A doença decorrente da infecção por Salmonella é um dos maiores problemas de saúde no mundo em termos de morbidade e mortalidade. Entre as sorovariedades de Salmonella, a sorovariedade Enteritidis é a de maior ocorrência mundial e compreende linhagens que tem seu nicho biológico relacionado a frangos e ovos. Várias metodologias de tipagem fenotípicas e genotípicas foram desenvolvidas a fim de se delinear a epidemiologia das infecções por S. Enteritidis. Entretanto a tipagem fenotípica usualmente falha em discriminar linhagens relacionadas das nãorelacionadas epidemiologicamente e apresenta problemas de reprodutibilidade que foram minimizados com a utilização de métodos genotípicos. No Brasil, poucos estudos que utilizaram técnicas moleculares na tipagem de linhagens dessa sorovariedade foram realizados. Os objetivos desse estudo foram investigar o potencial patogênico, a resistência a antimicrobianos e realizar a tipagem molecular de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, de alimentos e de frangos no Brasil. Para isso foram estudadas 188 linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de surtos e de casos esporádicos, de humanos (67) de alimentos (61) e de frangos (60), durante o período de 1986 a 2010, de vários locais do Brasil. A susceptibilidade frente a 14 antimicrobianos foi analisada através da técnica de disco difusão e a presença de 13 genes de virulência das ilhas de patogenicidade de Salmonella I e II e do plasmídio pSEV foram pesquisados por PCR. Os mecanismos de resistência a quinolonas foram verificados através da pesquisa de genes de resistência plasmidiais e cromossomais e também através da verificação de mutações no gene gyrA por High resolution melting analysis (HRMA) seguida de sequenciamento de algumas linhagens. As linhagens também foram tipadas molecularmente pelas metodologias Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) com a enzima XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) e por Multilocus sequence typing (MLST). Das 188 linhagens estudadas, 42,5% foi resistente ao ácido nalidíxico e somente 0,5% foi resistente a sulfametoxazol-trimetoprima e estreptomicina. A resistência a quinolonas foi relacionada principalmente a mutações no gene gyrA. A maioria das linhagens estudadas (98,4%) apresentou todos os genes de virulência pesquisados, sendo uma linhagem negativa para o gene sipA e duas linhagens negativas para o gene prot6E. ERIC-PCR dividiu as 128 linhagens isoladas de humanos e alimentos em 55 perfis diferentes com similaridade >79,7%. PFGE dividiu essas mesmas linhagens em 68 perfis diferentes com uma similaridade >73,1%. Para as linhagens isoladas de frango, o dendrograma concatenado de ERIC-PCR e PFGE dividiu as 60 linhagens em dois grandes grupos com 73,3% de similaridade. O grupo A consistiu de linhagens isoladas tanto de material clínico de frangos (23) quanto do ambiente da granja (5) com 81,2% de similaridade. O grupo B também consistiu de linhagens isoladas tanto de casos clínicos de frangos (21) quanto do ambiente da granja (11) com 81,1% de similaridade. MLVA dividiu as 188 linhagens isoladas no Brasil e outras 100 linhagens isoladas na América do Norte em dois grandes grupos. O grupo MLVA-A apresentou 71 linhagens isoladas na América do Norte e somente três linhagens isoladas no Brasil. Essas linhagens do ii Brasil incluíram as isoladas antes do início da pandemia de S. Enteritidis se iniciar no país. Em contraste, o grupo MLVA-B agrupou 185 linhagens isoladas no Brasil e 29 linhagens isoladas na América do Norte. As linhagens presentes no grupo A, foram divididas em 34 tipos genéticos diferentes com similaridade maior do que 46%, enquanto no grupo B as linhagens se diferenciaram em 15 tipos genéticos diferentes com mais de 66% de similaridade. MLST caracterizou 44 das 46 linhagens estudadas como pertencentes ao ST 11. As outras duas linhagens apresentaram alelos que não existiam no banco de dados e caracterizaram dois novos STs, o 1632 e o 1633. Os resultados de tipagem molecular obtidos por ERICPCR, PFGE e MLVA no presente estudo, demonstraram uma alta similaridade genotípica entre linhagens de S. Enteritidis isoladas no Brasil, o que sugere que as linhagens estudadas descendem de um precursor comum que pouco se diferenciou genotipicamente ao longo de 24 anos no país. Ademais, os resultados de MLVA sugerem que um novo e prevalente subtipo foi introduzido no Brasil após 1993 e tem contaminado alimentos e infectado humanos e animais. O grande número de genes de virulência encontrados reforça o potencial das mesmas causarem doenças em humanos e animais, bem como, os riscos de sua presença em alimentos. Ademais, a grande porcentagem de linhagens resistentes ao ácido nalidíxico observadas a partir de 1996 sugere o uso de quinolonas no tratamento de infecções em animais causadas por S. Enteritidis no Brasil. / The disease caused of the infection by Salmonella is one of the major health problem worldwide in terms of morbid and mortality. Among the Salmonella serovars, the Enteritidis is the most frequent isolated one and comprises strains that have their biological niche related to chickens and eggs. Several phenotypic and genotypic methodologies were developed to trace epidemiologically the infections by S. Enteritidis. However, the phenotypic typing usually fail to discriminate related from unrelated epidemiologicaly strains and presents problems of reproducibility that were minimized with the introduction of genotypic methods. In Brazil, few studies that used molecular typing techniques to type strains of this serovar were conducted. The aims of this study were to investigate the pathogenic potential, the antimicrobial resistance and to molecularly type of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil. For this, it was studied 188 strains of Salmonella Enteritidis isolated from outbreaks and sporadic cases, from humans (67), food (61) and chickens (60), during the period of 1986 to 2010, from various places of Brazil. The susceptibility to 14 antimicrobials were analyzed by the disc diffusion technique and the presence of 13 virulence genes of the Salmonella pathogenicity islands I and II and from the pSEV plasmid were searched by PCR. The mechanisms of resistance to quinolones were verified by the search of plasmidial and cromossomal resistance genes and also by the verification of mutations in the gyrA gene by High resolution melting analysis (HRMA) followed by sequencing of some strains. The strains were also molecularly typed by the methodologies Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the enzyme XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and by Multilocus sequence typing (MLST). From the 188 strains studied, 42.5% were resistant to nalidixic acid and only 0.5% were resistant to sulfamethoxazoletrimethoprim and streptomycin. Resistance to quinolones was related mainly to mutations in the gyrA gene. The majority of the strains studied (98.4%) harbored all the virulence genes searched, being only one strain negative for the sipA gene and two strains negative for the prot6E gene. ERIC-PCR divided the 128 strains isolated from humans and food in 55 different profiles with >79.7% of similarity. PFGE divided the same strains in 68 different profiles with a similarity of >73.1%. Regarding the strains isolated from chickens, the concatenated dendrogram of ERIC-PCR and PFGE divided the 60 strains in two major groups with a similarity of 73.3%. Group A consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (23) or from the farm environment (5) with a similarity of 81.2%. Group B also consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (21) or from the environment (11) with a similarity of 81.1%. MLVA divided the 188 strains isolated in Brazil and other 100 strains isolated from North America in two major groups. MLVA-A group consisted of 71 strains isolated in North America and only three strains isolated in Brazil. These strains from Brazil included the ones isolated before the beginning of the pandemic of S. Enteritidis in this country. In contrast, MLVA-B group clustered 185 strains isolated in Brazil and 29 strains isolated in North America. The strains in the MLVA-A group were divided in 34 different genotypic types with a similarity of 46%, while strains in iv the group B were divided in 15 different genotypic types with a similarity of 66%. MLST characterized 44 of the 46 strains studied as belonging to ST 11. The other two strains presented new alleles that characterized two new STs, the 1632 and the 1633. The results of molecular typing obtained by ERIC-PCR, PFGE and MLVA in this study showed a high genotypic similarity among S. Enteritidis strains isolated in Brazil, which suggests that the strains studied descend from a common ancestor that differed little genotypically during 24 years in the country. Moreover, the results of MLVA suggest that a new and prevalent subtype was introduced in Brazil after 1993 and has been contaminating food and infecting humans and animals. The high prevalence of virulence genes found in the strains studied reinforce their potential to cause disease in humans and animals, as well as the risks of their presence in food. Moreover, the high percentage of strains resistant to nalidixic acid observed after 1996 suggests the use of quinolones in the treatment of animal infections by S. Enteritidis in Brazil.

