Orientadores: Fernando Ferreira Costa, Dulcinéia Martins de Albuquerque / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_RegianeAparecida_M.pdf: 1067582 bytes, checksum: 33631c571ed5b3e047ee71d15d222e81 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As variantes de hemoglobina e as Talassemias estão entre as hemoglobinopatias hereditárias mais frequentes no Brasil. A hemoglobina S é resultante de uma mutação de ponto no gene que codifica a cadeia beta da globina e que em homozigose caracteriza a Anemia Falciforme. Outras variantes neste gene podem ocasionar redução parcial ou completa da síntese de uma ou mais cadeias da globina, originando as Talassemias do tipo beta. Recentemente, alguns estudos relacionaram a interação de fatores de transcrição e microRNAs que mediam, em conjunto, mecanismos regulatórios transcricionais e pós transcricionais e promovem a diferenciação, proliferação e maturação de células eritroides. Dessa maneira, alterações no perfil de expressão de fatores transcricionais e de pequenos RNAs podem ocasionar manifestações clínicas envolvidas na eritropoese de pacientes com Talassemia beta intermediária e com Anemia Falciforme. Este trabalho analisou o perfil de expressão dos fatores transcricionais GATA-1, TAL1, NFE-2, LDB1, SPI-1, LMO2 e EKLF e dos miRNAs miR24, miR144, miR155, miR210, miR221, miR222, miR223 e miR451 em reticulócitos de 9 pacientes com Talassemia beta intermediária e 8 pacientes com Anemia Falciforme, através da PCR quantitativa em tempo real. Os resultados apresentaram alterações significativas no perfil de expressão dos FTs GATA-1, TAL1 e NFE-2 em reticulócitos de pacientes com Talassemia beta intermediária. Nos pacientes com Anemia Falciforme, diferenças significativas foram observadas na expressão dos FTs LMO2 e EKLF e dos microRNAs miR221, miR223 e miR451. Em conjunto, nossos resultados sugerem o envolvimento dos fatores de transcrição em associação aos microRNAs como moduladores da manifestação clínica em pacientes com Talassemia e Anemia Falciforme. Trata-se do primeiro estudo que avalia o perfil de expressão de microRNAs e fatores de transcrição relacionados à eritropoese em reticulócitos de pacientes com Anemia Falciforme e Talassemia beta no Brasil / Abstract: The hemoglobin variants and thalassemias are the most frequent hemoglobinopathies in Brazil. Hemoglobin S results from a point mutation in the gene that encodes the beta globin chain, which is characterized in homozygous sickle cell disease. Other variants of this gene can cause partial or complete reduction of the synthesis of one or more globin chains that result in beta-thalassemias. Recently, some studies have identified the interaction of transcription factors and microRNAs that mediate, together, regulation of transcriptional and post transcriptional mechanisms to promote the differentiation, proliferation and maturation of erythroid cells. Thus, disorders in the transcriptional factors and small RNAs expression can cause clinical manifestations involved in the erythropoiesis of patients with beta thalassemia intermediate and in sickle cell disease. This study analyzed the expression profile of the transcription factors GATA-1, TAL1, NFE2, LDB1, SPI1, LMO2 and EKLF and microRNAs miR24, miR144, miR155, miR210, miR221, miR222, miR223 and miR451, in reticulocytes from 9 patients with beta thalassemia intermediate and 8 patients with sickle cell disease, by real-time quantitative PCR. The results showed significant changes in the expression profiles of the transcription factors, GATA-1, TAL1 and NFE-2, in the reticulocytes of patients with beta thalassemia intermediate. In patients with sickle cell disease, significant differences were observed in the expression of the transcription factors, LMO2 and EKLF, and microRNAs miR221, miR223 and miR451. Together, our results suggest the involvement of transcription factors in association with miRNAs as modulators of the clinical manifestation in patients with beta thalassemia and sickle cell disease. This is the first study that evaluates the gene expression of microRNAs and transcription factors related to erythropoiesis in reticulocytes from patients with sickle cell anemia and beta thalassemia in Brazil / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Beta-talassemia é uma das doenças genéticas mais comuns no mundo, com graus variados de anemia crônica, tratados por transfusões sanguíneas rotineiras nos casos mais graves. A sobrecarga de ferro acentuada a que esses pacientes são submetidos é a principal responsável pela morbimortalidade, sendo o acúmulo de ferro no miocárdio e a doença cardíaca disso decorrente, a principal causa de morte nessa população. A ressonância magnética cardíaca (RMC) é ferramenta central no acompanhamento desses pacientes, utilizando-se da técnica T2*, capaz de determinar a presença e grau da deposição de ferro no miocárdio, modificando o tratamento da terapia quelante de ferro (TQF). Além disso, outros parâmetros volumétricos e funcionais obtidos no exame de RMC podem estar alterados nesses pacientes. Até a atualidade, inexistem estudos nacionais descrevendo uma população de pacientes beta-talassêmicos pelos parâmetros da RMC. Objetivos: 1. Caracterizar a partir dos diversos parâmetros dos exames de RMC, a população dos pacientes talassêmicos acompanhados no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. 2. Avaliar o impacto dos diversos parâmetros da RMC com informações clinicas como mudança terapêutica, ocorrência de insuficiência cardíaca e óbito. Métodos: foram avaliados 44 pacientes com diagnóstico de beta-talassemia em seguimento no serviço de hematologia, para os quais foram solicitados exames de RMC na rotina clínica. Os exames incluíram sequências cine SSFP (steady state free precession) nos diversos planos cardíacos, incluindo uma sequência do eixo curto de ambos os ventrículos, esta utilizada para as medidas de volumes e função ventriculares. A sequência T2* utilizada foi gradiente eco com pré-pulso de saturação do sangue, com aquisição de 9 ecos consecutivos em apenas uma apneia. Sequência semelhante foi obtida para cálculo do T2* hepático. Foi feita revisão dos prontuários dos pacientes para avaliação dos dados clínicos. Resultados: 44 pacientes foram avaliados (25 do sexo masculino 56,8 %), com idade de 23,1±10,3 anos e diagnóstico de beta-talassemia maior em 30 casos (68,2 %) e talassemia intermedia em 14 casos (31,8 %). Foram descritos os volumes, massa e função para ambos os ventrículos, bem como a distribuição da medida do T2* miocárdico. Não foram observadas diferenças desses parâmetros entre os diferentes grupos de impregnação miocárdica pelo T2*. O seguimento médio do estudo foi de 4,0 (±1,1) anos com 4,7 (±1,6) exames por paciente. Foram identificados cinco pacientes com doença cardíaca e dois óbitos. Esses pacientes apresentaram redução significativa do T2* miocárdico, da fração de ejeção do ventrículo direito (VD), massa ventricular direita e esquerda e do volume sistólico final do VD, quando comparados aos indivíduos sem acometimento cardíaco reportado. Conclusão: Caracterizou-se a população de pacientes beta-talassêmicos acompanhados nesta instituição, em relação aos diversos parâmetros da RMC, salientando-se o impacto da introdução do método na mudança terapêutica. A medida do T2* miocárdico está correlacionada ao desenvolvimento de cardiopatia e pior evolução clínica, incluindo óbito. Acometimento do VD pode ser indicador precoce da impregnação miocárdica. / Beta-thalassemia is one of the most common genetic disorders worldwide, with different degrees of chronic anemia, treated with routine blood transfusions in severe cases. Morbidity and mortality is mainly related to the chronic iron overload and iron burden these patients endure. Myocardial iron overload and the development of cardiac disease remain the main cause of death for this population. Cardiac magnetic resonance (CMR) plays a central role in patient management, utilizing T2* sequences, which allows for detection and quantification of myocardial iron deposits, thus prompting changes in iron chelation therapy (ICT). Besides, there are other significant CMR volumetric and functional parameters to present abnormalities in these patients. To the present date, no national data has been published, describing a beta-thalassemia patient population from the standpoint of CMR parameters. Objectives: 1. To characterize, from the different CMR parameters, the beta-thalassemia patient population followed at a Brazilian tertiary hospital. 