O basidiomiceto Moniliophthora perniciosa é conhecido por causar a doença vassoura-debruxa no cacau (Theobroma cacao), responsável por grandes perdas de produção nessa cultura. A população de M. perniciosa apresenta variabilidade devido à sua capacidade de colonização de outras espécies de plantas, o que permite a identificação de biótipos e conseqüente agrupamento de isolados com base no hospedeiro. A caracterização de biotipos do fungo contribui para melhor conhecimento da estrutura populacional e sua dispersão, o que é importante para utilização em programas de melhoramento. Com esse objetivo foi avaliada a variabilidade genética e fisiológica de isolados do fungo correspondentes a três biotipos considerando a análise de taxas de crescimento pelo desenvolvimento micelial em diferentes meios e ambientes de cultivo in vitro, como a incorporação de cisteína, metionina e lisina e das fontes de nitrogênio tartarato de amônio e nitrato de potássio, iluminação, suscetibilidade a fungicidas, compatibilidade somática (SCG Grupo de Compatibilidade Somática), análise de perfis protéicos por SDS-PAGE e seqüenciamento parcial do 28S rDNA. A história evolutiva do patógeno não está registrada em seqüências de genes ribossomais e proteínas totais. Além disso, crescimento e produção de pigmentos são características compartilhadas pelos biótipos, não sendo fatores primários para adaptação do patógeno, porém com provável papel na colonização do hospedeiro. / The Basidiomycete Moniliophthora perniciosa is known as the pathogen for witches\' broom disease in cocoa (Theobroma cacao), responsible for large yield losts. Population of M. perniciosa presents variability due to its ability to colonize other plant species, which allows biotype identification and strains grouping, based upon the host specie. Fungi biotype characterization contributes to the knowledge of population and its dispersion and epidemiological methods, important for breeding programs. To aim the genetic and physiological variability of three strains, characteristics as growing rates, measured by the mycelia spreading at different culture media and different culture conditions in vitro, cysteine, methionine, lysine, nitrogen sources ammonium tartrate and potassium nitrate incorporation, light, fungicide susceptibility, somatic compatibility (SCG), protein patterns by SDS-PAGE and partial sequencing of rRNA 28S region were done. The evolutional history of it is pathogen is not printed into ribosomal genes sequences and total proteins. Besides that, growing and dye production are characteristics shared by the biotypes and can not be a primary adaptation factor but it can play a role in the host colonization process.

Moniliophthora perniciosa é um fungo basidiomiceto causador da doença vassoura de bruxa do cacaueiro. Um conjunto de técnicas para controle da doença vem sendo testado e aplicado, incluindo o uso de fungicidas a base de inibidores da cadeia respiratória principal, específicos para fungos. No entanto, M. perniciosa tem se mostrado resistente a estas drogas e uma possível explicação para tal resistência é a atividade de uma oxidase alternativa (AOXp), cuja expressão e atividade já vêm sendo caracterizadas. A análise funcional deste gene de M. perniciosa não foi realizada, pois uma técnica efetiva para produção de mutantes do fungo ainda não foi estabelecida. Assim, este projeto visou testar a hipótese de que a expressão do gene AOX de M. perniciosa (Mp-AOX) previne o estresse oxidativo devido à diminuição na produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) pela cadeia respiratória. Para isso realizamos a caracterização do gene Mp-AOX por clonagem e expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. O vetor de expressão em levedura pYES2/CT com o gene Mp-AOX foi montado e a linhagem de levedura W303-1b transformada. Foram realizadas análises de medição de formação de massa celular, geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) mitocondrial, testes de viabilidade na presença de inibidores da cadeia respiratória principal Antimicina A e azoxistrobina e do inibidor específico de AOXp - ácido salicil hidroxâmico (SHAM). Nossos resultados indicam que quando o gene Mp-AOX é expresso em S. cerevisiae há diminuição da geração de biomassa celular, menor proliferação celular e decaimento na produção de ROS, sugerindo que nossa hipótese inicial de que Mp-AOXp causa alívio no estresse oxidativo estar correta. A levedura recombinante expressando o gene Mp-AOX mostrou-se viável para utilização como modelo para estudos de novos análogos químicos para o combate da vassoura de bruxa, auxiliando a agricultura e promovendo novos entendimentos para o combate desse fungo. / Moniliophthora pernicious is a basidiomycete fungus that causes witches\' broom of cacao disease. A number of techniques for disease control has