Immunotherapy, especially the adoptive transfer of T cells and immune checkpoint blockade therapy, have revolutionized cancer therapy. In particular, utilizing antigen-specific T cells for adoptive cell therapy has enabled the development of specific and effective strategies. It has paved the way for developing more accurate and personalized cancer immunotherapies. Adoptive cell therapy (ACT) results depend on the characteristics of ex vivo expanded T cells, such as their differentiation and clonal diversity. However, ex vivo expanded specific T cells often express several inhibitory receptors involved in T-cell exhaustion and markers of terminal effector differentiation. Accordingly, we hypothesized that blocking one or several inhibitory receptors during the ex vivo expansion could improve the expansion and differentiation of antigen-specific T cells. Preconditioning the ACT products and combinatorial immunotherapy approaches are newly developed concepts in cancer therapy to optimize cancer immunotherapy for a larger group of patients. To study the development of antigen-specific T-cells in combination with checkpoint blockade, we have adopted a method that allows the expansion of rare antigen-specific T cell precursors from PBMCs via multiple stimulations, using antigen-pulsed dendritic cells. In the current study, we utilized our protocol to generate and expand antigen-specific CD8+ T cells targeting the oncogenic Epstein-Barr virus (EBV)-LMP2 and a tumor-associated antigen (TAA) from the Wilms Tumor 1 (WT1) protein. We employed two approaches to abolish the negative regulatory receptors, antibody-mediated blockade and deletion via CRISPR/Cas9. We evaluated the impact of checkpoint blockade on antigen-specific T cells development, proliferation, and function. Additionally, TCR clonality and transcriptomic changes were assessed by genomic studies, including single-cell RNA (scRNA) sequencing and T-cell receptor sequencing. Supporting our hypothesis, we observed that blocking both PD-L1 and TIM3 (not any of them alone) significantly enhanced LMP2 and WT1-specific T cell generation and expansion. Additionally, checkpoint blockade resulted in higher specific T cell function, including cytokine production and in vitro targeted cytotoxicity. Using scRNA-seq and TCR sequencing approaches, we first remarked that the specific T cells are highly oligoclonal and identified a few dominant shared clones between donors. Immune checkpoint blockade did not confer consistent transcriptional signatures but may have a clonotype and donor-specific impact on the expression of activation and exhaustion-related genes. Overall, immune checkpoint blockade did not markedly alter the clonal composition of the T-cell product. We also evaluated the impact of CD5 deletion in antigen-specific T cell priming and expansion as an inhibitory receptor and a part of the immune response synapse. However, in a human ACT setting, our data show that the CRISPR/Cas9 mediated CD5 deletion only has modest effects on antigen-specific T-cell generation. However, future combinations with the blockade of other immune checkpoint may be warranted. Conclusion We demonstrated that blocking PD-L1 and TIM3 during the ex vivo expansion improves antigen-specific T-cell yield. We show that blocking multiple checkpoints can synergistically optimize specific T-cell production without compromising the response's specificity. It is a rapidly implementable strategy to enhance the number and quality of ex vivo expanded antigen-specific T cells for immunotherapy. / Le transfert adoptif de cellules T et le traitement par le blocage des points de contrôle immunologiques ont révolutionné le traitement du cancer. En particulier, l'utilisation de cellules T antigène-spécifiques en thérapie cellulaire adoptive a facilité le développement d'immunothérapies anticancéreuses plus précises et personnalisées. Les résultats de la thérapie cellulaire adoptive (TCA) sont liés à la qualité des cellules T spécifiques expansées ex vivo, telles que leur état de différenciation et leur diversité clonale. Cependant, le pré-conditionnement des produits de thérapie cellulaire adoptive et les traitements d'immunothérapie combinatoire sont de nouveaux concepts en développement de la thérapie du cancer pour optimiser l'immunothérapie du cancer dans un plus grand groupe de patients. Nous avons formulé l’hypothèse que le blocage d'un ou plusieurs récepteurs inhibiteurs au cours de l'expansion ex vivo favorise une meilleure expansion et une meilleure fonction des cellules T destinées à la TCA. Pour étudier l’expansion et la différenciation de cellules T antigène-spécifiques lors d’un blocage des points de contrôle, nous avons adopté une méthode qui nous permet de stimuler et expanser de rares cellules T antigène-spécifiques à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) via de multiples stimulations utilisant des cellules dendritiques chargées avec l’antigène d’intérêt. Nous avons utilisé deux approches pour supprimer l’activité des récepteurs régulateurs négatifs, les anticorps bloquants des points de contrôle et la délétion génique via CRISPR/Cas9. Nous démontrons que le blocage combiné de PD-L1 et TIM3 améliore considérablement la l'expansion de cellules T CD8+ spécifiques à des antigènes viraux et tumoraux. De plus, le blocage des points de contrôle a