Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-06-02T18:06:52Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marillia Lima Costa - 2015.pdf: 1565311 bytes, checksum: 86f8a5df962df3ead1d2920fbee77ac8 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-06-03T11:22:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marillia Lima Costa - 2015.pdf: 1565311 bytes, checksum: 86f8a5df962df3ead1d2920fbee77ac8 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T11:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marillia Lima Costa - 2015.pdf: 1565311 bytes, checksum: 86f8a5df962df3ead1d2920fbee77ac8 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5) Previous issue date: 2015-11-19 / Chagas disease, American trypanosomiasis, is a zoonosis caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. At moment, there are about 6 to 8 million people infected in Latin America, 2 to 3 million brazilians and 6.000 annual deaths. The aim of these study is identify the actual situation of Chagas disease in the state of Goiás, central Brazil. This is a population, retrospective and descriptive study, with a data analysis about reported cases related to infection by T. cruzi in Goiás, between 2009 and 2014, collected in association with Department of Health, Health System, Expert Assistance Service, Protection Program Pregnant, Public Blood Centers of the state. The prevalence of infection in pregnant women attended by state from 2009 to 2014 was 0,25%. Of these, 49,60% resides in Goias’ central region, 54,07% have aged between 31 to 40 years, 59,55% refers itself as brown, 52,46% were in the first trimester of pregnancy at the time of diagnosis, and there is statistical difference between pregnant with and without serology for T. cruzi when they had more than one abortion. In prospective blood donors, were identified 644 (0,49%) individuals that carries T. cruzi, in all Goiás’ blood centers and there is no reported case related to acute phase Chagas Disease. In patients with positive sorology for HIV, in micro southwestern state, only one patient has positive sorology for T. cruzi in Jataí city. The study pointed a low prevalence in individuals with T. cruzi and this analysis will be useful for the creation of actual profile of these ones. The analysis will serve as a basis for creating the transmission control measures, and the treatment of the disease. / A doença de Chagas, ou tripanossomíase americana, é uma zoonose causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Atualmente, existem de 6 a 8 milhões de pessoas infectadas na América Latina, com estimativa de infecção em 2 a 3 milhões de brasileiros e de 6.000 mortes anuais. Objetivou-se, com este trabalho, reconhecer o atual panorama da doença de Chagas no estado de Goiás. Trata-se de um estudo populacional, retrospectivo e descritivo, com a análise de dados referentes a casos confirmados de infecção por T. cruzi e sorologia positiva para o mesmo, em todo o estado de Goiás, no período de 2009 a 2014, coletados em parceria com a Secretaria de Saúde, o Sistema Único de Saúde (DATASUS), Serviço de Assistência Especializada (SAE), Programa de Proteção à Gestante (PPG) e ao Hemocentro do Estado de Goiás (HEMOGO). A prevalência da infecção nas gestantes atendidas pelo estado no período de 2009 a 2014 foi de 0,25%. Destas, 49,60% residem no centro goiano, 54,07% possuem faixa etária de 31 a 40 anos, 58,55% se autoreferem parda, 52,46% se encontravam no primeiro trimestre de gestação no momento do diagnóstico. Existe diferença estatística entre gestantes com sorologia positiva e negativa para T. cruzi quando estas tiveram mais de 01 aborto. Nos candidatos a doadores de sangue, foram identificados 644 indivíduos portadores do T. cruzi (0,49%) e não foram encontrados registros de notificação de casos da doença de Chagas aguda no período de 2009 a 2013. Dos pacientes HIV+ da microrregião sudoeste do estado com sorologia positiva também para o T. cruzi, foi identificada apenas uma paciente no município de Jataí. O estudo apontou para uma baixa prevalência de portadores do T. cruzi e a análise será útil para criação de um perfil atual desses indivíduos. A análise servirá como base para a criação de medidas de controle da transmissão e tratamento da doença.