been applied and tested, including the use of the fungicides that inhibits the main respiratory chain, specific to fungi. However, M. pernicious has proven to be resistant to these drugs and one possible explanation to this resistance would be the activity of an alternative oxidase activity (AOXp), whose expression and activity have already been characterized. Functional analysis of this gene in M. pernicious was not performed because an effective technique for producing mutants of the fungus has not yet been established. This project aimed to test the hypothesis that the expression of Mp-AOX gene prevents oxidative stress due to decreased production of reactive oxygen species (ROS) by the respiratory chain. To perform this characterization, Mp- AOX gene was cloned and heterologous expressed in Saccharomyces cerevisiae. The yeast expression vector pYES2/CT with Mp-AOX gene was constructed and the yeast strain W303 - 1b transformed. Analyses measuring cell mass formation, generation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS), viability tests challenging the cells against inhibitors of the main respiratory chain, Antimycin A and azoxystrobin, and against the specific inhibitor of the AOXp - salicylaldehyde hydroxamic acid (SHAM) were performed. Our results indicate that the Mp-AOX gene expression in S. cerevisiae causes decreased generation of cellular biomass, less cell proliferation and the decay in the production of ROS, suggesting that our initial hypothesis that Mp-AOXp reliefs the oxidative stress is correct. The recombinant yeast expressing Mp- AOX gene was feasible for use as a model for studies of new chemical to fight witches\' broom, helping with agriculture and promoting new understandings to combat this fungus.

O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite

A vassoura-de-bruxa é a doença mais importante da cultura do cacaueiro, nos países onde ela ocorre. Em 1989 foi constatada pela primeira vez a presença do patógeno causador dessa doença na principal região produtora do Brasil. A falta de medidas de controle eficientes resultou, nos últimos anos, em menor produção, mudanças no uso da terra, venda de propriedades, diminuição do nível de emprego e danos ao meio ambiente. Em vista do pouco conhecimento sobre aspectos epidemiológicos da doença nas condições do sudeste da Bahia, elaborou-se o presente trabalho com os seguintes objetivos: estudar o gradiente de infecção da vassoura-de-bruxa em ramos e frutos em cacaueiros enxertados; comparar o efeito de genótipos e três tratamentos (poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensais) no controle da doença; estudar o progresso da vassoura-de-bruxa no tempo, quantificado em ramos e frutos doentes. O experimento foi conduzido em Uruçuca, BA, em área contendo 16 genótipos diferentes, adjacente a uma área com cacaueiros abandonados com alta incidência da doença. A área experimental foi dividida em três partes, as quais receberam os seguintes tratamentos: poda fitossanitária semestral, poda fitossanitária mensal e poda fitossanitária aliada a aplicação de fungicida mensal. Pelo menos uma vez por mês foram contados os ramos e frutos com vassoura. Os resultados mostraram a ausência de evidência clara da existência de gradiente de doença. Os níveis de resistência genética à vassoura-de-bruxa de ramos e frutos não foram correlacionados entre si. Houve bom ajuste do progresso da doença ao modelo monomolecular. As menores taxas de crescimento foram obtidas no tratamento com poda e aplicação de fungicida mensal. O tratamento que combinou poda e pulverização com fungicida apresentou diferença significativa na redução do percentual de frutos com vassoura. Os genótipos NO-34, NO-17 e NO-02 foram os que apresentaram menores percentagens de frutos com vassoura, sendo significativamente diferentes dos genótipos NO-24 e NO-13. / Witches' broom is the most important disease of cocoa, in the countries where it occurs. In 1989, it was verified for the first time the presence of the pathogen in the main producing area of Brazil. The lack of efficient control measures resulted, in the last years, in losses in the production, changes in the use of the soil, sale of properties, decrease of the employment level and damages to the environment. In view of the little knowledge on epidemic aspects of the disease in the conditions of the southeast of Bahia, the present work was elaborated with the following objectives: to study the gradient of the witches' broom infection in flushes and pods in grafted cocoa; to compare the effect of genotypes and three treatments (half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application) in the control of the disease; to study the witches' broom temporal progress, quantified in flushes and pods. Trials were carried out in Uruçuca, BA, in area contends 16 different genotypes, adjacent