Listeria monocytogenes é um importante patógeno de origem alimentar que causa listeriose, infecção severa que acomete, principalmente, gestantes, idosos, crianças e imunocomprometidos, e que apresenta elevada taxa de mortalidade. A bactéria está amplamente distribuída no ambiente e é comumente encontrada em produtos cárneos. O presente estudo teve como objetivos caracterizar 439 isolados de L. monocytogenes obtidos de salsicha bovina e produtos cárneos crus (carne moída, linguiça suína e coxa de frango) refrigerados, adquiridos no comércio do município de São Paulo, e previamente submetidos à sorotipagem molecular. Os isolados foram caracterizados quanto ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana; presença dos genes de virulência actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB e mpl; perfil genético por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e sequenciamento parcial dos genes actA e lmo0737. Baixa frequência de resistência antimicrobiana (0,5%) foi observada entre os 416 isolados avaliados. Um isolado pertencente ao sorogrupo 1 apresentou resistência à penicilina e à clindamicina e outro identificado como 4a ou 4c apresentou resistência à tetraciclina. Todos os isolados foram positivos para os genes de virulência testados. O sequenciamento parcial do gene actA mostrou a ocorrência de 14 sequências de nucleotídeos distintas nos 97 isolados avaliados. Além disso, verificou-se a ocorrência de uma deleção de 35 aminoácidos no gene actA em 36 isolados, além de substituições de nucleotídeos que resultaram em mutações nas sequências de aminoácidos da grande maioria dos isolados. A análise filogenética do gene actA possibilitou o agrupamento dos isolados em duas linhagens distintas (I e II). Os resultados do PFGE indicaram grande variabilidade nos perfis genéticos dos isolados analisados, principalmente naqueles pertencentes aos grupos 2 (1/2c e 3c), 3 (1/2b e 3b) e 4 (4b, 4d e 4e). Os resultados deste estudo mostram que os isolados de L. monocytogenes provenientes de salsicha bovina e produtos cárneos crus comercializados no município de São Paulo, apresentam grande diversidade genética, importante potencial de virulência e baixa frequência de resistência antimicrobiana. A diversidade observada deve-se, provavelmente, à característica ubíqua deste micro-organismo, tornando-o mais susceptível a grande pressão seletiva do ambiente. / Listeria monocytogenes is an important foodborne pathogen that causes listeriosis, a severe infection that affects primarily pregnant women, elderly, children and imunocompromised individuals, and has a high mortality rate. The bacteria is widely distributed in the environment and commonly found in meat products. The present study aimed to characterize 439 isolates of L. monocytogenes obtained from pork sausage and raw chilled meat products (ground beef, beef sausage, and chicken thigh) purchased in supermarkets in the city of São Paulo, and previously submitted to molecular serotyping. The isolates were characterized for antimicrobial susceptibility profile; presence of virulence genes actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB and mpl; genetic profile by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and partial sequencing of genes actA and lmo0737. A low frequency of antimicrobial resistance (0.5%) was observed among the 416 evaluated isolates. One isolate belonging to serogroup 1 presented resistance to clindamycin and penicillin and another one identified as 4a or 4c was resistant to tetracycline. All isolates were positive for the tested virulence genes. The partial sequencing of the gene actA indicated the occurrence of 14 distinct nucleotide sequences in the 97 isolates tested. Furthermore, a deletion of 35 amino acids in the actA gene was detected in 36 isolates, and nucleotide substitutions that resulted in amino acid changes in the sequences of most isolates. Phylogenetic analysis of the actA gene clustered the isolates in two distinct lineages (I and II). Results of PFGE indicated a great genetic variability among isolates, especially among those belonging to groups 2 (1/2c and 3c), 3 (1/2b and 3b) and 4 (4b, 4d and 4e). The results of this study show that isolates of L. monocytogenes from pork sausage and raw meat products marketed in the city of São Paulo present a great genetic diversity, significant virulence potential and low frequency of antimicrobial resistance. The detected diversity is probably due the ubiquitous nature of these microorganisms, making them more susceptible to selective pressure of the environment.