entraîné la génération de cellules T spécifiques fonctionelles tel que démontré par la production de cytokines et la cytotoxicité in vitro. En utilisant de séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq) et de séquençage des récepteurs des lymphocytes T (TCP-seq), nous avons remarqué que les cellules T spécifiques sont très fortment oligoclonales. Nous avons également identifié quelques clones dominants partagés entre les donneurs. L’application de l’inhibition des points de controles ne confère pas de signatures transcriptionelles particulières mais pourrait affecter certains clones provenant de certains donneurs davantage que d’autres. De plus, le peu de changements dans la composition clonale des cellules expandues suggèrent que le blocage de ces points de contrôle immunologiques n’altère pas de façon significative le produit cellulaire obtenu. Des données récentes soutiennent également un rôle du CD5 dans la régulation de l'activation des cellules T naïves et leur état fonctionnel. Cependant, dans un contexte compatible avec la TCA, nos données montrent que la suppression de CD5 via CRISPR/Cas9 n'a que des effets modestes sur la génération de cellules T antigène-spécifiques. Par contre, la combinaison éventuelle avec l’inhibition de d’autres points de contrôle immunologiques pourrait être envisagée. En conclusion, nos travaux fournissent une nouvelle méthode pour générer des cellules T spécifiques pour la TCA et la caractérisation à plus haute résolution de cellules T spécifiques expansées ex vivo. Nous avons donc démontré que le blocage combiné de plusieurs points de contrôle peut optimiser de manière synergique la production de cellules T spécifiques sans compromettre la spécificité de la réponse. Il s'agit là d'une stratégie rapidement applicable pour améliorer le nombre et la qualité des cellules T antigène-spécifiques expansées ex vivo pour l'immunothérapie.

La transplantation demeure le traitement de choix de l’insuffisance cardiaque (IC) et ce malgré les récents progrès des techniques de support d’assistance mécanique. Une amélioration considérable de la prévention et du traitement du rejet aigu a été réalisée ces 20 dernières années. Cependant, le succès à long terme des transplantations d’organes a été peu modifié : il est toujours compromis par la survenue d'une dysfonction chronique du greffon. Ainsi, l'avenir des transplantés cardiaques demeure sombre et représente un fardeau médical avec un impact socioéconomique important. Toutefois, la recherche a récemment mis en avant l'énorme potentiel de régénération des cellules souches (CS) et représenterait une nouvelle avenue thérapeutique pour les patients souffrant d’IC. Une meilleure compréhension des processus biologiques des CS et de leur interaction avec le cœur transplanté, permettrait d’exploiter pleinement leur potentiel de réparation cardiaque. Le but de cette thèse est d’explorer les différents aspects du traitement de l’IC en 2020. Les hypothèses proposées dans cette thèse sont les suivantes : (1) les excellents résultats obtenus (>20 ans de survie) chez près d’1/3 des patients greffés lors de la 1ère décade de notre expérience à ICM serait difficile à obtenir de nos jours à la vue de l’évolution d’une population plus malade et plus âgée; (2) le cœur artificiel total (CAT) temporaire Syncardia permet d’amener des patients en insuffisance cardiaque terminale à la greffe de façon satisfaisante; (3) la thérapie cellulaire, plus spécifiquement les CS d’origine adipeuse (ASC) sous forme sphéroïdes, permet de diminuer l’impact de la vasculopathie du greffon cardiaque; et (4) l’effet paracrine des ASC permet une diminution de l’inflammation dans un modèle expérimental de péritonite chez le rat. / Transplantation remains the preferred treatment for heart failure (HF) despite recent advances in mechanical support devices. A considerable improvement in the prevention and treatment of acute rejection has been achieved over the past 20 years. However, the long-term survival of organ transplants has not been changed: it is still compromised by the occurrence of chronic graft dysfunction. Thus, the future of cardiac transplant patients remains bleak and represents a medical burden with a significant socio-economic impact. However, research has recently highlighted the potential for regeneration of stem cells (SC) and would represent a new therapeutic avenue for patients with HF. A better understanding of the biological processes of SC and their interaction with the transplanted heart would allow them to fully exploit their cardiac repair potential. The aim of this thesis is to explore the various aspects of the treatment of HF in 2020. The hypotheses proposed in this thesis are as follows: (1) the excellent results obtained (> 20 years of survival) in almost 1/3 of the patients transplanted during the 1st decade of our experience at ICM would be difficult to obtain from our days at the sight of the evolution of a sicker and older population; (2) the temporary Syncardia total artificial heart (CAT) allows patients with end-stage heart failure to be transplanted satisfactorily; (3) cell therapy, more specifically CS of adipose origin (ASC) cultured as spheroid, reduce the impact of cardiac allograft vasculopathy (CAV); and (4) the paracrine effect of ASCs reduces inflammation in a rat experimental model of peritonitis.

