Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor λgt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com β-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em λEMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector λgt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as β-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a λEMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

Com o objetivo de analisar a expressão diferencial de genes em cepas de Trypanosoma cruzi pela técnica de microarranjos de DNA, construímos um protótipo de lâminas contendo 710 etiquetas de seqüências transcritas (ESTs) de epimastigotas de CL Brener e 20 genes de várias cepas do parasita. A seqüência nucleotídica estava disponível para 576 ESTs. Desta forma, seqüenciamos as 134 ESTs restantes e sua seqüência foi depositada no dbEST do GenBank. O agrupamento das sondas indicou que a lâmina continha 665 seqüências únicas. Inicialmente, avaliamos o microarranjo para a análise de genômica comparativa entre as cepas CL Brener (T. cruzi II) e Silvio (T. cruzi I). Um total de 4 hibridizações foram realizadas. Verificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01 no teste-t) que 31 seqüências do microarranjo (4,3%) apresentaram maior sinal de hibridização com o DNA de CL Brener, enquanto 37 sondas (5,0%) apresentaram situação inversa. Esse resultado sugere diferenças no número de cópias gênicas e/ou variação na similaridade das seqüências. Várias sondas com hibridização diferencial foram confirmadas em experimentos de Southern blot com DNA genômico dos dois isolados. Em seguida, o microarranjo foi avaliado para a análise da expressão diferencial de genes. Para isto, a lâmina foi hibridizada com cDNA de formas epimastigotas (fase midlog de crescimento) de CL Brener e Silvio. Um total de 8 experimentos de hibridização foi realizado com preparações de RNA obtidas de três cultivos independentes. Identificamos, com uma significância estatística (P≤ 0,01), 84 sondas (84/730; 11,5%) diferencialmente expressas: 35 sondas mais expressas em Silvio e 49 sondas mais expressas em CL Brener. Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. A comparação dos dados dos experimentos de hibridização do microarranjo com DNA e cDNA das duas cepas permitiu concluir que não há uma correlação direta entre a abundância de determinado ene e seu nível de expressão. Em alguns casos, observamos que seqüências com maior hibridização com o DNA de uma cepa são mais expressas na outra. Visando iniciar os estudos de expressão diferencial de genes em cepas isoladas de pacientes chagásicos, escolhemos as cepas Famema e Hem 179 (T. cruzi II), isoladas, respectivamente, de um paciente com a forma indeterminada da doença de Chagas e de um paciente com alterações cardíacas e digestivas. Observamos que aproximadamente 2,5% (18/730) das sondas apresentaram expressão diferencial nas formas epimastigotas das duas cepas e que 9,0% (65/730) das sondas mostraram razões de hibridização diferente nas formas infectantes (tripomastigotas metacíclicos). Algumas destas sondas foram confirmadas por Northern blot. Entre as sondas mais expressas em Hem 179, está a seqüência que codifica a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7). O conjunto de dados permitiu concluir que microarranjos contendo predominantemente ESTs de CL Brener são uma ferramenta útil para estudos de genômica comparativa, análise de expressão gênica em isolados de T. cruzi, bem como para a descoberta de novos genes. Além disto, este estudo indicou uma regulação pós-transcricional intensa dos níveis de RNA em T. cruzi. Ampliamos os estudos para um maior número de cepas e construímos outro microarranjo contendo 710 ESTs de CL Brener (forma epimastigota), 45 ESTs da cepa Tulahuen (forma amastigota) e 32 genes de várias cepas do parasita. As 787 seqüências representam 714 seqüências únicas. O RNA total foi isolado de formas epimastigotas de cepas de três pacientes com a forma cardíaca (cepas 115, B13 e 147), e de três pacientes assintomáticos (cepas VL10, Famema e Berenice 62). Cinco da seis cepas são de regiões endêmicas de Minas Gerais (exceto Famema que é do estado de São Paulo). Após hibridização competitiva, a análise estatística dos dados indicou expressão diferencial de 14 sondas (14/787; 17,7%) entre os dois grupos de cepas. Destas, 9 sondas estão induzidas em todas as cepas isoladas de pacientes cardíacos e 4 sondas estão reprimidas em todas as cepas de cardíacos quando comparadas com as cepas de assintomáticos. Dentre as sondas mais expressa em cepas de cardíacos estão: as ESTs que codificam a subunidade 7 da NADH desidrogenase (ND7), a aspartato aminotransferase, enzima importante no processo de regeneração de metionina, e a triparedoxina peroxidase de T. cruzi, envolvida na resistência a peróxidos exógenos. Também foram reveladas 8 ESTs que não apresentam similaridade em bancos de dados. Parte destas sondas foi confirmada por Northern blot com RNA total de todas as cepas. Em alguns casos, identificamos diferenças do tamanho de transcritos entre as cepas. Em resumo, a análise da expressão diferencial de genes em cepas de pacientes com a forma cardíaca e indeterminada da doença de Chagas permitiu identificar alguns genes que podem estar relacionados à patogênese e/ou serem usados como alvo para o prognóstico da evolução doença. Posteriormente, realizamos um experimentos-piloto para investigar a resposta transcricional de fibroblastos humanos em cultura à infecção com duas cepas de T. cruzi: VL10 (isolada de indivíduo assintomático) e 147 (isolada de indivíduo com cardiopatia severa). Após 24 horas de infecção, os RNAs das monocamadas foram extraídos. No mesmo período, RNA foi extraído de fibroblastos humanos não infectados e usado como referência. Experimentos de hibridização competitiva foram realizados em lâminas de microarranjo contendo oligonucleotídios derivados de 24.000 genes humanos, construídas o Laboratório de Tecnologia Molecular do Instituto Nacional do Câncer do NIH, em Frederick, EUA chefiado pelo Dr. David Munroe. Identificamos 28 sondas diferencialmente transcritas nas células infectadas com a cepa 147 (paciente cardíaco). Destas, 27 sondas (27/28; 96,4%) estão com expressão reduzida nas células infectadas. Por outro lado, apenas uma sonda, correspondente ao gene da \"heme oxigenase (decycling) 1\", apresentou indução nas células infectadas com 147. Na infecção de células com a cepa VL10, encontramos 17 sondas diferencialmente transcritas. Destas, 16 sondas (16/17; 94,1 %) estão com expressão aumentada nas células infectadas (dentre elas, a heme oxigenase), enquanto que apenas uma sonda (proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina) mostra situação inversa. Concluímos que as diferenças de resposta da mesma célula hospedeira à infecção pelas duas cepas são marcantes, o que determina um estudo temporal ao longo da infecção para a confirmação das observações