Spiders and scorpions are efficient predators arachnid (PA) consuming preys larger than themselves. Few studies reported, molecularly, the digestion in PA. This work describes a biochemical, transcriptomic and proteomic analysis of the midgut and midgut glands (MMG) and digestive juice (DJ) from Nephilengys cruentata and Tityus serrulatus MMG. Cathepsin L, B, D and F, legumain, trypsin, astacin, carbohydrases and lipases were identified by these approaches. Peptide isomerase and ctenitoxins, which are venom proteins were identified, showing a correlation among digestive and venom enzymes. Summarily, PA relies in multi peptidase system mainly constituted of astacins for extracellular prey liquefaction and cathepsin L for intracellular digestion, describing a molecular model for digestion. Probably, during evolution, gene duplication led a diversification of astacins in the derived groups of Arachnida, like spiders, distinctly from what is observed in basal groups like scorpions. These data on Arachnida digestion will allow detailed multi disciplinary studies. / Aranhas e escorpiões são aracnídeos predadores eficientes (AP) consumindo presas maiores que eles mesmos. Poucos estudos descrevem molecularmente a digestão em AP. Neste trabalho caracterizamos bioquimicamente, por transcriptoma e proteoma o intestino e glândulas digestivas (IGD) e suco digestivo (SD) de Nephilengys cruentata e o IGD de Tityus serrulatus. Catepsinas L, B, D e F, legumaína, tripsinas, astacinas, carboidrases e lipases foram identificadas. Peptídeo isomerase e ctenitoxina foram identificadas no IGD. Estas proteínas podem indicar uma correlação entre enzimas digestivas e do veneno. Portanto, AP apresentam várias peptidases principalmente astacinas para liquefazer a presa extraoralmente e catepsinas L para digestão intracelular, descrevendo um modelo molecular para a digestão. Provavelmente, durante a evolução, eventos duplicação gênica levaram à diversificação das astacinas aracnídeos derivados, como as aranhas, diferentemente dos grupos basais, como os escorpiões. Estes dados sobre a digestão em Arachnida permitirão estudos multidisciplinares.

A partir de uma biblioteca de cDNA de glândulas de veneno de Micrurus corallinus (cobra-coral), uma serpente da Família Elapidae bastante representada no Brasil e muito comum em áreas florestais tropicais, foram gerados 1.438 Expressed Sequences Tags (ESTs), agrupados em 611 clusters. O banco representa os genes mais expressos na glândula de veneno de M. corallinus. Os transcritos relacionados às toxinas apresentaram ao redor de 46% de representação nesse banco de seqüências. A composição geral das toxinas inclui: toxinas de três dígitos (3FTx) (24%), fosfolipases A2 (PLA2) (16%), lectinas do tipo C (5%), entre outros. O banco permitiu não somente a identificação de possíveis toxinas, mas também de transcritos celulares, sendo a maioria envolvida nas funções fisiológicas de células da glândula de veneno. A maior parte dessas moléculas apresenta um envolvimento na expressão gênica e protéica, o que reflete uma alta especialização do tecido para a síntese de toxinas. A análise do transcriptoma de glândulas de veneno de M. corallinus possibilitou a identificação de alguns candidatos antigênicos para um anti-soro antielapídico alternativo. Cinco candidatos antigênicos foram selecionados por meio da análise do transcriptoma obtido: Atg1 (Grupo das neurotoxinas Homolog 8), Atg2 (Grupo das neurotoxinas Homolog 7/3/1), Atg3 (Outras neurotoxinas 1), Atg4 (Outras neurotoxinas 2) e Atg5 (fosfolipase do tipo A2). Avaliamos a viabilidade de imunização com o DNA desses candidatos. Para isso, os cinco grupos de antígenos foram clonados, primeiramente em pGEM-T e, posteriormente, em pSecTag2A, que é um vetor de expressão em células de mamíferos. As clonagens foram inicialmente testadas em células do tipo COS (transfecção transiente), entretanto não ficou clara a capacidade dessas células em expressar os antígenos. Para a análise da resposta imunológica da vacina de DNA, proteínas recombinantes produzidas em E. coli foram utilizadas para o coating de ELISA para detectar anticorpos presentes no soro primário proveniente da imunização com DNA. Os resultados mostraram que o soro dos animais imunizados foi capaz de reconhecer os antígenos recombinantes. Isso indica que a imunização por DNA em camundongos poderia ser uma boa alternativa em relação à imunização do veneno puro de serpente, que é custosa e muito depende da disponibilidade do veneno. Apesar da necessidade de testes complementares, esse é um resultado promissor, já que a produção de anticorpos pode ser alcançada por via de imunização intramuscular, mais prática para objetivos de produção. / Micrurus corallinus(coral snake) is a tropical forest snake belonging to the Elapidae Family, and is very common in Brazil. From the cDNA library of its venom glands, 1.438 Expressed Sequences Tags (ESTs) were generated and grouped into 611 clusters. This database contains the most expressed genes in the M. corallinus venom glands. The transcripts related to toxins represent approximately 46% of the total genes in this database. The toxin compound consists of: three finger toxins (24%), phospholipases A2 (PLA2s) (16%), type-C lectins (5%), among others. This database allowed not only the identification of possible toxins, but also the identification of cellular transcripts, most of which seems to be involved in physiological functions of venom gland cells. The majority of these molecules are involved in gene and protein expression, revealing the high level of specialization of the tissue for toxin synthesis. The analysis of the M. corallinus venom gland transcriptome allowed the identification of some antigenic candidates for an alternative antielapidic antiserum. Five antigenic candidates were selected after analysing the transcriptome: Atg1 (Homolog group 8), Atg2 (Homolog group 7/3/1), Atg3 (Other neurotoxins 1), Atg5 (A2-type phospholipase). These five antigenic groups were used for DNA immunization. Then they were first cloned in pGEM-T and, after, in pSecTag2A, which is an expression vector in mammal cells. The cloning was tested in COS-type cells (transient transfection), without signs of expression. To analyze the immunological response, recombinant proteins were produced in E. coli and used for ELISA coating to react with the primary serum deriving from the DNA immunization. The results showed that the serum from the immunized animals was able to recognize the recombinant antigens, indicating that the DNA immunization in mice could be a feasible alternative regarding the traditional immunization with crude snake venom, which is costly and heavily dependent on the availability of the venom. Regardless the need for additional tests, this is a promising result, because the antibody production can be achieved by intramuscular immunization, a more effective method when aiming for downstream production.