La leucémie aigüe myéloïde est un cancer hautement létal notamment parce que le taux de rechutes est élevé, ce qui traduit l’importance du développement de nouvelles thérapies. Ces dernières peuvent tirer avantage du fait que les cellules leucémiques peuvent exprimer des antigènes qui ne sont pas exprimés par les tissus sains, soit les antigènes spécifiques aux tumeurs (TSA). À cet effet, nos collaborateurs ont découvert une source importante « d'aberrantly expressed TSA » (aeTSA) dans les régions non codantes de l’ADN. Ces aeTSA sont présentés par les molécules de CMH I et plusieurs ont provoqué la réactivité des lymphocytes T (LTs) in vitro. En plus d'être spécifiques aux cellules cancéreuses, ces aeTSA sont partagés entre plusieurs patients ce qui fait d'eux des cibles intéressantes dans le cadre d’immunothérapies. Sachant que c’est le récepteur de cellules T (TCR) qui confère la spécificité aux LTs, le but est d'isoler et de caractériser des TCR anti-aeTSA en vue de leur utilisation comme outils thérapeutiques. Pour ce faire, l’expansion de LTs CD8+ naïfs provenant de donneurs sains a été réalisée grâce à une co-culture avec des cellules dendritiques autologues chargées avec l'aeTSA d’intérêt. Les LTs CD8+ spécifiques du aeTSA ont été triés à l’aide d'un marquage dextramères et l’ARN a été isolé afin de réaliser le séquençage du TCR. Ce dernier a révélé que le répertoire de TCR anti-aeTSA est nettement oligoclonal, facilitant l'identification des séquences des chaînes α et β des clonotypes les plus abondants. En revanche, les répertoires de TCR anti-LMP2 426-434 (antigène viral) et anti-WT1 37-45 (antigène associé aux tumeurs) étaient plus diversifiés. De plus, des tests d'avidité fonctionnelle réalisés à l'aide d'ELISpot en concentrations décroissantes de peptides ont révélé que l'avidité fonctionnelle des LTs qui reconnaissent les aeTSA est similaire à celle du peptide LMP2 426-434, ce qui suggère que les aeTSA stimulent des réponses T de hautes avidités. Ensuite, la délétion du TCR endogène a été réalisée à l'aide de la technique CRISPR-Cas9, montrant plus de 90% d'efficacité. À des fins d'optimisation de protocoles, le TCR 1G4 spécifique de NY-ESO-1 a été introduit dans le locus TRAC et, simultanément, le knock-out de la chaîne α du TCR endogène a été réalisé afin de limiter les mésappariements et la compétition entre ces deux TCR. Les prochaines étapes seront d’introduire le gène codant pour le TCR spécifique d'aeTSA dans des LTs et de vérifier que les cellules éditées sont réactives envers ces aeTSA. Finalement, ce projet pourrait ouvrir la voie au ciblage d'aeTSA à l’aide de l’ingénierie du TCR pour rediriger un grand nombre de LTs envers les cellules leucémiques. / Acute myeloid leukemia is a highly lethal cancer for which effective immunotherapies are actively sought. These immunotherapies can take advantage of the fact that leukemia cells can express antigens that are not expressed by healthy tissues, namely tumor-specific antigens (TSA). In this regard, our collaborator's team has discovered an important source of aberrantly expressed TSA (aeTSA) in the non-coding regions of DNA. These aeTSAs are presented by MHC 1 molecules and can elicit T cells reactivity in vitro. In addition to being specific to cancer cells, these aeTSAs are shared between several patients, which makes them interesting targets in the context of immunotherapies. Knowing that the T cell receptor (TCR) is responsible for T cells specificity, the goal is to isolate and characterize anti-aeTSA TCRs for their use as therapeutic tools. To this end, we expanded aeTSA-specific T cells from naive CD8+ T cells obtained from healthy donors through co-culture with autologous dendritic cells loaded with the relevant aeTSA. The aeTSA-specific CD8+ T cells identified by dextramer staining were sorted for RNA extraction TCR sequencing. Amplicon sequencing reveals that the expanded anti-aeTSA TCR repertoire is markedly oligoclonal, facilitating the identification of dominant TCR α and β chains. In contrast, the anti-LMP2 426-434 (viral antigen) and anti-WT1 37-45 (tumor-associated antigen) TCR repertoires were more diverse. In addition, functional avidity tests, performed using ELISpot in decreasing concentrations of peptides, revealed that the functional avidity of T cells recognizing aeTSA is similar to LMP2 426-434 peptide, suggesting that aeTSAs stimulate high-avidity responses. Then, endogenous TCR knock-out was performed using the CRISPR-Cas9 technique, showing more than 90% efficiency. For protocol optimization purposes, the 1G4 TCR specific for NY-ESO-1 was introduced into the TRAC locus and, simultaneously, the knock-out of the α chain of the endogenous TCR was achieved in order to limit mismatches and competition between these two TCRs. The next steps will be to introduce the gene coding for the aeTSA-specific TCR into T cells and to validate that the edited cells are reactive toward these aeTSAs. Ultimately, this project could pave the way for targeting aeTSAs using TCR engineering to redirect large numbers of T cells toward leukemic cells.

