Um die Funktion von Proteinen in ihrer natürlichen Umgebung zu verstehen, ist es unerlässlich ihre Lokalisation und Bewegung im lebenden System durch z.B Fluoreszenz-markierung sichtbar zu machen. Eine ideale Markierungsmethode zeichnet sich dadurch aus, dass sie das Zielprotein (protein of interest, POI) selektiv und in kurzer Zeit mit einer maßgeschneiderten Reportergruppe ausstattet, ohne die Proteinfunktion und -lokalisation zu beeinflussen. Dabei ist die Größe der Erkennungssequenz von großer Bedeutung. In dieser Arbeit wird die Entwicklung einer Markierungsstrategie beschrieben, bei der die Ausbildung eines parallelen Coiled-Coil-Motivs den Transfer einer Reportergruppe auslöst. Untersucht wurde dabei die Übertragung eines Sulfonat-gebundenen Fluorophors auf ein Cystein in der Erkennungssequenz durch nukleophile Substitution. Ebenfalls untersucht wurde der Transfer verschiedener Thioester-verknüpfter Reporter auf ein N-terminales Cystein der Erkennungssequenz durch eine Acyltransferreaktion. Beide Strategien zeichnen sich durch eine hohe Selektivität und einen geringen Massenzuwachs am Zielprotein aus. Der Acyltransfer mit Arylthioestern zeigte zudem eine bemerkenswerte Reaktivität und erlaubte eine Markierung innerhalb weniger Minuten Reaktionszeit. Die Vielfältigkeit dieser Methode wurde anhand der Fluoreszenzmarkierung von sieben verschiedenen G-Protein gekoppelten Membranrezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen demonstriert. Die markierten Rezeptoren blieben dabei funktional und konnten ihren entsprechenden Liganden mit hoher Affinität binden. / In order to understand the function of proteins in their native environment, it is crucial to visualize their localization and trafficking in living cells by means of e.g. fluorescence labeling. An ideal labeling method adds a custom reporter group to the protein of interest (POI) in a selective and fast manner without disturbing the POIs function and localization. Hence the size of the recognition sequence is of major concern. This work describes the development of a labeling strategy in which the formation of a parallel coiled coil motif triggers the transfer of a reporter group. The transfer of a sulfonate-linked fluorescence dye onto the cysteine-modified recognition sequence via a nucleophilic substitution reaction was tested. Also the transfer of various thioester-linked reporters onto the N-terminal cysteine of the recognition sequence via an acyl transfer reaction was investigated. Both strategies are characterized by a high selectivity and low mass increase at the target protein. The acyl transfer with aryl thioesters also showed a remarkable reactivity and allowed labeling reactions to proceed within minutes. The versatility of this method was demonstrated by applying it to the labeling of seven different G-protein coupled membrane receptors on the surface of living cells. The labeled receptors remained functional and were able to bind their respective ligand with high affinity.

Die oxidative Transformation der Thiol-Gruppe des Cysteins in verschiedene andere funktionelle Gruppen wird als sehr wichtige posttranslationale Modifikation (PTM) angesehen. Cysteinsulfensäure (SA) ist eine Zwischenstufe der Thiol-Oxidation: Sie kann entweder mit freien Thiolen reagieren, um Disulfide zu bilden oder durch reaktive Sauerstoffspezies (reactiveoxygenspecies, ROS) weiter oxidiert werden. Jede Störung des zellulären Redox-Haushalts wird mit altersbedingten Erkrankungen , daher stellt die Überwachung des SA-Spiegels einen vielversprechenden Wegdar, den Status dieses Redox-Haushalts festzustellen. Da bereits kleinste Änderungen der Proteinmengen und PTMs tiefe Einblicke in den Zustand des biologischen Systems liefern können, ist eine quantitative Bestimmung von großer Bedeutung.Technologische Fortschritte im Bereich der Trennungsmethoden und Massenspektrometrie (MS) erlaubten die Entwicklung umfassender Möglichkeiten in der Protein-Analytik. In dieser Arbeit wurde eine neue, hochsensitive und selektive Methode zur Detektion von SA entwickelt. Dafür wurde ein Alkin-β-Ketoester (KE) an einen Lanthanid-haltigen (Ln) Chelatkomplex. Zum Nachweis des Funktionsprinzips wurden, mittels H2O2, Sulfensäuren in verschiedenen Peptidsequenzen erzeugt, um die in biologischen Systemen durch ROS hervorgerufenen Oxidationen nachzustellen. Diese Sulfensäuren wurden anschließend durch den Ln-DOTA-KE-Komplex gebunden. Die Bildung dieser SA-Ln-DOTA-KE-Einheit wurde mittels (Elektronenspray-Ionisation/ ESI-MS) und (induktiv gekoppeltem Plasma/ICP-MS) nachverfolgt. Die entwickelte Methode wurde weiterhin auf die Bestimmung von SA-Bildung in humanem Serum angewandt, humanes Serumalbumin wurde angereichert via Affinitätschromatographie. ICP-MS diente der Bestimmung der SA-Ln-DOTA-KE-Einheit, durch Kombination mit einer Isotopenverdünnungsanalyse (IDA) wurde eine absolute Quantifizierung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen oxidative Schäden bis zu 40 % des vorhandenen Albumins. / Oxidative transformation of cysteine thiol group into different functional groups is considered a significant posttranslational modification (PTM) of great importance. Cysteine sulfenic acid (SA) is the transient state for thiol group oxidation; it can react with free thiols to form disulfide bonds or can be further oxidized with reactive oxygen species (ROS) to form sulfinic and sulfonic acids. As any disturbance in the cellular reduction-oxidation (redox) balance is correlated to age-related diseases, the detection of SA transient state formed a sensor for such redox-mediated events. Whereas only any small change in the quantity of proteins, as well as the formed PTMs, can provide deeper insights into the status of the biological system, quantitative analysis should be carried out to reveal the status of the system. On the other hand, the technological advances, in particular the separation techniques and mass spectrometry (MS), allowed the development of several approaches for the comprehensive assessment of proteome analysis. Herein, we provide a new strategy for the highly sensitive and specific detection of SA using alkyne β-ketoester (KE) previously linked to a lanthanide (Ln)-containing chelator (Ln-DOTA. SA was generated by hydrogen peroxide (H2O2) in different peptide sequences by ROS and was detected by the prepared compound Ln-DOTA-KE. Molecular mass spectrometry (electrospray/ ESI-MS) and (Inductively coupled plasma mass spectrometry /ICP-MS) have been used to monitor the formation of SA linked to Ln-DOTA-KE. The developed strategy has been further applied to the determination of SA-induced formation in human serum by using affinity chromatography for purification of albumin followed by ICP-MS to monitor the formed SA linked to Ln-DOTA-KE in combination with isotope dilution analysis (IDA) for the absolute quantification. Quantitative results showed levels of oxidative damage regarding SA formation in human serum up to 40% of the albumin present.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Thermodynamik und Kinetik der Proteinadsorption auf neutralen sowie geladenen, kolloidalen Kern-Schale-Mikrogelen untersucht. Die weiche polymere Schicht der Schale reagiert mit großen Volumenänderungen auf Änderungen der Umgebungstemperatur, des pH-Wertes oder der Salzkonzentration. Untersuchungen mit Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FT-IR) zeigten, dass generell die native Sekundärstruktur der verwendeten Proteine, die auf den Mikrogelen adsorbiert wurden, erhalten blieb. Im Gegensatz zur Proteinadsorption auf festen Oberflächen wurde zudem eine hohe katalytische Aktivität der Enzyme nach der Immobilisierung verzeichnet, die gegenüber derjenigen der freien Enzyme in manchen Fällen sogar erhöht war. Mithilfe der isothermalen Titrationskalorimetrie (ITC) und FT-IR Spektroskopie wurden als treibende Kräfte des Adsorptionsprozesses elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen identifiziert. Weitere Untersuchungen zeigten, dass im Falle von geladenen Mikrogelen das elektrostatische Potential wie auch der abgesenkte lokale pH-Wert innerhalb des Netzwerks eine Änderung des Ladungszustands der adsorbierenden Proteine zur Folge hat. Zusätzlich konnte mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie und der Verwendung Fluoreszenz-markierter Proteine die kinetische Aufnahme in die Mikrogele als auch die Reversibilität der Reaktion analysiert werden. Es wurde dabei ein dynamischer Austausch zwischen gebundenen und freien Proteinmolekülen nachgewiesen, welcher die Verwendung von Gleichgewichtsmodellen für die Beschreibung der Proteinadsorption rechtfertigt. Außerdem erfolgt der Vorgang in zwei Schritten: i) ein schneller diffusionslimitierter Schritt, in dem der Hauptteil der gesamten Proteinmenge bindet und ii) ein anschließender wesentlich langsamerer Bindungsvorgang. Die Adsorptionsexperimente wurden anschließend auf Untersuchungen in binären Proteinmischungen ausgedehnt, um die kompetitive Proteinadsorption zu studieren. / In the present work the thermodynamics and the kinetic mechanism of protein adsorption to charged and uncharged core-shell microgels of colloidal dimension were explored. The soft polymeric layer of the shell is sensitive towards changes of the temperature, pH value, and salt concentration of the solution which results in a drastic volume change upon change of one of these triggers. Studies with Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy showed, that the secondary structure of the proteins used was significantly retained after immobilisation regardless of the charge state of the microgels employed. Moreover, unlike protein adsorption onto solid surfaces immobilisation into the networks did not compromise the catalytic activity of the proteins. Actually, an enhanced activity was found for some cases. The thermodynamic analysis performed by isothermal titration calorimetry (ITC) and structural investigations by