A cana-de-açúcar possui uma característica única entre as plantas de interesse econômico mundial: a capacidade de acumular altos níveis de sacarose no colmo. No Brasil, em virtude do aumento da demanda interna e mundial por fontes energéticas renováveis, é nítida a expansão da cultura canavieira para regiões menos propícias para cultivo, como as regiões secas do centro-oeste brasileiro. O déficit hídrico é um dos principais agentes que afetam o desenvolvimento das plantas e a obtenção de variedades melhor adaptadas é fundamental para a sustentabilidade e expansão da agroindústria canavieira. Neste sentido, genes regulados por seca são alvos importantes para a obtenção de plantas transgênicas mais tolerantes ao estresse. Como a expressão constitutiva do transgene pode causar efeitos indesejáveis nas plantas transgênicas, também é necessária a identificação de promotores induzíveis pelo estímulo ambiental. O objetivo deste trabalho é a identificação de genes e sequências promotoras reguladas pela seca em cana-de-açúcar que, além de contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância ao estresse, podem ser utilizados como alvos para obtenção de plantas transgênicas mais resistentes. Para a identificação de genes diferencialmente regulados por seca, utilizamos diferentes plataformas de microarranjo: SUCAST (com 1.830 genes relacionados à transdução de sinal), SUCAMET (com 4.594 genes relacionados a metabolismo) e CaneRegNet (com sondas para a identificação de transcritos senso e antisenso que correspondem a 14.522 genes únicos). Nestas plataformas, analisamos a expressão dos genes de quatro variedades de cana-de-açúcar, duas tolerantes e duas sensíveis à seca, submetidas a 24, 72 e 120 h de déficit hídrico. Dos genes diferencialmente expressos (alguns identificados como transcritos pelas fitas senso e/ou antisenso), 53 foram selecionados para validação por PCR em tempo real. As regiões promotoras de quatro dos genes selecionados foram identificadas por meio das técnicas de andamento cromossômico, de seleção e sequenciamento de cromossomos artificiais de bactéria contendo DNA de cana-de-açúcar e de análise de contigs obtidos por Whole Genome Shotgun. Sete sequências promotoras foram selecionadas e clonadas em um vetor contendo o gene repórter gus. As atividades promotoras destas sequências foram testadas e verificadas em transformações transientes de calos embriogênicos de cana-deaçúcar. Para obtenção de plantas de cana-de-açúcar transgênicas, selecionamos o gene induzido por seca que codifica uma PP2C. Através da transformação de calos embriogênicos de cana-de- açúcar com vetor de silenciamento de pp2c, obtivemos algumas plantas com expressão de pp2c reduzida. O transcriptoma das plantas transgênicas foi avaliado. Em comparação com plantas controles e em condições normais de irrigação, identificamos 352 transcritos com expressão alterada. As plantas transgênicas com pp2c silenciado e plantas controles também foram estudadas num experimento de supressão de rega. Os dados fisiológicos e as observações morfológicas demonstraram que um dos eventos transgênicos apresentou tolerância à seca. A comparação do transcriptoma das plantas irrigadas contra as submetidas à seca e da planta tolerante contra não tolerantes ao estresse mostrou que diversos genes estavam diferencialmente regulados, inclusive aqueles envolvidos na sinalização por ABA, via no qual o gene pp2c atua. / Sugarcane has a unique characteristic among crop plants in the world: the ability to accumulate high levels of sucrose in its stems. In Brazil, due to the local and global increasing demand for renewable energy sources, it is notable the expansion of sugarcane cultivation to areas less favorable for cultivation, such as the dry regions of central-western Brazil. Water deficit is one of the main agents that affect plant development. The production of better varieties is critical to the sustainability and expansion of the sugarcane industry. In this way, genes regulated by drought are important targets for obtaining transgenic plants tolerant to stress. Since transgene constitutive expression may cause unwanted effects in transgenic plants, it is also important to identify of stress inducible promoters. The goal of this work is the identification of genes and promoters regulated by drought in sugarcane that, in addition to contributing to the understanding of the mechanisms involved in stress tolerance, can be used as targets for the production of transgenic plants more resistant to water stress. For the identification of genes differentially expressed in response to drought, we have used different microarray platforms: SUCAST (contains 1,830 genes related to signal transduction), SUCAMET (contains 4,594 genes related to metabolism) and CaneRegNet (contains probes for the identification of sense and antisense transcripts that correspond to 14,522 unique genes). In these platforms we analysed gene expression of four different sugarcane varieties, two tolerant and two sensitive to drought, after 24, 72 and 120 h of water deficit. From the genes differentially expressed (some transcribed by the sense and/or antisense strand), 53 were selected for qPCR validation. Promoter regions of four genes were identified by Chromosome Walking, selection and sequencing of BACs and the analyses of Whole Genome Sequencing contigs. Seven promoter sequences were selected and cloned into a vector containing the gus reporter gene. Promoter activity was tested and verified through the transient transformation of sugarcane embryogenic calli. For sugarcane transgenics production we selected the drought-induced pp2c gene. Through the transformation of sugarcane embryonic calli with a vector for pp2c silencing we obtained transformed plants with pp2c gene expression reduced. The transcriptome of transgenic plants was analysed. In comparison with control plants and in irrigated conditions, we identified 352 differentially expressed transcripts. Transgenic plants with silenced pp2c and control plants were studied in a pilot drought experiment. Physiological data and morphological observations indicated that one of the transgenic events presented tolerance to drought. The comparison between irrigated and drought plants and between tolerant and no tolerant showed that a large number of genes was differentially regulated including genes related to the ABA signaling, pathway in which pp2c acts.