Um estudo caso-controle para investigar possíveis fatores de risco associados à infecção pelo Trypanosoma cruzi foi realizado em crianças de zona rural, dos municípios de Posse, Simolândia e Guarani de Goiás, localizados na região nordeste do Estado de Goiás. Os participantes do estudo foram selecionados entre 1.990 crianças de 7 a 12 anos de 60 escolas rurais, mediante triagem sorológica com coleta de sangue em papel de filtro por 3 técnicas: Imunofluorescência Indireta, Hemaglutinação Indireta e ELISA. Cento e quarenta e nove (149) crianças com presença de anticorpos anti-T. cruzi em pelo menos 2 testes realizados em amostras de sangue venoso e uma amostra aleatória de 298 crianças soronegativas para os 3 testes, pareadas por sexo, freqüência de idade e comunidade foram incluídas no estudo, respectivamente como Casos e Controles. As moradias dos casos e controles foram visitadas para obtenção de informações sobre presença de vetores na unidade domiciliar, características do domicílio, da família e do ambiente peridoméstico. Nessa ocasião foram coletadas amostras de sangue dos pais dos participantes do estudo. Casos e controles foram comparados em relação a fatores de risco relativos ao ambiente doméstico, peridoméstico e sorologia dos pais. Um segundo banco de dados foi construído com apenas um participante por moradia, correspondendo a 89 moradias de casos e 278 de controles. O modelo de regressão logística condicional foi empregado para controlar as principais variáveis de confusão. Sensibilidade de variáveis preditoras da casa da criança infectada foi também calculada. Uma associação estatisticamente significante foi encontrada entre criança soropositiva e evidência de vetor, ou seus vestígios, no domicílio. A presença de exúvia foi o maior preditor de criança infectada (OR=3,5; LC95 por cento 2,1-5,8), enquanto a presença de vetor sem detecção de vestígios não esteve associada à criança infectada. A identificação de triatomíneos pelos moradores apresentou OR=7,7 (LC95 por cento 2,3-25,5). A infecção em crianças esteve significativamente associada ao número de pessoas residentes na moradia atual. Uma maior proporção de pessoas soropositivas foi detectada nas casas dos casos quando comparada às casas do grupo controle sugerindo uma possível agregação familiar da soropositividade. Características peridomésticas foram semelhantes entre casos e controles, não havendo diferenças de OR entre os dois grupos. Detectou-se associação significativa entre mãe soropositiva e filho soropositivo (OR=3,6; LC95 por cento 2, 1-6,5), indicando a possibilidade da transmissão congênita ou um potencial efeito prejudicial exercido pela soropositividade de mães de recém-nascidos não infectados congenitamente. Entretanto, a associação entre pai infectado e filho infectado não foi estatisticamente significante (OR=1,6; LC95 por cento 1,0-2,7). O relato de vetores pelos moradores mostrou uma sensibilidade de 97,5 por cento em predizer moradia de criança soropositiva. Os aspectos relativos à aplicação da metodologia caso-controle no estudo da infecção pelo T. cruzi e possíveis medidas de vigilância e controle para a região de estudo são discutidos. / A population-based case-control study was conducted in a rural endemic area under routine vector surveillance with the objective of investigating the role of environmental characteristics, family and household factors regarding the risk of T. cruzi infection in childhood. One thousand nine hundred and ninety schoolchildren, aged 7-12 years, corresponding to 82 per cent of students enrolled in 60 village primary schools in three contiguous rural counties in Northeast Goiás were screened for T. cruzi infection between March and September, 1991. Blood samples collected on filter paper were tested by indirect haemagglutination (IHA), indirect immunofluorescence (IIF) and enzyme immunosorbent assay (ELISA) and further confrrmed by testing venous blood samples. Cases were 149 children out of the 158 (7.9 per cent ) positive children to anti-T. cruzi antibodies by at Ieast two serological tests. For each case, 2 seronegative controls were selected among classmates, matched by age (+I- 1 year) and sex. Socio-economicál and environmental factors possibly associated with the risk of T. cruzi transmission were recorded by interviewing parents of cases and controls. Domestic and peridomestic entomological evaluation was done by using pyrethrum às a flushing out agent. A venous blood sample was taken from parents of cases and controls to.be tested for anti-T. cruzi antibodies by the same three techniques. Cases and matched controls were compared regarding three groups of variables: parents\' serology, housing characteristics and peridomestic environment. To control for common exposures among household members and to avoid cluster of seropositive, further analyses were also performed considering only one case and one control per household (89 households of case and 278 households of controls). Conditional logistic regression models (CLR) were used to control for confounding variables and the sensitivity in identifying a house with a positive child was also estimated. Triatomine infestation or evidence of triatomine colonization in the houses were found to be statistically associated to children seropositivity. The presence of exuviae was the strongest predictor of infected children (OR=3.5; 95 per cent CL 2.1-5.8). Parents who reported triatomine bugs inside or outside the house in the last 5 years had odds ratio of 7.7 (95 per cent CL 2.3-25.5) of having an infected child. There was an increased risk of seroreactivity among children associated to the number of family members. Higher proportion of seropositive individuais was found in the household of cases when compared to the household of controls, suggesting familial aggregation. Cases and controls shared similar environmental and peridomestic characteristics. A strong association was found between mother\'s serology and child anti-T. cruzi antibodies (OR=3.6; 95 per cent CL 2.1-6.5) but no statistical association was found between seropositivity of father and child serology (OR=l.6; 95 per cent CL 1.0-2.7). Similar results were obtained after excluding cases and controls living in the same household. The possibility oftransplacental T. cruzi transmission and its implication for Chagas disease control was considered. Among the variables used as predictors of a house with a seropositive child the report of vector presence by householders showed a 97.5 per cent sensitivity. The capture of triatomine vectors in the dwelling was not correlated to a seropositive house. The methodological issues regarding case-control approach in T. cruzi infection and public health interventions for the study area were discussed.