acima. Comprovamos por PCR em tempo real o aumento da expressão da heme oxigenase na infecção pelas duas cepas e repressão da expressão da proteína 5 ligante do fator de crescimento do tipo insulina apenas em células infectadas por VL10. / To investigate differential gene expression in Trypanosoma cruzi strains by microarray DNA technology, we have constructed a prototype slide that contains 710 expression sequence tags (ESTs) of CL Brener epimastigotes and 20 genes of various parasite strains. The nucleotide sequence was available for 576 ESTs. Therefore, we have sequenced 134 additional ESTs and the sequences have been deposited in dbEST of GenBank. Clustering of these probes indicated that slide contains 665 unique sequences. Initially, we have evaluated the microarray for comparative genomic analysis between CL Brener (T. cruzi II) and Silvio (T. cruzi I) strains. Four independent experiments were performed. We verified that 31 probes (4.3%) showed statistical significant (P≤, 0.01 in t-test) higher hybridization with CL Brener DNA, whereas 37 probes (5.0%) showed the inverse situation. This suggests differences in the abundance of the genes in the genomes of the strains and/or variation in sequence similarity. Some of these probes were confirmed by Southern blot with genomic DNA of both strains. Next, we evaluated the microarray for the analysis of differential gene expression. For this purpose, the slide with hybridized with cDNA obtained from epimastigote forms in mid-log growth phase of CL Brener and Silvio strains. A total of eight hybridization experiments were perfonned with RNA preparations obtained from three independent parasite harvests. We identified 84 probes (841730; 11.5%) that showed statistically significant changes (P≤, 0.01 in t-test) in expression: 35 probes up regulated in Silvio and 49 probes up regulated in CL Brener. Some of these probes were confirmed by Northern blot. When we compared the data of the hybridization of the microarray with genomic DNA and cDNA of CL Brener and Silvio, we verified no correlation between the putative abundance of a particular gene and its expression level. In a few cases, we noticed that sequences with higher hybridization with genomic DNA of one strain were more expressed in the other. In an initial attempt of investigate differential gene expression in human T. cruzi isolates, we selected the strains Famema and Hem 179 (both T. cruz II), obtained, respectively, from an asymptomatic individual and from a patient with severe cardiopathy and digestive disorders. Differential expression of 2.5% (181730) and 9.0% (651730) of the probes was observed, respectively, in epimastigotes and metacyclic trypomastigotes of the two strains. Some of the probes were confirmed by Northern blot. Among the probes more expressed in Hem 179 is the gene encoding subunit 7 of theNADH dehydrogenase (ND7). We concluded that microarrays, containing predominantly ESTs of CL Brener, are a powerful tool for comparative genomics and gene expression analyses in T. cruzi as well as for discovery of new genes. In addition, this study has provided further evidence for a high level of post-transcriptional regulation of RNA abundance in T. cruzi. We have extended the analysis to a larger number of strains and constructed a new set of microarray slides, which contain 710 ESTs of CL Brener epimastigotes, 45 ESTs Tulahuen strain amastigotes and 32 characterized genes of various strains. These probes represent 714 unique sequences. Total RNA was extracted from mid-log phase epimastigotes of three strains isolated from patients with cardiac disorders (115, B13 and 147) and three strains from asymptomatic patients (VL10, Famema and Berenice 62). Five of these strains are from endemic areas of Minas Gerais (except Famema that is from the state of São Paulo). After competitive hybridization with the microarray, statistical analysis of the data indicated differential expression of 14 probes (14/787, 17.7%) between the two groups of strains. Among these sequences, 9 probes are up regulated in all the strains from cardiac patients and 4 probes are down regulated in all these strains as compared with all the strains isolated from asymptomatic individuals. Among the probes up regulated in the strains from cardiac patients there are ESTs encoding subunit 7 of the NADH dehydrogenase (ND7); aspartate aminotransferase, key enzyme in the methionine regeneration process; and T. cruzi tryparedoxin peroxidase, an important enzyme for resistance to exogenous peroxides. Eight ESTs with no similarity matches in databases were also disclosed. Some of these probes were confirmed by Northern blot assays with RNA of all the strains. In some cases, we noticed differences of the molecular size of the transcripts among the strains. In summary, the analysis of differential gene expression in strains isolated from human chagasic patients with the cardiac and indeterminate forms allowed the identification of some potential genes that may be related to pathogenesis and/or may be used as targets for prognosis of the evolution of Chagas disease. Subsequently, we performed a pilot experiment to investigate the transcriptional response of human fibroblasts in culture to the infection by two T. cruzi strains: VL10 (isolated from an asymptomatic patient) and 147 (isolated from a patient with severe cardiomyopathy). After 24 hours of infection, total RNA was extracted from the infected monolayers. In the same period, RNA was extracted from not infected human fibroblasts, and used as a control. Competitive hybridization experiments were performed in microarray slides containing oligonucleotides representing 24,000 human genes, constructed in the Laboratory of Molecular Technology of the National Institute of Cancer of N1H, in Frederick, EUA headed by Dr. David Munroe. We identified 28 probes differentially transcribed in cells infected with 147 strain. Of these, 27 probes (27/28; 96.4%) were down regulated in the infected celIs, and only one probe, corresponding to the heme oxygenase (decycling) 1 gene, showed up regulation. For the fibroblast infected with VL 10 strain, we found 17 probes differentially transcribed. Of these, 16 probes (16/17; 94.1%) were up regulated (among these probes there is the heme oxigenase sequence), and only one probe (insulin-like growth factor binding protein 5) showed the inverse situation. We concluded that there are drastic differences in the response of the same cell line to the infection by two parasite stmins. This determines that a temporal analysis of gene expression during the infection process should be performed to corroborate the above observations. The increase of heme oxigenase transcripts in fibroblasts infected by the two strains was comrrmed by real time-PCR This methodology also confirmed down-regulation of the insulin-like growth factor binding protein 5 rnRNA in fibroblasts infected with VL 10 strain.