Les lymphocytes T (LT) CD8 sont un sous-type de cellules immunitaires qui participent à l’élimination des certains agents infectieux et de cellules tumorales. La capacité de réponse des LT CD8 est dépendante de leur état de différenciation. Lors d’une réponse immunitaire, les LT CD8 spécifiques à l’agent infectieux sont activés, se différencient et prolifèrent en LT effecteurs (LTE) qui participent à l’élimination de l’agent pathogène. Les LTE peuvent être distingués en effecteurs de courte durée de vie (SLEC), terminalement différenciés et éliminés par apoptose après l’infection, et en précurseurs des cellules mémoires (MPEC) qui survivent et génèrent les LT mémoires (LTM). Par contre, lors d’une infection chronique ou d’une réponse antitumorale, la persistance antigénique et inflammatoire induisent l’épuisement des LT CD8, soit un état de différenciation caractérisé par des fonctions effectrices et prolifératives diminuées ainsi qu’une forte expression de récepteurs inhibiteurs (RI). Afin d’améliorer les thérapies vaccinales, les traitements antitumoraux et les thérapies lors des infections chroniques, il est important de mieux comprendre la différenciation des LT CD8. Nous avons étudié le rôle de NR4A3 dans la différenciation des LT CD8 chez la souris. NR4A3 est un récepteur nucléaire et un facteur de transcription (FT) dont l’expression est rapidement induite par une stimulation antigénique, mais dont le rôle dans les LT CD8 n’a pas été encore déterminé. Nous avons émis l’hypothèse que l’expression de NR4A3 dans ces cellules suite à une stimulation antigénique contrôle leur différenciation. Premièrement nous avons étudié le rôle du NR4A3 dans la différenciation des LT CD8 lors d’une infection aiguë et avons déterminé que la délétion de NR4A3 dans les LT CD8 augmente la différenciation MPEC, la génération des LTM et la production de cytokines. La régulation de la différenciation des LT CD8 par NR4A3 est transcriptionnelle et, lors des premiers jours postinfection, sa délétion induit un programme transcriptionnel associé avec la différenciation des LTM. De plus, dès les premières heures postactivation, la délétion de NR4A3 favorise l’induction d’un état de chromatine plus ouvert avec une prédiction d’activité augmentée des FT bZIP. Deuxièmement, nous avons étudié le rôle de NR4A3 lors d’une réponse immunitaire antitumorale au cours d’une thérapie cellulaire adoptive (ACT) sous traitement d’anti-PD-L1 (ligand d’un RI) où la meilleure fonctionnalité et persistance des LT CD8 NR4A3 déficients ont été mises à l’épreuve. Ainsi, l’ACT avec des LT CD8 NR4A3 déficients augmente la survie de souris porteuses de tumeurs et les lymphocytes T infiltrants les tumeurs (TIL) NR4A3 déficients sont moins terminalement épuisés et présentent des plus fortes proportions et nombres cellulaires intra-tumoraux. Le profil transcriptomique au niveau de cellules uniques a révélé que les TIL NR4A3 déficients favorisent la génération de progéniteurs distincts et des populations fonctionnelles associées avec le traitement anti-PD-L1. En conclusion, NR4A3 est un régulateur de la fonction et la différenciation des LT CD8 dont l’activité pourrait être modulée afin d’améliorer les stratégies de vaccination ou les thérapies cellulaires. / CD8 T cells are an immune cell population involved in the clearance of different types of infections and the elimination of tumor cells. The response capacity of CD8 T cells depends on their differentiation state. During an immune response, antigen-specific CD8 T cells are activated, differentiate and proliferate into effectors that participate in elimination of the pathogen. Among the pool effectors, there are short-lived effector cells (SLEC) that are terminally differentiated and die by apoptosis after the infection clearance, and the memory precursors effector cells (MPEC) that survive to give rise to memory CD8 T cells. However, during chronic infection or an anti-tumor immune response, antigen persistence and inflammation induce CD8 T cell exhaustion, which is a differentiation state characterized by decreased effector functions and proliferative capacity and an increased expression of inhibitory receptors (IR). Thus, to be able to increase the efficiency of CD8 T cells following vaccination, in the context of antitumoral or during