A doença de Chagas representa um grave problema de saúde em regiões endêmicas que vão desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina. O protozoário tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi é o agente causador dessa devastadora doença, que afeta milhões de pessoas. Existem em torno de 10 milhões de indivíduos contaminados e pelo menos 25 milhões de pessoas vivem em locais riscos de infecção. Os dois medicamentos, o nifurtimox e o benzonidazol, apresentam sérios efeitos colaterais além de se mostrarem ineficazes na fase crônica da doença. Esse triste perfil, felizmente, tem se alterado com recentes avanços que levaram o ravuconazol, pozaconazol e K11777 para estudos em fase clínica. Com base em seu papel fundamental no ciclo do T. cruzi, a sexta enzima da via glicolítica, a gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) vem sendo considerada um alvo promissor para a descoberta e o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos para o tratamento da doença de Chagas. É amplamente conhecida a importância do planejamento de compostos tanto por método baseado na estrutura do alvo quanto do ligante. A docagem molecular foi usada para a seleção inicial dos compostos para o teste biocalorimétrico, e a partir dessa estratégia foi possível, de 25 compostos. Os parâmetros cinéticos da catálise da TcGAPDH foram determinados (KM = 10,51 ± 0,91 µM, Vmax = 4,18 ± 0,09 x 10-4 mM s-1 e kcat = 85,88 ± 3,22 s-1). Os experimentos cinéticos por ITC possibilitou na identificação de cinco compostos bioativos, sendo três com constante de inibição abaixo de 100 µM (13,21 ± 0,88, 35,00 ± 1,70 e 78,45 ± 2,69 µM). Processos de simulação de dinâmica molecular foram aplicados para a predição do modo de interação dos três compostos com Ki app menores que 100 µM. / Chagas disease is a serious health problem in endemic regions ranging from the southern the United States to Argentina. The protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent of this devastating disease that affects millions of people. Exist about 10 million people infected and at least 25 million people live in risk of local infection. There are only two drugs used to treat Chagas disease during acute phase and it show harmful side effects. This gloomy outlook has changed due to major advances in research of anti-trypanosomatid agents; an example is posaconazole, ravuconazole and K11777 both, which currently is in clinical phase. A promising target that is receiving considerable attention is the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH, EC 1.2.1.12) a key protein in the glycolytic pathway of trypanosomatids. SBVS methods were used for the selection of 25 compounds and these were assayed against GAPDH using Isothermal Titration Calorimetry. The kinetic parameters of catalysis were determined TcGAPDH (KM = 10.91 ± 0.91 µM, Vmax = 4.18 ± 0.09 x 10-4 mM s-1 and kcat = 85.88 ± 3.22 s-1). The kinetic experiments by ITC allowed the identification of five bioactive compounds, three with inhibition constant below 100 µM. Simulation process of molecular dynamics were applied to predict the mode of interaction for the three compounds with Kiapp less than 100 µM.

A doença de Chagas é uma das principais Doenças Tropicais Negligenciadas (DTNs) e considerada um importante problema de saúde pública, pois acomete milhares de pessoas e outras, permanecem expostas ao risco de infecção. É descrito que as terapias disponíveis baseadas no benzonidazol e nifurtimox, provocam severos efeitos colaterais, além de possuírem baixa eficácia durante a fase crônica da doença. Estudos fitoquímicos relatam que o oleorresina de copaíba, extraído de árvores do gênero Copaífera, é constituído por diversos terpenos que apresentam alta atividade e seletividade contra Trypanosoma cruzi. Portanto, na busca de moléculas alternativas para tratamento dessa patologia, o objetivo deste trabalho consistiu em determinar o potencial tripanocida in vitro de derivados semissintéticos, obtidos a partir dos terpenos óxido de cariofileno e ácido copálico. O ácido copálico foi obtido por métodos cromatográficos, porém devido às dificuldades encontradas durante a execução do trabalho, não foram obtidos derivados semissintéticos a partir dessa substância embora, algumas das metodologias propostas proporcionaram a obtenção do diterpeno ácido 19-ent-cauranóico, pouco descrito na literatura. As reações de síntese para o óxido de cariofileno resultaram em oito derivados semissintéticos (D1 a D8). Logo, no presente trabalho foram determinadas as atividades biológicas in vitro dos seguintes compostos: óleo de copaíba, ácido 19-ent-cauranóico, ácido copálico, óxido de cariofileno, os derivados D1 a D7 e benzonidazol. D8 foi instável a presença de luz. A atividade citotóxica dos compostos foi avaliada sobre a linhagem celular de mamífero LLC-MK2 e os ensaios tripanocidas, obtidos sobre as formas epimastigotas e tripomastigotas das cepas Y e Bolívia. Todas as substâncias apresentaram citotoxicidade moderada, porém as modificações estruturais em D1, D2, D3 foram importantes por reduzir o efeito tóxico sobre células LLC-MK2. Os derivados semissintéticos do óxido de cariofileno apresentaram maior atividade sobre as formas evolutivas de T. cruzi quando comparados ao produto bruto. Além disso, a ação da maioria dessas substâncias demonstrou ser mais seletiva para os parasitos do que para células de mamífero. Deve-se destacar que a estrutura química de D3 mostrou-se promissora, pois os resultados indicaram que o derivado foi efetivo tanto para reduzir a citotoxicidade quanto por ser ativo para ambas as formas das cepas Y e Bolívia. Os dados obtidos neste trabalho confirmam a efetividade da química orgânica sintética como um mecanismo ímpar para potencializar a ação de substâncias terapeuticamente úteis, de modo que estudos posteriores serão realizados a fim de determinar a atividade desses novos compostos em protocolos in vivo, bem como determinar os possíveis mecanismos de ação dos mesmos, sobre estruturas biológicas ou rotas metabólicas do protozoário T. cruzi. / Chagas\' disease is one of the most important tropical