an area with abandoned cocoa with high incidence of the disease. The experimental area was divided in three parts, which received the following treatments: half-yearly phytosanitation, monthly phytosanitation and monthly phytosanitation allied to fungicide application. At least once a month, flushes and pods with broom were counted. Results showed the absence of clear evidence of the existence of disease gradient. The levels of genetic resistance to the witches' broom of flushes and pods were not correlated to each other. There was good adjustment of progress of the disease to the monomolecular model. The smallest growth rates were obtained in the treatment with monthly phytosanitation and fungicide application. The treatment that allied phytosanitation and fungicide application presented significant difference in the reduction of the percentage of witches' broom infected pods. The genotypes NO-34, NO-17 and NO-02 presented smaller percentages of diseased pods, being significantly different from the genotypes NO-24 and NO-13.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-25Bitstream added on 2014-06-13T20:04:39Z : No. of bitstreams: 1 simoes_mlg_dr_rcla.pdf: 7383499 bytes, checksum: 3bdb988e95e0edaf3bc9450a229443f5 (MD5) / Diferentes isolados de Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum, e T. viride) e um isolado de T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum foram estudados para uso no biocontrole de quatro subgrupos genéticos de Moniliophthora perniciosa, designados como Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. A associação das características dos isolados de Trichoderma avaliados quanto à velocidade de crescimento micelial, germinação, produção de esporos e produtividade massal de esporos em arroz, além das suas capacidades de antibiose e micoparasitismo a cada subgrupo do patógeno, resultou na determinação do índice denominado Potencial para uso no biocontrole (%PCB) a cada subgrupo de M. perniciosa. Os %PCBs variaram, demonstrando haver variabilidade genética entre os isolados do antagonista quanto às características avaliadas, como também nos níveis de resistência do patógeno. T. harzianum 911 apresentou o melhor %PCB para todos os subgrupos de M. perniciosa, sendo o pior apresentado por T. reesei 1612. Mp1445 foi o subgrupo que apresentou a menor capacidade de supressão aos antagonistas, sendo a maior apresentada por Mp1916. T. harzianum 906 inibiu o crescimento de Mp1916 por metabólitos não voláteis e todos os isolados de Trichoderma avaliados inibiram todos os subgrupos do patógeno pela ação de metabólitos voláteis, variando, porém, os percentuais de inibição entre as espécies e entre isolados da mesma espécie. Mp1445 inibiu o crescimento de T. virens 2007 por metabólitos não voláteis, sendo comprovada, portanto, a possibilidade do patógeno inibir o antagonista. T. harzianum 911 apresentou capacidade de micoparasitismo em placa e em vassouras infectadas individualmente pelos subgrupos do patógeno, além de produzir as enzimas β-1,3-glucanase, quitinase, protease, FPase, CMCase e amilase, tanto em substratos específicos como em cultivos... / Different isolates of Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum and T. viride) and one isolate of T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum were studied for their usage in biocontrol of four genetic subgroups of Moniliophthora perniciosa named as Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. The association of the characteristics of the Trichoderma isolates evaluated regarding to velocity of mycelial growth, germination, spores production in Petri dish and mass production of spores in rice, besides their capacities of antibiosis and mycoparasitism to each subgroup of the pathogen, resulted in the determination of the index named Potential to be used in Biocontrol (%PCB) to each subgroup of M. perniciosa. The %PCBs varied, pointing out that there is a genetic variability among the antagonistic isolates regarding to the evaluated characteristics, as well as the levels of the pathogen resistance. T. harzianum 911 showed the best %PCB for all subgroups of M. perniciosa, being the worst presented by T. reesei 1612. Mp1445 was the subgroup that presented the lowest antagonistic suppression capacity, being the highest presented by Mp1916. T. harzianum 906 inhibited the growth of Mp1916 by non-volatile metabolites and all the evaluated isolates of Thrichoderma inhibited all the subgroups through volatile metabolites, varying, although, the percentages of inhibition among the species and among the isolates of the same species. Mp1445 inhibited the growth of T. virens 2007 by non-volatile metabolites, being proved, therefore, the possibility of the pathogen to inhibit the antagonist. T. harzianum 911 presented the mycoparasitism capacity in Petri dishes and in brooms infected indiviadually by the pathogen, besides the production of β-1,3-glucanase, chitinase, protease, FPase, CMCase and amilase, in both specific substrates and in cultivations with dried mycelia... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-15Bitstream added on 2014-06-13T20:23:22Z : No. of bitstreams: 1 moreira_rfc_dr_jabo.pdf: 545090 bytes, checksum: 6b6b5062d2bd5f7bc8ff1ca523e6a689 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) / Comon Fund For Comidities, International Cocoa Organization / Vassoura-de-bruxa e podridão de Moniliophthora, causadas pelos fungos Crinipellis perniciosa e Moniliophthora roreri, respectivamente, são as doenças de maior impacto econômico da cultura do cacau e estão presentes na maioria dos países produtores do Continente Americano. Evidências biológicas e moleculares comprovam que estes fitopatógenos estão intimamente relacionados. O uso de resistência genética através de dones resistentes de cacaueiro, é a medida mais eficiente no controle destas doenças. O conhecimento sobre as populações destes fungos é importante na geração de informações para o programa de melhoramento genético do cacau visando resistência. Marcadores moleculares RAPO e SSR foram usados para analisar a estrutura genética de populações destes fitopatógenos. No geral, as populações do Brasil, Equador, Peru e Trinidad agruparam-se de acordo com o país de origem, apresentando maior variabilidade dentro e não entre países, com presença de subpopulações. A população do Brasil apresentou maior diversidade genotípica em comparação com as demais. A transferibilidade de pares de primers SSR de C. perniciosa para M. roreri foi satisfatório. Populações de M. roreri do Equador e Peru apresentaram alta diferenciação genética interpopulacional, sendo que a do Peru apresentou maior variabilidade. / Witches' broom and fresty pod hot, caused by Crinipellis perniciosa and Moniliophthora roreri, are the most important disease of cacao in the American Continent. Biological and molecular data have shown that these pathogen are closely related. Resistance is the most efficient method to control these diseases. Therefore, information about the population structure of these cacao pathogen are important to support the breeding programo Molecular markers such as RAPD and SSR were used to analyzed the genetic structure of C. perniciosa and M. roreri frem the American Continent. Populations of C. perniciosa clustered according to their country of origin, with more variability within than between countries, revealing the presence of subpopulations. C. perniciosa Brazilian populations presented higher genotypic diversity than C. perniciosa from other countries. The transferability of C. perniciosa-SSR to M. roreri was positive. On the contrary, high interpopulation variability was observed between Ecuador and Peru, being M. roreri from Peru much more diverse than Ecuador.

Moniliophthora perniciosa é o agente causal da doença vassoura-de-bruxa em cacaueiro (Theobroma cacao). Os sintomas da doença compreendem perda de dominância apical, inchamento e excesso de brotações em ramos novos, reversão de meristemas florais em vegetativos, partenocarpia e lesões necróticas em frutos, sugerindo a ocorrência de alterações hormonais no hospedeiro. A disponibilidade de isolados do biótipo-S capazes de infectar o tomateiro, permitiu a utilização da cultivar miniatura \'Micro-Tom\' (MT) como um modelo para estudo da interação Moniliophthora perniciosa x Solanum lycopersicum. Além de provocar sintomas característicos no MT, a disponibilidade de mutantes e linhas transgênicas introgredidos em MT, com alterações que afetam o metabolismo e sensibilidade hormonal, permitem investigar o papel dos hormônios vegetais no desenvolvimento dos sintomas. Inicialmente, foi avaliada a agressividade de três isolados do biótipo-S no MT, sendo que um isolado de Tiradentes apresentou maior agressividade, com maior incidência dos sintomas, maior engrossamento do caule, redução na altura das plantas, aumento no número de lóculos nos frutos e redução na biomassa radicular. Mutantes com alterações na percepção para auxina (diageotropica e entire) e uma linha transgênica expressando uma citocinina oxidase de Arabidopsis (35S::AtCKX2) diferiram para o engrossamento do caule e distribuição do número de lóculos nos frutos em relação ao MT. A linha transgênica 35S::AtCKX2 diferiu significativamente de MT com menor incidência de infecção. O engrossamento do caule associa-se ao aumento na área do córtex e, principalmente do xilema e floema. A aplicação exógena de citocinina sintética benzil-adenina (BA) e da auxina sintética ácido naftaleno acético (ANA) em MT evocam sintomas similares aos de plantas infectadas com M. perniciosa. Linhas transgênicas repórter de sinalização por citocinina (ARR5::GUS) ou auxina (DR5::GUS) indicaram