treatment against chronic viral infections, it is important to better understand CD8 T cell differentiation. We studied the role of NR4A3 in CD8 T cell differentiation in mice. NR4A3 in a nuclear receptor and transcription factor (TF), which expression is rapidly induced following antigenic stimulation, but the role of its induction in CD8 T cells was not yet identified. We propose that NR4A3 expression in CD8 T cells following antigenic stimulation controls their differentiation. First, we studied the role of NR4A3 in CD8 T cell differentiation during acute infection and determined that its deletion increases MPEC differentiation, memory generation, and cytokines production. NR4A3 regulates CD8 T cell differentiation at the transcriptional level, and its deletion induces a memory-related transcriptional program early during the immune response (day three post-infection). Moreover, a few hours following the CD8 T cell activation, NR4A3 deletion increased chromatin accessibility, particularly to bZIP TF. Secondly, we studied the role of NR4A3 during the antitumoral response in the context of adoptive cell therapy (ACT) and cotreatment with anti-PD-L1 (ligand of an IR), during which we tested the increased functionality and persistence of NR4A3 deficient cells. ACT with NR4A3-deficient cells increases the survival of tumor-bearing mice. In addition, NR4A3 deficiency increased the frequency of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and decreased T cell exhaustion. Single-cell transcriptional profile of TILs revealed that NR4A3 deficiency induces the generation of a transcriptionally distinct progenitor population and an increase in functional populations associated with the anti-PD-L1 treatment. To conclude, NR4A3 is a new regulator of CD8 T cell differentiation and function whose activity regulation could increase the efficiency of vaccinations and cell therapy treatments.

Les infections virales peuvent demeurer latentes pendant plusieurs décennies et se réactiver pendant des périodes d’immunosuppression. Les receveurs de greffes hématopoïétiques sont particulièrement susceptibles compte tenu de l’immunosuppression importante qui est nécessaire pour prévenir le rejet ou la maladie du greffon contre l’hôte, souvent pendant des périodes prolongées. La plupart de ces infections ne peuvent pas être traitées avec des médicaments antiviraux, et lorsque c’est possible, les traitements peuvent amener de la résistance. L’injection de cellules T spécifiques contre les virus provenant de donneurs sains est un traitement efficace pour traiter ces infections virales potentiellement mortelles ou les cancers qu’elles causent. Cependant, la persistance de ces cellules est limitée en partie par la stimulation antigénique chronique qui cause l’épuisement des cellules T. En éliminant les membres de la famille de récepteurs orphelins NR4A, qui favorisent l’épuisement et limitent la différenciation en cellules mémoires durables, notre but est de rendre ces cellules transférées plus persistantes et efficaces. Nos données à ce jour montrent que l’élimination du récepteur NR4A3 n’ altère pas la différenciation mémoire ni la production de cytokines effectrices. Cependant, l’absence de NR4A3tend à amener une diminution le l’expression du marqueur d’épuisement Tim-3, ce qui suggère que l’on peut prévenir l’épuisement et ainsi améliorer les thérapies cellulaires en ciblant les membres de la famille des récepteurs NR4A. / Viral infections can lay dormant for decades only to reactivate in periods of immune suppression. Transplant recipients are particularly susceptible to these infections as they require intensive immunosuppression to prevent rejection or graft-versus-host-disease, often for the rest of their life. Most of these infections cannot be treated with currently available antiviral medications and those that do can develop resistance. Virus-specific T cells (VSTs) are a treatment that uses expanded T cells to treat these infections by infusing donor cells into patients with life-threatening viral infections and cancers. However, these cells have a limited lifespan in part due to chronic antigen stimulation causing T cell exhaustion and lack of persistence. By knocking out members of the NR4A family of orphan receptors, which favour exhaustion and limit differentiation into long-lasting memory cells, we aim to make these transferred cells more persistent and effective. NR4A3 knockout did not alter memory differentiation or effector cytokine production but did result in a trend towards decreased expression of the exhaustion marker Tim-3, which indicates that targeting members of this family may improve clinically translatable cellular therapies.