neglected diseases in global public health, affecting thousands of people, and exposing other ones to the infection risk. According to the literature, therapies with benznidazole and nifurtimox cause serious side effects, and show low efficacy during the chronic phase of the disease. Phytochemical studies showed that copaiba oils obtained from threes of Copaifera genus present several terpenes that show high activity and selectivity against Trypanosoma cruzi. In order to search alternative molecules for this treatment, the aim of this study was to determine the in vivo potential trypanocidal effect of semisynthetic derivatives obtained by the terpenes caryophyllene oxide and copalic acid. We obtained copalic acid by chromatographic methods but due some difficulties during the procedure, we could find no semisynthetic derivatives from this substance besides, some purposed methodologies allowed the obtaining of the diterpene acid 19-ent-cauranoic that was not commonly described on the literature. The synthesis reactions for caryophyllene oxide resulted in eight semisynthetic derivatives (D1 to D8). So, we could determine the in vivo biological activities of the following compounds: copaiba oil, acid 19-ent-cauranoic, copalic acid, caryophyllene oxide, D1 to D8 derivatives, and Benznidazole. D8 was unstable in the presence of light. Cytotoxic activities of the compounds were evaluated by cellular mammal strain LLC-MK2 and trypanocidal activity assays, obtained from epimastigotes and trypomastigotes forms of Bolivia and Y strains. All the substances showed high activity on the evolutive forms of T.cruzi when compared with the row product. Besides, the action of great part of the substances has been shown more selectivity for parasites than the mammals´ cells. The test results of chemical structure of D3 showed that its derivative was effective for both cases reducing the toxicity, and being active for Bolivia and Y strains. Obtained data confirmed the effectiveness of the synthetic organic chemistry as a very important way to increase the action of substances therapeutically so useful that posterior studies will be accomplished in order to determine the activity of these new in vivo compounds protocols, as well as to indicate its possible action mechanisms on biological structures or metabolic routes of the protozoa T. cruzi.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), mais de um bilhão de pessoas estão infectadas com uma ou mais doenças tropicais endêmicas encontradas especialmente entre as populações pobres da África, Ásia e América Latina. Nos últimos 25 anos, apenas 1% de todos os medicamentos desenvolvidos no mundo foram destinados ao tratamento de doenças tropicais, como a doença de Chagas. A doença de Chagas é causada por um protozoário intracelular, o Trypanosoma cruzi, e atualmente apenas dois compostos tem sido empregados para tratamento etiológico da doença de Chagas: nifurtimox e benznidazol. Entretanto, ambos os compostos apresentam considerável toxicidade sistêmica. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver complexos híbridos de rutênio, com potencial atividade tripanocida, que possam atuar com maior eficácia em sítios biológicos específicos do Trypanosoma cruzi e com reduzida toxicidade sistêmica. Para tal efeito, moléculas com conhecida atividade microbicida como derivados aminoglicosídeos, óxido nítrico e benznidazol foram coordenados a complexos de rutênio originando as espécies Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6. Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de absorção no UV-vis e FTIR, espectrometria de massa, análise elementar, voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial. Nossos estudos sugerem que os complexos Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 e cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 apresentam propriedades químicas que suportam o sucesso da coordenação dos ligantes ao íon metálico rutênio(II) ou (III). Dentre todos os compostos estudados, cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6, apresentou maior potência tripanocida desprovida de citotoxicidade, a julgar pelos estudos in vitro. IC50 foi ao redor de 0,24 ?mol.L-1, o que é 47 vezes menor do que a droga comumente usada em tratamento de Doença de Chagas. Isto determinou avaliação in vivo, no que foi observado aumento da sobrevida dos animais infectados com tripomastigotas, para 60 dias. Os estudos desenvolvidos com complexos de rutênio no presente trabalho reafirmam o sucesso na obtenção de tais complexos inicialmente propostos, implementando importantes informações e perspectivas no que diz respeito a complexos nitrosilos de rutênio e seus potenciais terapêuticos na doença de Chagas. / Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. The compounds were characterized by UV-vis absorption spectroscopy, FTIR, mass spectrometry, elemental analysis, and cyclic voltammetry and differential pulse voltammogram. The chemical characterization presented in this work gave evidencie that support the coordination of biological ligand in ruthenium ion such as in Ru(desoxiestreptamina), Ru(neamina), cis-[Ru(bpy)2(Bz)(NO)](PF6)3 and cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 complexes. Subsequently, in vitro and in vivo studies have been conducted evaluating the cytotoxicity and trypanocidal activity of the ligands and ruthenium complexes. In vitro analysis suggested us that ruthenium complexes are greatly effective against T. cruzi. Among all complexes synthesized cis-[Ru(NO2)(bpy)2(Bz)]PF6 showed higher in vitro trypanocidal activity, which has determined the in vivo assays with this compound. IC50 was around 0,24 ?mol.L-1, which is 47 times less than usual drugs used in Chagas diseases treatment. This was performed using animals infected with T. cruzi in trypomastigote form, animal survivals until 60 days. The studies developed for ruthenium complexes reaffirm the success in obtaining of the complexes originally proposed, implementing important information and perspectives regarding the nitrosyl ruthenium complex and its therapeutic potential in Chagas disease.