Os peptídeos bioactivas são fundamentais no sistema imune inato (SII), devido a que eles proveem informação importante sobre o SII. O objetivo deste estudo é caracterizar os componentes e reações do SII em quilópodes. Para isto, analisamos o transcriptoma dos hemócitos de Scolopendra subspinipes subspinipes; assim como também, extraímos, purificamos e caracterizamos os peptídeos antimicrobianos presentes na exúvia, o extrato total e a hemolinfa de S. s. subspinipes e S. viridicornis. Várias frações com atividade antimicrobiana foram isoladas da hemolinfa. Dois novos peptídeos antimicrobianos foram caracterizados e sintetizados: a Pinipesina, de S. s. subspinipes e a Lacraina, de S. viridicornis. A análise preliminar do transcriptoma apresentou que os contigs relacionados ao SII foram transcritos com mais frequência moléculas com atividade regulatória (33,7%) e de reconhecimento (11,6%), e as relacionadas a cascata de coagulação (21,4%). Uma análise mais completa do transcriptoma e das moléculas bioactivas é apresentado. / Bioactive peptides are vital in the innate immune system (IIS), because they provide substantial information about the IIS. This study aims to characterize the components and reactions that constitute the ISS in Chilopoda. For this, we analyzed the hemocytes transcriptome from Scolopendra subspinipes subspinipes; as also extracted, purified and characterized the bioactive peptides presents in the exuviae, the body extract and the hemolymph from S. s. subspinipes and S. viridicornis. Several fractions with antimicrobial activity from the hemolymph were isolated. Two new antimicrobial peptides were characterized and synthetized as well: The Pinipesin, from S. s. subspinipes, and the Lacrain, from S. viridicornis. The preliminary analysis from the transcriptome show that the contigs related to the IIS were transcribed more frequently molecules with regulatory (33,7 %) and recognition (11,6%) activities, and those involved in the coagulation cascade (21,4%). A more complete analysis of the transcriptome and the bioactive molecules is presented.

Arcella Ehrenberg 1832 is one of the most numerous testacean genera. Arcellinids are an aerobic lineage of testate amoeba that live in a wide variety of environments. Probably their ability to survive in such divergent conditions is related to some de- gree of metabolic flexibility. Anaerobic organisms have gained and lost a number of genes related to energetic metabolism. These processes modify classic mitochondria until loss of function and transformation in mitochondrial related organelles (mitosomes and hydrogenosomes). Here I propose that Arcella intermedia adaptation to microarophilic environments is related to the acquisition of new genes. There are two main modes of acquisition of new genes. The traditional view, where duplication is followed by mutations and neo-functionality of the duplicate. Or genes can be acquired from other species (lateral gene transfers). The second process has a major importance in prokaryotic evolution and is probably under considered in eukaryotic evolution. I also propose in this work that genes related to anaerobic metabolism in Arcella are acquired by lateral gene transfer. However, analysis of genomic and transcriptomic data are absent for A.intermedia. Characterizing genome-scale data from eukaryotes is essential for gene discovery and for inferring transitions over the tree of life. The transcriptome dataset from this work provides the first effort of characterization of expressed sequences in A.intermedia. We used single cell from different moments of growth and whole culture RNA extraction in order to increase the diversity of metabolic moments of the cells. Mapped sequences allowed us to identify functional pathways in A.intermedia cells. In general, it seems that metabolic processes are showing up more, followed by signaling and responses to stimuli. We describe functioning of carbohydrate and energy metabolism including even an anaerobic pathway to produce energy. We found ACS-ADP and PFO genes in A.intermedia. We describe amino acid metabolism, with at least 12 amino acids metabolizing pathways described and catabolism mainly related to TCA cycle intermediates. Calcium, Ras GTPases, PI3K-AK and AMPK-mTOR are the main signaling pathways represented in transcriptomes. We described important pathways for amoeba: endocytosis and phagocytosis and it seems to be similar with the ones already described for other amoeba with a dependence on F-actin and small GTPases of Rho subfamily. We couldn\'t find lots of information about programmed cell death in A.intermedia, however cell growth are similar to pathways described for dinoflagellates. We expect that upcoming genomes will finish the description of functioning of those organisms, but we believe our work already is a good starting point. In order to gain a clearer picture of the presence of anaerobic metabolism genes in Amoebozoa, we conducted BLAST searches in Amoebozoa and Arcellinida data bases for the presence/absence of ACS-ADP, PFO and [FeFe]-H2ase. Other Arcellinida species also presented these genes, Difflugia sp., Difflugia compressa and Cyclopyxis lobostoma. Besides these, the already known Mastigamoeba balamuthi, Entamoeba histolytica and Acanthamoeba castelanii. Amoebozoa sequences don\'t form a monophyletic group in any of the three genes. However, Arcellinida sequences always grouped together. As such distinct amoeba groups have those anaerobic metabolism genes, however, most of the