L’immuno-isolation des îlots de Langerhans est proposée comme moyen d’effectuer des transplantations sans prise d’immunosuppresseurs par le patient. Cette immuno-isolation, par l’entremise d’une microcapsule composée d’alginate et de poly-L-lysine (microcapsule APA), protège le greffon d’une éventuelle attaque du système immunitaire du receveur grâce à sa membrane semi-perméable. Cette membrane empêche le système immunitaire du receveur de pénétrer la microcapsule tout en laissant diffuser librement les nutriments, le glucose et l’insuline. Avant l’application de cette technique chez l’humain, quelques défis doivent encore être relevés, dont la biocompatibilité de ce système. La biocompatibilité fait ici référence à la biocompatibilité du biomatériau utilisé pour la fabrication des microcapsules, l’alginate, mais aussi la biocompatibilité des microcapsules reliée à leur stabilité. En effet, il a été remarqué que, lors d’implantation in vivo de microcapsules fabriquées avec de l’alginate non purifiée, ceci induisait un phénomène nommé Réaction de l’Hôte contre la Microcapsule (RHM). De plus, il est connu que la stabilité des microcapsules APA peut influencer leur biocompatibilité puisqu’une microcapsule endommagée ou brisée pourrait laisser s’échapper les cellules du greffon chez le receveur. Nous croyons qu’une compréhension des processus d’initiation de la RHM en fonction de l’efficacité des procédés de purification d’alginate (et donc des quantités de contaminants présents dans l’alginate) ainsi que l’augmentation de la stabilité des microcapsules APA pourront améliorer la biocompatibilité de ce dispositif, ce que tente de démontrer les résultats présentés dans cette thèse. En effet, les résultats obtenus suggèrent que les protéines qui contaminent l’alginate jouent un rôle clé dans l’initiation de la RHM et qu’en diminuant ces quantités de protéines par l’amélioration des procédés de purification d’alginate, on améliore la biocompatibilité de l’alginate. Afin d’augmenter la stabilité des microcapsules APA, nous décrivons une nouvelle technique de fabrication des microcapsules qui implique la présence de liaisons covalentes. Ces nouvelles microcapsules APA réticulées sont très résistantes, n’affectent pas de façon négative la survie des cellules encapsulées et confinent les cellules du greffon à l’intérieur des microcapsules. Cette dernière caractéristique nous permet donc d’augmenter la biocompatibilité des microcapsules APA en protégeant le receveur contre les cellules du greffon. / Islet of Langerhans inmmunoisolation is proposed as a way to avoid the use of immunosuppressive drugs after transplantation. Microcapsules, the immuno-isolating device, are composed of alginate and poly-L-lysine and the protection of the graft is granted by a semi-permeable membrane. This membrane allows small molecules to freely diffuse within the microcapsule, such as nutrients, glucose and insulin while protecting the graft against the host immune system. Biocompatibility is one of the challenges that must be addressed before the successful clinical application of this device. Microcapsules biocompatibility is related, first, to the biocompatibility of alginate, the polymer used to made microcapsules and second, to the in vivo stability of these microcapsules. In facts, it is well know that the use of an unpurified alginate containing many foreign contaminants to make microcapsules induce the host reaction against microcapsule (HRM). Moreover, damaged or broken microcapsules can allow the dissemination of cells from the encapsulated graft, activating the host immune system. We believe that a better understanding of the initiation processes of the HRM in terms of alginate purification efficacy to remove contamination as well as an improve microcapsule stability will increase microcapsules biocompatibility. Results reported in this thesis suggest that foreign proteins found in alginate are playing a key role in the initiation of HRM and that the reduction of these foreign proteins, by the improvement of alginate purification processes, improves microcapsules biocompatibility. In order to increase microcapsules stability, we also described and characterized an innovative type of microcapsules which involve covalent bonds. These covalently cross-linked microcapsules were found to by highly resistant and stable. The novel fabrication process of these microcapsules was not harmful for the encapsulated cell survival and was also found to confine the graft inside the microcapsules. This characteristic enables us to increase microcapsules biocompatibility by the protection of the host from the encapsulated cells.