trans-Sialidase de Trypanosoma cruzi (TcTS) pertence à família de glicoproteínas de superfície do parasita e constitui um dos poucos exemplos naturais de glicosiltransferases superficiais encontradas em eucariotes. T. cruzi é incapaz de sintetizar ácido siálico e utiliza esta enzima para retirar este monossacarídeo de glicoconjugados do hospedeiro para sialilar moléculas aceptoras, como mucina-GPI (glicosilfosfatidilinositol), presentes na sua membrana plasmática. Esta enzima é específica em catalisar, preferencialmente, a transferência de ácido siálico para moléculas de mucina, originando ligações -2,3 com moléculas de galactose aceptoras na superfície do parasita. Considerando a heterogeneidade das moléculas de mucina de T. cruzi, é necessário que novas moléculas sejam sintetizadas a fim de que estas atuem como substratos glicopeptídicos, os quais podem levar ao melhor entendimento das interações entre enzima e substratos e permitir o planejamento racional de inibidores seletivos. Por isso, o trabalho foi divido em três rotas sintéticas: (i) preparação do doador de galactose, (ii) preparação dos aceptores-doadores e (iii) acoplamento dos dissacarídeos com aminoácidos aceptores para obtenção dos blocos de construção. Apesar dos objetivos propostos inicialmente não terem sido totalmente alcançados, o trabalho desenvolvido durante esse período permitiu a síntese do doador de galactose (3) em três etapas, aceptor de galactose (6) em cinco etapas, dissacarídeo (11) na glicosilação de 6 com 3, aminoácidos aceptores (13 e 14) e também dos blocos de construção (17 e 18) decorrente do acoplamento de 11 com os aminoácidos aceptores. Não obstante, é importante ressaltar que apesar da extensa rota planejada, porém necessária, a síntese dos blocos de construção é inédita. Portanto, pode-se concluir que o trabalho trouxe relevante contribuição no que diz respeito à química de carboidratos e à disponibilização de dados espectrométricos de compostos orgânicos para a literatura. / Trypanosoma cruzi trans-sialidase (TcTS) belongs to the family of glycoproteins expressed on the surface of the parasite and constitutes one of the few examples of natural surface glycosyltransferases found in eucariotes. T. cruzi can not synthesize sialic acid itself and uses this enzyme to scavenge this monosaccharide from host glycoconjugates to sialylate acceptors molecules, such as GPI (glycosylphosphatidylinositol) mucins, that are present in parasite plasma membrane. This enzyme is specific to catalyze, preferentially, the transference of sialic acid to mucin glycoproteins, generating -2,3-linkages with acceptor galactose molecules in the parasite surface. Considering the heterogeneity of T. cruzi mucin molecules, its necessary to synthesize new compounds that can act as glycopeptide substrates, leading to a better understanding concerning the enzyme and substrates and allow the rational design of some selective inhibitors. Thus, this work was developed in three synthetic routes: (i) the synthesis of galactose donor, (ii) synthesis of donor-acceptors and (iii) coupling between disaccharides and acceptors amino acids in order to obtain building blocks. Despite of some objectives initially proposed had not been accomplished, the developed work during this period allow the synthesis of the galactose donor (3) in three steps, donor-acceptor (6) in five steps, disaccharide (11), acceptors amino acids (13 and 14) and also the building blocks (17 and 18). However, its important highlight that the synthesis of the building blocks by this necessary, but extensive, synthetic route is unpublished. Therefore, it can be concluded that the present work brought rich contribution concerning the carbohydrate chemistry and the availability of spectrometric data of organic compounds to the literature.

Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, o sistema endócrino exerce importante influência no direcionamento da resposta imune do hospedeiro. A prolactina é um dos diversos hormônios envolvidos em uma série de complexas interações com o sistema imunológico, participando diretamente do processo de imunorregulação. As pesquisas relacionadas com a administração de hormônios em modelos experimentais infectados por T. cruzi visam comprovar a modulação dos mecanismos de defesa por estas substâncias e contribuem para a busca de novas terapias auxiliares e melhorias no tratamento convencional da Doença de Chagas. O objetivo deste trabalho foi elucidar o papel da prolactina na modulação do sistema imune durante a fase aguda da doença de Chagas experimental, através da administração desta substância em ratos Wistar jovens infectados com a cepa Y de T.cruzi. O envolvimento e o perfil de ativação das células de defesa durante a infecção aguda foram analisados, utilizando-se ensaios de linfoproliferação, apoptose de linfócitos e análise de marcadores celulares. Além disso, outros parâmetros imunológicos também foram avaliados, entre eles, citocinas intracelulares IFN-?, TNF-?, IL-4 e IL-10, quimiocina MCP-1 e óxido nítrico. Os animais submetidos ao tratamento com prolactina apresentaram redução significativa na parasitemia sanguínea, bem como diminuição na apoptose celular e elevados percentuais de células essenciais na resposta imune do hospedeiro frente ao parasita. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho demonstram os efeitos estimulatórios da prolactina e corroboram a ideia da utilização de substâncias imunomoduladoras no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que possam promover o equilíbrio da resposta imune do hospedeiro frente à infecção, prevenindo os possíveis danos teciduais observados tanto na fase aguda como crônica da doença de Chagas. / During the course of infection by Trypanosoma cruzi, the host immune system is involved in distinct, complex interactions with the endocrine system, and prolactin (PRL) is one of several hormones involved in immunoregulation. Numerous studies have demonstrated that the modulation of the immune system with the administration of regulatory hormones in different experimental models infected with T. cruzi, are very important inciting the investigation of new therapies for Chagas\' disease. The role of PRL as a possible factor in the modulation of the immune response was the target of this study using as animal model young rats infected with the Y strain of T. cruzi, in the attempt to demonstrate the relationship between the neuroendocrine system and the immune response involved in the acute phase of the experimental Chagas\' disease. For this purpose, some immune parameters were analyzed: dosages of cytokines IFN-?, TNF-?, IL-4, IL-10 and chemokine MCP-1, phenotypic analysis of cell subsets by flow cytometry, production of nitric oxide, lymphoproliferation and apoptosis of splenocytes. Therapy with PRL caused a significant decrease in parasitemia during the acute phase. PRL also triggered an increase in the percentage of cells of the innate and adaptive immune response and decreased apoptosis. Thus, the data obtained in this study corroborate the idea of using substances such as PRL in the development of new therapeutic strategies that can modulate the inflammatory response, contributing to the balance of the host body against infection, preventing the possible tissue damage observed in both acute and chronic Chagas\' disease.

O objetivo central desta dissertação de mestrado foi analisar se, pela sua resposta ao interferon-g (IFNg), as células não leucocitárias contribuem ao controle dos protozoários Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS e Plasmodium berghei ANKA. O IFNg é uma citocina que promove a ativação de diversos tipos de leucócitos, a sua ação sobre as células mononucleares fagóciticas merece um destaque especial. Apesar de conhecermos os pormenores do papel desta citocina na ativação dos leucócitos, desconhecemos se o IFNg exerce ação ativadora sobre as células estruturais (não leucocitárias), ou seja, sobre as células não profissionais da resposta imune. A nossa hipótese de trabalho é que, no caso dos parasitas intracelulares, o IFNg poderia reforçar a ação sinalizadora e efetora das células estruturais infectadas. Por outro lado, em ambas as situações de parasitas intracelulares e extracelulares, o IFNg, ao agir sobre diversas células estruturais, poderia induzir a produção de mediadores inflamatórios (citocinas, quimiocinas, etc) que contribuiriam direta ou indiretamente à remoção/controle do parasita. A nossa abordagem tem sido o estudo da infecção por estes protozoários em quimeras de medula óssea B6/IFNgRKO, nas quais as células não leucocitárias são deficientes em receptores para IFNg e as células leucocitárias são normais. A análise por imunofluorescência de cortes histológicos mostrou uma alta expressão de IFNgR pelas células estruturais do coração dos animais B6 e quimeras controle B6/B6, mas nenhuma expressão deste receptor nos cortes histológicos correspondentes de animais IFNgRKO e quimeras experimentais B6/IFNgRKO, apesar de grande parte dos leucócitos dos animais deste último grupo ter se tornado IFNgR+. Após infecção pelo T. cruzi, o coração e músculo esquelético dos animais quiméricos B6/IFNgRKO mostraram maior carga parasitária e menor intensidade dos infiltrados 8 inflamatórios do que aqueles dos animais quiméricos