Amoebozoa do not. It is more likely to think of lateral transfers occurring independently among these amoeba groups, generating the possibility of occupying a new niche. The main objective of this work was to start generating tools to understand the ability of some testate amoeba to resist environmental harsh conditions. We found lots of interesting questions but the one we focused on this dissertation was (1) the evolution of anaerobic related genes in testate amoeba lineages. The assembled and annotated sequence data will be available as reference sequences, making the work with this group easier. The results can also potentially be applied as biomonitoring markers for the management of water resources. This work will improve the general knowledge on the evolution and function of freshwater organisms. We expect also to make a contribution on the understanding of the impact of lateral gene transfers in Arcellinida diversity / Arcella Ehrenberg 1832 é um dos gêneros de tecamebas mais numerosos, perten- cente aos Arcellinida. Estas são uma linhagem aeróbia de amebas tecadas que vivem em uma grande variedade de ambientes. Provavelmente, sua capacidade de sobreviver em condições tão divergentes está relacionada a algum grau de flexibilidade metabólica. Os organismos anaeróbicos ganharam e perderam vários genes relacionados ao metabolismo energético. Este processo modifica mitocôndrias clássicas até a perda da função e transformação em organelas relacionadas (mitossomos e hidrogenossomos). Aqui proponho que a adaptação de Arcella intermedia a ambientes microaerófilos está relacionada à aquisição de novos genes. Existem dois modos principais de aquisição de genes. Na visão tradicional, a duplicação gênica é responsável por gerar diversidade, seguida por mutações e neofuncionalidade da duplicata. Alternativamente, os genes podem ser adquiridos de outras espécies (transferências laterais de genes). O segundo processo tem uma grande importância evolutiva e é ainda pouco considerado na evolução eucariótica. Por isso, também proponho neste trabalho que genes relacionados ao metabolismo anaeróbico em Arcella sejam adquiridos por transferência lateral de genes. Entretanto, a análise de dados genômicos e transcriptômicos é inexistente para A.intermedia. A caracterização de dados em escala genômica de eucariotos é essencial para a descoberta de genes e para a inferência transições sobre a árvore da vida. O conjunto de dados de transcriptoma deste trabalho fornece um primeiro esforço de caracterização de sequências expressas em A. intermedia. Utilizamos extrações de célula-única em diferentes momentos de crescimento e extração de RNA de cultura inteira, a fim de aumentar a diversidade de momentos metabólicos das células. Sequências mapeadas permitiram identificar vias funcionais em células de A. intermedia. Em geral, parece que genes relacionados a processos metabo?licos são os que aparecem mais frequentemente, seguidos dos de sinalização e respostas a estímulos. Nós descrevemos a função do metabolismo de carboidratos e energia, incluindo uma via anaeróbica. Encontramos em A.intermedia os genes ACS-ADP e PFO. Descrevemos o metabolismo de aminoácidos, com pelo menos 12 vias metabólicas de aminoácidos descritas e catabolismo relacionado a intermediários do ciclo de TCA. Cálcio, Ras GTPases, PI3K-AK e AMPK-mTOR são as principais vias de sinalização representadas nos transcriptomas. Descrevemos importantes vias para amebas, que são endocitose e fagocitose. Parecem ser vias semelhantes àquelas já descritas para outras amebas, com dependência de F-actina e pequenas GTPases da subfamília Rho. Não conseguimos encontrar muitas informações sobre a morte celular programada em A. intermedia, mas o crescimento celular é semelhante com as vias descritas para os dinoflagelados. Esperamos que os próximos genomas terminem a descrição da função desses organismos, mas acreditamos que nosso trabalho já é um bom ponto de partida. A fim de obter uma visão mais clara da presença de genes de metabolismo anaeróbico em Amoebozoa, realizamos buscas no BLAST em bancos de dados de Amoebozoa e Arcellinida, para a presença/ausência de ACS-ADP, PFO e [FeFe] -H2ase. Outras espécies de Arcellinida também apresentaram estes genes, Difflugia sp, Difflugia compressa e Cyclopyxis lobostoma. Além destes, os já conhecidos Mastigamoeba balamuthi, Entamoeba histolytica e Acanthamoeba castelanii. Sequências de amebozoários não formam um grupo monofilético em nenhum dos três genes. No entanto, as sequencias de Arcellinida sempre se agrupam. Como são grupos de Amoebozoa de tal maneira distintos que possuem estes genes de metabolismo anaeróbico, e sendo que a maioria não possui, é mais provável que sejam transferências laterais independentes entre esses grupos de ameba, gerando a possibilidade de ocupar um novo nicho. O objetivo principal deste trabalho foi gerar ferramentas para entender a capacidade de algumas amebas tecadas em resistir a condições adversas do meio ambiente. Encontramos muitas questões interessantes, mas a que teve nosso foco nesta dissertação foi (1) a evolução de genes relacionados ao metabolismo anaeró?bio em linhagens de amebas tecadas. Os dados da sequência reunidos e anotados estarão disponíveis como sequências de referência, facilitando o trabalho com esse grupo. Os resultados também podem ser aplicados aos marcadores de biomonitoramento para o gerenciamento dos recursos hídricos. Este trabalho irá melhorar o conhecimento geral sobre a evolução e função de organismos de água doce. Esperamos tambem contribuir para a compreensão do impacto das transferências laterais na diversidade de Arcellinida