2. To evaluate the impact of these different CMR parameters, in relation to clinical data, such as therapeutic change, cardiac disease and death. Methods: 44 beta-thalassemia patients followed by the hematology service of this institution were evaluated, to whom CMR exams were performed in routine clinical practice. CMR exams included SSFP (steady state free precession) cine images through the different cardiac planes, including a short axis stack through both ventricles, used to calculate ventricular volumes and function. A gradient echo sequence with a dark blood pre-pulse saturation was used to calculate myocardial T2* values, with 9 consecutive echo times acquisition in one breath hold. A similar sequence was used to determine liver T2* values. Medical records were reviewed for clinical data. Results: 44 patients were evaluated (25 males, 56.8 %), with a mean age of 23,1 (±10,3) years, and diagnosis of betathalassemia major in 30 patients (68,2 %) and beta-thalassemia intermedia in 14 (31,8 %). Ventricular volumes, mass and function were described, as well as myocardial T2* distribution. There were no statistical difference observed among the different CMR parameters and the myocardial T2* degrees. Mean follow up was 4,0 (±1,1) years, with 4,7 (±1,6) exams per patient. Five patients with cardiac disease were identified with two deaths during observation. These patients showed a significantly reduced myocardial T2* and RVEF, and an elevated ventricular mass, for both ventricles, and final systolic right ventricular volume, when compared to patients without cardiac disease. Conclusion: A betathalassemia patient population was characterized through the different CMR parameters, highlighting the impact of CMR introduction to treatment decision. Myocardial T2* is related to cardiac disease development, clinical worsening and death. Right ventricular functional worsening could be an early sign of myocardial iron involvement.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-11T17:27:27Z No. of bitstreams: 1 danieladeoliveirawerneckrodrigues.pdf: 3809110 bytes, checksum: c650e81b66628763f82026695326df44 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-18T12:48:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 danieladeoliveirawerneckrodrigues.pdf: 3809110 bytes, checksum: c650e81b66628763f82026695326df44 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-18T12:48:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 danieladeoliveirawerneckrodrigues.pdf: 3809110 bytes, checksum: c650e81b66628763f82026695326df44 (MD5) Previous issue date: 2016-05-20 / Introdução: A doença falciforme (DF) é a doença hereditária monogênica mais comum no Brasil.O termo DF inclui Anemia Falciforme (AF) e condições patológicas em que o gene da hemoglobina S está associado a outras hemoglobinopatias hereditárias, tais como SC, S/beta0 e S/beta+ talassemia (S/b), SD Punjab, entre outras. Há descrição de 5 haplótipos do cluster da cadeia globina (βS) ligados à HbS: Asiático, Senegal, Benin, Bantu (CAR) e Camarões. A DF pode ainda coexistir com as α-talassemias (α-Tal). A complicação mais severa na DF é o Acidente Vascular Encefálico (AVE), responsável por 20% da mortalidade. As causas e fatores que aumentariam o risco de AVE não são completamente conhecidos. Várias linhas de evidência sugerem que uma assinatura genética poderia influenciar o desenvolvimento de AVE. Objetivos: Determinar a frequência de DF, investigar a coexistência da α-Tal, identificar os haplótipos e estudar as associações entre estes determinantes genéticos com AVE em crianças triadas pelo Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais e acompanhadas na Hemominas de Juiz de Fora. Metodologia: Foi realizada uma coorte retrospectiva, na qual foram incluídas as crianças nascidas entre 1998 a 2007, com diagnóstico confirmado de DF. Foram considerados para inclusão no estudo, crianças com Anemia Falciforme (AF), SC, S/b0 e S/b+. As informações clínicas e laboratoriais foram extraídas dos prontuários médicos até 31 de dezembro de 2013 permitindo um acompanhamento de no mínimo cinco anos. O perfil socioeconômico foi obtido através da aplicação do questionário do Instituto Nacional de Estudos e Pesquisas Educacionais Anísio Teixeira. A determinação dos haplótipos e a presença da α-Tal foi realizada por reação em cadeia da polimerase e polimorfismo de tamanho dos fragmentos de restrição. A análise estatística das associações foi feita com aplicação do teste Qui-quadrado considerando-se um nível de significância de 5%, no programa SPSS Statistics® 14.0. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Fundação Hemominas. Resultados: Entre 1998 e 2007, foram 11 triadas 188.916 crianças nascidas na região da Zona da Mata Mineira e Vertentes, 110 crianças com DF preencheram os critérios de inclusão e constituíram a população deste estudo. Entre as crianças com DF, 60% eram portadoras de AF. A prevalência da coexistência com a α-Tal foi de 30,3% e o haplótipo Bantu (CAR) foi identificado em 89,2%. A incidência de AVE foi significativamente maior nas crianças com AF (27,3% versus 2,3%; p = 0,001) e no sexo masculino (24,1% versus 9,6%; p = 0,044). A presença da α-Tal (p = 0,196), do haplótipo CAR (p = 0,543) e fatores socioeconômicos não foram significantemente associadas à ocorrência de AVE. Conclusões: As crianças com AF tem 12 vezes mais risco de ter AVE do que as que têm outros tipos de DF. A incidência de AVE no sexo masculino foi maior. Coexistência de α-Tal ou haplótipos CAR não apresentaram associação significante com AVE. A heterogeneticidade entre as populações previamente avaliadas e a não reprodutibilidade entre estudos indicam a necessidade de realização de novas pesquisas para verificar o papel desses fatores genéticos em crianças com DF. / Introduction: Sickle cell disease (SCD) is the most common monogenic hereditary disease in Brazil. The term SCD includes sickle cell anaemia and pathological conditions in which the S haemoglobin gene is associated with other hereditary hemoglobinopathies, as SC, S/beta0 and S/beta+ talassemia (S/b), SD Punjab, among others. Five different types of beta globin chain (βS) cluster haplotypes linked to HbS have been described: Asian, Senegalese, Benin, Bantu (CAR) and Cameroon. SCD can also coexist with alpha thalassemia (α-Tal). The most severe complication on SCD is stroke, which is responsible for 20% of mortality. The causes and factors that could increase the risk of stroke are not completely known. Many lines of research suggest that a genetic signature could influence the occurrence of stroke. Objective: Determine the frequency of SCD , identify the haplotypes and study the associations between these genetic determinants and stroke in children screened by the Minas Gerais’ State Program of Neonatal Screening and followed-up in Fundação Hemominas in Juiz de Fora. Methods: A retrospective cohort was established, in which were