La cardiomyopathie ischémique et l’insuffisance cardiaque (IC) sont deux des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. L’IC représente la condition finale résultant de plusieurs pathologies affectant le myocarde. Au Canada, plus de 400 000 personnes souffrent d’IC. Malgré la grande variété de traitements disponibles pour prendre en charge ces patients à haut risque de mortalité, l’évolution et le pronostic clinique de cette population demeurent sombres. Les thérapies de régénération par transplantation cellulaire représentent de nouvelles approches pour traiter les patients souffrant d’IC. L’impact de cette approche cellulaire et les mécanismes qui sous-tendent l’application de ce nouveau mode de traitement demeurent obscurs. Les hypothèses proposées dans cette thèse sont les suivantes : 1) l’évolution à long terme des patients qui se présentent en IC grave est nettement défavorable malgré les techniques actuelles de revascularisation chirurgicale à cœur battant; 2) la thérapie cellulaire et, plus spécifiquement, l’injection intracoronaire précoce de milieu de culture cellulaire, permet d’améliorer la récupération fonctionnelle du ventricule gauche suite à un infarctus aigu du myocarde; et 3) la mobilisation de l’axe cœur-moelle osseuse constitue un mécanisme de réponse important lors de la survenue d’un événement ischémique chronique affectant le myocarde. / Congestive heart failure (CHF) remains a leading cause of mortality in the developed world. There are more than 400,000 diagnosed cases of this pathology in Canada. Despite the numerous treatment options available for patients presenting with left ventricular dysfunction, the evolution of this population is still dismal. Stem cell transplantation is a potential approach to repopulate the injured myocardium, to treat heart failure, and to restore cardiac function. However, the exact mechanisms underlying the beneficial effects of this approach remain to be elucidated. The hypotheses of this thesis are the following: 1) the long-term evolution of patients undergoing coronary artery bypass graft surgery is still poor, even when considering the use of new innovative surgical strategies such as off-pump coronary revascularization; 2) the intracoronary injection of concentrated biologically active factors secreted by stem cells can achieve early protection of the ischemic myocardium and preserve heart function; and 3) the bone marrow/heart interaction in a critical axis is involved in chronic myocardial repair following persistent ischemic injury.

La thérapie cellulaire consiste à utiliser des cellules comme médicament injectable dans le but de favoriser la réparation d'un tissu ou d'un organe. Certaines cellules possèdent la propriété de stimuler la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Elles présentent un intérêt pour le développement d'un traitement des ischémies des membres inférieurs ou du myocarde. Déterminer le devenir de ces cellules après injection in vivo est important pour comprendre les mécanismes responsables de l'efficacité d'un tel traitement. Cependant, il est difficile à observer et très peu décrit dans la littérature. Quelques exemples d'utilisation de nanotechnologies sont rapportés pour suivre des cellules in vitro. Mais des facteurs limitant tels qu'une complexité de mise en oeuvre de ces techniques ou leur trop faible sensibilité rend difficile leur utilisation in vivo. Ce travail de thèse propose de décrire le développement de nanoparticules originales associant les modalités d'imagerie optique et d'IRM afin de marquer simplement des cellules ayant un potentiel thérapeutique. Les protocoles développés ont permis de vectoriser et suivre en temps réel ces cellules après injection chez la souris. / Cell therapy aims to use cells as injectable medicines in order to enhance damaged organs or tissues repair. Some cells have the ability to promote new blood vessels growth. Therefore, they have an interest in revascularization of ischemic tissues and are potential candidates for cell therapy in peripheral ischemia or myocardial infarction. Being able to determine these cell's fates after in vivo injection is a major step to better understand the mechanisms of such treatments efficiency. However, following this phenomenon is challenging and rarely described in scientific litterature. Only some applications of nanotechnologies to follow labeled cells in vitro have been published. But limitations as implementation complexity or a low sensitivity prevent from using these techniques in vivo. This phD work describes the development of new hybrids nanoparticules associating optical and magnetic resonance imaging modalities in order to efficiently label cells that have a therapeutic potential. Developed protocols allowed us to follow magnetic cell vectorisation after injection in mice in real time.