B6/B6, resultados que sugerem o envolvimento das células estruturais no controle do parasita e promoção do recrutamento leucocitário. Na infecção pelo Plasmodium chabaudi AS a análise comparativa dos grupos IFNgRKO e quimera B6/IFNgRKO mostrou que no início da infecção as curvas de parasitemia destes grupos são idênticas sugerindo que nesta fase da infecção a presença do IFNgR nos leucócitos em pouco contribui na evolução da parasitemia. Por outro lado, a análise comparativa dos grupos quimera B6/IFNgRKO e quimera B6/B6 mostrou níveis mais elevados de parasitemia e maior índice de mortalidade nos animais B6/IFNgRKO, sugerindo que as células estruturais participam no controle do parasita através da sua resposta ao IFNg. Entretanto, em uma experiência preliminar de infecção pelo Plasmodium berghei ANKA não observamos grandes diferenças entre os animais dos grupos B6/IFNgRKO e B6/B6, não somente no que se refere à curva de parasitemias, como também na indução de morte precoce decorrente de malária cerebral. / The main purpose of our work was to analyze if by their response to Interferon-g (IFN-g), the non-leucocyte cells are able to control Trypanosoma cruzi, Plasmodium chabaudi AS and Plasmodium berghei ANKA protozoans. IFNg was described as a cytokine that promote activation on different types of leucocytes, its action on mononuclear phagocytic cells is important. Despite the fact that this cytokine activate leucocytes, it is unknown whether IFNg activates the structural cells (non-leucocytes), that is, the non-professional cells of the immune response. Our hypotheses suggest that in the case of intracellular parasites, IFNg could help the infected structural cells by increasing their signaling and effect actions. In addition, during the response against intracellular and extracellular parasites, IFNg could induce the production of inflammatory mediators by these cells guaranteeing direct or indirectly the parasite clearance. In the present study, we analyzed the infection of diferente protozoans on bone marrow B6/IFNgRKO chimeras, in which the non-leukocyte cells are deficient in IFNg receptor and the leukocyte cells are normal. Immunofluorescence analyses of histological sections revealed a high expression of IFNgR on the structural cells from the heart of B6 and control chimeras B6/B6 animals, but non-expression of this receptor on histological sections from IFNgRKO and experimental chimeras B6/IFNgRKO, despite the fact that a great part of leucocytes from the last group of animals express the receptor. After T. cruzi infection, the cardiac and skeletal muscle from B6/IFNgRKO chimera animals showed a huge amount of parasite and less infiltration inflammatory than B6/B6 animals, suggesting that the structural cells are involved in the parasite control and leukocyte recruitment. During Plasmodium chabaudi AS infection, comparative analyses from IFNgRKO and 10 B6/IFNgRKO groups showed that parasitemia curves at the early phase are similar, suggesting that during this phase IFNgR expression on leukocytes are not important. On the other hand, parasitemia and mortality levels on B6/IFNgRKO and B6/B6 groups were higher than those on B6/IFNgRKO animals, determining that structural cells participate during the course of infection through their response to IFNg. However, when B6/IFNgRKO and B6/B6 animals were infected with Plasmodium berghei ANKA no significantly difference was observed between these groups related to the course of parasitemia and cerebral malaria.

O controle do parasita na fase crônica da infecção por Trypanosoma cruzi se dá principalmente por uma resposta mediada por anticorpos, uma resposta celular TH1 e uma resposta mediada por linfócitos T CD8. Na fase crônica, co-existem linfócitos T CD8 com fenótipo CD8Low CD45RCLow (CD8LL que apresentam marcadores de células sensibilizadas pelo antígeno) junto com células CD8High CD45RCHigh (CD8HH, que em grande parte apresentam fenótipo de célula naive). Células CD8High CD45RCLow (CD8HL) podem ser também observadas. As células CD8LL se apresentam no camundongo independente da cepa de T. cruzi infectante. Verificou-se que na sua grande maioria as células CD8LL tem fenótipo de células em repouso, baixa expressão de CD62L baixa expressão de CD127 (CD62LLOWCD127LOW), sendo estas as características de células efetoras de memória (EM). Este tipo celular ainda pode chegar a expressar marcadores de células NK de significado incerto. Observa-se, na análise funcional, que na estimulação in vitro das células CD8 com anticorpos anti-CD3/CD28 há uma recuperação baixa de CD8 por provável morte por AICD. Este fato é reforçado pelo aumento da ligação à anexina nas células sobreviventes, bem como através da expressão de CD69. Estudos anteriores relataram que o número de células CD8 diminuía após desafio in vivo com o parasita; porém o observado foi uma diminuição das células CD8LL na estimulação inespecífica in vivo com Poli-IC, um ligante de TLR-3. O desafio in vivo com antígeno de tripanossoma na cavidade pleural ocasiona uma migração preferencial de células CD8 e entre estas migram células de fenótipos CD8LL e CD8HL. No entanto, ao contrário do esperado, este estímulo resulta em uma diminuição da expressão de CD69 nas células CD8 infiltrantes. Visando determinar in vivo o papel protetor das células CD8, em um primeiro momento células de baço total foram tranferidas para camundongos sadios e, após a infecção com T. cruzi, observou-se um controle parcial da infecção, caracterizado por um retardo