included children born between 1998 and 2007, with confirmed diagnosis of SCD. Children with sickle cell anaemia, SC, S/b0 and S/b+ were included. The clinical and laboratorial information were extracted from medical records until December 31st, 2013, allowing a follow-up of at least five years. The socioeconomic profile was obtained by applying the Anísio Teixeira National Institute of Studies and Educational Research questionnaire. The haplotype determination and presence of α-Tal was documented through the usage of polymerase chain reaction and restriction fragments length polymorphisms. The statistical analysis of such associations was performed by application of the chi-square test considering a level of significance of 5%, with SPSS Statistics® 14.0 program. The project was approved by Fundação Hemominas’s Reasearch Ethics Committee. Results: Between 1998 and 2007, 188,916 children were screened in Minas Gerais’ Zona da Mata e Vertentes region, 110 children with SCD fulfilled the inclusion 13 criteria and composed the population of this study. Among children with SCD, 60% were carriers of sickle cell anemia. The prevalence of coexistence with α-Tal was 30.3% and the Bantu (CAR) haplotype was identified in 89.2%. The incidence of stroke was significantly higher in children with sickle cell anemia (27.3% versus 2.3%; p = 0.001) and in the male gender (24.1% versus 9.6%; p = 0.044). Presence of α-Tal (p = 0.196), CAR haplotype (p = 0.543) and socioeconomic factors were not significantly associated with the occurrence of stroke. Conclusion: Children with sickle cell anemia have 12 times increased risk of having a stroke than patients with other types of SCD. The incidence of stroke in the male gender was higher. Coexistence with α-Tal and CAR haplotype were not significantly associated with stroke. Heterogeneity between previously assessed populations and non reproducibility among studies indicate the need to conduct further research to determine the role of these genetic factors in children with SCD.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-06-29T14:15:54Z No. of bitstreams: 1 thaisanettosouzavalentefrossard.pdf: 4978395 bytes, checksum: ac5dc0c8f717447878ea3a336969d945 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-07-03T14:14:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 thaisanettosouzavalentefrossard.pdf: 4978395 bytes, checksum: ac5dc0c8f717447878ea3a336969d945 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-03T14:14:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thaisanettosouzavalentefrossard.pdf: 4978395 bytes, checksum: ac5dc0c8f717447878ea3a336969d945 (MD5) Previous issue date: 2018-04-09 / Hipocolesterolemia e hipertrigliceridemia são documentadas na Doença Falciforme (DF) há muitos anos, mas as causas e os efeitos na fisiopatologia ainda precisam ser esclarecidos. Além disto, relatos sobre marcadores genéticos relacionados ao metabolismo lipídico que explicam a variação dos níveis de lipídios e suas associações com os subfenótipos de hemólise e vaso-oclusão e com a variabilidade clínica da DF não foram publicados até o momento. O objetivo geral do estudo foi investigar se havia dislipidemia e se polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) em genes ligados às variações lipídicas e inflamatórias estariam associados a alterações nas variáveis hematológicas, bioquímicas e clínicas, em crianças e adolescentes com as duas formas mais frequentes da DF, anemia falciforme (HbSS) e hemoglobinopatia SC (HbSC). A população consistiu de 155 indivíduos nascidos entre 2001 e 2010, com média de idade de 12,54 anos, sendo 55,5% do sexo masculino, acompanhados nos Hemocentros Regionais de Governador Valadares e de Uberaba da Fundação Hemominas. Um grupo conrole constituído de 40 crianças sem DF com média de idade de 12,98 anos também foi incluído para comparações com dados lipídicos. Foram realizadas coletas de dados em registros médicos, exames bioquímicos, genotipagens dos SNPs de ANGPTL4, APOA5, ZNF259 e TNFA, pesquisa de alfa-talassemia e avaliação do uso de hidroxiuréia (HU). Verificaram-se associações entre as variáveis investigadas e, destas, com a ocorrência de eventos clínicos da DF. Para estes fins foram aplicados testes qui-quadrado, Mann-Withiney, Teste T de Students, ANOVA, Kruskal-Wallis e realizadas correlações com o teste de Spearman. A significância estatística foi estabelecida em P < 0,05. Dentre os achados, foram encontrados piores índices de marcadores de hemólise e inflamação nos indivíduos HbSS em relação aos HbSC. A hipocolesterolemia (HDL < 40 mg/dL) foi encontrada em 64,52% da população com DF, havendo diferença significativa entre os indivíduos e os controles, sem diferença entre HbSS e HbSC. Indivíduos com DF que possuíam a HDL superior a 40 mg/dL apresentaram maiores níveis de APOA1 e menores de colesterol total e triglicerídios. A hipertrigliceridemia (TG > 100 mg/dL até os 10 anos e > 130 mg/dL acima de 10 anos) presente em apenas 8,51% dos pacientes DF não mostrou diferença significativa entre os grupos HbSS e HbSC e foi associada com níveis elevados da enzima LDH. Nos indivíduos HbSS os baixos níveis de HDL estavam em maior proporção se comparados ao grupo HbSC. O uso de HU no grupo HbSS não interferiu nos níveis de lipídios. A variante rara do gene ANGPTL4 rs116843064 (G>A), no modelo de dominância, foi associada com redução de leucócitos globais e monócitos e aumento de apolipoproteína A1 e colesterol total nos indivíduos com DF. O polimorfismo de ZNF259 rs964184 (c.724C>G) foi associado ao aumento dos marcadores de hemólise/inflamação (leucócitos globais, reticulócitos e bilirrubinas total e direta) e apresentou efeito dose dependente nos níveis de bilirrubina direta. A variante de menor frequência (-308A) de TNFA rs1800629 foi associada com aumento de 73% dos níveis de bilirrubina direta. A co-herança de alfa-talassemia presente nos dois grupos HbSS e HbSC, reduziu VCM e HCM, mas não influenciou os níveis de HbF, reticulócitos, bilirrubina ou o perfil lipídico. Em conclusão, a hipocolesterolemia foi caracterizada por baixos níveis de HDL em ambos os grupos de indivíduos HbSS e HbSC e o uso terapêutico da hidroxiuréia ou a co-existência de alelos de deleção dos genes HBA parecem não influenciar este quadro dislipidêmico. Entre os polimofismos estudados o de ZNF259 rs964184 foi o único associado a níveis de lipídios nos indivíduos com DF. Nosso estudo é o primeiro a mostrar que a variantes de menor frequência de ZNF259 rs964184 e TNFA rs1800629 estão associadas a hiperbilirrubinemia em pacientes com DF. / Hypocholesterolemia and hypertriglyceridemia have been documented in sickle cell disease (SCD) for many years, but the causes and effects on pathophysiology still need to be clarified. In addition, reports on genetic markers related to lipid metabolism that explain the variation of lipid levels and their associations with subtypes of hemolysis and vaso-occlusion and clinical variability of SCD have not been published to date. The overall objective of the study was to investigate whether dyslipidemia and single nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes linked to lipid and inflammatory changes would be associated with changes in hematological, biochemical and clinical variables in children and adolescents with the two most frequent forms of SCD, sickle cell anemia (HbSS) and hemoglobinopathy SC (HbSC). The population consisted of 155 individuals born between 2001 and 2010, with a mean age of 12.54 years, being 55.5% male, followed in the Regional Hemocenters of Governador Valadares and Uberaba of the Hemominas Foundation. A conrole group consisting of 40 children without SCD with a mean age of 12.98 years was also included for