Submitted by Leticia Schettini (leticia@ufrrj.br) on 2017-03-16T14:03:46Z No. of bitstreams: 1 2008 - Telma de Figueiredo do Nascimento.pdf: 875301 bytes, checksum: 0d53eac4a000372a6c136ed189b7dd48 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-16T14:03:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008 - Telma de Figueiredo do Nascimento.pdf: 875301 bytes, checksum: 0d53eac4a000372a6c136ed189b7dd48 (MD5) Previous issue date: 2008-11-19 / In Brazil it is believed that bovine tuberculosis is present in all states, as is in all continents. The official indices are 1.3% of the national herd infected, which represent a large number in the order of 2.5 million animals. Mycobacterium bovis stands out as zoonotic disease of major importance. Increasing are the economic losses, caused by tuberculosis in cattle, such as low productivity of the herd, condemnation of carcasses at slaughterhouses, reduction in the production of milk and meat, commitment marketing of animals and their products domestically and externally. It is estimated that about 5,0 % of human tuberculosis is caused by Mycobacterium bovis. The success of a program to control a disease is closely linked to various factors including the knowledge of the history of the causative agent and its spatial and temporal distribution. Molecular methods are used as auxiliary tools in combating the disease by providing information in order to achieve these goals. In the last decade, methods for molecular typing of M. tuberculosis were developed and implemented on a large scale. Although the genomes of the two parasites are very similar, the discriminatory power of the methods is smaller in Mycobacterium bovis. In this study were analyzed samples from cattle slaughtered in refrigerators under Federal Inspection in the state of Minas Gerais. A total of 215 cultures sent to the Laboratory of Applied Molecular biology to Micobacterioses, and only 159 confirmed a profile of Mycobacterium bovis through molecular techniques applied. The south and state has the highest prevalence of the disease in the samples studied. The method of Spoligotyping applied to the samples showed the presence of 32 different profiles, obtaining a HGDI of 0.86 and a departure from the MIRU-VNTR presented 40 different profiles with a HGDI of 0.87. In this study was to evaluate that when using these techniques together we get a greater discriminatory power between these strains. / No Brasil acredita-se que a tuberculose bovina est? presente em todos os Estados, assim como est? em todos os continentes. Os ?ndices oficiais est?o em 1,3% do rebanho nacional infectado, que representaria um n?mero elevado, na ordem de 2,5 milh?es de animais. Mycobacterium bovis destaca-se como zoonose de reconhecida import?ncia. Crescentes s?o as perdas econ?micas, causada pela tuberculose em bovinos, como a baixa na produtividade do rebanho, condena??o de carca?as em matadouros, redu??o na produ??o de leite e carne, comprometimento da comercializa??o de animais e seus produtos no mercado interno e externo. Estima-se que em torno de 5,0% da tuberculose humana ? causada por M. bovis. O sucesso de um programa de controle de uma doen?a est? estreitamente ligado a diferentes fatores entre os quais o conhecimento da hist?ria do agente etiol?gico e sua distribui??o espacial e temporal. Os m?todos moleculares s?o utilizados como ferramentas auxiliares no combate ? doen?a fornecendo informa??es com a finalidade de alcan?ar estes objetivos. Na ?ltima d?cada, m?todos para tipagem molecular de Mycobacterium tuberculosis foram desenvolvidos e aplicados em larga escala. Embora o genoma dos dois parasitos seja muito parecido, o poder discriminat?rio dos m?todos decresce para Mycobacterium bovis. Neste trabalho foram analisadas amostras de bovinos abatidos em Frigor?ficos sob Inspe??o Federal no estado de Minas Gerais. Um total de 215 culturas foram enviadas ao Laborat?rio de Biologia Molecular Aplicada ? Micobacterioses, e apenas 159 confirmaram um perfil de Mycobacterium bovis atrav?s das t?cnicas moleculares de Spoligotyping e 159 a t?cnica do MIRU-VNTR. A mesorregi?o Sul e Sudoeste mostraram a maior preval?ncia da doen?a nas amostras estudadas. O m?todo de Spoligotyping aplicados ?s amostras mostrou a presen?a de 32 perfis diferentes, obtendo um HGDI de 0,86 e em contra partida o MIRU-VNTR apresentou 40 perfis diferentes com um HGDI de 0,87. Neste estudo foi poss?vel avaliar que quando utilizamos estas t?cnicas em conjunto obtemos um maior poder discriminat?rio entre essas cepas.

A doença decorrente da infecção por Salmonella é um dos maiores problemas de saúde no mundo em termos de morbidade e mortalidade. Entre as sorovariedades de Salmonella, a sorovariedade Enteritidis é a de maior ocorrência mundial e compreende linhagens que tem seu nicho biológico relacionado a frangos e ovos. Várias metodologias de tipagem fenotípicas e genotípicas foram desenvolvidas a fim de se delinear a epidemiologia das infecções por S. Enteritidis. Entretanto a tipagem fenotípica usualmente falha em discriminar linhagens relacionadas das nãorelacionadas epidemiologicamente e apresenta problemas de reprodutibilidade que foram minimizados com a utilização de métodos genotípicos. No Brasil, poucos estudos que utilizaram técnicas moleculares na tipagem de linhagens dessa sorovariedade foram realizados. Os objetivos desse estudo foram investigar o potencial patogênico, a resistência a antimicrobianos e realizar a tipagem molecular de linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de humanos, de alimentos e de frangos no Brasil. Para isso foram estudadas 188 linhagens de Salmonella Enteritidis isoladas de surtos e de casos esporádicos, de humanos (67) de alimentos (61) e de frangos (60), durante o período de 1986 a 2010, de vários locais do Brasil. A susceptibilidade frente a 14 antimicrobianos foi analisada através da técnica de disco difusão e a presença de 13 genes de virulência das ilhas de patogenicidade de Salmonella I e II e do plasmídio pSEV foram pesquisados por PCR. Os mecanismos de resistência a quinolonas foram verificados através da pesquisa de genes de resistência plasmidiais e cromossomais e também através da verificação de mutações no gene gyrA por High resolution melting analysis (HRMA) seguida de sequenciamento de algumas linhagens. As linhagens também foram tipadas molecularmente pelas metodologias Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) com a enzima XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) e por Multilocus sequence typing (MLST). Das 188 linhagens estudadas, 42,5% foi resistente ao ácido nalidíxico e somente 0,5% foi resistente a sulfametoxazol-trimetoprima e estreptomicina. A resistência a quinolonas foi relacionada principalmente a mutações no gene gyrA. A maioria das linhagens estudadas (98,4%) apresentou todos os genes de virulência pesquisados, sendo uma linhagem negativa para o gene sipA e duas linhagens negativas para o gene prot6E. ERIC-PCR dividiu as 128 linhagens isoladas de humanos e alimentos em 55 perfis diferentes com similaridade >79,7%. PFGE dividiu essas mesmas linhagens em 68 perfis diferentes com uma similaridade >73,1%. Para as linhagens isoladas de frango, o dendrograma concatenado de ERIC-PCR e PFGE dividiu as 60 linhagens em dois grandes grupos com 73,3% de similaridade. O grupo A consistiu de linhagens isoladas tanto de material clínico de frangos (23) quanto do ambiente da granja (5) com 81,2% de similaridade. O grupo B também consistiu de linhagens isoladas tanto de casos clínicos de frangos (21) quanto do ambiente da granja (11) com 81,1% de similaridade. MLVA dividiu as 188 linhagens isoladas no Brasil e outras 100 linhagens isoladas na América do Norte em dois grandes grupos. O grupo MLVA-A apresentou 71 linhagens isoladas na América do Norte e somente três linhagens isoladas no Brasil. Essas linhagens do ii Brasil incluíram as isoladas antes do início da pandemia de S. Enteritidis se iniciar no país. Em contraste, o grupo MLVA-B agrupou 185 linhagens isoladas no Brasil e 29 linhagens isoladas na América do Norte. As linhagens presentes no grupo A, foram divididas em 34 tipos genéticos diferentes com similaridade maior do que 46%, enquanto no grupo B as linhagens se diferenciaram em 15 tipos genéticos diferentes com mais de 66% de similaridade. MLST caracterizou 44 das 46 linhagens estudadas como pertencentes ao ST 11. As outras duas linhagens apresentaram alelos que não existiam no banco de dados e caracterizaram dois novos STs, o 1632 e o 1633. Os resultados de tipagem molecular obtidos por ERICPCR, PFGE e MLVA no presente estudo, demonstraram uma alta similaridade genotípica entre linhagens de S. Enteritidis isoladas no Brasil, o que sugere que as linhagens estudadas descendem de um precursor comum que pouco se diferenciou genotipicamente ao longo de 24 anos no país. Ademais, os resultados de MLVA sugerem que um novo e prevalente subtipo foi introduzido no Brasil após 1993 e tem contaminado alimentos e infectado humanos e animais. O grande número de genes de virulência encontrados reforça o potencial das mesmas causarem doenças em humanos e animais, bem como, os riscos de sua presença em alimentos. Ademais, a grande porcentagem de linhagens resistentes ao ácido nalidíxico observadas a partir de 1996 sugere o uso de quinolonas no tratamento de infecções em animais causadas por S. Enteritidis no Brasil. / The disease caused of the infection by Salmonella is one of the major health problem worldwide in terms of morbid and mortality. Among the Salmonella serovars, the Enteritidis is the most frequent isolated one and comprises strains that have their biological niche related to chickens and eggs. Several phenotypic and genotypic methodologies were developed to trace epidemiologically the infections by S. Enteritidis. However, the phenotypic typing usually fail to discriminate related from unrelated epidemiologicaly strains and presents problems of reproducibility that were minimized with the introduction of genotypic methods. In Brazil, few studies that used molecular typing techniques to type strains of this serovar were conducted. The aims of this study were to investigate the pathogenic potential, the antimicrobial resistance and to molecularly type of Salmonella Enteritidis strains isolated from humans, food and chickens in Brazil. For this, it was studied 188 strains of Salmonella Enteritidis isolated from outbreaks and sporadic cases, from humans (67), food (61) and chickens (60), during the period of 1986 to 2010, from various places of Brazil. The susceptibility to 14 antimicrobials were analyzed by the disc diffusion technique and the presence of 13 virulence genes of the Salmonella pathogenicity islands I and II and from the pSEV plasmid were searched by PCR. The mechanisms of resistance to quinolones were verified by the search of plasmidial and cromossomal resistance genes and also by the verification of mutations in the gyrA gene by High resolution melting analysis (HRMA) followed by sequencing of some strains. The strains were also molecularly typed by the methodologies Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR), Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the enzyme XbaI, Multilocus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) and by Multilocus sequence typing (MLST). From the 188 strains studied, 42.5% were resistant to nalidixic acid and only 0.5% were resistant to sulfamethoxazoletrimethoprim and streptomycin. Resistance to quinolones was related mainly to mutations in the gyrA gene. The majority of the strains studied (98.4%) harbored all the virulence genes searched, being only one strain negative for the sipA gene and two strains negative for the prot6E gene. ERIC-PCR divided the 128 strains isolated from humans and food in 55 different profiles with >79.7% of similarity. PFGE divided the same strains in 68 different profiles with a similarity of >73.1%. Regarding the strains isolated from chickens, the concatenated dendrogram of ERIC-PCR and PFGE divided the 60 strains in two major groups with a similarity of 73.3%. Group A consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (23) or from the farm environment (5) with a similarity of 81.2%. Group B also consisted of strains isolated either from chicken\'s clinical samples (21) or from the environment (11) with a similarity of 81.1%. MLVA divided the 188 strains isolated in Brazil and other 100 strains isolated from North America in two major groups. MLVA-A group consisted of 71 strains isolated in North America and only three strains isolated in Brazil. These strains from Brazil included the ones isolated before the beginning of the pandemic of S. Enteritidis in this country. In contrast, MLVA-B group clustered 185 strains isolated in Brazil and 29 strains isolated in North America. The strains in the MLVA-A group were divided in 34 different genotypic types with a similarity of 46%, while strains in iv the group B were divided in 15 different genotypic types with a similarity of 66%. MLST characterized 44 of the 46 strains studied as belonging to ST 11. The other two strains presented new alleles that characterized two new STs, the 1632 and the 1633. The results of molecular typing obtained by ERIC-PCR, PFGE and MLVA in this study showed a high genotypic similarity among S. Enteritidis strains isolated in Brazil, which suggests that the strains studied descend from a common ancestor that differed little genotypically during 24 years in the country. Moreover, the results of MLVA suggest that a new and prevalent subtype was introduced in Brazil after 1993 and has been contaminating food and infecting humans and animals. The high prevalence of virulence genes found in the strains studied reinforce their potential to cause disease in humans and animals, as well as the risks of their presence in food. Moreover, the high percentage of strains resistant to nalidixic acid observed after 1996 suggests the use of quinolones in the treatment of animal infections by S. Enteritidis in Brazil.