FT-IR spectroscopy experiments led to the identification of the electrostatic and hydrophobic interactions as the main driving forces of protein adsorption. Further studies showed that proteins bound to negatively charged gel networks regulate their charge according to the electrostatic potential and to the lowered local pH value around the hydrogels. Fluorescence spectroscopy experiments with fluorescent-tagged proteins were suitable to analyse the kinetic uptake of the proteins into the gel networks as well as the reversibility of binding. It was demonstrated that bound proteins are dynamically exchanged by proteins in solution which justifies the application of equilibrium binding models to quantify the adsorption data. Moreover, the adsorption of proteins proceeds in two steps: i) a fast, diffusion-limited binding regime in which the majority of proteins is bound and ii) a second slow binding regime. The adsorption experiments were extended to binary protein mixtures in order to study competitive protein adsorption.

Einleitung: Wachstumsprozesse beim gesunden Menschen sind weitgehend untersucht und bekannt. Über die Auswirkungen von stark erniedrigtem bzw. fehlendem Wachstumshormon auf das Längen- und Breitenwachstum einzelner auxiologischer Parameter und die Folgen einer Wachstumshormonsubstitutionstherapie auf die Körperproportionen im Einzelnen weiß man außer den Kenntnissen über die Körperhöhenveränderungen wenig. Fragestellung: Ziel dieser Arbeit war die auxiologische Untersuchung von Kindern mit Wachstumshormonmangel vor und unter einer Substitutionstherapie mit Wachstumshormon. im Vordergrund stand die Erkennung bestimmter auxiologischer Muster vor und die Frage nach Veränderungen der Körperproportionen unter der Therapie. Methode: Grundlage der Daten sind 62 Kinder mit idiopathischem und 20 Kindern mit organischem Wachtumshormonmangel, bei denen über einen maximalen Zeitraum von fünf Jahren halbjährlich 22 verschiedene Parameter vermessen und drei weitere berechnet worden sind. Ergebnisse: Die phänotypischen Merkmale des hypophysären Kleinwuchses vor Substitutionsbeginn (Puppengesicht, Akromikrie, pyknomorpher Körperbau) sind Ausdruck bestimmter auxiologischer Konstellationen, die Längenparameter weichen signifikant stärker als die Breitenparameter vom Altersnormwert ab. In Abhängigkeit von der Therapiedauer kommt es durch unterschiedlich stark ausgeprägte Größenzuwachsraten im Verhältnis zum Längenwachstum insbesondere bei der Unterarmlänge, den Breiten- und Tiefenmaßen des Thorax und den Kopfmaßen zu Veränderungen der Körperproportionen. In der Regel verbessern sich die Ausgangsproportionen. Der relative Körperfettgehalt, sowie die Umfänge (Brust-, Taillen- und Hüftumfang) nehmen unter der Therapie in Relation zur Körperhöhe ab. Schlussfolgerung: Anhand der vorliegenden Daten wird gezeigt, dass die Substitutionstherapie mit Wachstumshormon beim hypophysären Kleinwuchs Auswirkungen auf das Längen- und Breitenwachstum einzelner auxiologischer Parameter hat und sich von physiologischem Wachstum unterscheidet. Für die Bestätigung unserer Beobachtungen sind weitere prospektive Untersuchungen in größeren Kollektiven notwendig. / Introduction: Processes of growth in healthy children are well established. However, little is known about the effects of strongly degraded or missing growth hormone on the lengths and breadths growth of single axiological parameters. In particular, changes of body proportions under hormone replacement therapy are not known. Objective: The aim of the study was to estimate the influence of growth hormone deficiency of single axiological parameters and changes in body proportions during replacement therapy with growth hormone. Patients/Material and Methods: Subjects studied include 62 children with idiopathic growth hormone deficiency and 20 children with organic reason of growth hormone deficiency. 22 anthropometric measurements per person were taken by the same trained examiner prior to the start of GH-treatment and then every six months over a maximal period of 5 years. Results: Results give a distinct anthropometric picture before start of therapy. All linear parameters were significantly below average, while width measurements differed less. During treatment changes of the body proportions occur due to different growth rates of measured distances compared to height growth. The most positive changes were seen in the upper arm, hand and feet growth under GH-therapy. A comparable low growth was seen in forearm length, chest width and depth and head measures. The growth dynamics of the other parameters correspond to that of height itself. Conclusion: It is shown that the replacement therapy with growth hormone has different effects on the length and width growth of different bones. The growth is different from physiological growth processes in patient with growth hormone deficiency. Further prospective examinations are necessary to confirm our observations in larger collectives.