comparison with lipid data. Data collection on medical records, biochemical tests, genotyping of ANGPTL4, APOA5, ZNF259 and TNFASNPs, alpha-thalassemia screening and assessment of hydroxyurea (HU) use were performed. There were associations between the variables investigated and, of these, with the occurrence of clinical events of the SCD. For these purposes chi-square, Mann-Withiney, Student's T-Test, ANOVA, Kruskal-Wallis and correlations with the Spearman test were applied. Statistical significance was set at P <0.05. Among the findings, we found worse markers of hemolysis and inflammation in HbSS individuals in relation to HbSC. Hypocholesterolemia (HDL <40 mg / dL) was found in 64.52% of the SCD population, with a significant difference between individuals and controls, with no difference between HbSS and HbSC. Individuals with SCD that had HDL greater than 40 mg / dL had higher levels of APOA1 and lower total cholesterol and triglycerides. Hypertriglyceridemia (TG> 100 mg / dL up to 10 years and> 130 mg / dL over 10 years) present in only 8.51% of SCD patients showed no significant difference between the HbSS and HbSC groups and was associated with high levels of the LDH enzyme. In the HbSS subjects the low HDL levels were in a higher proportion when compared to the HbSC group. The use of HU in the HbSS group did not interfere with lipid levels. The rare variant of the ANGPTL4 gene rs116843064 (G> A) in the dominance model was associated with reduction of global leukocytes and monocytes and increase of apolipoprotein A1 and total cholesterol in subjects with DF. The polymorphism of ZNF259 rs964184 (c.724C> G) was associated with increased markers of hemolysis/ inflammation (total leukocytes, reticulocytes and total and direct bilirubin) and had a dose-dependent effect on direct bilirubin levels. The lower frequency variant (-308A) of TNFA rs1800629 was associated with a 73% increase in direct bilirubin levels. Alpha-thalassemia co-inheritance in both HbSS and HbSC groups reduced MCV andMCH, but did not influence HbF, reticulocyte, bilirubin or lipid profile levels.In conclusion, hypocholesterolemia was characterized by low levels of HDL in both groups of HbSS and HbSC and the therapeutic use of hydroxyurea or the coexistence of deletion alleles of HBA genes does not appear to influence this dyslipidemic condition. Among the polymorphisms studied, that of ZNF259 rs964184 was the only one associated with lipid levels in SCD. Our study is the first to show that the lower frequency variants of ZNF259 rs964184 and TNFA rs1800629 are associated with hyperbilirubinemia in SCD.

Orientador: Maria de Fátima Sonati / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T22:02:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_ThalesAllyrioAraujodeMedeiros_D.pdf: 2937928 bytes, checksum: 301442af6cf4af176a07dec075589b81 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As doenças falciformes apresentam uma heterogeneidade fenotípica substancial e vários fatores, tanto genéticos quanto ambientais, contribuem para esta variabilidade. A co-herança com a talassemia ? e os haplótipos ?S são considerados importantes moduladores genéticos da doença, mas outros fatores hereditários podem também influenciar os perfis clínicos e laboratoriais dos pacientes. Estudos têm sugerido que os genótipos da haptoglobina (Hp) poderiam estar entre esses fatores. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o efeito da presença da talassemia ?, dos diferentes haplótipos ?S e dos genótipos da haptoglobina na evolução clínica e nas características laboratoriais de pacientes com doença falciforme provenientes do estado do Rio Grande do Norte (RN). Foram analisados 155 indivíduos não aparentados (82 homens e 73 mulheres), com idades variando de 7 meses a 48 anos (mediana de 12 anos), provenientes de diversos municípios do RN e atendidos nos centros de referência de tratamento de doenças hematológicas para acompanhamento ambulatorial. Todos os pacientes, ou seus responsáveis, foram informados a respeito dos objetivos e procedimentos da pesquisa, e responderam a um questionário padronizado. Ao final, coletaram-se alíquotas de sangue periférico para a realização das análises hematológicas, bioquímicas e moleculares. Posteriormente, foram examinados os prontuários médicos arquivados nestes centros, de onde foram obtidas as informações relativas à evolução clínica (número de internações e transfusões nos últimos 12 meses, necessidade de estabelecimento de terapia transfusional crônica, desenvolvimento de infecções bacterianas graves, síndrome torácica aguda, sequestro esplênico, alterações cerebrovasculares, priapismo, úlcera de perna, necrose óssea, problemas cardiovasculares, renais e oftalmológicos, colelitíase, déficit ponderal e retardo no crescimento). Predominaram os indivíduos com idades inferiores a 12 anos, que se autodeclararam mulatos, que moravam em pequenas cidades relativamente distantes dos centros de referência e que possuíam baixo nível educacional e socioeconômico. Os pacientes com idades inferiores a 10 anos foram diagnosticados com a doença mais precocemente. Quase 50% dos indivíduos analisados faziam uso de hidroxiuréia, 91,4% relatou ter recebido vacinação pneumocócica/meningocócica e 76,1% já tinha feito uso profilático de penicilina alguma vez na vida. A co-herança com a talassemia alfa foi encontrada em 11,6% dos pacientes e não mostrou associação significativa com nenhuma das complicações clínicas avaliadas. No entanto, os pacientes ?-talassêmicos apresentaram maiores níveis de hemácias e hematócrito, e menores valores de hemoglobina corpuscular média (HCM). Os haplótipos ?S mais frequentes foram o CAR (77,5%), Benin (11,9%) e Camarões (5,5%). A homozigoze do haplótipo CAR esteve associada à maior incidência de retardo no crescimento, enquanto as demais combinações de haplótipos apresentaram valores significativamente maiores de hemoglobina e hemácias. A distribuição dos genótipos da haptoglobina estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os grupos considerados e o tipo predominante foi o Hp2-1 (47,7%). As frequências dos alelos HP*1 (0,503) e HP*2 (0,497) foram muito semelhantes. A herança do alelo HP*2 se correlacionou significativamente com a necessidade de implementação da terapia transfusional crônica ao longo da vida e a níveis mais elevados de ferritina. Já os homozigotos do alelo HP*1 (18 pacientes) apresentaram níveis mais elevados de LDH e AST, que deixaram de ser significativos quando se incluiu na análise os indivíduos que faziam uso da hidroxiuréia (10 pacientes). Nossos resultados sugerem que os fatores genéticos aqui avaliados influenciaram em algum grau a evolução clínica e/ou os perfis laboratoriais dos pacientes desta amostra populacional. A ausência de associação significativa com as demais complicações aqui investigadas reflete a natureza multifatorial da doença e a necessidade de ampliação do tamanho amostral em estudo / Abstract: Sickle cell disease presents a significant phenotypic heterogeneity, and both genetic and acquired factors contribute to this variability. Co-inheritance of alpha-thalassemia and ?S haplotypes are the major genetic modifiers of the disease, but others inherited features can influence the clinical and laboratorial profile of the patients. Reports have suggested that haptoglobin genotypes could be one. Therefore, this study aimed to evaluate the effect of alpha thalassemia, ?S haplotypes and genotypes of haptoglobin in the clinical outcome and laboratorial characteristics of patients with sickle cell disease of Rio Grande do Norte State (RN). We analyzed 155 non-related individuals (82 men and 73 women) with sickle cell disease from various municipalities of