Nos bancos de dados de T. cruzi há cerca de 3.750 ESTs de amastigotas e tripomastigotas, seqüenciadas a partir das extremidades 5\' ou 3\' de clones de cDNA. A metodologia ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) possibilita obter seqüências transcritas parciais derivadas majoritariamente da porção central dos mRNAs, favorecendo a descoberta de novos genes. Neste trabalho, caracterizamos ORESTES de formas infectantes amastigotas e tripomastigotas da cepa humana VL10 (ATVL). A metodologia foi padronizada com formas epimastigotas da cepa CL Brener (ECL), monitorando-se nas preparações de mRNA a contaminação por DNA e a integridade dos transcritos. Populações de cDNA foram obtidas utilizando-se diferentes iniciadores aleatórios. O mesmo iniciador foi empregado nas etapas de RT e PCR, realizada em condições de baixa estringência. Obtivemos 776 e 1522 ORESTES de ECL e ATVL, respectivamente. Após análise com o programa PHRED, aceitaram-se 745 ORESTES de ECL e 1476 de ATVL. As ORESTES apresentaram um tamanho médio de 680 pb e um conteúdo de G+C de 53%. O agrupamento com CAP3 gerou 463 agrupamentos de ECL (360 singletons e 103 contigs) e 454 de ATVL (337 singletons e 117 contigs). A anotação foi feita utilizando-se o programa BLAST contra o banco nr do NCBI. Na biblioteca de ATVL observamos um número elevado de seqüências de RNA ribossômico (27%), amplificadas preferencialmente por dois iniciadores. Para ECL, a contaminação por rRNA foi de 3,6%. Para cerca de 50% das ORESTES de ATVL (n= 729) foi encontrada similaridade em bancos de dados de proteínas. Destas, 316 apresentaram similaridade com proteínas putativas conhecidas e 413 foram anotadas como proteínas hipotéticas e hipotéticas conservadas. Para 87 ORESTES de ATVL (5,9%) não foi observada nenhuma similaridade. 628 ORESTES de ECL (84%) apresentaram similaridade com proteínas depositadas em bancos públicos, ao passo que nenhuma similaridade foi encontrada para 18 cDNAs (2,4%). Ensaios de Southern blot confirmaram a presença de 4 ORESTES no match analisadas nos genomas das duas cepas. Não puderam ser atribuídas a processos biológicos conhecidos 39% e 68% das seqüências dos contigs de ECL e ATVL, respectivamente. Nos processos de Proteólise e Peptidólise, estão incluídas 11% das ORESTES de ECL e 0,3% das ORESTES de ATVL. Outras diferenças funcionais putativas foram observadas. A abundância diferencial dos transcritos de algumas ORESTES foi analisada por northern blot nos estágios evolutivos das cepas. Southern blot do contig ATVL95 originou um padrão de hibridização com múltiplas bandas, característico de seqüências repetitivas. Este contig corresponde ao transcrito do DNA satélite de 195 pb (195 SAT), uma seqüência repetitiva que perfaz cerca de 10% do genoma de T. cruzi e cuja transcrição é controversa na literatura. A transcrição do 195 SAT foi comprovada por experimentos de + northern blot e por RT-PCR. Transcritos de 195 SAT foram detectados nas frações de RNA de poliA+ e poliA-. Esses transcritos não conteriam a seqüência SL, presente nos mRNAs de tripanossomatídios. e poliA Utilizando oligonucleotídios complementares às duas fitas de 195 SAT concluímos que ambas são transcritas. Embora esteja claro que 195 SAT é transcrito, sua função biológica permanece desconhecida. / In T. cruzi databases, aproximately 3.750 ESTs of amastigotes and trypomastigotes, sequenced from the 3´ or 5´ ends cDNA clones can be found in T. cruzi databases. The ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags) methodology generates partial transcribed sequences derived mainly from the central portions of mRNAs, favoring the discovery of new genes. In this work, we have characterized ORESTES sequences from the infective amastigote and trypomastigote forms of the human strain VL10 (ATVL). The methodology was standardized with epimastigotes of the CL Brener strain (ECL), monitoring in the mRNA population DNA contamination and the integrity of the transcripts. cDNA populations were obtained using different arbitrarily selected, nondegenerate primers. The same primer was used in the RT and PCR steps, performed under low-stringency conditions. We obtained 776 and 1522 ORESTES of ECL and ATVL, respectively. After analysis with PHRED program, 745 ORESTES of ECL and 1476 of ATVL were accepted for further characterization. ORESTES showed a medium size of 680 bp and a G+C content of 53%. Clustering with CAP3 generated 463 unique sequences of ECL (360 singletons and 103 contigs) and 454 of ATVL (337 singletons and 117 contigs). The annotation was made with BLAST program against the NCBI nr database. In the ATVL library we observed an elevated number of ribosomal RNA sequences (27%), amplified mainly by two primers. In the ECL library, rRNA contamination was about 3.6%. Approximately 50% of the ATVL sequences (n= 729) were found in protein databases. From these, 316 showed similarity with putative known proteins and 413 were annotated as hypothetical proteins and hypothetical conserved proteins. No hit was observed for 87 ORESTES of ATVL (5.9%). 628 ORESTES of ECL (84%) showed similarity with proteins in public databases, while for 18 cDNAs (2.4%) no similarity was found. Southern blot assays confirmed the presence of four no match analyzed ORESTES in the genomes of the two strains. No known biological process could be assigned to 39% and 68% of the sequences of ECL and ATVL contigs, respectively. In Proteolysis and Peptidolysis processes 11% and 0.3% of ECL and ATVL ORESTES were allocated, respectively. Additional putative functional differences were observed. The differential abundance of transcripts of some ORESTES was analyzed by northern blot assays in the developmental stages of the strains. Southern blot of the contig ATVL95 originated a hybridization pattern with multiple bands, characteristic of repetitive sequences. This contig corresponds to the transcript of the 195 bp satellite DNA (195 SAT), a repetitive sequence that accounts for 10% of the T. cruzi genome and whose transcription is controversial in the literature. The transcription of the 195 SAT was evidenced by northern blot and RT-PCR experiments. Transcripts of 195 SAT were detected in polyA+ and poly- RNA fractions. These transcripts apparently do not contain the SL sequence, present in trypanosomatid mRNAs. By using oligonucleotides complementary to the two strands of 195 SAT, we concluded that both strands are transcribed. Although it is clear that 195 SAT is transcribed, its biological function remains unknown.