A popularização dos répteis no mercado pet e no meio científico amplia a necessidade por conhecimentos clínicos e fisiológicos mais adequados a classe o que, consequentemente, irá melhorar a qualidade dos atendimentos e do manejo desses animais. Destaca-se que, como cada espécie de réptil apresenta um comportamento metabólico e fisiológico distinto é necessário a realização de estudos com cada espécie em particular. Assim, buscou-se caracterizar os receptores opioides no sistema nervoso central (SNC) e os efeito sedativo e analgésico da morfina e do butorfanol em Iguana iguana. Na 1ª etapa três iguanas jovens (101 ± 6g) e saudáveis foram submetidas à eutanásia para colheita do SNC. Os tecidos de dois animais foram submetidos à técnica do RNAseq para formação de um transcriptoma de novo, para então obter-se as sequências de nucleotídeos dos receptores opioides. Já o tecido de um animal foi submetido à técnica de imuno-histoquímica (IH). Na 2ª etapa, 10 iguanas jovens (160 ± 46g) receberam cinco tratamentos, por via intramuscular e com intervalo de duas semanas entre eles: solução salina (0,3mL, CON), morfina 5 mg/kg (MOR5) e 10 mg/kg (MOR10), butorfanol 5 mg/kg (BUT5) e 10 mg/kg (BUT10). A sedação foi avaliada por meio da escala comportamental específica para iguanas e pelo teste de natação forçada, sendo este por 120 segundos. A latência do reflexo de retirada do membro (LRRM) frente ao estímulo térmico foi utilizada para avaliação antinociceptiva promovida pelos opioides. Todos os testes foram avaliados antes do tratamento (0) e com 30 minutos, 1, 2, 3, 4, 6, 12 e 24 horas pós-tratamento. Utilizou-se ANOVA e Dunnett para a comparação com o momento basal (0 minuto) e ANOVA de dois fatores e Tukey entre os grupos. As sequências gênicas compatíveis com os receptores μ (mu), κ (kappa) e δ (delta) foram identificadas, porém o teste de IH não revelou resultados confiáveis para as marcações dos receptores no SNC. Na escala comportamental apesar dos escores de sedação terem sido baixos, foi observado aumento significativo na pontuação entre 30 minutos e 2 horas em MOR5 e entre 30 minutos e 3 horas em MOR10, BUT5 e BUT10. O tempo de natação foi reduzido em MOR10 e BUT5 entre 30 minutos e 2 horas e em BUT10 a redução ocorreu entre 30 minutos e 12 horas. Todos os tratamentos proporcionaram sedação pelos dois testes com 12 horas de avaliação. Por outro lado no teste de termoalgimetria só foi observado aumento no tempo de LRRM em MOR10, entre 2 horas e 4 horas de avaliação. Conclui-se que os receptores opioides estão presentes no SNC, porém apenas κ e δ foram evidenciados na IH. Ademais, as duas doses de butorfanol e a maior dose de morfina promovem sedação, sendo que apenas 10 mg/kg de morfina promoveu antinocicepção em iguanas no presente estudo. / The increasing popularity of reptiles in the pet market and in the scientific studies requires appropriate clinical and physiological knowledge, which will consequently improve the quality of care and management of this classe. It is necessary to have studies with each species in particular because of every specie of reptile has different metabolic and physiological behavior. Therefore, it was aimed localization of opioid receptor in the central nervous system (CNS) and evaluated the sedative and analgesic effect of morphine and butorphanol in Iguana iguana. At the first stage three young (101 ± 6g) and healthy green iguanas were submitted to euthanasia for harvesting the CNS, then the tissues of two animals were submitted to the RNAseq technique for the formation of de Novo transcriptome, so we could get the nucleotide sequences of the opioid receptors obtained. The immunohistochemistry (IH) technique was use to locate the distribution of these receptors in the CNS. In the second stage, 10 young green iguanas (160 ± 46 g) received five treatments, intramuscularly and with an interval of two weeks between them: saline solution (0.3 mL, CON), morphine 5 mg/kg (MOR5) and 10 mg/kg (MOR10), butorphanol 5 mg/kg (BUT5) and 10 mg/kg (BUT10). The sedation was estimate by behavioral scale for iguanas and forced swing test, during 120 seconds. The latency of hind limb withdrawal reflex (LWR) in front of the thermal stimulus was use for antinociceptive evaluation promoted by opioids. All the tests were evaluate before treatment (0) and at 30 minutes, 1, 2, 3, 4, 6, 12 and 24 hours post-treatment. ANOVA and Dunnett were used for comparison with the baseline (0 minute) and two-way ANOVA and Tukey between the groups. We identified sequences compatible with μ (mu), κ (kappa) and δ (delta), but only κ and δ were marked in the IH of the CNS. In the behavior scale despite of low scores of sedation, it was observe a significant increase in the score between 30 minutes and 2 hour MOR5 and between 30 minutes and 3 hours in MOR10, BUT5 and BUT10. The time of swimming test was reduced in MOR10 and BUT5 between 30 minutes and 2 hours and in BUT10 the reduction occurred between 30 minutes and 12 hours. All treatment provided sedation for both tests in 12 hours of evaluation. Otherwise, the thermoalgymetry test showed increased time in LWR in MOR10 between 2 hours and 4 hours of evaluation. It concluded that the opioid receptors are present in the CNS. In addition, the two doses of butorphanol and the highest dose of morphine further sedation and only 10 mg/kg of morphine promoted antinociception in iguanas in this study.