RN, ages ranging from 7 months to 48 years (median age 12 years), who went to referral centers for outpatient visits. All the patients, or their caregivers, were informed about the research procedures and objectives, and answered a standardized questionnaire. After this, we collected blood samples for hematological, biochemical, and molecular analyses. Additionally, clinical data (number of blood transfusions and hospital admission in the last 12 months, need for chronic transfusion therapy, development of severe bacterial infections, acute chest syndrome, splenic sequestration, cerebrovascular disease, priapism, leg ulcers, osteonecrosis, cardiovascular, renal, and ophthalmologic problems, gallstones, weight deficit and stunted growth) were obtained from the patients¿ medical records archived in these referral centers. The patients were predominantly younger than 12 years old, self-declared as mulatto, lived in small cities relatively distant from the referral center, and had a low education and socio-economic level. Individuals who were 10 or younger were diagnosed at an earlier age. Almost 50% of the patients were taking hydroxyurea, 91.4% reported having received pneumococcal/meningococcal vaccination and 76.1% have ever done prophylactic use of penicillin. The co-inheritance of alpha thalassemia was found in 11.6% of patients and presented no significant association with any clinical complication of sickle cell disease. However, patients with this genetic feature had higher red blood cell (RBC) counts and packet cell volume (PCV), and lower values of mean corpuscular hemoglobin (MCH). The ?S haplotypes more frequent were CAR (77.5%), Benin (11.9%) and Cameroon (5.5%). The homozygous CAR/CAR haplotype was associated with higher incidence of stunted growth, while the other haplotype presented higher hemoglobin and RBC. The distribution of haptoglobin genotype were in Hardy-Weinberg equilibrium in all the groups, and the predominant type was Hp2-1 (47.7%). The frequencies of HP*1 (0.503) and HP*2 (0.497) alleles were similar. The inheritance of HP*2 allele was significantly correlated to the requirement of chronic transfusion therapy and higher levels of ferritin. On the other hand, the Hp1-1 patients (18 individuals) had higher levels of LDH and AST, that were not significant when we included in the analysis the individuals who were using hydroxyurea (10 individuals). Our results suggest that the genetic characteristics evaluated in this study influenced in a certain extent the clinical outcome and/or laboratorial profile of patients with sickle cell disease from RN. The absence of significant association with the others clinical complications reflect the multifactorial nature of these events and the need to increase the analyzed sample size / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:13:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fertrin_KleberYotsumoto_D.pdf: 1904934 bytes, checksum: a74beda8b565fcdc3f59ad37d66ca23e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As hemoglobinopatias são distúrbios hereditários em que uma mutação genética leva a alteração da produção normal de hemoglobina, tal como na anemia falciforme e nas talassemias ß. Na maioria dessas doenças, ocorre anemia com necessidade transfusional variável, o que pode acarretar sobrecarga corporal de ferro. Na talassemia ß intermediária, ocorre aumento espontâneo e desproporcional da absorção do ferro, com consequente excesso desse metal mesmo na ausência de transfusões. Com a evolução da terapia transfusional e o aumento da expectativa de vida desses pacientes, o conhecimento sobre a regulação do metabolismo do ferro tornou-se fundamental para melhor controle da sobrecarga de ferro. O principal regulador desse metabolismo é a hepcidina, um polipeptídeo produzido majoritariamente pelo fígado, porém também sintetizado por células do sistema fagocítico-mononuclear, em que seu papel é pouco conhecido. Uma citocina capaz de suprimir a produção de hepcidina é o GDF-15 (fator de crescimento e diferenciação 15). Neste estudo, com a avaliação de amostras de sangue de 103 pacientes com anemia falciforme, talassemia ß intermediária, anemia por deficiência de cobalamina ou outros tipos de anemia, constatou-se que o aumento dos níveis desse fator ocorre tanto em quadros de hemólise crônica quanto na presença de eritropoese ineficaz, constituindo um sinal da medula óssea modulador da absorção de ferro nos estados de aumento da eritropoese. Entretanto, evidenciou-se que a associação de supressão da hepcidina com altos níveis de GDF-15 ocorre nas hemoglobinopatias, mas não nas demais causas de anemia. Na anemia megaloblástica, a ausência de sobrecarga de ferro com níveis normais de hepcidina ao diagnóstico e sua queda durante o tratamento sugerem regulação da hepcidina independente de GDF-15 neste tipo de anemia. A análise da razão hepcidina/ferritina mostrou-se mais fidedigna que os níveis de hepcidina circulante na identificação dos estados em que há propensão a absorção aumentada de ferro por alta atividade eritropoética, e sugerem que o estado inflamatório crônico da anemia falciforme poderia exercer um fator protetor contra sobrecarga de ferro, quando comparados a talassemia intermediária, pela elevação relativa da produção de hepcidina. Além disso, observou-se uma correlação negativa entre a expressão gênica de hepcidina (gene HAMP) em monócitos humanos e os níveis de GDF-15, denotando um provável efeito regulatório semelhante ao descrito em hepatócitos. Não se identificou correlação entre essa expressão nos monócitos e marcadores de sobrecarga de ferro, corroborando a hipótese de a hepcidina ter outra função nessas células, não relacionada diretamente à absorção de ferro. Pacientes com anemia falciforme em uso de hidroxiureia apresentaram maiores níveis de expressão de hepcidina monocítica e obteve-se evidência in vitro de uma ação estimuladora dessa expressão por esse fármaco, caracterizando a hidroxiureia com potencial atividade agonista de hepcidina, de futuro interesse em estudos de sua aplicação clínica nos estados em que exista deficiência monocítica dessa proteína. Trata-se do primeiro estudo avaliando comparativamente hemoglobinopatias e outros tipos de anemia com e sem componente eritropoético ineficaz do ponto de vista dos reguladores da absorção de ferro, além de caracterizar, pela primeira vez, a expressão de hepcidina extra-hepática nos distúrbios da síntese de hemoglobina / Abstract: Hemoglobinopathies are inherited diseases in which a genetic mutation leads to abnormal production of hemoglobin, such as in sickle cell anemia or in the ß-thalassemias. In the majority of these disorders, anemia causes variable degrees of transfusion dependency, which may lead to iron overload. In ß-thalassemia intermedia, an increase in iron absorption occurs spontaneously and regardless from the total body iron stores, generating iron overload even in the absence of repeated transfusions. Owing to advances in transfusion medicine and to the improvement in the overall life expectancy of patients with hemoglobin disorders, further knowledge on the regulation of iron metabolism has become increasingly important for appropriate management of iron overload. The main regulator of iron metabolism is hepcidin, a polypeptide mainly produced by the liver, although its synthesis also occurs in phagocytic-mononuclear cells, in which its role is less known. Growth differentiation factor 15 (GDF-15) is a cytokine capable of downregulating hepcidin production. This study analyzed 103 blood samples from patients with sickle cell anemia, ß-thalassemia intermedia, cobalamin deficiency anemia and other types of anemia, showing elevation of GDF-15 plasmatic levels both