Reaktionen zwischen reaktiven Oligonukleotiden, die durch komplementäre Nukleinsäuretemplate in hoher effektiver Molarität angeordnet werden, haben auf dem Gebiet der Nukleinsäurediagnostik an Bedeutung gewonnen. Sie bieten die Möglichkeit zur Erzeugung von mehreren Signalmolekülen pro Templat, wenn die templatgebundenen Produkte durch neue Reaktanden verdrängt werden. Da die Produkte ebenfalls hohe Templataffinitäten aufweisen, schränken sie jedoch die katalytische Templataktivität ein (Produktinhibierung). In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuer Ansatz zur Umgehung der Produktinhibierung entwickelt. Dazu wurde eine DNA-vermittelte PNA-Verknüpfungsreaktion in eine PCR integriert. Die Reaktion wurde direkt durch das während der PCR vervielfältigte Templat ausgelöst und erfolgreich in der einzelbasenspezifischen Genotypisierung von genomischer DNA eingesetzt. Die Nachweisgrenze war mit 30 Templatmolekülen im Vergleich zu bisherigen templatgesteuerten Reaktionen um etliche Größenordnungen niedriger. Ein alternativer Ansatz widmete sich neuen Strategien zur Verminderung der Produktinhibierung. Templatgesteuerte Verknüpfungs-Zyklisierungsreaktionen lieferten zyklische Verknüpfungsprodukte, welche gegenüber ihren linearen Pendants durch deutlich geringere Templataffinitäten gekennzeichnet waren. Daher überstiegen die Ausbeuten jene von Verknüpfungsreaktionen ohne Zyklisierung. Die Zunahme der Templataffinität in Folge der Verknüpfung wurde jedoch durch die Zyklisierung nicht vollständig kompensiert. Daher wurden templatgesteuerte Transferreakionen entwickelt, bei denen das DNA-Templat die Zyklisierung von nicht verknüpften Reaktionsprodukten steuert. Diese waren durch geringere Templataffinitäten als die linearen Reaktanden gekennzeichnet. Die Transfer-Zyklisierungsreaktionen lieferten bei fortgeschrittener Reaktion höhere Ausbeuten als Transferreaktionen ohne Zyklisierungsschritt. Dies bestätigte die erfolgreiche Verminderung der Produktinhibierung. / Reactions between reactive oligonucleotides that are aligned by complementary nucleic acid templates at high effective molarities have gained considerable attention in the field of nucleic acid diagnostics. They are capable of generating multiple signaling molecules per target, if the template-bound products are replaced by fresh reactants. However, since product molecules usually exhibit high template affinities, they impede the catalytic activity of the template (product inhibition). This work initially describes the development of a new approach that bypasses product inhibiton. To this end, a DNA-mediated PNA-ligation reaction was integrated in a PCR. The reaction was directly triggered by the template which was amplified during PCR. Furthermore, the reaction was successfully applied in single base-specific genotyping of genomic DNA. The limit of detection (30 template molecules) was several magnitudes lower compared to previous template-controlled reactions. In an alternative approach, new strategies to reduce product inhibition were developed. Template-mediated ligation-cyclization (“cycligation”) reactions generated cyclic ligation products that were characterized by significantly lower template affinities compared to their linear counterparts. The yields upon cycligation were higher than those from ligation reactions without cyclization. However, the increase in template affinity gained upon ligation of the reactants could not be completely compensated through product cyclization. Therefore, template-mediated transfer reactions were designed in which the DNA-template actuates the cyclization of non-ligated products. These were characterized by reduced template affinities compared to the linear reactants. The transfer-cyclization reactions produced higher yields than transfer reactions without a cyclization step, thereby confirming the successful reduction of product inhibition.