La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d’organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d’hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d’envisager la transplantation d’hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L’hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l’origine d’un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l’enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l’hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l’ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSC. / Cell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient’s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC.

L’immuno-isolation des îlots de Langerhans est proposée comme moyen d’effectuer des transplantations sans prise d’immunosuppresseurs par le patient. Cette immuno-isolation, par l’entremise d’une microcapsule composée d’alginate et de poly-L-lysine (microcapsule APA), protège le greffon d’une éventuelle attaque du système immunitaire du receveur grâce à sa membrane semi-perméable. Cette membrane empêche le système immunitaire du receveur de pénétrer la microcapsule tout en laissant diffuser librement les nutriments, le glucose et l’insuline. Avant l’application de cette technique chez l’humain, quelques défis doivent encore être relevés, dont la biocompatibilité de ce système. La biocompatibilité fait ici référence à la biocompatibilité du biomatériau utilisé pour la fabrication des microcapsules, l’alginate, mais aussi la biocompatibilité des microcapsules reliée à leur stabilité. En effet, il a été remarqué que, lors d’implantation in vivo de microcapsules fabriquées avec de l’alginate non purifiée, ceci induisait un phénomène nommé Réaction de l’Hôte contre la Microcapsule (RHM). De plus, il est connu que la stabilité des microcapsules APA peut influencer leur biocompatibilité puisqu’une microcapsule endommagée ou brisée pourrait laisser s’échapper les cellules du greffon chez le receveur. Nous croyons qu’une compréhension des processus d’initiation de la RHM en fonction de l’efficacité des procédés de purification d’alginate (et donc des quantités de contaminants présents dans l’alginate) ainsi que l’augmentation de la stabilité des microcapsules APA pourront améliorer la biocompatibilité de ce dispositif, ce que tente de démontrer les résultats présentés dans cette thèse. En effet, les résultats obtenus suggèrent que les protéines qui contaminent l’alginate jouent un rôle clé dans l’initiation de la RHM et qu’en diminuant ces quantités de protéines par l’amélioration des procédés de purification d’alginate, on améliore la biocompatibilité de l’alginate. Afin d’augmenter la stabilité des microcapsules APA, nous décrivons une nouvelle technique de fabrication des microcapsules qui implique la présence de liaisons covalentes. Ces nouvelles microcapsules APA réticulées sont très résistantes, n’affectent pas de façon négative la survie des cellules encapsulées et confinent les cellules du greffon à l’intérieur des microcapsules. Cette dernière caractéristique nous permet donc d’augmenter la biocompatibilité des microcapsules APA en protégeant le receveur contre les cellules du greffon. / Islet of Langerhans inmmunoisolation is proposed as a way to avoid the use of immunosuppressive drugs after transplantation. Microcapsules, the immuno-isolating device, are composed of alginate and poly-L-lysine and the protection of the graft is granted by a semi-permeable membrane. This membrane allows small molecules to freely diffuse within the microcapsule, such as nutrients, glucose and insulin while protecting the graft against the host immune system. Biocompatibility is one of the challenges that must be addressed before the successful clinical application of this device. Microcapsules biocompatibility is related, first, to the biocompatibility of alginate, the polymer used to made microcapsules and second, to the in vivo stability of these microcapsules. In facts, it is well know that the use of an unpurified alginate containing many foreign contaminants to make microcapsules induce the host reaction against microcapsule (HRM). Moreover, damaged or broken microcapsules can allow the dissemination of cells from the encapsulated graft, activating the host immune system. We believe that a better understanding of the initiation processes of the HRM in terms of alginate purification efficacy to remove contamination as well as an improve microcapsule stability will increase microcapsules biocompatibility. Results reported in this thesis suggest that foreign proteins found in alginate are playing a key role in the initiation of HRM and that the reduction of these foreign proteins, by the improvement of alginate purification processes, improves microcapsules biocompatibility. In order to increase microcapsules stability, we also described and characterized an innovative type of microcapsules which involve covalent bonds. These covalently cross-linked microcapsules were found to by highly resistant and stable. The novel fabrication process of these microcapsules was not harmful for the encapsulated cell survival and was also found to confine the graft inside the microcapsules. This characteristic enables us to increase microcapsules biocompatibility by the protection of the host from the encapsulated cells.