Orientador: Mara Correa Lelles Nogueira / Banca: Beatriz Meurer Moreira / Banca: Marina Baquerizo Martinez / Banca: Suzana Margareth Ajeji Lobo / Banca: Fátima Pereira de Souza / Resumo: O gênero Acinetobacter compreende bacilos Gram-negativos ubíquos na natureza e suas principais espécies, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A. nosocomialis, foram agrupadas no complexo Acinetobacter baumannii-Acinetobacter calcoaceticus (complexo ACB) por apresentarem alta similaridade genética e por serem de difícil diferenciação por métodos bioquímicos. As infecções mais causadas pelo complexo ACB são pneumonias e bacteremias e, para o tratamento destas, são muito utilizados os beta-lactâmicos, aminoglicosídeos e polimixinas. Entretanto, a resistência aos beta-lactâmicos e aminoglicosídeos tem aumentado em Acinetobacter spp., principalmente, devido à produção de enzimas chamadas beta-lactamases e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (EMAs). Neste contexto, os objetivos do estudo foram avaliar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, investigar genes de carbapenemases (blaOXA-23like, blaOXA-51like, blaOXA-58like, blaOXA24-40like, blaOXA-143like, blaOXA-48like, blaKPC, blaGES,blaVIM, blaIMPe blaSPM), e de EMAs [aac(3)-Ia, aac(3')-II, aaac(6')-Ih, aph(3')-VI, ant(2')-Ia, aph(3')-Ia e aac(6')-Ib] por PCR e determinar a similaridade genéticados isolados de A. baumannii por REP-PCR. Cem isolados do complexo ACB resistentes aos carbapenêmicos provenientes de pacientes admitidos em unidades de terapia intensiva (UTIs) do Hospital de Base de São José do Rio Preto (HB) foram encaminhados ao laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), onde foram realizadas a extração de DNA, a identificação da espécie, a investigação dos genes e a tipagem molecular por REP-PCR. Todos os isolados apresentaram fenótipo de multirresistência e foram identificados como pertencentes à espécie A. baumannii. Os genes blaOXA-23like e blaOXA-51like foram detectados em 100% dos isolados, e, em todos, ISAba1 estava localizado "upstream" ao gene blaOXA-23like... / Abstract: The Acinetobacter genus comprises ubiquitous Gram-negative bacilli and its main species, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii and A. nosocomialis were grouped in the the Acinetobacter baumannii - Acinetobacter calcoaceticus Complex (ACB Complex) due to their high genetic similarity and for their difficult differentiation by biochemical methods. Most infections caused by ACB complex are pneumonia and bacteremias, and, to treat these, beta-lactams, aminoglycosides and polymyxins are widely used. Nevertheless, beta-lactams and aminoglycosides resistance has been increasing in Acinetobacter spp., mainly, due to the enzymes production called beta-lactamases and aminoglycosides modifying enzymes (AMEs). Thus, the study objectives were to evaluate the antimicrobial susceptibility profile, investigate the carbapenemases gene (blaOXA-23like, blaOXA-51like, blaOXA-58like, blaOXA24-40like, blaOXA-143like, blaOXA-48like, blaKPC, blaGES, blaVIM, blaIMPand blaSPM), the AMEs genes [aac(3)-Ia, aac(3)-II, aac(6')-Ih, aph(3')-VI, ant(2')-Ia, aph(3')-Ia and aac(6')-Ib], and to determine the genetic similarity by REP-PCR. One hundred carbapenem resistant isolates of ACB complex were sent to the Microbiology Laboratory of the Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, where DNA extraction, species identification, PCRs and molecular typing by REP-PCR were carried out. All of the isolates showed multidrug resistance phenotype and were identified as A. baumannii. The genes blaOXA-23like and blaOXA-51like were present in 100% of the isolates andISAba1 was "upstream" to the blaOXA-23likegene. The AMES genes detected were aph(3')-VI (55%), aac(6')-Ib (46%), aac(3)-Ia (30%) and aph(3')-Ia (24%). The REP-PCR typing generated five groups (A, B, C, D and E) with 20 clusters. Of these, many were endemic clusters, because they were isolated during all the collection period and in all the HB's ICUs. Furthermore, the horizontal transmission ... / Doutor

Listeria monocytogenes é um importante patógeno de origem alimentar que causa listeriose, infecção severa que acomete, principalmente, gestantes, idosos, crianças e imunocomprometidos, e que apresenta elevada taxa de mortalidade. A bactéria está amplamente distribuída no ambiente e é comumente encontrada em produtos cárneos. O presente estudo teve como objetivos caracterizar 439 isolados de L. monocytogenes obtidos de salsicha bovina e produtos cárneos crus (carne moída, linguiça suína e coxa de frango) refrigerados, adquiridos no comércio do município de São Paulo, e previamente submetidos à sorotipagem molecular. Os isolados foram caracterizados quanto ao perfil de susceptibilidade antimicrobiana; presença dos genes de virulência actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB e mpl; perfil genético por eletroforese em campo pulsado (PFGE) e sequenciamento parcial dos genes actA e lmo0737. Baixa frequência de resistência antimicrobiana (0,5%) foi observada entre os 416 isolados avaliados. Um isolado pertencente ao sorogrupo 1 apresentou resistência à penicilina e à clindamicina e outro identificado como 4a ou 4c apresentou resistência à tetraciclina. Todos os isolados foram positivos para os genes de virulência testados. O sequenciamento parcial do gene actA mostrou a ocorrência de 14 sequências de nucleotídeos distintas nos 97 isolados avaliados. Além disso, verificou-se a ocorrência de uma deleção de 35 aminoácidos no gene actA em 36 isolados, além de substituições de nucleotídeos que resultaram em mutações nas sequências de aminoácidos da grande maioria dos isolados. A análise filogenética do gene actA possibilitou o agrupamento dos isolados em duas linhagens distintas (I e II). Os resultados do PFGE indicaram grande variabilidade nos perfis genéticos dos isolados analisados, principalmente naqueles pertencentes aos grupos 2 (1/2c e 3c), 3 (1/2b e 3b) e 4 (4b, 4d e 4e). Os resultados deste estudo mostram que os isolados de L. monocytogenes provenientes de salsicha bovina e produtos cárneos crus comercializados no município de São Paulo, apresentam grande diversidade genética, importante potencial de virulência e baixa frequência de resistência antimicrobiana. A diversidade observada deve-se, provavelmente, à característica ubíqua deste micro-organismo, tornando-o mais susceptível a grande pressão seletiva do ambiente. / Listeria monocytogenes is an important foodborne pathogen that causes listeriosis, a severe infection that affects primarily pregnant women, elderly, children and imunocompromised individuals, and has a high mortality rate. The bacteria is widely distributed in the environment and commonly found in meat products. The present study aimed to characterize 439 isolates of L. monocytogenes obtained from pork sausage and raw chilled meat products (ground beef, beef sausage, and chicken thigh) purchased in supermarkets in the city of São Paulo, and previously submitted to molecular serotyping. The isolates were characterized for antimicrobial susceptibility profile; presence of virulence genes actA, inlA, inlC, inlJ, prfA, iap, hly, plcA, plcB and mpl; genetic profile by pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and partial sequencing of genes actA and lmo0737. A low frequency of antimicrobial resistance (0.5%) was observed among the 416 evaluated isolates. One isolate belonging to serogroup 1 presented resistance to clindamycin and penicillin and another one identified as 4a or 4c was resistant to tetracycline. All isolates were positive for the tested virulence genes. The partial sequencing of the gene actA indicated the occurrence of 14 distinct nucleotide sequences in the 97 isolates tested. Furthermore, a deletion of 35 amino acids in the actA gene was detected in 36 isolates, and nucleotide substitutions that resulted in amino acid changes in the sequences of most isolates. Phylogenetic analysis of the actA gene clustered the isolates in two distinct lineages (I and II). Results of PFGE indicated a great genetic variability among isolates, especially among those belonging to groups 2 (1/2c and 3c), 3 (1/2b and 3b) and 4 (4b, 4d and 4e). The results of this study show that isolates of L. monocytogenes from pork sausage and raw meat products marketed in the city of São Paulo present a great genetic diversity, significant virulence potential and low frequency of antimicrobial resistance. The detected diversity is probably due the ubiquitous nature of these microorganisms, making them more susceptible to selective pressure of the environment.