in chronic hemolytic states and ineffective erythropoiesis, thus characterizing it as a signalling molecule produced by the bone marrow to stimulate iron absorption in the presence of increased erythropoietic activity. Nevertheless, hepcidin suppression was only associated with high levels of GDF- 15 in the hemoglobinopathies. In megaloblastic anemia, absence of iron overload with normal hepcidin levels, associated with their reduction during treatment, suggest that hepcidin regulation occurs independently from GDF-15 in thie type of anemia. Analysis of hepcidin/ferritin ratio proved to be more reliable to identify patients prone to increased iron absorption due to erythropoietic hyperactivity than hepcidin levels themselves and suggests that the chronic inflammatory state in sickle cell anemia may protect from iron overload by relatively increasing hepcidin levels in comparison to levels found in thalassemia intermedia. Moreover, we found a negative correlation between GDF-15 levels and HAMP monocytic expression, a regulatory mechanism similar to what has been observed in hepatic cell lines. In further analyses of the present study, no correlation between hepcidin expression and iron overload markers was observed in monocytes from patients with hemoglobinopathies, corroborating the hypothesis that the monocytic counterpart of hepcidin could have a different function, unrelated to iron regulation. Patients with sickle cell anemia under hydroxyurea treatment have been shown to present with higher levels of hepcidin expression in monocytes, and a cell culture model managed to demonstrate the upregulating effect of hydroxyurea in vitro, thus highlighting the possibility of exploring this drug in the future as a potential hepcidin agonist and, therefore, as a therapeutic intervention in diseases with impaired monocytic hepcidin production. This is the first study of molecules involved in iron metabolism regulation comparing hemoglobinopathies and other anemia types with and without ineffective erythropoiesis. Furthermore, this is the first characterization of extra-hepatic hepcidin expression in hemoglobin disorders / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

As síndromes talassêmicas (?- e ?-talassemia) são as desordens mais comuns e frequentes associadas com eritropoese ineficaz. O desbalanço na produção das cadeias ?- e ?-globinas resulta no comprometimento da produção de eritrócitos, em anemia e aumento de progenitores eritroides no sangue periférico. Enquanto os pacientes homozigóticos afetados por essas desordens demonstram alterações características dos parâmetros relacionados a eritropoese, a relação entre grau de anemia, eritropoese alterada e disfunção do metabolismo de ferro ainda não foram investigados nos indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica ou ?+-talassêmia. Duzentos e vinte seis indivíduos (75 do gênero feminino e 151 do gênero masculino) foram recrutados e divididos em 5 grupos: Controle (n=28), doadores de sangue regulares (DSR, n=23), ?+-talassemia heterozigótica (TAT, n=14), ?+-thalassemia (traço ?-talassêmico, TBT, n=20) e ?0-talassemia, (?-talassemia maior, BTM, n=27). As amostras foram analisadas para parâmetros hematológicos (Micros ABX 60); ferro sérico, capacidade total de ligação ao ferro e saturação de transferrina por método colorimétrico (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritina e proteína C-reativa ultra sensível por imunoensaio (Immulite 1000); receptor solúvel de transferrina, eritropoetina, fator de diferenciação do crescimento 15 (R&D Systems) e hepcidina (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) por ELISA. As razões sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR foram calculadas para avaliar o metabolismo do ferro. sTfR/log ferritina pode distinguir depleção dos estoques de ferro de eritropoese deficiente de ferro, enquanto (hepcidina/ferritina)/sTfR pode avaliar os estímulos contrários (disponibilidade de ferro e atividade eritropoética) que controlam a síntese de hepcidina e a absorção de ferro, na ausência de estímulos inflamatórios. Foi demonstrado que TAT teve significativa redução da hepcidina e aumento do receptor solúvel de transferrina, com parâmetros hematológicos relativamente normais. Em contraste, todos os parâmetros hematológicos de TBT foram significativamente diferentes do Controle, incluindo aumento dos níveis do receptor solúvel de transferrina, ferritina, eritropoetina e fator de diferenciação do crescimento 15. Essas alterações em ambos os grupos sugerem um balanço alterado entre eritropoese e metabolismo de ferro. Os índices sTfR/log ferritina e (hepcidina/ferritina)/sTfR estão, respectivamente, aumentado e reduzido comparados ao Controle, proporcional a severidade de cada grupo talassêmico. Em conclusão, destacamos que, pela primeira vez, foram descritas alterações no metabolismo de ferro em indivíduos com ?+-talassemia heterozigótica. Esses dados demonstram que, no contexto da saúde pública, são necessários identificação e acompanhamento dos portadores de ?+-talassemia. / The thalassemia syndromes (?- and ?-thalassemia) are the most common and frequent disorders associated with ineffective erythropoiesis. Imbalance of ?- or ?-globin chain production results in impaired red blood cell synthesis, anemia and more erythroid progenitors in the blood stream. While patients affected by these disorders show definitive altered parameters related to erythropoiesis, the relationship between the degree of anemia, altered erythropoiesis and dysfunctional iron metabolism have not been investigated in both carriers of ?-thalassemia and ?-thalassemia. 226 subjects (75 females and 151 males) were recruited to this study and divided in 5 groups: Control (n=28), repeat blood donors (DSR, n=23), ?+-thalassemia heterozygous carriers (TAT, n=14), ?+-thalassemia (?-thalassemia trait, TBT, n=20) and ?0-thalassemia, (?-thalassemia major, BTM, n=27). Samples were tested for hematological parameters (Micros ABX 60); serum iron, total iron binding capacity, and transferrin saturation by the colorimetric method (Pointe Scientific, Inc., Canton, MI, USA), ferritin and high sensitive C-reactive protein by immunoassay (Immulite 1000); soluble transferrin receptor, erythropoietin and growth differentiation factor 15 (R&D Systems) and hepcidin (Intrinsic LifeSciences, La Jolla, CA) by ELISA. Were calculated the ratios sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR to evaluate iron metabolism. sTfR/log ferritin can distinguish storage iron depletion from iron-deficient erythropoiesis, while (hepcidin/ferritin)/sTfR can be utilized to explore and quantify the opposing forces (i.e. iron availability and erythropoietic activity) regulating hepcidin synthesis and iron absorption in absence of inflammatory stimuli. We demonstrate that TAT have a significantly reduced hepcidin and increased soluble transferrin receptor levels but relatively normal hematological findings. In contrast, TBT have all hematological parameters significantly different from controls, including increased soluble transferrin receptor, ferritin, erythropoietin and growth differentiation factor 15 levels. These changings in both groups suggest an altered balance between erythropoiesis and iron metabolism. The indexes sTfR/log ferritin and (hepcidin/ferritin)/sTfR are respectively increased and reduced relative to controls, proportional to the severity of each thalassemia group. In conclusion, we emphasize that, for the first time in the literature, subjects with heterozygous ?+-thalassemia have altered iron metabolism. Our data demonstrate that within the context of public health, identification and monitoring of patients with ?+-thalassemia are needed.

