression de l'ARNm de la TACE et de la protéine diminue de façon significative dans les quatre heures suivant l'exposition au LPS+HI comparativement au témoin et à l'HI seule. Parallèlement, les conditions expérimentales influencent l'expression cérébrale de l'ARNm et de la protéine du TNFR1, avec une augmentation significative (h8) dans tous les groupes expérimentaux comparativement aux témoins. In situ, le TNFR1 est régulé à la hausse dans le corps calleux, la substance blanche frontale et le cortex frontal, présentant un marquage principalement astrocytaire. En ce qui concerne le TNFR2, aucune variation dans son expression cérébrale n'a été observée. Nos résultats montrent une régulation serrée de la production des molécules du système TNF-[alpha] dans le système nerveux central en développement. Puisque la combinaison du LPS anténatal et de l'HI post-natale exacerbe l'étendue des lésions dans ce modèle animal, l'absence de régulation parallèle du système du TNF-[alpha] suggère que cette voie inflammatoire ne semble pas être impliquée dans la genèse des lésions cérébrales dans le contexte physiopathologique étudié.

La paralysie cérébrale (PC) affecte 3/1000 nouveau-nés. Les conditions pathologiques menant à la PC sont de natures infectieuse-inflammatoire et/ou hypoxique-ischémique (HI). Ce projet a eu comme objectif de caractériser un modèle animal de lésions cérébrales à un temps où la maturité cérébrale du raton est comparable à celle du nouveau-né humain à terme. L'hypothèse est que les cytokines pro-inflammatoires IL-1[bêta] et TNF-[alpha] jouent un rôle dans l'induction des lésions cérébrales. Matériel et Méthodes : Ce modèle animal est composé de cinq conditions expérimentales : CTL, sham , LPS, HI, et LPS+HI. Brièvement, une injection i.p de LPS à une dose de 200[micro]g/kg a été réalisée 4h avant une ligature permanente de la carotide commune droite suivie d'une hypoxie (8% O[indice inférieur 2]) pendant 2h30-3h30. Les ratons ont été sacrifiés à différents temps post-HI afin d'analyser l'expression d'IL-1[bêta], d'IL-1Ra et de TNF-[alpha] cérébrales. L'expression in situ des cellules CD68+, Iba-1+ et GFAP+ a été analysée par IF. L'IRM et l'histologie ont été utilisés afin de caractériser les dommages cérébraux. Des injections de bloquants de cytokines pro-inflammatoires ont été effectuées. Résultats : Des dommages cérébraux ont été induits dans les conditions HI«LPS, sélectivement dans l'hémisphère cérébral droit, et étaient maximaux lors de la combinaison des agression [sic]. Une surexpression des cytokines IL-1[bêta], IL-1Ra, et TNF-[alpha] a été induite dans l'hémisphère droit exposé à l'HI«LPS. Une gliose a été détectée au sein des lésions cérébrales. Certains déficits cognitifs et moteurs ont été observés dans la condition LPS+HI. L'administration systémique des bloquants de cytokines n'a pas réduit les dommages cérébraux aux doses utilisées. Conclusions : Dans ce modèle animal, l'HI«LPS a induit des dommages cérébraux similaires à ceux observés chez le nouveau-né humain à terme. Les déficits cognitifs et comportementaux induits sont caractéristiques de la PC. Bien qu'il y ait une forte induction intracérébrale d'IL-1[bêta] et de TNF-[alpha], les essais de neuroprotection ont suggérés que ces cytokines ne sont pas impliquées dans la genèse des lésions cérébrales à ce stade de développement.

<p>Neuroinflammation associated with lumbar radiculopathy and peripheral nerve injury is characterized by locally increased levels of the pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor alpha (TNF&alpha;). Systemic administration of TNF antagonists for radiculopathy in the clinic has shown mixed results, and there is growing interest in local delivery of anti-inflammatory drugs to treat this pathology, as well as similar inflammatory events of peripheral nerve injury. Curcumin, a known antagonist of TNF&alpha; in multiple cell types and tissues, was chemically modified and conjugated to a thermally responsive elastin-like polypeptide (ELP) to create an injectable depot for sustained, local delivery of curcumin to treat neuroinflammation. </p><p>ELPs are biopolymers capable of thermally-triggered in situ depot formation and have been successfully employed as drug carriers and biomaterials in several applications. A library of ELP-curcumin conjugates were synthesized and characterized. One lead conjugate was shown to display high drug loading, rapidly release curcumin in vitro via degradable carbamate bonds, and retain in vitro bioactivity against TNF&alpha; and NF-&kappa;B with near-equivalent potency compared to free curcumin. When injected into the perineural space via intramuscular (i.m.) injection proximal to the sciatic nerve in mice, ELP-curcumin conjugates underwent a thermally triggered soluble-insoluble phase transition, leading to in situ formation of a depot that released curcumin over 4 days post-injection and decreased systemic exposure of curcumin 3-fold. </p><p>The results of this dissertation support the use of ELP as a drug carrier for local perineural drug delivery, and the strategy presented here for drug conjugate development and use of depot-forming ELP-curcumin conjugates represents a novel means of providing sustained treatment of neuroinflammation and pain associated with radiculopathy and peripheral nerve injury.</p> / Dissertation

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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