Submitted by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:23Z No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Sara Ribeiro (sara.ribeiro@ucb.br) on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-06T11:52:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AllanPiresdaSilvaDissertacao2017.pdf: 4098983 bytes, checksum: 94ec346f3edc58586d44cec31a8597f4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 / Currently, various bacteria can be harmful to human health. Moreover, with continued use of antibiotics and development of resistance by these microorganisms, many infections became worrying, with no effective treatments available generating the need for development of other fighting molecules. In this context, the antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as an alternative in the control of infections caused by resistant microorganisms. Despite the variation in sequence levels, AMPs may present high structural conservation in specific families, especially peptides stabilized by disulfide bonds. Canonically, the identification of PAMs is by exploitation of bioactive natural extracts and subsequent analysis and purification thereof. In the post genomics era, in turn, identifying PAMs could be made from databases using molecular modeling of peptides in direct search. In this work were selected AMPs without structure in PDB, from antimicrobial peptide database (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). The sequences were pre-filtered, being selected two AMPs (myticin B and MiAMP-2b) of classes described with modifications in disulfide bonds pattern arrangement. Additionally, the original bank was submitted to STPs identification. PredSTP was used as an additional evaluation. After prefiltering phases, a new potential STP (CRS4C-2b) with a new hypothetical structural topology was modelled by QUARK and simulated at 300 ns molecular dynamics, maintaining the initial structure. The methodology was then applied to identify PAMs in the Zantedeschia aethiopica transcriptome where two new potential PAMs were found that were predicted to be active by CAMP. Thus, the two methodologies developed here can be successfully applied in the identification of new PAMs and in the analysis of the structural diversity of antimicrobial families. / Atualmente, v??rias bact??rias podem ser prejudiciais ?? sa??de humana. Al??m disso, com o uso cont??nuo de antibi??ticos, e desenvolvimento de resist??ncia por parte desses microrganismos, muitas infec????es se tornaram preocupantes, sem tratamentos eficazes dispon??veis gerando a necessidade de desenvolvimento de outras mol??culas de combate. Nesse ??mbito, os pept??deos antimicrobianos (PAMs) t??m sido propostos como uma alternativa no controle de infec????es causadas por microrganismos resistentes. Apesar da variabilidade nas sequ??ncias, os PAMs podem apresentar grande conserva????o estrutural em fam??lias espec??ficas, principalmente em pept??deos estabilizados por pontes dissulfeto. De forma can??nica, a identifica????o de PAMs se d?? pela explora????o de extratos naturais bioativos e posterior an??lise e purifica????o dos mesmos. Na era p??s-gen??mica, por sua vez, a identifica????o de PAMs pode ser feita a partir de bancos de dados utilizando modelagem molecular na busca direta de pept??deos. Nesse trabalho foram selecionados PAMs sem estrutura no PDB, a partir do banco de dados de pept??deos antimicrobianos (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Desta forma, as sequ??ncias foram pr??-filtradas, sendo selecionados dois PAMs (miticina B e MiAMP-2b) de classes descritas com varia????o na disposi????o ou padr??o de pontes dissulfeto. Al??m disso, o banco original foi submetido ?? identifica????o de STPs. Para tal, o servidor PredSTP foi utilizado como avalia????o adicional. Ao final das etapas de pr??-filtragem, um novo potencial STP (CRS4C-2b) com uma nova topologia estrutural foi modelado pelo QUARK e simulado em din??mica molecular, mantendo a estrutura inicial. A metodologia foi ent??o aplicada para identifica????o de PAMs no transcriptoma de Zantedeschia aethiopica onde foram encontrados dois novos potenciais PAMs que foram preditos como ativos pelo CAMP. Dessa forma, as duas metodologias desenvolvidas aqui podem ser aplicadas com sucesso na identifica????o de novos PAMs e na an??lise de diversidade estrutural de fam??lias antimicrobianas.

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico, que invade tecidos queratinizados causando infecções superficiais e cutâneas. Algumas drogas são usadas para o tratamento das dermatofitoses, sendo o ácido undecanóico (AUN) uma delas. O AUN é o mais tóxico dos ácidos graxos saturados de cadeia média, utilizado como medicamento de uso tópico. O estudo de expressão gênica e mecanismos regulatórios são fundamentais para ampliar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta à exposição a estes agentes citotóxicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos no processo adaptativo da exposição ao ácido undecanóico, através da análise global do transcriptoma e mecanismos regulatórios como o processamento alternativo. Para tanto o micélio de T.rubrum foi submetido ao ácido undecanóico por 3 e 12 h de exposição, em triplicata biológica, e o RNA resultante foi submetido ao sequenciamento por RNAseq. O sequenciamento gerou aproximadamente 58 milhões de reads por biblioteca, as quais foram filtradas e alinhadas com o genoma de referência utilizando-se os softwares FASTQC e bowtie2, respectivamente. A análise de expressão gênica diferencial foi feita por meio do pacote do Bioconductor DESeq e, para esta análise, foi utilizada a amostra de 0h como referência. Foram identificados 492 genes diferencialmente expressos em resposta ao AUN, sendo 385 e 210 genes modulados em resposta a 3 e 12 horas de exposição, respectivamente. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares envolvendo transporte transmembrana, degradação de xenobióticos, metabolismo de lipídeos e aminoácidos, secreção de enzimas proteolíticas e patogênese, sugerindo que o AUN ativa duas principais vias de sobrevivência em resposta a este agente estressor, a degradação e o efluxo da droga. Posteriormente, foram realizadas as análises de processamento alternativo quanto ao uso diferencial de exons por meio do algoritmo HTSeq e DEXSeq e retenção de introns utilizando-se algoritmos construídos na linguagem Perl. Os genes envolvidos em algum tipo de processamento alternativo estão relacionados com funções metabólicas variadas como tradução, transporte vesicular, metabolismo lipídico, biogênese ribossomal, sequência de ligação ao DNA, regulação da transcrição e processamento do pré-mRNA. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta de sobrevivência perante a exposição ao AUN. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous fungus, anthropophilic that invades keratinized tissue causing superficial infections on the skin. Some drugs are used for the treatment of dermatophytosis, being the undecanoic acid (AUN) one of them. The AUN the most toxic of the saturated medium chain fatty acids, is used as a topical medicine. The study of gene expression and the regulatory mechanisms are fundamental to understand the molecular mechanisms involved in response to exposure of these cytotoxic agents. So, the aim of this study was to characterize the molecular mechanisms involved in the adaptive process of the exposure to undecanoic acid, by the global analysis of the transcriptome and regulatory mechanisms such as alternative splicing. To this end, the mycelium of T. rubrum was exposed to undecanoic acid for 3 or 12 hours in biological triplicate, and the resulting RNA was sequenced by RNA-Seq. The sequencing generated approximately 58 million of reads per library, which were filtered and aligned with the reference genome using the softwares and Bowtie2 and FASTQC, respectively. The analysis of differential gene expression was performed through the Bioconductor package DESeq and, for this analysis, we used as reference sample the 0h time. We identified 492 differentially expressed genes in response to UDA, being 385 and 210 genes modulated in response to 3 and 12 hours of exposure, respectively. These genes are related to various cellular processes involving the transmembrane transport, xenobiotics degradation, lipids and amino acids metabolism, secretion of proteolytic enzymes and pathogenesis, suggesting the activation of two major survival pathways in response to this stressor, degradation and drug efflux, by UDA. Also, the alternative splicing analysis was performed through the differential use of exons using the algorithms HTSeq and DEXSeq and intron retention using algorithms built in Perl language. The genes involved in some kind of alternative splicing are associated with various metabolic functions such as translation, vesicular transport, lipid metabolism, ribosomal biogenesis, DNA binding sequence, transcription regulation and processing of pre-mRNA. These results contribute to increase the knowledge of the molecular mechanisms involved in the survival response upon exposure to the AUN.

INTRODUCTION: Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and metastatic dissemination is the principal factor related to death by this disease. Breast cancer stem cells (bCSC), defined in this work as the ALDH1high/LIN-/ESA+ population, are thought to be responsible for metastasis and chemoresistance. The objective of this work is to find gene master regulators, in particular transcription factors (TFs), which are controlling the bCSC phenotype. METHODS: We used in this work two groups of datasets with transcriptome data, the discovery dataset group contains one dataset obtained by ourselves containing three paired samples comparing the bCSC and the bulk of the tumor (My Data - bCSC/Bulk dataset), a dataset with eight paired samples comparing the bCSC and cancer cells (Wicha - bCSC/CC dataset) and a dataset with 115 samples of breast cancer tissue (clinical response dataset). The second group, validation datasets, contains the BRCA-TCGA dataset with information of 621 samples, 4142 breast cancer samples of the Kmplot tool, 17 primary samples of BasL subtype and their information of grafting in patient derived xenografts and analyzes of cell lines (MF10A and HMLE). For the analyzes we used the paired t-test in the Limma R package, the ARACNE algorithm for the inference of regulons in the clinical response dataset, MRA-FET to define the master regulators of the bCSC phenotype, and GSEA to identify the biological meaning of the findings in the different datasets. RESULTS: We identified 12 TFs as master regulators of the bCSC phenotype, with nine of them forming two highly interconnected networks, one positively related with the bCSC phenotype formed by SNAI2, TWIST, PRRX1, BNC2 and TBX5 with its regulons, defined here as the mesenchymal transcription network and one negative correlated to the phenotype formed by SCML4, ZNF831, SP140 and IKZF3, defined as the immune response transcription network, totally unknown in the context of breast cancer in the literature. Although still with weak evidence, ZEB1 seems to control the two networks and can be responsible for the expression of ALDH1 and of the three remaining TFs: ID4, HOXA5 and TEAD1. As their names portray, our data showed in the different datasets, and independently of the molecular subtype and of the platform used, that the mesenchymal transcription network seems to be responsible for the bCSC phenotype and the immune response transcription network to the adaptive immune response in the tumor and a better prognosis for the patients. We also defined 10 membrane proteins as new markers and/or therapeutic targets of the bCSC. CONCLUSION: We found and described two TF networks that seem to control the bCSC phenotype, one of them totally unknown until now and correlated to a good prognosis. Our findings have a clear potential for clinical use. / INTRODUÇÃO: O cancer de mama é no mundo o câncer mais comum em mulheres e a disseminação metastática é o principal fator relacionado com a morte pela doença. Acreditasse que as células tronco do câncer de mama - bCSC, na sigla em inglês e definida neste trabalho com a população ALDH1high/LIN-/ESA+ - é responsável pela metástase e pela quimioresistência. O objetivo deste trabalho é encontrar genes que são essenciais para o controle do fenótipo das bCSC, em particular fatores de transcrição. MATERIAIS E MÉTODOS: Nesse trabalho nós utlizamos dois grupos de datasets com dados do transcriptoma, o grupo de datasets de descoberta contém um dataset gerado por nós com 3 amostras pareadas comparando as bCSC com o tumor total (My Data - bCSC/Bulk dataset), um dataset com 8 amostras pareadas comparando as bCSC com as células cancerígenas (Wicha - bCSC/CC dataset) e um dataset com 115 amostras de tecido de câncer de mama (Clinical Response dataset). O segundo grupo, grupo de validação, contém o dataset BRCA-TCGA com 621 amostras, as 4142 amostras de câncer de mama da ferramenta Kmplot, as 17 amostras humanas primárias do subtipo BasL e sua informação sobre a geração, ou não, de tumores em camundongos imunosuprimidos e a análise de linhagens celulares (MF10A e HMLE). Para a análise dos dataset utilizamos o test-t pareado no pacote Limma da liguagem R, o algoritmo ARACNE para a inferência de regulons no dataset Clinical Response, a análise MRA-FET para definir os Reguladores Mestres para o fenótipo das bCSC e a análise GSEA para identificar o significado biológico de nosso achados nos diferentes datasets. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Nós identificamos 12 TFs como reguladores mestres, com 9 deles formando duas redes altamente conectadas, uma positivamente relacionada ao fenótipo bCSC formada por SNAI2, TWIST, PRRX1, BNC2 e TBX5 com seus regulons, e definida aqui como a rede de transcrição mesenquimal, e uma rede correlacionada negativamente, formada por SCML4, ZNF831, SP140 e IKZF3, definida aqui como a rede de transcrição da resposta imune e totalmente desconhecida da literatura no contexto do câncer de mama. Embora ainda com fraca evidencia, ZEB1 para controlar as duas redes e ser responsável pela expressão de ALDH1 e dos 3 TFs restantes: ID4, HOXA5 e TEAD1. Como mostram seus nomes, e independente do dataset, do subtipo molecular ou da plataforma utilizada, a rede de transcrição mesenquimal, parece ser responsável pela manutenção do fenótipo de células tronco cancerígenas e a rede de transcrição da resposta imune pela resposta imune adaptativa ao tumor e a um bom prognóstico para as pacientes. CONCLUSÃO: Nós encontramos e descrevemos duas redes de fatores de transcrição que parecem controlar o fenótipo das bCSC, uma delas totalmente desconhecida até agora e relacionada a um bom prognóstico. Nosso achados possuem um claro potencial para uso clínico.