sinalização diferencial por citocinina a 24 h e 36 h após inoculação (HAI) e 48 HAI por auxina. A infecção por M. perniciosa aumentou os níveis de ácido jasmônico, ácido salicílico (AS) e auxina em MT entre 5 d a 30 DAI, com maior incremento aos 5 DAI, enquanto que o nível de ácido abscísico aumentou aos 20 d e 30 DAI, e AS foi o único detectado em micélio dicariótico do biótipo-S. Genes de biossíntese de citocinina (IPT), ativação (LOG), degradação (CKX) e resposta à citocinina (ARRs e CRF) e auxina (AUX/IAA, ARFs, SAUR e GH3) foram induzidos em MT inoculado de 12 h a 5 DAI, mas com maior acúmulo de transcritos aos 30 DAI. M. perniciosa induziu maior expressão desses genes citados e de biossíntese auxina, nos momentos iniciais da interação (12 h a 5 DAI) em 35S::AtCKX2 do que no MT. O efeito da infecção em aumentar o número de lóculos nos frutos parece ser independente ou downstream a mutação fasciated, Mouse ears e ovate. A mutação Lanceolate parece ter um papel na redução do efeito da infecção em aumentar o número de lóculos. Os resultados obtidos sugerem que a infecção pelo M. perniciosa em MT altere os níveis/sinalização dos hormônios vegetais, principalmente auxina e citocinina, provocando o engrossamento do caule (aumento no xilema, floema e córtex), redução no crescimento e na biomassa radicular e aumento no número de lóculos nos frutos / Moniliophthora pernicisa is the causal agent of witches\' broom disease in cocoa (Theobroma cacao). The disease symptoms comprise loss of apical dominance, thickening and proliferation of axillary shoots, shift from inflorescence into vegetative meristem, parthernocarpy and necrotic lesions on fruits, suggesting a host hormonal imbalance. The availability of an isolated of S-biotype M. perniciosa, which colonizes tomato, enabled the utilization of the miniature tomato (Solanum lycopersicum) cultivar \'Micro-Tom\' (MT) as a suitable model to study the pathosystem M. perniciosa x S. lycopersicum. In addition to the characteristic symptoms of the infection in MT, the availability of mutants and transgenic lines introgessed into MT, with changes in plant metabolism and hormonal sensitivity, enable the investigation of the role of plant hormones in the development of symptoms. Initially, we evaluated the aggressiveness of three S-biotype M. perniciosa isolates. The isolate \'Tiradentes\' showed greater aggressiveness infecting MT, with higher plant infection incidence, greater stem thickening, reduction in plant height, increase in fruit locule number and reduction in root dry weight. Mutants with altered auxin perception (diageotropica e entire) and the transgenic line expressing a cytokinin oxidase gene of arabidopsis (35S::AtCKX2) differed in stem thickening and fruit locule number distribution, as compared to MT. The transgenic line 35S::AtCKX2 differed significantly from MT, showing lower incidence of infection. The thickening of the stem may be related with an increase in area of the cortex, especially xylem and phloem. The exogenous application of synthetic cytokinin benzyl adenine (BA) and auxin naphthalene acetic acid (NAA) in MT induces similar symptoms to plants infected with M. perniciosa. Cytokinin (ARR5::GUS) and auxin (DR5::GUS) signaling reporter transgenic lines revealed differential cytokinin signaling 24 h e 36 h hours after inoculation (HAI) and differential auxin signaling in 48 HAI. Infection of MT by M. perniciosa increased the content of JA, SA and auxin during the development of symptoms from 5 d to 30 DAI, with greater increase at an early stage of symptoms development (5 days after inoculation - DAI), whereas abcisic acid content increased in 20 and 30 DAI, and only AS was detected in dicariotic mycelium of the S-biotype M. perniciosa. Cytokinin biosynthesis (IPT), activating (LOG), and breakdown (CKX) genes and response to cytokynin genes (ARRs e CRF) and auxin (AUX/IAA, ARFs, SAUR e GH3) were induced in MT infected in 12 h a 5 DAI, with greater accumulation of transcripts in 30 DAI. M. perniciosa induced higher levels of IPT, LOG, CKX, ARRs, and CRF genes and auxin biosynthesis genes at an ealry stage of infection (12 h a 5 DAI) in 35S::AtCKX2, as compared to MT. The effect of the infection on increasing fruit locule number seems to be independent or downstream fasciated, Mouse ears and ovate mutation. Lanceolate mutation seems to play a role in reducing M. perniciosa ability of increasing fruit locule number. The results suggest infection of MT by S-biotpye M. perniciosa alters levels/signaling of the hormones, especially auxin and cytokinin, inducing stem thickening (increasing xylem, phloem and cortex), reduction in plant height, root dry weight and increase in fruit locule number