Resumo: A beta talassemia é um dos mais freqüentes distúrbios genéticos no mundo. Estima-se que 1,5% a 3% da população mundial seja portadora do traço talassêmico. Esses portadores geralmente são oligo ou assintomáticos e têm uma expectativa de vida semelhante à dos não portadores. Entretanto, níveis elevados de ferritina sérica têm sido observados em alguns estudos comparativos entre beta talassemia heterozigota e não portadores e, alguns indivíduos, que nunca foram transfundidos, apresentam sinais clínicos e laboratoriais de sobrecarga de ferro. A fisiopatologia dessa complicação continua em discussão. Vários pesquisadores têm sugerido um efeito modulador da mutação do gene da beta globina e mutações em genes codificadores de proteínas relacionadas ao metabolismo do ferro. Mutações no gene HFE são as mais freqüentemente associadas à hemocromatose hereditária. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a freqüência das mutações C282Y e H63D no gene HFE em portadores de beta talassemia heterozigota e analisar sua influência no metabolismo do ferro. Foram estudados 162 portadores de beta talassemia heterozigota, residentes na cidade de São Carlos ou região, caucasóides e, acompanhados no serviço de Hematologia. O diagnóstico de traço talassêmico foi confirmado em todos por meio do eritrograma e da quantificação da Hb A2 e Hb fetal por HPLC. O metabolismo do ferro foi avaliado pelas dosagens de ferro sérico, capacidade total de ligação do ferro, ferritina e saturação da transferrina e, a análise molecular das mutações no gene HFE, pela técnica de PCR-RLFP. Foram realizadas análises de correlação linear de Pearson por idade e gênero entre hemoglobina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Beta thalassemia is one of the most frequent genetic disorder in the world. It is estimated that 1.5% to 3% of the world population is a thalassemia carrier. These individuals are generally slightly symptomatic or asymptomatic and they have a life expectancy similar to those who are non-carriers. However, high levels of serum ferritin have been observed in some comparative studies between heterozygous for beta thalassemia and non-carriers, and some individuals that were never transfused, present clinic and laboratories signs of iron overload. The physiopathology of this disease continues in discussion. Several researchers have suggested a modulator effect from the mutation of the beta globin gene and mutations in genes related with the iron metabolism. Mutations of the gene HFE are the most frequently associated to the hereditary hemochromatosis. The aim of this study was evaluate the frequency of C282Y and H63D mutations in the HFE gene in beta thalassemia carriers, and analyze its influence in the iron metabolism. 162 beta thalassemia carriers, Caucasoid, residing in the city of Sao Carlos or region and accompanied in the Hematology service were studied. The diagnostic of thalassemia trait was confirmed in every one through a complete erythrogram and quantification of Hb A2 and Hb fetal by HPLC. The iron metabolism was evaluated by serum iron, total iron-binding capacity, serum ferritin and percent saturation of transferring. The molecular analysis of the mutations in the HFE gene was made by PCR-RLFP. There were made analysis of linear Pearson' correlation, by age and gender, among hemoglobin, Hb A2, VCM and among reticulocytes count and the values of saturation of transferrin and serum ferritin. / Orientador: Claudia Regina Bonini Domingos / Coorientador: Antonio José Manzato / Banca: Celso Carlos de Campos Guerra / Banca: Paula Rahal Liberatore / Mestre

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-10T14:17:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wenning_MarciaReginadeSouzaCossa_D.pdf: 2460425 bytes, checksum: bd59f41846de3b0439b17450b12154a1 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A Doença da Hb H resulta da remoção ou inativação de três dos quatro genes da cadeia a da hemoglobina normalmente presentes no genoma diplóide e é caracterizada por anemia hemolítica crônica de intensidade moderada a grave. Os pacientes apresentam microcitose, hipocromia e poiquilocitose, com cerca de 25 a 30% de Hb Bart¿s (?4) ao nascimento e 5-30% de Hb H (ß4) na vida adulta. Embora a base molecular da doença tenha influência nos níveis de Hb H produzidos, uma heterogeneidade em relação a esse aspecto tem sido observada mesmo em pacientes com genótipos a idênticos, sugerindo que outros fatores contribuem para esta diversidade além dos determinantes talassêmicos. No presente trabalho, procuramos identificar transcritos diferencialmente expressos nos reticulócitos de dois pacientes com Doença da Hb H, irmãos, de origem étnica mista (chinesa e africana), um do sexo masculino, 21 anos de idade, com 18% de Hb H (MKS), e outro do sexo feminino, 19 anos, com 5% desta Hb (FKS), ambos com genótipo -a3.7/--SEA. O método envolveu a técnica de Differential Display Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) e a realização de Hibridização Subtrativa Supressiva (SSH). A validação dos achados foi feita pela Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR). Quatro perfis diferenciais de expressão foram selecionados, todos mais representados no paciente com maior nível de Hb H. Dois foram detectados por ambas as abordagens metodológicas: um transcrito altamente homólogo à parte do gene da PIP5KIIA (fosfatidilinositol 4-fosfato-5 quinase tipo II a) e outro ao gene da cadeia ß da hemoglobina humana. Os outros dois transcritos, selecionados apenas pela SSH, apresentararam similaridade ao gene FAM46C (Family with sequence similarity 46, member C), que corresponde a uma proteína hipotética de função indeterminada, e ao gene EIF4E-BP1 (eukariotic translation initiation factor 4E ¿ binding protein 1), que codifica uma proteína regulatória da tradução com capacidade de inibição do fator eIF4E (eukariotic translation initiation factor 4E). Na tentativa de identificar os mecanismos responsáveis pelo aumento dos transcritos da PIP5KIIA e da globina ß nos reticulócitos de MKSalguns outros genes, relacionados às vias de atuação ou ao processo de transcrição dos primeiros, tiveram sua expressão também avaliada pela qRT-PCR. Os resultados obtidos, embora não conclusivos, sugeriram que a diferença nos níveis de Hb H apresentada pelos pacientes aqui estudados está correlacionada com a taxa de síntese de cadeias ß, e que a enzima PIP5KIIA, provavelmente via sinalização celular pelo fosfatidilinositol, de alguma maneira participa de sua regulação. O significado destes achados e o papel dos transcritos dos genes FAM46C e EIF4E-BP1 devem ser futuramente investigados para uma melhor compreensão dos mecanismos de regulação da expressão dos genes da globina ß em pacientes com talassemia a / Abstract: Hb H disease results from the inactivation of three of the four a-globin genes normally present on diploid genome and it is characterized by a moderate to severe chronic hemolytic anemia. Patients usually present microcytosis, hypochromia and poikilocytosis, with 25 to 30% of Hb Bart¿s (?4) at birth and 5 to 30% of Hb H (ß4) in adult life. Although the molecular base of this disease influences the Hb H levels produced, some heterogeneity has been observed in relation to this aspect, even in patients with identical a genotypes, thus suggesting that other factors contribute to this diversity besides a-thalassemic determinants. The aim of the present study was to identify differentially expressed transcripts in the reticulocytes from two patients with Hb H disease, siblings, from Chinese and African origins, a 21-year- old male (MKS) with 18% of Hb H and a 19-year-old female (FKS) with 5% of Hb H, both with genotype -a3.7/--SEA. The methodology involved two techniques: the Differential Display Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (DDRT-PCR) and the Suppression Subtractive Hybridization (SSH). Quantitative real time PCR (qRT-PCR) experiments were used to confirm some results. Four differentially expressed profiles were obtained, all of them better represented in the subject with the highest Hb H level. Two transcripts were detected by both methodological approaches, one being highly similar to PIP5KIIA gene (Phosphatidylinositol ¿ 4 phosphate 5-kinase, type II a) and the other one similar to human ß-globin gene. Two others transcripts were selected only by SSH and they showed to be to FAM 46C (Family with sequence similarity 46, member C) and EIF4E-BP1 (eukariotic translation initiation factor 4E-binding protein 1) gene homologues. In order to identify the mechanisms that are responsible for the transcripts PIP5KIIA and ß- globin increase in the reticulocytes from MKS patient, some other genes related to the transcriptional process also had its expression evaluated by qRT-PCR. Although not conclusive, our results suggest that the difference between the Hb H levels, showed by the subjects here studied, is correlated with ß-globin synthesis rate and that PIP5KIIA may participate of its regulation, probably by cell signalizing through Phosphatidylinositol. Studies, particularly involving a higher number of patients, and experiments aimed at elucidating the PIP5KIIA function in erythroid cells, should help to understand this process. The initiation factor -4E binding protein (EIF4E-BP1) and its capacity to bind to eIF4E, acts as negative regulator of cell growth. Its overexpression was detected in the patient with the highest HbH level. The significance of these findings and the role of the FAM46C and EIF4E-BP1 gene transcripts should be further investigated so that the regulating of the ß-globin gene expression in a-thalassemic patients can be better understood / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia Medica

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese final Karlla.pdf: 1794329 bytes, checksum: 2a2d0436bd4d9a7eeebe61077580e8f9 (MD5) Previous issue date: 2009-03-27 / Alpha thalassemia is a syndrome resulting from disturbances in the synthesis of alpha globin chain that forms the tetramer of the hemoglobin molecule. Alpha thalassemia is classified into four types according to the number of alpha genes affected: silent carrier (-&#945;/&#945;&#945;), alpha thalassemia trait (--/&#945;&#945; or -&#945;/-&#945;) Hemoglobin H disease (-- /-&#945;), and fetalis hydrops (--/--). The decrease in synthesis of alpha globin causes inadequate production of hemoglobin resulting in hypochromic and microcytic anaemia. Also it causes accumulation of beta chains, inside the erythrocytes, resulting in formation of beta chain tetramer of hemoglobin called Hb H. Clinically the individual with thalassemia can be asymptomatic or present severe anemia. Asymptomatic forms of thalassemia, silent carrier and alpha thalassemia trait, are more difficult to diagnose because of the inclusions bodies of Hb H are not always present. In these situations it is necessary to research the molecular characterization of the genotype and confirming the presence of alpha thalassemia. This is mainly because the diagnosis by conventional methods, although important, is limited and imprecise. This study evaluated some of the traditional laboratory methods in the detection of alpha thalassemia and associated molecular characterization of the more prevalent deletion forms &#945;3,7 and &#945;4,2. For confirmation and characterization of alpha thalassemia, new oligonucleotides were designed. By conventional PCR technique, using 3.7F/KGB01 primers it was possible to detect the deletion &#945;3,7, differentiating the normal genotype (&#945;&#945;/&#945;&#945;), the heterozygote (-&#945;3,7/&#945;&#945;), and homozygous (-- &#945;3,7/- &#945;3,7). Although it was designed to detect the deletion &#945;3,7, this primers also identified the deletion &#945;4,2 when in homozigose (-&#945;4,2/- &#945;4,2). The primers KGB04/KGB05 detected the deletion &#945;4,2, but without differentiating between the heterozygous and homozygous genotype. The most prevalent deletion founded was the &#945;4,2 (20.0%) which represents 9.2% in the homozygous form (- &#945;4,2/-&#945;4,2). The deletion &#945;3,7 in the heterozygous form was detected in 12.3% of patients. The data demonstrate that the importance of molecular detection for alpha thalassemia is not limited only to the definition of the genotype, but also confirmation of the presence in patients with abnormal erythrogram values, with regular erythrogram values, with values closed to the boundary values and in neonates. / A talassemia alfa é uma síndrome resultante de distúrbios na síntese da cadeia da globina alfa que formam o tetrâmero da molécula da hemoglobina. A talassemia alfa é classificada em quatro tipos de acordo com o número de genes alfa afetado: portador silencioso (-&#945;/&#945;&#945;); traço alfa talassêmico (--/&#945;&#945; ou - &#945;/-&#945;); doença de hemoglobina H (--/-&#945;) e hidropsia fetal (--/--). A diminuição na síntese de globina alfa causa a produção inadequada de hemoglobina que resulta em anemia microcítica e hipocrômica. Causa também o acúmulo de cadeias do tipo beta, no interior do eritrócito, pela falta de balanceamento com a síntese da globina alfa afetada. O resultado deste desbalanceamento é a formação de tetrâmeros de cadeias beta denominados Hb H. Clinicamente o indivíduo portador de talassemia alfa pode ser assintomático ou apresentar anemia severa. As formas assintomáticas da talassemia alfa, o portador silencioso e o traço alfa talassêmico, são mais difíceis de diagnosticar, pois os corpúsculos de Hb H nem sempre estão presentes. Para estas situações faz-se necessária a investigação molecular visando a caracterização do genótipo e a confirmação da presença da talassemia alfa. Este fato se deve principalmente porque o diagnóstico através de métodos clássicos não moleculares, apesar de importantes, é limitado e impreciso. O presente trabalho avaliou alguns dos métodos laboratoriais clássicos na detecção de talassemia alfa e associou a caracterização molecular das formas delecionais mais prevalentes &#945;3,7 e &#945;4,2. Para a confirmação e caracterização da talassemia alfa, foram desenhados novos oligonucleotídeos. Através da técnica convencional da PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos 3.7F/KGB01 foi possível detectar a deleção &#945;3,7, diferenciando o genótipo normal (&#945;&#945;/&#945;&#945;), do heterozigoto ( &#945;3,7/&#945;&#945;) e do homozigoto ( &#945;3,7/ &#945;3,7). Apesar de ter sido desenhado para detectar a deleção &#945;3,7, este par também permitiu detectar a deleção &#945;4,2 quando em homozigose ( &#945;4,2/ &#945;4,2). Utilizando o par KGB04/KGB05 foi possível detectar a deleção &#945;4,2, porém sem diferenciar entre o genótipo heterozigoto e homozigoto. A deleção mais prevalente encontrada foi a &#945;4,2 (20,0%) sendo que destas podemos afirmar que 9,2% estão na forma homozigótica ( &#945;4,2/ &#945;4,2). A deleção do tipo &#945;3,7 na forma heterozigótica foi detectada em 12,3% dos pacientes. Os dados obtidos revelam que a importância da detecção molecular para talassemia alfa não se restringe apenas na definição do genótipo, mas também na detecção deste tipo de talassemia em pacientes que apresentam: quadros hematológicos alterados, quadros hematológicos normais, mas com valores próximos aos valores limítrofes e em neonatos.