no pico de parasitemia e diminuição na intensidade de infecção, evidenciando um papel protetor parcial in vivo. Na determinação de fatores envolvidos na geração e manutenção das células CD8LL, observou-se que os camundongos deficientes em CD28, INOS ou CD4 têm geração normal de células CD8LL. Os camundongos IL-12p40-KO têm uma deficiência parcial na geração de células CD8LL. Já os camundongos deficientes em INF-gama, por sua vez, possuem uma deficiência acentuada destas células, apesar de que a diminuição poderia se dever a um aumento da necessidade periférica. Por outro lado, os camundongos IL-12p40-KO e INF-gama-KO desenvolvem um quadro neurológico sub-agudo progressivo, onde as células CD8 infiltrantes na medula espinhal apresentam um fenótipo misto CD8LL e CD8HL, e não são anérgicas, por sinal. / The control of the parasite in the chronic phase of infection by Trypanosoma cruzi occurs mainly by an antibody response mediated by a TH1 response and a cellular response mediated by CD8 T lymphocytes. In the chronic phase, co-exist with CD8 T lymphocyte phenotype CD8Low CD45RCLow (CD8LL showing markers of cells sensitized by antigen) with cell CD8High CD45RCHigh (CD8HH which have largely naive cell phenotype). Cells CD8High CD45RCLow (CD8HL) can also be observed. CD8LL cells were present in mice independent of the strain of T. cruzi infecting. It was found that in most cells CD8LL cell phenotype is at rest, low expression of CD62Llow expression of CD127 (CD62LLOWCD127LOW), which are the characteristics of effector memory cells (MS). This cell type can still get to express markers of NK cells of uncertain significance. There is, in functional analysis, which in vitro stimulation of CD8 cells with anti-CD3/CD28 antibodies there is a low recovery of CD8 by probable death IACD. This fact is reinforced by the increase in connection anexina cells survived, and through the expression of CD69. Previous studies reported that the number of CD8 cells decreased after in vivo challenge with the parasite, but the observed was a decrease in cell CD8LL the nonspecific stimulation in vivo with poly-IC, a ligand of TLR-3. The challenge with antigen in vivo of trypanosome in the pleural cavity causes a preferential migration of CD8 cells and between the migrating cells CD8LL phenotypes and CD8HL. However, unlike the expected, this stimulation results in a decrease in the expression of CD69 on CD8 cells infiltrating. To determine the in vivo protective role of CD8 cells in a first time total spleen cells were transferred to healthy mice and after infection with T. cruzi, there was a partial control of infection, characterized by a delay in peak parasitemia and decrease in intensity of infection, indicating a partial protective role in vivo. In determining the factors involved in the generation and maintenance of cells CD8LL, it was observed that mice deficient in CD28, iNOS and generation have normal CD4 cell CD8LL. The mouse IL-12p40-KO have a partial deficiency in the generation of cells CD8LL. But the mice deficient in INF-gamma, which in turn have a marked deficiency of these cells, although the decrease could be due to increased peripheral need. Moreover, the mice IL-12p40-KO and INF-gamma-KO develop a progressive neurological sub-acute, where the infiltrating CD8 cells in the spinal cord showed a mixed phenotype CD8LL and CD8HL, and are not anergic, by signal.

As células da linhagem macrofágica são fundamentais na infecção por T. cruzi. Além do reconhecimento por PRRs, a interação com anticorpos e/ou complemento facilita a internalização. Avaliamos o papel in vivo e in vitro de IgM e IgG específicas na saída de parasitas Sylvio X10/4 do sangue, um clone miotrópico de T. cruzi que causa infecção sem parasitemia patente. Devido à sua saída espontânea, estudamos a remoção no sexto dia de infecção, momento em que a parasitemia subpatente aumenta. Camundongos foram infectados e tratados com soro normal (NMS), soro crônico (B6) e soro de animais CD28KO crônicos (que produzem somente IgM). O grupo tratado com soro de CD28KO apresentou uma remoção significativa, porém menos eficiente do que com soro crônico (B6). Tais resultados foram reproduzidos em estudo in vitro na invasão de macrófagos (derivados de medula óssea ou do peritônio) com os distintos tratamentos. Concluímos que os macrófagos são fundamentais na remoção dos parasitas e os anticorpos, não somente IgG, mas também os da classe IgM reforçam este processo. / The cells of the macrophage lineage are essential for the infection by T. cruzi. Besides the recognition by PRRs, interaction with antibodies and/or complement facilitates internalization. We evaluated the role in vivo and in vitro of specific IgM and IgG in the blood output of parasites Sylvio X10/4, clone myotropic of T. cruzi which causes infection without patent parasitemia. Due to its spontaneous exit, we studied the removal on the sixth day of infection, when the parasitemia subpatent increases. Mice were infected and treated with normal mouse serum (NMS), chronic serum (B6) and serum from CD28KO chronic mice (which produce only IgM). The group treated with CD28KO serum showed a significant removal, but less efficiently than with chronic serum (B6). These results were reproduced in vitro study on the invasion of macrophages (derived from bone marrow or peritoneum) with these different treatments. We conclude that macrophages are essential in the removal of parasites and antibodies, not only IgG, but also IgM enhance this process.