O fungo Moniliophthora perniciosa é o agente causal da vassoura de bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao L.). Três biótipos distintos (biótipos -C, -L e -S) são reconhecidos de acordo com a especificidade quanto ao hospedeiro. O presente estudo teve como objetivo a análise da diversidade genética com o uso de marcadores microssatélites de 134 isolados dos biótipos -C, -L e -S de M. perniciosa coletados principalmente na Amazônia Brasileira e áreas de cultivo. A diversidade genética foi associada com virulência e/ou agressividade dos isolados a acessos diferenciais (suscetíveis ou resistentes) de T. cacao. Os biótipos -S e -L apresentaram uma diversidade gênica e genotípica superior em comparação com o biótipo-C. A população do biótipo-C com maior diversidade genotípica foi a do Acre, seguida pelo Oeste do Amazonas, ambas correspondendo a áreas em que se encontra cacaueiro nativo no Brasil. A população com menor diversidade genotípica foi a da Bahia, que corresponde a uma área onde a presença de M. perniciosa foi registrada mais recentemente, no final da década de 1980. Dos 134 isolados, 83 correspondem a genótipos multilocos únicos, sendo encontrados apenas dois indivíduos com genótipos idênticos para o biótipo-S, e nenhum para o biótipo-L. No biótipo-C foram identificados 61 genótipos multilocos em 111 isolados coletados em áreas de ocorrência natural e cultivo de cacau. Os dados de similaridade genética corroboram que o biótipo-C e também o -S que são homotálicos evoluíram de um biótipo heterotálico, possivelmente o biótipo-L. As populações do biótipo-C do estado do Pará e Leste do Amazonas compartilham ancestrais comuns em Ji-Paraná (RO) e Assis Brasil (AC), enquanto que a região sob a influência do rio Amazonas possui outra ascendência, que seria em Atalaia do Norte (Alto Solimões). Os genótipos multilocos da Bahia exibiram origens análogas as da população do Baixo Amazonas, com ascendência em Ji-Paraná (RO) e Alenquer (PA). Na avaliação de agressividade de M. perniciosa, a concentração do inóculo se mostrou determinante para a manifestação dos sintomas, com o aumento de plântulas com sintomas à medida que aumenta a concentração de basidiósporos. Dentre as progênies avaliadas, \'PA 195 x CAB 214\' apresentou menor proporção de plântulas com sintomas. Na inoculação com isolados de M. perniciosa oriundos do Acre e Amazonas, a proporção de plântulas com sintomas foi superior quando inoculadas com o isolado de Tabatinga (AM). O genótipo de cacaueiro que apresentou uma reação diferenciada foi o \'CAB 214\', para o qual nenhuma plântula apresentou sintomas quando inoculada com o isolado de Marechal Thaumaturgo (AC). Com o uso de microssatélites os genótipos multilocos de Tabatinga (AM) e Marechal Thaumaturgo (AC) foram identificados em grupos distintos. Na análise de treze genes de patogenicidade induzidos pela limitada disponibilidade de N, o gene 88KD foi o que demonstrou o maior número de transcritos acumulados. Os isolados que apresentaram uma mesma tendência em seus genes mais expressos foram Tabatinga (AM) e Óbidos (PA) que apesar de possuírem origens geográficas distintas, foram identificados no mesmo grupo na análise com microssatélites / The fungus Moniliophthora perniciosa is the causal agent of witches\'broom in cacao (Theobroma cacao L.). Three different biotypes (C-; S-; and L-biotypes) are recognized according to host specificity. The present study aimed to analyze the genetic diversity using microsatellite markers for 134 isolates of the C-, L- and S- biotypes of M. perniciosa collected mainly in the Brazilian Amazon and areas of cultivation. Genetic diversity was associated with virulence and/or aggressiveness of isolates in differential accesses (susceptible or resistant) of T. cacao. The L- and S- biotypes showed a higher genetic and genotype diversity compared with C-biotype. Of the 134 isolates, 83 corresponded to unique multilocus genotypes, and found only two individuals with identical genotypes for the S-biotype, and none for the L-biotype. In the C-biotype were identified 61 multilocus genotypes in 111 isolates collected in areas of natural occurrence and cultivation of cocoa. The genetic similarity data corroborate that the C- and S- biotypes that are apparently homothallic evolved from a heterothallic biotype, possibly L-biotype. The populations of C-biotype of the state of Para and Amazonas East share common ancestors, in Ji-Paraná (RO) and Assis Brazil (AC), while the region under the influence of the Amazon River has another descent that would be in the Atalaia do Norte (Upper Solimões). The multilocus genotypes from Bahia showed a similar origin of the population of the Lower Amazon, with ancestry in Ji-Paraná (RO) and Alenquer (PA). In the evaluation of aggressiveness of M. perniciosa, the inoculum concentration proved to be decisive for the manifestation of symptoms, with the increase of seedlings with symptoms as increases the concentration of basidiospores. Among