Ácaros Brevipalpus yothersi Baker (1949) são vetores do citrus leprosis virus C (CiLV-C), o mais comum causador da leprose dos citros. Esta é considerada, atualmente, a doença viral de maior importância na cultura dos citros no Brasil e ocorre também em países da América do Sul e Central, além do México, na América do Norte. A doença prejudica a vida útil da planta, devido à queda de folhas e frutos, e seca de ramos, podendo levá-la à morte quando o ataque é demasiadamente severo. O controle e manejo da leprose são basicamente atribuídos ao uso de acaricidas, demandando dos produtores um acréscimo significativo no orçamento por defensivos agrícolas e potencial risco ao ambiente. Nos últimos anos, análises de expressão gênica (transcriptoma), envolvendo ácaros praga da agricultura, resultaram em informações importantes como o envolvimento de genes específicos no processo de resistência a acaricidas e desenvolvimento biológico. No entanto, ainda pouco se sabe sobre a interação do ácaro B. yothersi com o CiLV-C, tornando o estudo de transcriptoma muito significativo para a obtenção de informações aprofundadas sobre o atípico padrão vírus-vetor do patossistema leprose. Assim, através do sequenciamento de RNA (RNAseq), foi investigado o perfil de expressão diferencial entre ácaros B. yothersi virulíferos e avirulíferos. O RNAseq foi realizado em sistema Illumina HiSeq 2500, e os dados analisados com base em linguagem R e ferramentas do software Bioconductor. Os reads sequenciados foram mapeados no genoma de B. yothersi e foi feita análise de expressão utilizando DESeq2. Foram observados 5.690 genes diferencialmente expressos (GDE), sendo 2.736 transcritos induzidos em ácaros virulíferos. Os GDE foram analisados em banco de dados do NCBI, buscando por proteínas similares em artrópodes. Dentre os transcritos induzidos em B. yothersi, potencialmente em resposta ao CiLV-C, foram encontrados genes relacionados ao processo de detoxificação de xenobióticos, metabolismo primário e imunidade, com possível envolvimento na interação vírus-vetor. A expressão de 23 genes foi verificada por RT-PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). As análises indicaram que os genes envolvidos em detoxificação são induzidos durante a interação entre o ácaro da leprose e o CiLV-C. / The false spider mite Brevipalpus yothersi Baker (1949) is recognized as vector of citrus leprosis virus C (CiLV-C), the most common causal agent of citrus leprosis disease. Currently, it is considered the viral disease of major importance in citrus in Brazil and occurs in countries of South and Central America, as well as in Mexico, North America. It reduces the lifespam of the plants due to leaf and fruit drop, dried branches, and can lead to death when the attack is severe. The management of leprosis is based primarily on the chemical control of the mite vector, increasing significantly the cost of production and harming the environment. On the last years, gene expression (transcriptome) analyzes involving phytophagous mites resulted in important data, such as the involvement of specific genes in the process of resistance to acaricides and biological development. However, there is little information about B. yothersi-CiLV-C interaction, making the transcriptome a very interesting tool to obtaining data regarding the atypical virus-vector relationship of the leprosis pathosystem. RNA sequencing (RNAseq) was used to investigate the differential expression profiles between viruliferous and aviruliferous B. yothersi mites. The RNAseq was performed using the Illumina HiSeq 2500 system, the data were analyzed using the R language and Bioconductor software packages. The sequenced reads were mapped on the genome of B. yothersi and expression analysis was performed in DESeq2. We identified 5.690 differentially expressed genes (DEGs), of which 2.736 transcripts were induced in viruliferous mites. The DEGs were analyzed in NCBI database, searching for similar proteins in arthropods. Among the transcripts induced in response to CiLV-C, there are genes related to the detoxification of xenobiotics, primary metabolism, immunity and possible involvement in the virus-vector interaction. Expression of 23 genes was verified by quantitative real-time RT-PCR (RT-qPCR). The analyzes indicate that detoxification genes are induced during the interaction between the false spider mite and CiLV-C.