A doença de Chagas é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas, que vão desde a ausência de sintomas à doença grave com comprometimento cardíaco e/ou digestivo. A influência do parasito, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente etiológico da doença, nessas apresentações clínicas têm sido largamente estudada, não se tendo demonstrado o papel da diversidade genética de populações de T. cruzi na determinação das diferentes formas clínicas em humanos. Este trabalho teve como objetivos: a) geral: analisar as características moleculares de T. cruzi em pacientes com doença de Chagas com e sem imunodepressão (infecção por HIV e transplante de órgãos com e sem reativação); b) específicos: 1. Analisar comparativamente isolados do parasito quanto à distribuição em DTU; 2. Relacionar os resultados obtidos pela análise molecular do gene ND7 com a forma clínica e origem; 3. Avaliar por LSSP-PCR a variabilidade da sequência do kDNA de T. cruzi diretamente de amostras biológicas assim como em isolados de T. cruzi obtidos pelos exames de hemocultura/xenodiagnóstico; 4. Comparar os padrões polimórficos obtidos por LSSP-PCR em amostras repetidas de um mesmo paciente no mesmo sítio ou distintos sítios biológicos. Foram incluídos, após aprovação do protocolo na CAPPesq e mediante assinatura de TCLE, 106 pacientes com doença de Chagas crônica ou com imunossupressão, provenientes dos ambulatórios e enfermarias do HCFMUSP, além de 75 indivíduos controle, com provas sorológicas e moleculares negativas. Foram analisadas 187 amostras isoladas de hemocultura/xenodiagnóstico e 236 diretamente de amostras sanguíneas de pacientes. Os seguintes grupos foram constituídos: Agudo-AG, Crônico-CR, Crônico Imunodeprimido-CRI (doenças autoimunes/neoplasias), Coinfecção-CO (infecção por HIV/T.cruzi), Coinfecção-CO/RE (infecção por HIV/T.cruzi e reativação da doença de Chagas), Transplantado-TX, Transplantado-TX/RE (Transplantado com reativação da doença de Chagas). Foram identificados DTU TcI, TcV, TcVI e em maior número TcII, por ensaios de tipagem molecular do parasito, com distribuição estatisticamente significantemente de acordo com a naturalidade dos pacientes (P=0,013). Quanto ao gene ND7, observou-se que a banda de ~900 bp ocorreu em 83,0% das amostras das regiões norte, nordeste, centro-oeste e Bolívia e a de ~400pb em 54% das amostras nas regiões sul e sudeste brasileiras sendo esta diferença estatisticamente significante (P < 0,001). A comparação dos perfis observados por LSSP-PCR a partir de amostras extraídas diretamente do sangue e de isolados obtidos de hemocultura/xenodiagnóstico mostrou maior variabilidade em amostras sanguíneas, confirmada pelo dendrograma. Adicionalmente, o estudo de amostras repetidas do mesmo paciente permitiu confirmar a maior variabilidade nas amostras diretamente extraídas do sangue, com mudança dos padrões durante e após o tratamento com reaparecimento de perfis antigos não presentes no período prétratamento imediato, além de presença de perfis diferentes em distintos sítios biológicos do mesmo paciente. O encontro de DTU diferentes de TcII nos grupos CR/CRI e AG enfatiza a necessidade de atentar para a diferença em limiares de reatividade segundo DTU na análise da parasitemia por PCRq (quantitativa), conforme registrado na literatura. Os dados observados por LSSP-PCR acrescentam informações adicionais não revelados por tipagem molecular, representando novos desafios para o entendimento da relação hospedeiro-parasito em pacientes com doença de Chagas sem e com imunossupressão, ao lado de fatores como nível de parasitemia e pressão seletiva de medicamentos antiparasitários e imunossupressores / Chagas\' disease is characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from asymptomatic cases to severe cardiovascular and/or gastrointestinal involvement. The clinical presentations are thought to be determined primarily by genetic diversity of populations of Trypanosoma cruzi (T. cruzi), but no correlation was clearly demonstrated yet. This study aimed to: a) general: to analyze the molecular characteristics of T. cruzi in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression (HIV infection and organ transplantation with or without reactivation); b) specifics: 1.To analyze comparatively isolates from the parasite as for the distribution in DTU; 2. To describe the results obtained by molecular analysis of gene ND7 in relationship with the clinical form and origin; 3. To assess by LSSP-PCR the variability of the sequence of the T. cruzi kDNA directly from biological samples, as well as in T. cruzi isolates obtained by examination of blood culture/xenodiagnosis; 4. To compare the polymorphic patterns obtained by LSSP-PCR in repeated samples of the same patient on the same site or different biological sites. After approval of the protocol in CAPPesq and by signing an informed consent, 106 patients with chronic Chagas disease or immunosuppression, from the HCFMUSP\'s clinics and wards, and 75 control subjects with negative serological and molecular tests were included. They were analyzed 187 isolated samples from blood culture/xenodiagnosis and 236 directly from blood samples of patients. The following groups were formed: Acute-AC, Chronic-CR, Chronic immunocompromised-CRI (autoimmune diseases/ neoplasms), Coinfection-CO (HIV/T. cruzi infection), Coinfection-CO/RE (HIV/T. cruzi and reactivation of Chagas disease), Transplantation-TX, Transplantation-TX/RE (Transplantation/ with reactivation of Chagas\' disease). DTU TcI, TcV, TcVI and higher TcII number were identified for molecular typing assays of the parasite and the distribution of DTU was statistically significant according to patient´s naturality (P=0.013). As for ND7 gene, was observed that the band of ~ 900 bp was prevalent in 83% of the samples in the North, Northeast, Midwest regions and Bolivia and the band of ~400bp occurred in 54% of the samples of Brazilian\' South and Southeast regions, this distribution was statistically significant (P < 0.001). The comparison between the profiles observed by LSSP-PCR from samples taken directly from blood and isolates obtained from blood culture/xenodiagnosis showed greater variability in blood samples, confirmed by dendrogram. Additionally, the study of repeated samples from the same patient allowed to confirm the greater variability in blood samples taken directly, with changing patterns during and after the treatment with reappearance of old profiles not present in the immediate pre-treatment period, and the presence of different profiles at different biological sites in the same patient. The presence of other DTUs than TcII in chronic and chronic immunosuppressed patients and AC groups emphasizes the need to pay attention to the different reactivity thresholds for the various DTU in the analysis of parasitaemia by PCRq (quantitative), according to the data registered in the literature. The results observed by LSSP-PCR add further information not revealed by molecular typing, representing new challenges for the understanding of the host-parasite relationship in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression, alongside factors such as level of parasitaemia and selective pressure of antiparasitic drugs and immunosuppressive

O Herpesvírus 8 humano (HHV-8) é endêmico em populações africanas e indígenas da região Amazônica. A infecção nestas populações acontece durante a infância e, na África, envolve o contato íntimo no ambiente intrafamiliar. Diversos estudos confirmam a distribuição geográfica dos diferentes subtipos de HHV-8, sendo que o subtipo E é típico das populações indígenas. Objetivos: 1. Caracterizar o(s) subtipo(s) de HHV-8 que circula(m) em população indígena da Amazônia brasileira baseado na análise da região ORF K1 do vírus; 2. Construir a árvore filogenética dos subtipos virais encontrados; 3. Comparar filogeneticamente os subtipos encontrados com os subtipos prevalentes em outras populações indígenas do Brasil e de outros países da América do Sul; 4. Calcular a taxa de substituição para a região VR1 do HHV-8 para as amostras estudadas; 5. Estimar a data de entrada do vírus na população do estudo; 6. Investigar a dinâmica de transmissão do vírus no ambiente intrafamiliar; 7. Averiguar se há correlação entre os alelos de HLA classe I (A e B) e II (DQB1 e DRB1) e suscetibilidade à infecção por HHV-8. Casuística e métodos: Estudo de soroprevalência da infecção por HHV-8 em amostra de população indígena da Amazônia brasileira utilizando IFI para detecção de antígenos da fase latente (LANA) e lítica (Lítico) do vírus. Análise filogenética da amostras encontradas utilizando-se o DNA/HHV-8 extraído de amostras de saliva, submetidas à reação de nested PCR para amplificar as regiões hipervariáveis VR1 e VR2. Cálculo da taxa de substituição do HHV-8, utilizando-se os métodos de distância e técnica bayesiana. Estimar a data do ancestral comum mais recente para as amostras em estudo, utilizando-se o programa BEAST. Tipagem de HLA de indivíduos positivos e negativos para a infecção por HHV-8, utilizando-se a técnica de PCR-SSO. Resultados: A soroprevalência geral da infecção por HHV-8 na população em estudo foi de 75,3% (399/530). Observou-se que a soropositividade dos filhos está correlecionada com a soropositividade materna. O único subtipo viral encontrado foi o subtipo E. A taxa de substituição de nucleotídeos do HHV-8 utilizando a região VR1 foi da ordem de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a). Ao analisar todas as seqüências estudadas o ancestral comum mais recente está em torno de 138 anos. Não houve correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e alelos de HLA classe I ou II. Conclusões: A população estudada é endêmica para a infecção por HHV-8. A infecção ocorre principalmente na infância, por via horizontal não-sexual, e a transmissão se dá provavelmente pela saliva. Assim como em outras populações endêmicas da África, a soropositvidade dos filhos está correlacionada com a soropositividade das mães. Confirmando achados anteriores, o único subtipo do HHV-8 circulante na população estudada, foi o subtipo E. Nossos dados sugerem que a região do gene VR1 do HHV-8 evolui com uma taxa de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a), e que o ancestral comum mais recente do vírus, a partir das amostras analisadas está em torno de 138 anos. Os dados sugerem, também, que não há correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e os alelos de HLA classe I ou II. / The human herpesvirus 8 (HHV-8) is endemic in Africa and Amerindian populations from Amazon region. The infection in those populations occurs during childhood and, in Africa, involves a close contact in intrafamilial environment. Several studies confirm the geographical distribution of different subtypes of HHV-8, and the subtype E is typical of the Amerindian population. Objectives: 1. To characterize the HHV-8 subtypes circulating in Amerindian population from Brazilian Amazon, based on the analysis of ORF K1 region of the virus. 2. To construct a phylogenetic tree of viral subtypes found among Amerindians 3. To compare by phylogenetic methods the subtypes found in Mapuera Amerindians with the subtypes prevalent in others Amerindians populations of Brazil and South America 4. To determine the substitution rate of VR1 region of HHV-8 for the sequences obtained in the present study 5. To estimate the date of entry of the viruses in the Mapuera population 6. To investigate the dynamic of transmission of the virus in the intrafamilial environment 7. To investigate if there is a correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I (A and B) and II (DQB1 and DRB1) alleles. Patients and methods: The seroprevalence of HHV-8 infection in a sample of the indigenous population of the Brazilian Amazon was carried out using IFA to detect antibodies to latent (LANA) and lytic phase antigens of HHV-8. Phylogenetic analysis of the sequences was performed by using the DNA extracted from samples of saliva, using a nested PCR to amplify the hypervariable regions VR1/ VR2 of HHV-8. Estimation of the substitution rate of HHV-8 nucleotides was performed by using the method of distance and the Bayesian technique. Estimates of the time of the most recent common ancestor (TMRCA) for all samples studied were done by using the BEAST program. HLA typing of positive and negative subjects for HHV-8 infection was performed by using the PCR-SSO technique. Results: The overall HHV-8 seroprevalence was 75.3% (399/530). There was a positive correlation between soropositivity of children and maternal seropositivity. The only viral subtype found was subtype E. The substitution rate of HHV-8 using the VR1 region was estimated around 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y). By using this rate of substitution, the TMRCA of the Mapuera viruses sequences was estimated to be around 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles. Conclusions: The population studied is endemic for HHV-8 infection. The infection occurs mainly in childhood, by horizontal, nonsexual transmission, probably by saliva. As in endemic populations of Africa, the soropositvity of children is positively correlated with the seropositivity of the mothers. In agreement with previous reports, the subtype E was the only HHV-8 subtype found in Mapuera Amerindians. Our data suggest that the VR1 gene region of HHV-8 evolves with a rate of 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y), which results in a time of the most recent common ancestor for Mapuera HHV-8 sequences of 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles.

O gênero Trichosporon é composto por leveduras artrosporadas do Filo Basidiomycota e é conhecido agente de infecção fúngica invasiva (IFI) em pacientes imunodeprimidos ou com outros fatores de risco. Em pacientes onco-hematológicos é a principal levedura responsável por IFI depois do gênero Candida. Entre as espécies responsáveis por infecções no homem encontram-se: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. A tecnologia de identificação de fungos por espectrometria de massa (SM) MALDI-TOF ainda carece de padronização para identificação de fungos do gênero Trichosporon, mas a literatura mostra resultados encorajadores. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF para a identificação das espécies do gênero Trichosporon de importância médica. O estudo foi realizado em cooperação entre a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC, HC-FMUSP), Instituto de Medicina Tropical da USP (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Laboratoire de Parasitologie-Mycologie do Hospital Saint Antoine de Paris, vinculado ao grupo de pesquisa INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\" Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie de Paris. Noventa e três cepas/isolados foram analisado(a)s, sendo dezenove cepas de referência adquiridas junto à coleção holandesa Centraalbureau Schimmelcultures (CBS), 19 isolados do HC-FMUSP e IAL, e 55 isolados de diferentes hospitais franceses. A identificação molecular foi realizada através do sequenciamento da região IGS1 do rDNA e foi considerada como método de referência. O protocolo de extração de proteínas foi estabelecido através da comparação do desempenho de três metodologias (Bruker®, Cassagne et al., Sendid et al.). Os espectros de massa foram obtidos no laboratório de bacteriologia do Hospital Saint Antoine de Paris através do aparelho Microflex LT®. A interpretação dos resultados qualitativos e quantitativos (logscore) foi realizada através do Software Biotyper 3.0®. O desempenho de identificação do banco de espectros de referência Biotyper 3.0® foi comparado a outros cinco bancos criados a partir de espectros de referência (ERs) derivados de 18 cepas de referência CBS, sete isolados clínicos e 11 ERs do banco Biotyper 3.0. O protocolo de extração de proteínas descrito por Sendid et al. foi escolhido como protocolo de referência pois os espectros produzidos tiveram logscore superiores àqueles obtidos através do método do fabricante. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou 32,3% de identificações corretas das espécies, sendo que o banco de ERs in house (número 5, constituído cepas CBS e isolados clínicos) apresentou 98,5% de identificações de espécies. Espectros de referência do banco de dados Biotyper 3.0® foram submetidos à identificação com a utilização dos ERs criados a partir de cepas CBS e isolados clínicos e foram evidenciados com erros de identificação: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). Após padronização do protocolo de extração e criação de banco de ERs com cepas CBS e isolados clínicos caracterizados pelo sequenciamento da região IGS, a SM por MALDI-TOF apresentou-se como potente uma ferramenta para a identificação de fungos do gênero Trichosporon. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou um fraco desempenho, relacionado a ERs que foram criados a partir de cepas mal identificadas / Trichosporon spp. are arthrospored yeasts from the Filum Basidiomycota that are known to produce invasive fungal infection (IFI) in patients with immunosupression or other risk factors. After Candida, Trichosporon is the second genus of yeasts responsible for IFI in patients with onco-hematological diseases. The most important species related to human infection are: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. The technology of mass spectrometry (MS) for identification of Trichosporon species has not yet been standardized. However, preliminary promising results can be found in the literature. The objective of this study is to analyse and validate MS MALDI-TOF for the identification of Trichosporon species of medical relevance. This was a multicentric study with collaboration from the Central Laboratory Section from Clinics Hospital of the Medical School from the University of São Paulo (DLC-HCFMUSP), Tropical Medicine Institute from the University of São Paulo (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) and Laboratoire de Parasitologie-Mycologie from the Hospital Saint Antoine of Paris and INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\", Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie of Paris. Ninety three strains/isolates belonging to sixteen Trichosporon species were analysed. Nineteen were purchased from Centraalbureau Schimmelcultures (CBS) yeast collection, 19 belonged to HC-FMUSP and IAL collections, 55 belonged to different French collections. The reference identification method was the IGS1 rDNA sequencing. A protein extraction protocol was first established after comparing the performance of three different methodologies (Bruker(TM), Cassagne et al., Sendid et al.). The mass spectra were obtained through a Microflex LT(TM) mass spectrometer located at the bacteriology laboratory from Saint Antoine Hospital, Paris. Mass spectra, qualitative and quantitative results were produced through the software Biotyper 3.0(TM). The performance of the original main spectrum (MSP) library was compared to other 5 in house libraries built with the combination of MSPs derived from CBS strains (18), clinical strains (7) or (Bruker Daltonics/BD, Germany/USA) (11). The extraction protocol described by Sendid et al. showed better performance when compared to the manufacturer\'s one and was chosen for the subsequent extractions. Among the 6 different reference spectra databases tested, a specific one composed of 18 reference strains plus 7 clinical isolates (database 5) allowed the correct identification of 66 amongst 67 clinical isolates (98,5%). Biotyper 3.0 library produced only 32,3% of correct identifications. Biotyper\'s MSPs were submitted to cross-identification with MSPs derived from CBS strains and clinical isolates and misidentified original MSPs were identified: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). While until now less widely applied to basidiomycetous fungi, MALDI-TOF appears to be a valuable tool for identifying clinical Trichosporon isolates at the species level. The MSP library Biotyper 3.0 showed a poorer performance which was due to misidentified strains utilized as reference for the MSPs

O Herpesvírus 8 humano (HHV-8) é endêmico em populações africanas e indígenas da região Amazônica. A infecção nestas populações acontece durante a infância e, na África, envolve o contato íntimo no ambiente intrafamiliar. Diversos estudos confirmam a distribuição geográfica dos diferentes subtipos de HHV-8, sendo que o subtipo E é típico das populações indígenas. Objetivos: 1. Caracterizar o(s) subtipo(s) de HHV-8 que circula(m) em população indígena da Amazônia brasileira baseado na análise da região ORF K1 do vírus; 2. Construir a árvore filogenética dos subtipos virais encontrados; 3. Comparar filogeneticamente os subtipos encontrados com os subtipos prevalentes em outras populações indígenas do Brasil e de outros países da América do Sul; 4. Calcular a taxa de substituição para a região VR1 do HHV-8 para as amostras estudadas; 5. Estimar a data de entrada do vírus na população do estudo; 6. Investigar a dinâmica de transmissão do vírus no ambiente intrafamiliar; 7. Averiguar se há correlação entre os alelos de HLA classe I (A e B) e II (DQB1 e DRB1) e suscetibilidade à infecção por HHV-8. Casuística e métodos: Estudo de soroprevalência da infecção por HHV-8 em amostra de população indígena da Amazônia brasileira utilizando IFI para detecção de antígenos da fase latente (LANA) e lítica (Lítico) do vírus. Análise filogenética da amostras encontradas utilizando-se o DNA/HHV-8 extraído de amostras de saliva, submetidas à reação de nested PCR para amplificar as regiões hipervariáveis VR1 e VR2. Cálculo da taxa de substituição do HHV-8, utilizando-se os métodos de distância e técnica bayesiana. Estimar a data do ancestral comum mais recente para as amostras em estudo, utilizando-se o programa BEAST. Tipagem de HLA de indivíduos positivos e negativos para a infecção por HHV-8, utilizando-se a técnica de PCR-SSO. Resultados: A soroprevalência geral da infecção por HHV-8 na população em estudo foi de 75,3% (399/530). Observou-se que a soropositividade dos filhos está correlecionada com a soropositividade materna. O único subtipo viral encontrado foi o subtipo E. A taxa de substituição de nucleotídeos do HHV-8 utilizando a região VR1 foi da ordem de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a). Ao analisar todas as seqüências estudadas o ancestral comum mais recente está em torno de 138 anos. Não houve correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e alelos de HLA classe I ou II. Conclusões: A população estudada é endêmica para a infecção por HHV-8. A infecção ocorre principalmente na infância, por via horizontal não-sexual, e a transmissão se dá provavelmente pela saliva. Assim como em outras populações endêmicas da África, a soropositvidade dos filhos está correlacionada com a soropositividade das mães. Confirmando achados anteriores, o único subtipo do HHV-8 circulante na população estudada, foi o subtipo E. Nossos dados sugerem que a região do gene VR1 do HHV-8 evolui com uma taxa de 6x10-4 substituições por sítio por ano (s/s/a), e que o ancestral comum mais recente do vírus, a partir das amostras analisadas está em torno de 138 anos. Os dados sugerem, também, que não há correlação entre a susceptibilidade à infecção por HHV-8 e os alelos de HLA classe I ou II. / The human herpesvirus 8 (HHV-8) is endemic in Africa and Amerindian populations from Amazon region. The infection in those populations occurs during childhood and, in Africa, involves a close contact in intrafamilial environment. Several studies confirm the geographical distribution of different subtypes of HHV-8, and the subtype E is typical of the Amerindian population. Objectives: 1. To characterize the HHV-8 subtypes circulating in Amerindian population from Brazilian Amazon, based on the analysis of ORF K1 region of the virus. 2. To construct a phylogenetic tree of viral subtypes found among Amerindians 3. To compare by phylogenetic methods the subtypes found in Mapuera Amerindians with the subtypes prevalent in others Amerindians populations of Brazil and South America 4. To determine the substitution rate of VR1 region of HHV-8 for the sequences obtained in the present study 5. To estimate the date of entry of the viruses in the Mapuera population 6. To investigate the dynamic of transmission of the virus in the intrafamilial environment 7. To investigate if there is a correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I (A and B) and II (DQB1 and DRB1) alleles. Patients and methods: The seroprevalence of HHV-8 infection in a sample of the indigenous population of the Brazilian Amazon was carried out using IFA to detect antibodies to latent (LANA) and lytic phase antigens of HHV-8. Phylogenetic analysis of the sequences was performed by using the DNA extracted from samples of saliva, using a nested PCR to amplify the hypervariable regions VR1/ VR2 of HHV-8. Estimation of the substitution rate of HHV-8 nucleotides was performed by using the method of distance and the Bayesian technique. Estimates of the time of the most recent common ancestor (TMRCA) for all samples studied were done by using the BEAST program. HLA typing of positive and negative subjects for HHV-8 infection was performed by using the PCR-SSO technique. Results: The overall HHV-8 seroprevalence was 75.3% (399/530). There was a positive correlation between soropositivity of children and maternal seropositivity. The only viral subtype found was subtype E. The substitution rate of HHV-8 using the VR1 region was estimated around 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y). By using this rate of substitution, the TMRCA of the Mapuera viruses sequences was estimated to be around 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles. Conclusions: The population studied is endemic for HHV-8 infection. The infection occurs mainly in childhood, by horizontal, nonsexual transmission, probably by saliva. As in endemic populations of Africa, the soropositvity of children is positively correlated with the seropositivity of the mothers. In agreement with previous reports, the subtype E was the only HHV-8 subtype found in Mapuera Amerindians. Our data suggest that the VR1 gene region of HHV-8 evolves with a rate of 6x10-4 substitutions per site per year (s / s / y), which results in a time of the most recent common ancestor for Mapuera HHV-8 sequences of 138 years. There was no correlation between susceptibility to HHV-8-infection and HLA class I or II alleles.