the progenies, \'PA 195 x CAB 214\' showed a lower proportion of seedlings with symptoms. In inoculation with M. perniciosa from Acre and Amazonas, the proportion of seedlings with symptoms was higher when inoculated with the isolate from Tabatinga (AM). The genotype of cocoa that had a differentiated reaction was the \'CAB 214\', for which no plants showed symptoms when inoculated with the isolate Marechal Thaumaturgo (AC). With the use of microsatellite, the multilocus genotypes of Tabatinga (AM) and Marechal Thaumaturgo (AC) were identified in different groups. In the analysis of thirteen genes of pathogenicity induced by the limited availability of N, 88KD gene showed the highest number of transcripts. The isolates that showed a similar trend in their more expressed genes were Tabatinga (AM) and Óbidos (PA) that despite having different geographical origins were identified in the same group in the analysis with microsatellite

Resumo: Diferentes isolados de Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum, e T. viride) e um isolado de T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum foram estudados para uso no biocontrole de quatro subgrupos genéticos de Moniliophthora perniciosa, designados como Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. A associação das características dos isolados de Trichoderma avaliados quanto à velocidade de crescimento micelial, germinação, produção de esporos e produtividade massal de esporos em arroz, além das suas capacidades de antibiose e micoparasitismo a cada subgrupo do patógeno, resultou na determinação do índice denominado Potencial para uso no biocontrole (%PCB) a cada subgrupo de M. perniciosa. Os %PCBs variaram, demonstrando haver variabilidade genética entre os isolados do antagonista quanto às características avaliadas, como também nos níveis de resistência do patógeno. T. harzianum 911 apresentou o melhor %PCB para todos os subgrupos de M. perniciosa, sendo o pior apresentado por T. reesei 1612. Mp1445 foi o subgrupo que apresentou a menor capacidade de supressão aos antagonistas, sendo a maior apresentada por Mp1916. T. harzianum 906 inibiu o crescimento de Mp1916 por metabólitos não voláteis e todos os isolados de Trichoderma avaliados inibiram todos os subgrupos do patógeno pela ação de metabólitos voláteis, variando, porém, os percentuais de inibição entre as espécies e entre isolados da mesma espécie. Mp1445 inibiu o crescimento de T. virens 2007 por metabólitos não voláteis, sendo comprovada, portanto, a possibilidade do patógeno inibir o antagonista. T. harzianum 911 apresentou capacidade de micoparasitismo em placa e em vassouras infectadas individualmente pelos subgrupos do patógeno, além de produzir as enzimas β-1,3-glucanase, quitinase, protease, FPase, CMCase e amilase, tanto em substratos específicos como em cultivos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Different isolates of Trichoderma (T. stromaticum, T. pseudokoningii, T. harzianum and T. viride) and one isolate of T. atroviride, T. longibrachiatum, T. virens e T. pilulliferum were studied for their usage in biocontrol of four genetic subgroups of Moniliophthora perniciosa named as Mp1441, Mp1445, Mp1893 e Mp1916. The association of the characteristics of the Trichoderma isolates evaluated regarding to velocity of mycelial growth, germination, spores production in Petri dish and mass production of spores in rice, besides their capacities of antibiosis and mycoparasitism to each subgroup of the pathogen, resulted in the determination of the index named Potential to be used in Biocontrol (%PCB) to each subgroup of M. perniciosa. The %PCBs varied, pointing out that there is a genetic variability among the antagonistic isolates regarding to the evaluated characteristics, as well as the levels of the pathogen resistance. T. harzianum 911 showed the best %PCB for all subgroups of M. perniciosa, being the worst presented by T. reesei 1612. Mp1445 was the subgroup that presented the lowest antagonistic suppression capacity, being the highest presented by Mp1916. T. harzianum 906 inhibited the growth of Mp1916 by non-volatile metabolites and all the evaluated isolates of Thrichoderma inhibited all the subgroups through volatile metabolites, varying, although, the percentages of inhibition among the species and among the isolates of the same species. Mp1445 inhibited the growth of T. virens 2007 by non-volatile metabolites, being proved, therefore, the possibility of the pathogen to inhibit the antagonist. T. harzianum 911 presented the mycoparasitism capacity in Petri dishes and in brooms infected indiviadually by the pathogen, besides the production of β-1,3-glucanase, chitinase, protease, FPase, CMCase and amilase, in both specific substrates and in cultivations with dried mycelia... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo / Coorientador: Givaldo Rocha Niella / Banca: Antonio Carlos Monteiro / Banca: Iracema Helena Schoenlein-Crusius / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Carlos Renato Corso / Doutor