Óxido nítrico (NO) é um segundo mensageiro biosintetizado a partir de L-Arginina e envolvido em sinalização celular por diferentes mecanismos: ativação da produção de cGMP pela Guanilil Ciclase; regulação de enzimas pela interação com seus centros metálicos; ou pela S-nitrosilação de cisteína e nitração de tirosina, modificações pós-traducionais, capazes de modular a atividade de diversas proteínas. Neste trabalho buscou-se investigar se a interação de Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, com a matriz extracelular (ECM) era capaz de modular a sinalização por NO em T. cruzi. Tripomastigotas de T. cruzi incubados com ECM apresentaram diminuição na atividade de NOS e menor produção de NO. Da mesma maneira, observou-se, por imunofluorescência indireta e imunoblotting, uma diminuição no padrão geral de S-nitrosilação e nitração de proteínas do parasita incubado com ECM. Além disto, os perfis de proteínas S-nitrosiladas e nitradas foram modificados, predominando a denitrosilação e denitração (de 40 para 22 proteínas nitradas após a adesão a ECM), embora em alguns casos tenha sido observado um aumento de nitração, como em proteínas de citoesqueleto (de 2,5% para 9,1% após adesão). O mesmo padrão foi observado em relação a proteínas nitradas, com diminuição de 48 para 20 proteínas após adesão a ECM e novamente com modificação no percentual de proteínas nitradas pertencentes a processos biológicos distintos, como proteínas relacionadas à síntese proteica (35,4% das proteínas nitradas no grupo controle e apenas 5,0% no grupo incubado com ECM). Apesar do perfil de denitração, algumas classes de proteínas têm aumento no número de alvos nitrados, como proteínas relacionadas a metabolismo (de 18,8% para 35,0%), além de alguns alvos específicos que têm aumento na nitração, como enolase. Em suma, os resultados sugerem que a sinalização intracelular por NO em tripomastigotas de T. cruzi é modulada durante a adesão do parasita a componentes da matrix extracelular, tanto através da via clássica de produção de óxido nítrico, quanto por modificações pós-traducionais induzidas por NO. / Nitric oxide (NO) is a second messenger biosynthesized from L-Arginine and involved in cell signaling by different mechanisms: activation of cGMP production by guanilyl cyclase; regulation of enzymes by interaction with their metallic centers; or by S-nitrosylation of cysteine and nitration of tyrosine, posttranslational modifications capable of modulating the activity of several proteins. In this work, we sought to investigate whether the interaction between extracellular matrix (ECM) and Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas\' disease, was capable of modulating NO signaling in the parasite. Trypomastigotes incubated with ECM presented a decrease in NOS activity and NO production. Accordingly, a decrease in S-nitrosylation and tyrosine nitration of proteins from ECM-incubated parasites was also observed, as evidenced by indirect immunofluorescence and immunoblotting. In addition, S-nitrosylated and tyrosine nitrated proteins profiles were modified in ECM-incubated parasites, with an enhancement in protein denytrosylation and denitration. A decrease from 40 to 22 of S-nitrosylated proteins was detected after parasite adhesion to ECM, more evident in some protein groups (as for example 52.5% hypothetical proteins modified in the control group against 36.4% after adhesion). On the other hand, an increase of S-nitrosylation was detected in other groups of proteins, such as cytoskeleton proteins (from 2.5% of total S-nitrosylated proteins to 9.1% after adhesion). The same general pattern was observed in relation to tyrosine-nitrated proteins, with a decrease in the number of modified proteins from 48 to 20 after incubation with ECM, exemplified by those related to protein synthesis, with a contribution of 35.4% in the control group versus 5.0% after treatment with ECM. Despite this general denitration profile, some protein classes have an increase in nitration, such as metabolic proteins (from 18.8% to 35.0%), in addition to some specific targets, such as enolase. Taken together, the results suggest that NO signaling is modulated during adhesion of T. cruzi to components of the extracellular matrix, probably by the classical nitric oxide pathway and by NO-induced post translational modifications.

Trypanosoma cruzi, utiliza os aminoácidos como importantes metabólitos para sua manutenção e viabilidade, dentre eles glutamato e glutamina que participam no suprimento energético, metaciclogênese e síntese de pirimidinas. Neste trabalho a glutamina sintetase de T. cruzi (TcGS) foi estudada sob a hipótese de contribuir com a detoxificação de NH4+. Extratos de T. cruzi e a enzima recombinante pura foram utilizados na caracterização cinética e determinação da conformação oligomérica. Na forma amastigotas, observamos que TcGS é mais expressa e ativa. Além disso, a metionina sulfoximina (MS) inibiu TcGS de maneira competitiva e com alta afinidade e reduziu a proliferação de epimastigotas em excesso extracelular de NH4+, relacionando TcGS com a detoxificação dessa molécula. Assim, o tratamento com MS ao longo do ciclo intracelular reduziu a eclosão de formas tripomastigotas de células CHO-K1, ressaltanto a importância da GS no metabolismo de nitrogênio e no ciclo de vida de T. cruzi. / Trypanosoma cruzi uses amino acids as important metabolites for its maintenance and viability, glutamate and glutamine are involved in energy supply, metacyclogenesis and synthesis of pyrimidines. It was described here the glutamine synthetase of T. cruzi (TcGS), and its relation with the ammonium detoxification. Extracts of T. cruzi and pure recombinant enzyme were used to determine the kinetic parameters and the oligomeric conformation of the enzyme. In amastigote forms, we observed that TcGS is more expressed and active. In addition, methionine sulfoximine (MS) inhibited competitively the TcGS, with high affinity and reduced the epimastigotes proliferation exposed to extracellular ammonium excess, connecting TcGS to the ammonium detoxification. Therefore, the treatment with MS along the intracellular cycle reduced the trypomastigote bursting from the CHO-K1 cells, demonstrating the importance of GS on the T. cruzi life cycle establishment and nitrogen metabolism.

As doenças negligenciadas são conseqüências marcantes do subdesenvolvimento que atinge diversas regiões do planeta. Dentre estas, destaca-se a Doença de Chagas, causada pelo parasita Trypanosoma cruzi, a qual afeta aproximadamente um quarto da população da América Latina e para qual os fármacos utilizados apresentam baixa eficácia, toxidez e sérios efeitos colaterais. Este quadro é agravado pela emergência de cepas resistentes, o que indica a grande necessidade de desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos contra esta doença. A enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) da via glicolítica do T. cruzi é um alvo macromolecular interessante devido ao seu papel essencial no metabolismo de tripanossomatídeos. Constitui o objetivo desta tese o desenvolvimento, a padronização e a validação de ensaios enzimáticos para a realização de extensivas triagens bioquímicas de modo a contribuir para a identificação de novos inibidores da GAPDH pertencentes a diversas classes químicas. Os compostos estudados são provenientes de síntese orgânica e de complexos inorgânicos de Rutênio, bem como de origem natural. Paralelamente, a realização do ensaio virtual em larga escala a partir de uma base de dados dirigida e da estrutura da GAPDH de T. cruzi resultou na identificação de um inibidor inédito da proteína alvo. Estudos do mecanismo de ação enzimático levaram à elucidação da modalidade de alguns inibidores identificados nesse estudo. / Parasitic diseases are a major global cause of illness, long-term disability, and death, with severe socio-economic consequences for millions of people worldwide. In Latin America, nearly one fourth of the population is infected by Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. The limited existing drug therapies suffer from a combination of drawbacks including poor efficacy, resistance and serious side effects. Therefore, there is an urgent need for new drugs that can overcome resistance and are safe and effective for use in human. The crucial dependence on glycolysis as a source of energy makes the glycolytic parasite enzymes promising targets for drug design. In this context, the enzyme glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was identified as an attractive target for drug design. The development of standard enzymatic assays combined with extensive biological screening was the aim of this work and it has been contributing for the identification of novel GAPDH inhibitors. These compounds belong to several chemical classes from different sources, including organic synthesis, inorganic complexes and natural products. In addition, a virtual screening approach was applied in a focused database, previously filtered by drug-like properties, in order to identify new hits. This strategy resulted in the discovery of a novel scaffold with significant inhibitory activity against T. cruzi GAPDH. Kinetic and inhibition assays were conducted to shed light on the mechanism of action of the promising inhibitors.

A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi e foi descoberta em 1909 por Carlos Chagas. A doença atinge cerca de 18 milhões de indivíduos na região das Américas, causando 50.000 mortes ao ano e deixando mais de 100 mil pessoas sob risco de infecção. Os tratamentos disponíveis foram desenvolvidos ainda na década de 70 apresentando baixa eficácia e fortes efeitos colaterais. Assim, é extremamente importante o desenvolvimento de novos fármacos mais seguros e eficazes para o tratamento da doença de Chagas. Uma importante estratégia que pode ser utilizada para o planejamento de novas moléculas bioativas é o planejamento baseado em um receptor-alvo. Nessa tese o alvo em estudo é a enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) que faz parte da via glicolítica do protozoário T. cruzi. Este trabalho compreendeu os estudos estruturais e mecanísticos de quatro complexos cristalográficos da GAPDH na presença de ligantes diferentes. As estruturas obtidas subsidiaram estudos que forneceram informações importantes no planejamento de novos inibidores. Foi elucidado o modo pelo qual os compostos alquilantes iodoacetamida e iodoacetato atuam causando a inativação enzimática e as diferenças existentes nesse processo foram esclarecidas, mostrando que é necessária a expulsão do NAD+ do sítio ativo para que a inativação ocorra por parte do iodoacetamida. Além disso, o mecanismo de nitrosilação por complexos de rutênio foi investigado fornecendo informações que contribuem para o entendimento do mecanismo de inibição enzimática por parte dessa classe compostos. Além disso, a partir de um dos complexos estruturais obtidos, foi possível identificar a localização de um novo sítio alostérico que se forma na superfície da proteína. Essa informação é extremamente importante, pois abre novas perspectivas para o planejamento de novos inibidores mais potentes e seletivos da enzima GAPDH de T. cruzi. / Chagas disease, caused by Trypanosoma cruzi protozoan, was discovered in 1909 by Carlos Chagas. The disease affects about 18 million people in the American region, causing 50,000 deaths per year, leaving more than 100 thousand people at risk of infection. Available treatments developed in the 70 decade present low efficiency and strong side effects. Thus, it is extremely important the development of new drugs that safer and more effective. An important strategy used for the design of new bioactive molecules is based on a macromolecular target. The goal of this thesis is to study the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), an enzyme that participates of the glycolytic pathway of the parasite T. cruzi. This work comprised structural and mechanistic studies of four complex crystallographic GAPDH in the presence of different ligands. The structures obtained subsidized structural and mechanistic studies that provided important information for the design of new inhibitors. It was clarified the way in which the alkylating agents iodoacetamide and iodoacetate acts causing enzyme inactivation and the differences in this process were resolved, showing that it is necessary the NAD+ is excluded of the active site wherefore the inactivation occurs by the iodoacetamide. Moreover, the mechanism of enzyme nitrosylation by ruthenium complexes was investigated, providing information that contributed to the understanding of the mechanism of enzyme inhibition by this class of compounds. Moreover, from the structural complexes obtained, it was possible to identify the location of a new allosteric site formed at the surface of the protein. This information is extremely important, because it opens new perspectives for the design of new inhibitors that are more potent and selective for the enzyme GAPDH of T. cruzi.

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No. of bitstreams: 3 Tese_DIP_Jo?oVictorLeiteDias.pdf.txt: 355863 bytes, checksum: d476e278a3e7e647d0e295e1c759d53d (MD5) Tese_DIP_Jo?oVictorLeiteDias.pdf: 6357155 bytes, checksum: 49e964fd560fe7feb582301c409eab99 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A região do Vale do Jequitinhonha foi uma área de intensa transmissão vetorial da infecção chagásica no século passado, tendo sido uma das primeiras áreas do Brasil a realizar ações de combate a populações de triatomíneos domiciliados. Com os níveis de controle alcançados e a virtual eliminação do Triatoma infestans no país, outras espécies continuam como alvo das atividades de vigilância. Esse estudo teve por objetivo analisar a ocorrência e distribuição de triatomíneos nas áreas urbana e rural do município de Diamantina, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, além de analisar a infecção por Trypanosoma cruzi em vetores e eventuais reservatórios da infecção. Os triatomíneos foram coletados durante as ações de vigilância entomológica entre setembro de 2011 e agosto de 2014. Os insetos positivos para tripanossomatídeos tiveram o conteúdo intestinal submetido a ensaio para determinação da linhagem de T. cruzi. A distribuição dos triatomíneos na área urbana foi analisada por meio de estatística espacial cotejando com dados de vegetação. A distribuição dos insetos na área rural foi analisada por meio de Modelos Lineares Generalizados empregando dados obtidos de sensores remotos. Avaliaram-se os conhecimentos a respeito de triatomíneos e doença de Chagas por meio de questionário entre moradores de localidades com diferentes níveis históricos de infestação triatomínica domiciliar. Mamíferos silvestres e sinantrópicos foram capturados e examinados quanto à infecção por T. cruzi. Foi realizada análise morfométrica de asas e análise molecular por meio de sequenciamento de gene do citocromo B para esclarecer relações de espécies de triatomíneos morfologicamente semelhantes ao Triatoma maculata. Foram capturados 975 triatomíneos pertencentes a oito espécies. Panstrongylus megistus foi a principal espécie capturada, sobretudo em colônias detectadas durante atividades de atendimento às notificações. Triatoma vitticeps foi a espécie mais notificada no município. A infecção por tripanossomatídeos foi observada em 7,4% dos insetos examinados, com destaque para Panstrongylus geniculatus (38,1%) e T. vitticeps (17,6%). Foram detectadas as linhagens TcI, TcII e TcIII do T. cruzi entre triatomíneos. As espécies distribuíram-se em distintas áreas de ocorrência ao longo do município. Os Modelos Lineares Generalizados não mostraram bom poder preditivo para descrever a ocorrência de P. megistus, T. arthurneivai e T. vitticeps. Na área urbana foi observada ocorrência de 140 exemplares de quatro espécies (P. geniculatus, P. megistus, Triatoma arthurneivai e T. vitticeps). A distribuição de imóveis infestados foi agregada para todas as espécies, exceto P. megistus, estando T. vitticeps e P. geniculatus próximos a áreas mais vegetadas e cobertas por campo rupestre. A população reconheceu os triatomíneos independentemente da localidade de residência, porém os moradores de áreas mais infestadas conheciam melhor os serviços de controle e as condutas a se adotar em relação aos insetos. Não foram detectados mamíferos infectados por T. cruzi. Na morfometria geométrica T. maculata e Triatoma pseudomaculata formaram um clado enquanto na análise molecular T. pseudomaculata com Triatoma wygodzinskyi foram agrupados em um clado, sendo T. maculata e T. arthurneivai espécies mais distantes. Os resultados mostram diferenças nos espaços geográficos ocupados pelos triatomíneos no município, além da interação com diferentes linhagens de T. cruzi, contribuindo para um melhor entendimento da ecoepidemiologia das espécies encontradas em Diamantina e indicando a necessária manutenção da vigilância entomológica. / Jequitinhonha Valley region represented an area with intense vector-borne transmission of Chagas disease infection in the past century, and also was one of the first areas in Brazil to carry out activities against domiciliated triatomines. Because of the controlled transmission and elimination of Triatoma infestans in Brazil, other triatomine species remain as target of surveillance. This study aimed to analyze the occurrence and distribution of triatomines in the urban and rural areas of the municipality of Diamantina, Jequitinhonha Valley, Minas Gerais, and to evaluate infection by Trypanosoma cruzi among vectors and possible reservoirs. Triatomines were collected during entomological surveillance between September 2011 and August 2014. Intestinal content of the insects with trypanosomes was evaluated for diagnosis of T. cruzi lineage. Distribution of triatomines in an urban area was analyzed by means of spatial statistics associated to vegetation cover data. Distribution of insects in the rural areas was analyzed by means of Generalized Linear Models with remote sensed data. Knowledge related to triatomines and Chagas disease was evaluated by using a questionnaire among residents in localities with different historical levels of triatomine infestation. Sylvatic and synanthropic mammals were examined about T. cruzi infection. Wing morphometry and sequencing of cytochrome B gene were used to clarify relationships of species morphologically similar to Triatoma maculata. A total of 975 triatomines of eight species were captured. Panstrongylus megistus was the most captured species, especially in colonies detected during searches by health agents in response to previous notification. Triatoma vitticeps was the most notified triatomine. Infection by trypanosomes was observed in 7.4% of examined insects, and Panstrongylus geniculatus (38,1%) and T. vitticeps (17,6%) were most infected species. T. cruzi lineages TcI, TcII and TcIII were detected among triatomines. Triatomine species occurred in distinct areas along the municipality. Generalized Linear Models did not present good predictive power in describing P. megistus, Triatoma arthurneivai and T. vitticeps distribution. In urban area 140 triatomines of four species were captured (P. geniculatus, P. megistus, T. arthurneivai and T. vitticeps). Spatial distribution of infested buildings was clustered for all species, except for P. megistus. T. vitticeps and P. geniculatus were found in more vegetated areas covered by rocky fields. People from all localities were able to recognize triatomines, but the residents in areas with more infestation knew better the existence of triatomine control service and reported desirable attitudes about the detection of insects. T. cruzi-infected mammals were not detected. At geometric morphometrics T. maculata and Triatoma pseudomaculata were grouped into a clade, whereas in molecular analysis T. pseudomaculata and Triatoma wygodzinskyi were grouped into a clade and T. maculata and T. arthurneivai remained more distant to them. Results presented differences in geographic space occupied by triatomines in the municipality, with interaction with distinct lineages of T. cruzi, contributing to improved understanding of ecoepidemiology of the triatomines species found in Diamantina, and indicating the necessity of a sustained entomological surveillance.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2018-01-17T14:43:51Z No. of bitstreams: 1 PATRÍCIA PEREIRA FARIAS.PDF: 3725473 bytes, checksum: 27a790c0c992ee9cf80615ba7199bc05 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-17T14:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PATRÍCIA PEREIRA FARIAS.PDF: 3725473 bytes, checksum: 27a790c0c992ee9cf80615ba7199bc05 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As doenças parasitárias são um grave problema de saúde pública em diversos países e estão distribuídas, principalmente, em áreas endêmicas em países da África, Ásia, América Central e do Sul. Entre estas doenças estão a doença de Chagas e a doença do Sono, reconhecidas como negligenciadas. Há uma necessidade de tratamentos mais eficientes para essas doenças devido a toxicidade, baixa eficácia e segurança dos fármacos existentes, além da dificuldade de administração e evolução de resistência. O grupo de pesquisa da Dra. Núbia Boechat (Farmanguinhos/FIOCRUZ), vem realizando estudos com análogos nitroimidazólicos sintetizados considerando o megazol como protótipo, molécula ativa contra Trypanosoma cruzi, porém com efeitos mutagênicos e genotóxicos. Estes derivados apresentaram atividade contra o T. cruzi, com menor efeito genotóxico quando comparados com o megazol. Através deste trabalho, a relação estrutura-atividade dos derivados nitroimidazólicos (40a, 40b e 41a-41h) foi realizada e através dos descritores eletrônicos HOMO e LUMO, observou-se que grupos volumosos e com caráter retirador de elétrons do anel nitroimidazólico apresentam relação direta com a atividade. A avaliação do perfil toxicológico in silico confirmou que o composto 41a, mais ativo da série, não apresentou citotoxicidade em células sanguíneas humanas in vitro. O modelo da enzima nitrorredutase de T. cruzi, construído por modelagem comparativa, pode ser utilizado nos estudos de docagem molecular, os quais sugeriram que o tamanho da molécula, a possibilidade de interação com os resíduos His503 e Tyr545 e interações hidrofóbicas do tipo π-π com o cofator FMN podem contribuir para a atividade de derivados nitroimidazólicos no sítio ativo da enzima nitrorredutase. Através dos estudos de docagem molecular, sete novos derivados otimizados foram propostos (PR01 a PR07), dentre os quais o PR03, considerado como melhor ligante planejado, apresentou interações no sítio ativo similares às observadas para o protótipo 41a. Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho podem ser úteis a novas pesquisas e podem contribuir para o desenvolvimento de novos protótipos contra o T. cruzi / Parasitic diseases are a major public health problem in many countries, and they are distributed primarily in endemic areas in Africa, Asia, Central and South America. Among them, there are Chagas disease and African trypanosomiasis, known as neglected. There is a need for better treatments for these diseases due to toxicity, low efficacy and safety of the existing drugs, besides the difficulty of administration and evolution of resistance. The research group of Dr. Núbia Boechat (Farmanguinhos/FIOCRUZ), has been conducting studies with nitroimidazole analogs synthesized through the prototype megazol (active molecule against trypanosoma, but with mutagenic and genotoxic effects). In this work, the structure activity relationship of the nitroimidazole derivatives (40a, 40b and 41a-41h) was performed and it was observed through the electronic descriptors HOMO and LUMO that groups with electron withdrawing character display relation with activity. In silico toxicological studies confirmed that the most active compound 41a did not show cytotoxicity in human blood cells in vitro. T. cruzi type I nitroreductase constructed by comparative modeling, can be used in molecular docking studies, which suggested that the size of the molecule, the possibility of interaction with the residues His503 and Tyr545, and hydrophobic interactions of the π- Π with the FMN cofactor may contribute to the activity of nitroimidazole derivatives in the active site of the nitroreductase. From molecular docking studies, seven new optimized derivatives were proposed (PR01 to PR07), among them PR03 was considered as the best planned molecule, it displayed similar active site interactions to those observed for prototype 41a. Thus, the results obtained in this work may be useful to new research and may contribute to the development of new prototypes against T. cruzi

Chagas disease is endemic in a region from Mexico to Argentina. In Brazil, chronic cases predominate with approximately two million infected individuals. Central nervous system involvement, triggering stroke in chagasic patients with myocardiopathy, has occurred in high incidence, usually due to cardiac emboli originating from apical aneurysm, mural thrombi and atrial fibrillation. However, the occurrence of stroke can also occur in individuals with Chagas disease (CD) even without a history of cardiopathy. This study aims to evaluate cerebral hemodynamics in individuals with serological diagnosis for CD through Transcranial Doppler(TCD) in the various chronic forms of the disease. A cross-sectional study was carried out in twelve settlements in the rural area of municipality of Umbaúba, State of Sergipe, where 617 individuals answered a questionnaire on socio-epidemiological conditions and collected blood sample for the performance of serology for Trypanosoma cruzi. There was a prevalence of 12.1% (75/617) of seropositivity for CD, 64% had a primary school level and 33.3% were illiterate, 78.7% worked in agriculture and 92% had a family income of up to one minimal salary. Of these seropositive individuals, 71 underwent clinical examination and electrocardiogram, echocardiogram, chest X-ray, and contrast-enhanced radiography of the esophagus and colon to determine the clinical form of CD. For the TCD, 96 individuals participated, 59 seropositive for CD and 37 seronegative. These individuals had a mean age of 54 ± 11 years and female sex in 62.5%. Among the chronic clinical forms of CD, 22 individuals were in the indeterminate, 17 cardiac, 16 cardiodigestive and 4 digestive forms. The values of mean velocity of the middle cerebral artery (MVMCA) and pulsatility index did not change in the individuals examined. Correlating the mean velocity of the middle cerebral artery with the age and clinical forms of Chagas disease and control, it was observed that in the cardiac and indeterminate forms and control there was a reduction of the MVMCA with the increase of the age in a similar way. However, with the cardiodigestive and digestive forms, the opposite occurred, increasing MVMCA with increasing age. No signs of microemboli were evident. The present study did not show alteration of the cerebral hemodynamics among the clinical chronic forms and control, probably due to individuals with CD being in a controlled phase of the disease, not presenting during the research symptoms or cardiac signals. / A doença de Chagas é endêmica numa região que abrange desde o México até a Argentina. No Brasil, atualmente predominam os casos crônicos com aproximadamente dois milhões de indivíduos infectados. O acometimento do sistema nervosa central, desencadeando acidente vascular cerebral (AVC) nos indivíduos chagásicos com miocardiopatia tem ocorrido em alta incidência, geralmente em decorrência de êmbolos cardíacos originados de aneurisma apical, trombos murais e fibrilação atrial. Entretanto, a ocorrência de AVC também pode advir de indivíduos com doença de Chagas (DC) mesmo sem história de cardiopatia. Este estudo tem por objetivo avaliar a hemodinâmica cerebral nos indivíduos com diagnóstico sorológico para DC por meio do Doppler Transcraniano (DTC) nas diversas formas crônicas da doença. Foi realizado um estudo transversal em doze povoados da zona rural do município de Umbaúba, Estado de Sergipe, onde 617 indivíduos responderam a um questionário sobre as condições sócio epidemiológicas e coletado amostra de sangue para realização de sorologia para Tripanosoma cruzi. Houve uma prevalência de 12,1% (75/617) de soropositividade para DC, 64% apresentavam nível de escolaridade primária e 33,3% eram analfabetos, 78,7% trabalhavam na lavoura e 92% tinham renda familiar de até um salário mínimo. Desses indivíduos soropositivos, 71 foram submetidos ao exame clínico e realização de eletrocardiograma, ecocardiograma, radiografia de tórax e radiografia contrastada de esôfago e cólon para determinar a forma clínica da DC. Para a realização do DTC, participaram 96 indivíduos, 59 soropositivos para DC e 37 soronegativos. Esses indivíduos tiveram uma média de idade de 54± 11 anos e sexo feminino em 62.5%. Dentre as formas clínicas crônicas da DC, 22 indivíduos estavam na forma indeterminada, 17 cardíaca, 16 cardiodigestiva e 4 digestiva. Os valores da velocidade média da artéria cerebral média (VMACM) e do índice de pulsatilidade não apresentaram alteração nos indivíduos examinados. Correlacionando a velocidade média da artéria cerebral média com a idade e as formas clínicas da doença de Chagas e o controle, foi observado que nas formas cardíaca, indeterminada e controle houve redução da VMACM com o aumento da idade de maneira semelhante. Entretanto com as formas cardiodigestiva e digestiva ocorreu o contrário, elevação da VMACM com o aumento da idade. Não foram evidenciados sinais de microêmbolos. O presente estudo não demonstrou alteração da hemodinâmica cerebral entre as formas crônicas clínicas e o controle, provavelmente em decorrência dos indivíduos com DC estarem numa fase controlada da doença, não apresentando durante a pesquisa sintomas ou sinais cardíacos. / Aracaju