In dieser Arbeit wurde eine neuartige Möglichkeit zur Funktionalisierung von beliebigen Oberflächen entwickelt und getestet. p-(N-maleimido)phenyl- (MP) und p-Aminophenyl-Reste (AP) wurden auf CVD gewachsenem Graphen via Elektroreduktion der jeweiligen Diazoniumkationen abgeschieden. Die so funktionalisierten Graphenschichten wurden auf verschiedenste Materialien transferiert. Die Präsenz der funktionellen Gruppen wie auch ihre kovalente Anbindung wurde durch Infrarotellipsometrie und Ramanspektroskopie bestätigt. Für das MP-funktionalisierte Graphen wurde mittels optischer Simulation der IRSE-Daten die Dicke der MP-Schicht zu 4.4 nm vor und 4.8 nm nach dem Transfer bestimmt. Die Dicke nach Transfer wurde zusätzlich durch Infrarot-gekoppelte Rasterkraftmikroskopie zu 4.4 nm bestimmt. MP-Graphen wurde via MICHAEL-Addition sowohl mit p-Nitrobenzylmercaptan (NBM), als auch mit Cystein-terminierter Peptidnukleinsäure (PNA) modifiziert. Die jeweiligen Moleküle wurden nach dem Transfer per IRSE nachgewiesen. Die Modifikation mit NBM wurde darüber hinaus in einem Mikrofluidikaufbau in-situ verfolgt. Die Zeitabhängigkeit der Anreicherung an der MP-Oberfläche wurde mit der auf einer Goldoberfläche verglichen. AP-Graphen wurde mittels Zero-Length-Crosslinking mit p-Nitrobenzoesäure (NBA), sowie Carboxyl-funktionalisierten Nanokristallen (Quantum Dots) modifiziert. Die kovalente Anbindung wurde durch Vorhandensein der Amid-I-Bande nachgewiesen und der erfolgreiche Transfer mittels Photolumineszenz-Spektroskopie. Um das herausragende Potential des Transfers von funktionalisiertem Graphen zu zeigen, wurde PNA-modifiziertes MP-Graphen auf ein vorkontaktiertes Sensor-Array transferiert. Durch einfache Widerstandsbestimmung des Graphens konnte die Hybridisierung mit komplementärer DNA von 1b-mismatch DNA unterschieden werden. / A new pathway for the functionalization of arbitrary surfaces was developed and tested. p-(N-maleimido)phenyl (MP) and p-Aminophenyl (AP) residues were deposited on CVD grown graphene on copper, via electroreduction from the respective diazonium cation. The functional graphene layers were subsequently transferred to a variety of substrates, comprising metals (gold), insulators (SiO2, glass) and flexible ones (PTFE tape). The presence and covalent attachment of the desired groups was confirmed via infrared ellipsometry and Raman backscattering spectroscopy. The thickness of the Maleimidophenyl layer was determined via optical simulation of the IR ellipsometry data. The resulting 4.4 nm prior to and 4.8 nm after transfer to a gold film on silicon are in good agreement. The thickness after transfer was additionally measured using AFM, amounting as well to 4.4 nm. All results are in good agreement and confirm the possibility to transfer covalently functionalized graphene without noticeable loss. MP functionalized graphene was modified wet-chemically. MP-functionalized graphene was modified using the MICHAEL addition, attaching p Nitrobenzylmercaptane (NBM) or cysteine terminated peptide nucleic acid (PNA) to the surface. The success of modification and subsequent transfer was confirmed via infrared ellipsometry. MP graphene was furthermore integrated in a microfluidic setup. The time dependence of the accumulation of NBM on the functionalized graphene was compared to a similar on a plain gold surface. The different behaviour strongly hints at a covalent bonding between thiol and maleimide. AP functionalized graphene was modified via zero-length crosslinking with p Nitrobenzoic acid (NBA) and COOH containing Nanocrystals (Quantum Dots). The covalent attachment was shown by the presence of the amide bonds. Additionally, the successful transfer of the Quantum Dots was demonstrated via photoluminescence spectroscopy. To prove the outstanding potential of the transfer of functionalized graphene, PNA-modified MP-graphene was transferred on top of a pre-contacted sensor array. By simple current measurement, complementary DNA strands could be distinguished from the respective 1 b mismatch DNA.

In dieser Dissertation wurden Verfahren für die konvergente Synthese von Peptide entwickelt. Für die erweiterte native chemische Ligation kamen bisher raumbeanspruchende Auxiliare zum Einsatz, die anspruchsvolle Ligationen behinderten. Zudem waren die drastischen säure-basierten Abspaltbedinungen mit vielen post-translationalen Modifikationen nicht vereinbar. In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Auxiliargerüst mit geringerem Raumanspruch untersucht, dass eine erheblich mildere Abspaltung unter basischen Bedingungen ermöglichte. Dazu wurde ein kleiner Elektronenakzeptorsubsituent eingeführt, durch den nach der Ligation eine das Zielpeptid freisetzende Eliminierungsreaktion induziert werden konnte. Weiterhin konnte die Verwendung des kommerziell verfügbaren Penicillamins als Vorläufer in der Ligations-Entschwefelungs-Strategie demonstriert werden. Abschließend wurde die Ligation mit sequenz-internem Cystein untersucht. Hierbei zeigte sich, dass Peptide mit Cystein in einer bestimmten Position bevorzugt in thioester-basierten Kondensationen reagierten. / In this thesis approaches for convergent synthesis of peptides have been developed. In the extended native chemical ligation so far space demanding auxiliaries encumbered challenging condensations. Furthermore the required drastic acidolytic cleavage conditions were furthermore incompatible with many post-translational modifications. In the thesis a nouvelle less space demanding scaffold was scrutinized which allowed a milder basic cleavage. Therefore a small electron-accepting substituent was introduced that enabled the induction of an elimination reaction liberating the target peptide after the peptide ligation had taken place. Furthermore the applicability of the commercially available penicillamine as precursor of valine in the ligation-desulfurization strategy could be demonstrated. Finally the ligation with sequence internal cysteines was scrutinized. Herein it could be shown that certain peptides with cysteine in a distinctive position of the sequence preferable reacted in thioester-based condensation reactions.

Die vorliegende Arbeit untersucht mit bioinformatischen Methoden die biologische Bedeutung von Ähnlichkeiten in Kleinstrukturen und peptidischen Sequenzmotiven sowie lokaler und globaler Sequenzähnlichkeit. Der erste Teil der Arbeit behandelt chemische Ähnlichkeiten. Ausgehend von bekannten Inhibitoren der Fehlfaltung des Prionproteins wurde eine Datenbank pharmakologischer Wirkstoffe nach chemisch und strukturell ähnlichen Substanzen durchsucht und 16 Substanzen als neue potentielle Inhibitoren der Fehlfaltung vorgeschlagen. Der nächste Teil untersucht Ähnlichkeiten in Sequenzmotiven, die eine Interaktion mit Pex19, dem Importrezeptor für peroxisomale Membranproteine, vermitteln. In Zusammenarbeit mit einer experimentellen Arbeitsgruppe konnte die Bindestelle charakterisiert und Präferenzen für bestimmte Aminosäuren herausgearbeitet werden. Das Bindemotiv ist eine vermutlich helikale Region mit verzweigtkettigen aliphatischen und basischen Aminosäuren. Aus experimentellen Daten konnte eine positionsabhängige Vorhersagematrix erstellt und validiert werden. Die Beziehung zwischen lokalen Sequenzähnlichkeiten und der Konformation von Prolylbindungen in Proteinen ist Thema des dritten Teils. Die Aminosäurepräferenzen in der Nachbarschaft von cis- und trans-Prolylresten unterscheiden sich, und beide zeigen unterschiedliche Austauschpräferenzen bei Mutationen. Im Gegensatz zu lokaler Sequenzähnlichkeit ist eine globale Sequenzähnlichkeit von nur 20% ein wesentlich besserer Indikator für das Auftreten von cis-Prolylbindungen. Der letzte Teil befaßt sich mit inverser Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen, die wesentlich öfter auftritt als erwartet. Proteine aus einem nichtredundanten Datensatz wurden gleich- und gegenläufig aligniert und strukturelle Ähnlichkeiten zwischen den aufgefundenen Proteinpaaren untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß bis auf kurze Sekundärstruktur-Einheiten eine inverse Sequenzähnlichkeit zwischen Proteinen keine strukturelle Ähnlichkeit impliziert. / This work is dealing with the biological impact of similarities between chemical structures, protein sequence motifs and local sequence surrounding as well as global sequence similarity. All four aspects are analyzed by computational methods. The first part is dealing with chemical similarities. Based on a recently published set of prion protein misfolding inhibitors, a data base of approved drugs has been screened for compounds with chemical and structural similarities to these substances. 16 drugs are proposed as new potential inhibitors of prion protein aggregation. The next part addresses similarities of sequence motifs which mediate the interaction with the peroxisomal membrane protein import receptor Pex19. In cooperation with an experimental group, the binding site could be characterized, and amino acid preferences of the different positions of the motif have been determined. The binding motif is a probably helical region of target proteins bearing branched aliphatic and basic residues. A position specific scoring matrix for the prediction of Pex19 binding sites could be generated and validated. The relation between local sequence similarity and prolyl bond conformation is examined in the third part. Amino acid preferences of neighboring residues differ between cis and trans prolyl residues, and both species show different amino acid exchange patterns upon mutation. In contrast to local sequence similarity, overall sequence similarity between proteins as low as 20% is a much better indicator for the occurrence of cis prolyl bonds. The last part focuses on inverse sequence similarity between proteins which occurs far more often than expected by chance. Proteins from a nonredundant data set have been aligned in parallel and antiparallel, and structural similarities between the detected protein pairs have been examined. It could be shown that, with the exception of short secondary structural elements, inverse sequence similarity does not imply structural similarity.

Ergotalkaloide sind sekundäre Stoffwechselprodukte des parasitären Schlauchpilzes Claviceps purpurea der auf Getreide Mutterkörner (Sklerotien) bildet. In Sklerotien sind toxische Ergotalkaloide enthalten. Durch C. purpurea werden vorrangig sechs verschiedene Ergotalkaloid-Epimerenpaare gebildet, die toxischen C8-(R)-Epimere und die biologisch nicht relevanten C8-(S)-Epimere, die ineinander umgewandelt werden können. Das Ziel der Arbeit war es, die Epimerisierung der Ergotalkaloide während der Probenvorbereitung im Vergleich zu bisher bekannten Probenaufarbeitungsverfahren zu minimieren. Dieses gelang durch den Verzicht des Zusatzes starker Säuren oder Basen. Die aufgereinigten Extrakte können bei Raumtemperatur über 96 Stunden epimerisierungsfrei in einer tensidischen Acetonitril-Wasser-Lösung gelagert werden. Die Probenaufarbeitung mit anschließender Auftrennung über die Hochleistungsflüssigchromatographie und fluorimetrischer Detektion (HPLC-FLD) wurde für Roggenmehl und Speiseöl validiert und auf diese Martices angewendet. So konnten erstmals die Ergotalkaloidgehalte auch in Weizenkeimöl quantifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Epimerisierungsverhalten von Ergotalkaloiden bei Backversuchen und in vitro Verdauexperimenten untersucht. Das Backen resultierte in eine Verschiebung des Epimerengleichgewichtes auf die Seite der (S)-Epimere. Das angewendete in vitro Verdaumodell führte für die Ergotalkaloidepimerenpaare Ergotamin und Ergosin zu einer Verschiebung des Epimerengleichgewichtes auf die Seite der toxischen (R)-Epimere. Dagegen zeigten die Ergotalkaloide der Ergotoxingruppe eine Verschiebung des Epimerengleichgewichtes auf die Seite der (S)-Epimere. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit Ergotalkaloid-Konjugaten, die unter dem Einfluss von UV-Licht entstehen. Es wurden sechs Ergotalkaloid-Fettsäure-Konjugate synthetisiert und in Sklerotien über die HPLC in Verbindung mit massenspektrometrischer Detektion nachgewiesen. / Ergot alkaloids are secondary metabolites of the parasitic fungus Claviceps purpurea that forms sclerotia on cereals. These sclerotia contain toxic ergot alkaloids. C. purpurea forms six epimeric pairs of ergot alkaloids predominantly the toxic C8-(R)-epimers and the biologically inactive C8-(S)-epimers. In view of the fact that both epimeric forms can be transformed into one another, the objective of this work was to develop a novel sample preparation method that minimizes the epimerization rate compared to previously published methods. The presented sample preparation procedure minimizes epimerization of ergot alkaloids, as it operates without the addition of strong acidic or alkaline modifiers for matrix removal. After sample preparation, an ergot alkaloid containing extract in a sodium hexanesulfonate solution is obtained in which no epimerization after 96 hours was observed. Thus, the sample preparation allows extract storage at ambient temperature for prolonged HPLC analysis. This novel sample preparation followed by HPLC-flourescence analysis was validated for the matrices rye flour and wheat germ oil and was applied for food samples. This is the first time that the ergot alkaloid content in wheat germ oil was quantified. The second part of this work was the study of the epimerization behaviour of ergot alkaloids during baking and in vitro digestion. Baking of cookies resulted in a shift of the epimeric ratio towards the (S)-epimers. The in vitro digestion showed an ergot alkaloid specific shift of the epimeric ratio. The initial percentage of the (R)-epimer increased for ergotamine und ergosine. In contrast, ergot alkaloids of the ergotoxine type showed an epimeric shift towards their (S)-epimers. The third part of this work was the study of ergot alkaloid derivatives that are formed in combination with UV-light. Six different ergot alkaloid fatty acid derivates were synthesized and detected in sclerotia using a HPLC-MS/MS method.

Wir haben DNA-basierte Hybridisierungssonden zur erzwungenen Interkalation (sogenannte FIT-Sonden) entwickelt. Diese beruhen auf dem Ersatz einer natürlichen Nukleobase durch einen umgebungssensitiven Farbstoff. Die einzelsträngigen Sonden zeigen ein geringes Fluoreszenzsignal, da die Rotation um die zentrale Methinbrücke den angeregten Zustand effizient entvölkert. Durch Hybridisierung mit komplementären Zielsequenzen wird der Farbstoff in den Basenstapel gezwungen, wodurch die Rotation eingeschränkt wird und verstärkt Fluoreszenz auftritt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Sonden optimiert, um maximale Fluoreszenzanstiege und maximale Helligkeit zu erzielen. Wir konnten zeigen, dass der Einbau von Locked Nucleic Acid (LNA) gleichzeitigt die Helligkeit und die Stabilität gegenüber Nukleaseverdau vergrößert. Solche LNA-verstärkten FIT-Sonden konnten in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Anne Ephrussi (EMBL-Heidelberg) wurden solche Sonden erfolgreich in der Lebendzell-Bildgebung von Oskar mRNA in Oozyten von Drosophila Melanogaster eingesetzt. Die kombinierte Verwendung von Thiazolorange und einem zweiten, terminal angebrachten Cy7-Reporter ermöglichte durch Ratiometrische Messungen die Quantifizierung von Sonden und Ziel RNA durch waschfreien Fluoreszenz in-situ Hybridisierung. Wir konnten die Farbauswahl für FIT-Sonden erweitern und etablierten Chinolinblau als den höchst-responsiven Farbstoff in DNA-FIT-Sonden, welcher bis zu 195-fache Fluoreszenzintensivierung zeigte. Die Verwendung von cyan- (Thiazolgelb), grün- (Thiazolorange) und rot-emittierende (Chinolinblau) FIT-Sonden ermöglichte die simultane Detektion drei verschiedener RNA-Sequenzen. Dieselben Farbkanäle wurden ebenfalls zur Entwicklung von Wiederholungseinheiten für FIT-Sonden verwendet. Durch die Expression transgener RNA und die benachbarter Hybridisierung zahlreicher Sonden sollten die Mehrfarbdetektion in lebenden Zellen mit sehr geringer Nachweisgrenze gelingen. / We developed oligonucleotide hybridization probes based on forced intercalation (FIT). FIT probes contain asymmetric cyanine dyes of the thiazole orange family as nucleobase surrogates as an internal label. The thiazole orange is dark in the unbound, single stranded state, due to rapid depletion of the chromophores excited state by torsional twisting. Upon hybridization with target nucleic acids, the reporter is forced into the base stack, resulting in restriction of intramolecular rotation which is accompanied by a dramatic increase in quantum yield. The probes have been optimized for highest fluorescence response and maximum brightness upon hybridization with complementary nucleic acids. We discovered that locked nucleic acids (LNA) increase both, the nuclease resistance in living cells and the brightness. FIT-probes were applied in real-time PCR and RNA localization studies in fixed tissue and in living cells. Together with our collaborator Anne Ephrussi we demonstrated that carefully chosen probe sequences disrupted RNA secondary structure and thereby altered the motility of oskar ribonucleotide-particles in living oocytes of Drosophila melanogaster. The combined use of fluorogenic base surrogates and a second, terminally attached, independent reporter allowed the rapid intracellular RNA-quantification by means of wash-free fluorescence in-situ hybridization. We expanded the color repertoire of FIT probes by screening multiple chromophores and discovered quinoline blue as the most responsive chromophore with up to 195-fold fluorescence enhancement. The combined use of cyan- (thiazole yellow), green- (thiazole orange) and red-emissive (quinoline blue) FIT probes allowed the simultaneous detection of multiple RNAs of interest. The same color channels could be used for the development of artificial repeat tags for FIT-probes that will enable live-cell multiplexing by FIT-probes with transgenic RNAs.