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:13:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rincones_Johana_D.pdf: 3507237 bytes, checksum: b5905da7ffa8ea3a869dd3090e9a1d1f (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A Vassoura-de-Bruxa do cacaueiro constitui um patosistema complexo e até o momento não foi estabelecido um plano de controle efetivo na região produtora da Bahia. O objetivo principal deste trabalho foi aprimorar os conhecimentos sobre a interação C. perniciosa-Cacaueiro com informações referentes à: 1) tamanho e organização do genoma através da obtenção do cariótipo molecular do fungo; 2) variabilidade genética deste fitopatógeno a nível cromossômico na região produtora da Bahia; e 3) expressão gênica do fungo em presença de extratos do hospedeiro. O cariótipo molecular foi estabelecido por eletroforese em gel de campo pulsado. Esta mesma metodologia foi utilizada em combinação com análise tipo microsatélites para um estudo de variabilidade a nível cromossômico de 38 isolados provenientes de três biótipos e diferentes regiões geográficas. Para análise da expressão gênica foram seqüenciadas quatro bibliotecas de cDNA do fungo sob diferentes condições de cultivo e em diferentes estágios do desenvolvimento, incluindo uma biblioteca subtrativa obtida por SSH. Como resultados, apresentamos o cariótipo molecular de C. perniciosa e a existência de polimorfismos cromossômicos. A análise dos 38 isolados permitiu observar que o cariótipo do biótipo-C é estável ao longo do tempo e sua variabilidade na região da Bahia é baixa, mostrando assim a fragilidade do programa de melhoramento genético do cacaueiro na Bahia, onde os clones resistentes selecionados no campo foram desafiados contra apenas dois genótipos do patógeno. Com relação à análise da expressão do fungo, obtivemos 1427 unigenes e sua análise por similaridade com as bases de dados permitiu a identificação de diversos mecanismos pelos quais o fungo poderia estar manipulando o metabolismo da planta para seu benefício e em detrimento da produção de cacau. Assim, consideramos que a partir deste trabalho foi possível obter uma maior compreensão dos mecanismos utilizados por C. perniciosa no desenvolvimento da Vassoura-de-Bruxa em cacaueiro e estudos mais aprofundados, baseados nos resultados aqui obtidos, deverão auxiliar no desenvolvimento de estratégias de controle para esta importante doença / Abstract: Witches' broom disease of cocoa is a complex pathosystem that has evaded an efficient control program in the cacao-producing region of Bahia, Brazil. The main goal of this work was to acquire a better understanding of the C. perniciosa-Cacao interaction by providing new data regarding: 1) the size and organization of the fungal genome through molecular karyotyping; 2) the genetic variability of this phytopathogen at the chromosomal level in the cacao-producing region of Bahia; and 3) the gene expression of the fungus in the presence of host extracts. The molecular karyotype was obtained through pulsed-field gel electrophoresis. This same technique was applied in combination with microsatellite PCR analysis of 38 isolates from different biotypes and geographic regions in order to study the chromosomal-level genetic variability of this pathogen. For the gene expression analysis, four cDNA libraries of the fungus grown under different culture conditions and developmental stages, including a subtractive library using SSH, were sequenced and searched for similarities in the public databases. As results, we present the molecular karyotype of C. perniciosa and the existence of chromosome-length polymorphism. The analysis of the 38 isolates showed that the karyotype of the C-biotype is very stable in time and that the variability of the pathogen in Bahia is very low, thus indicating the fragility of the current cacao-breeding program in Bahia, where the resistant cacao clones selected in the field were challenged against only two different genotypes of the pathogen. With regards to the gene expression analysis, we obtained 1427 unigenes and the similarity searches allowed the identification of various mechanisms through which the fungus might be manipulating the metabolism of the plant for its own benefit and in detriment of cocoa production. Therefore, we consider that this work allowed us to acquire a better understanding of the molecular mechanisms used by C. perniciosa during witches' broom development in cacao and more detailed studies, based on the results presented here, might aid in the development of novel control strategies for this important disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular