A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

Com o objetivo de estudar as diferenças de potencial hemorrágico entre metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs), compararamos a ação da jararagina, toxina hemorrágica da classe P-III, e da BnP1, SVMP da classe P-I fracamente hemorrágica, quanto à ação em proteínas de matriz extracelular (MEC), células endoteliais e distribuição na MEC e endotélio. Nos ensaios de ligação em fase sólida, apenas a jararagina e a jarararagina-C (domínios tipo disintegrina e rico em cisteínas) se ligaram ao colágeno I e IV. Em HUVECs, a jararagina e BnP1 induziram apoptose, mas em modelo de pele, apenas a jararagina induziu intensa hemorragia, acompanhada de degradação do colágeno fibrilar e colágeno IV na região da hipoderme. A jararagina e jararagina-C localizaram-se na parede dos capilares sangüíneos co-localizando-se como o colágeno IV. Esses resultados sugerem que a ligação ao colágeno é importante para a hemorragia induzida pelas SVMPs da classe P-III, promovendo seu acúmulo nas proximidades dos vasos sanguíneos tornando a catalise dos componentes da MEC mais eficiente. / In order to enlighten the mechanisms of hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases (SVMPs), the effects of jararhagin, a highly hemorrhagic P-III SVMP and BnP1, a weakly hemorrhagic P-I SVMP, on extracellular matrix (ECM) proteins, endothelial cells, and distribution in MEC and endothelium, was compared. In solid phase assay, only jararhagin and jararhagin-C (disintegrin-like and cysteine-rich domains) bond to collagen I and IV. In HUVECs, jararhagin and BnP1 induced apoptosis, but in skin model only jararhagin induced intense hemorrhage with degradation of the fibrillar collagen and collagen I, in hypodermis region. Jararhagin and jararhagin-C concentrated in blood vessels walls, co-localizing with collagen IV. These results suggest that the collagen binding is important to hemorrhage induced by P-III SVMPs, promoting their accumulation near to the blood vessels, making the catalysis of the basement membrane components more efficient.

Estudamos a ação das proteases bothropasina e Bothrops protease A, do veneno da serpente Bothrops jararaca, sobre o fibrinogênio (FBG), fibronectina (FN) e cininogênio (HK), como ferramenta para geração de peptídeos bioativos. As sequências primárias dos produtos de digestão foram identificadas por espectrometria de massas, com as buscas direcionadas por peptídeos em comum gerados pelas duas proteases. Foram encontradas oito sequências em comum provenientes do FBG e onze, da FN. Apenas a bothropasina clivou o HK, liberando desArg9BK. Foram sintetizados peptídeos derivados do FBG (FBG1-6) e da FN (FN1-4), além de des-Arg9-BK. Oito peptídeos apresentam potencial atividade antiangiogênica predita in silico. Observamos a inibição da elastase (28-20%) causada por FBG1-2-5-6. A melhor inibição da trombina foi de 17%, por FBG1. Contudo, a maioria dos peptídeos intensificou sua atividade. Por fim, este trabalho sugere que as proteases de veneno de serpentes podem ser usadas como ferramentas para processar componentes do plasma, visando à busca por peptídeos bioativos. / We studied the action of the proteases bothropasin and Bothrops protease A purified from the venom of snake Bothrops jararaca upon fibrinogen (FBG), fibronectin (FN) and kininogen (HK), as a tool to generate bioactive peptides. The primary sequences of the digestion products were identified by mass spectrometry and we focused the search for common peptides released by both proteases simultaneously. Sequences in common released by both proteases were found, being eight peptides from FBG, and 11 from FN. Only bothropasin was able to cleave HK releasing des-Arg9-BK. Peptides from fibrinogen (FBG1-6) and from fibronectin (FN1-4), as well as the des-Arg9-BK were synthetized. Eight peptides have potential antiangiogenic predicted in silico. We observed the inhibition of elastase (28-20%) caused by FBG1-2-5-6. The best inhibition of thrombin was 17% by FBG1. However, most of the peptides intensified its activity. Finally, this work suggests that the snake venom protease can be used as tools to process plasma components in order to search for bioactive peptides.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Leonardo de Castro Palmieri / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) de veneno de serpente são uma das principais toxinas responsavéis pela miotoxicidade e necrose muscular observadas nos acidentes ofídicos. Essas toxinas podem ser separadas em Asp49-PLA2s, cujo mecanismo é catalítico e dependente de cálcio, e as PLA2s homólogas, cuja estrutura é semelhante, porém atividade em mecanismo não catalítico e independente de cálcio. Apesar de os detalhes deste mecanismo não serem bem conhecidos, estudos funcionais ressaltam importância da região do C-terminal e estudos cristalográficos propõem, mais especificamente, um sítio miotóxico composto por resíduos básicos e um hydrophobic knuckle composto por hidrofóbicos, ambos situados na região C-terminal da toxina. O presente trabalho tem objetivo de oferecer mais detalhes acerca do mecanismo de ação miotóxico independente de cálcio. Para tanto, realizamos estudos cristalográficos com miotoxinas botrópicas BthTX-II (uma Asp- PLA2s), BthTX-I e PrTX-I (duas PLA2s homólogas), em presença de íons relevantes para suas atividades. Recentemente, foi demonstrado que íons, tal como manganês, cálcio, zinco entre outros, interferem na atividade biológica de PLA2s e PLA2s homólogas. Assim, estudo cristalográfico da PrTX-I e BthTX-I com íons manganês e zinco foram elucidados no estado nativo e complexado. Experimentos in vivo indicam que tais íons promoveriam efeito inibitório da miotoxicidade. Enquanto os íons manganês não foram localizados no modelo cristalográfico, os íons zinco foram identificados interagindo apenas no modelo nativo com uma His48 e com as His120 de ambos monômeros. Estudos comparativos destas estruturas com a PrTX-II (PLA2s homóloga) com ácidos graxos foi desenvolvido e guiaram para elaboração de nova hipótese do mecanismo de ação independente de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venom are among the main toxins responsibles for miotoxicity and muscular necrosis observed in offidic accidents. These toxins can be separated in Asp49-PLA2s, whose catalytic mechanism of action is dependent of calcium, and in homologue PLA2s or PLA2s-like, whose terciary structure is similar, although its activity is not catalytic in a calcium independent mechanism of action. Despite the fact that this calcium independent mechanism is not well known, functional studies highlight the C-terminal region and structural studies points to a myotoxic site, composed by basic residues, and a hydrophobic knuckle, composed by aromatic and hydrophobic, in the C-terminal region. The present study aims to gather more knowledge about this myotoxic calcium independent mechanism of action. For this purpose, the botropic myotoxins BthTX-II (an Asp49- PLA2), BthTX-I and PrTX-I (homologue PLA2s) were studied in the presence of divalent ions by Xray crystallography. Recently, it was demonstrated divalent ions, such as manganese, zinc and calcium, interfere with the biological activity of these toxins. The crystallographic structure of PrTX-I and BthTX-I with manganese and zinc ions in a native and complexed form were elucidated. In vivo studies demonstrated that these ions inhibit the myotoxic activity of these proteins. Although manganese ions were not found in the structures, zinc ions were found interacting with His48 and the C-terminal residue His120. Comparative studies of this structure and PrTX-II (a homologue PLA2) complexed with stearic acid were performed and support a new hypothesis for the myotoxic mechanism of action for homologue PLA2s which includes both myotoxic site and hydrophobic knuckle and, for the first time, His120. Differently from most PLA2s of snake venom... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Daniel Carvalho Pimenta / Resumo: O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), baseado no critério do perfil da cromatografia de exclusão molecular, pode ser descrito como sendo composto de quatro principais toxinas: Giroxina, Crotamina, Crotoxina e Convulxina. A crotoxina é uma neutoroxina, é um heterodímero não covalente, composta por duas subunidades: fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina (Ctp). A crotapotina constitui o componente da crotoxina que apresenta atividade anti-inflamatória além de ser chaperona de PLA2. Esta molécula é constituída por três cadeias peptídicas ligadas por pontes dissulfeto. Além disso, já foram descritas isoformas para a crotapotina. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método cromatográfico para isolar a crotapotina, separar suas cadeias e analisá-las por LC/MS e LC-MS/MS para análise proteômica e/ou seqüenciamento de novo e avaliação da possível existência de um padrão de variação nas substituições de aminoácidos. O método C8-RP-HPLC foi capaz de separar os componentes do veneno de Cdt que puderam ser identificados por espectrometria de massas, de acordo com a sua massa molecular. A crotapotina foi isolada, reduzida e alquilada e submetida à outra separação cromatográfica RP-HPLC (C18) para isolamento das subunidades alquiladas. Conforme descrito na literatura, a cadeia α da crotapotina é composta por 40 resíduos de aminoácidos, enquanto que a cadeia β possui 35 resíduos e a cadeia γ 14, pelo que as subunidades podem ser identificadas pelas suas massas moleculares. As a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Crotalus durissus terrificus venom (Cdt), based on molecular size chromatography, can be described as being composed of four main toxins: Giroxin, Crotamine, Crotoxin and Convulxin. Crotoxin is a neutoroxin, a non-covalent heterodimer composed of two subunits: phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin (Ctp). Crotapotin is the component of crotaxin that has anti-inflammatory activity besides being a PLA2 chaperone. This molecule consists of three peptide chains linked by disulfide bonds. In addition, isoforms for crotapotin have been described. The objective of this study was to develop a chromatographic methodology to isolate a crotapotin, separate its chains and analyze by LC/MS and LC-MS/MS for proteomic analysis and/or de novo sequencing and evaluation of the possibility of a variation pattern amino acid substitutions. The C8-RPHPLC method was able to separate the Cdt venom components that could be identified by mass spectrometry, according to their molecular mass. The crotapotin was isolated, reduced and alkylated and subjected to another RP-HPLC (C18) chromatographic separation for isolation of the alkylated subunits. As described in the literature, the α chain of crotapotin is composed of 40 amino acid residues, while the β chain has 35 residues and the γ chain, 14, and thus the subunits can be identified by their molecular masses. The analyzes of isolated chains of crotapotin showed the presence of more than one molecule per fraction, indicating the presence of isofor... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Resumo: As aranhas do gênero Phoneutria (Aranae, Ctenidae) são comumente conhecidas como "aranha armadeira" ou "aranha da banana", devido à posição de ataque/defesa que elas assumem contra uma presa/competidor e devido sua alta incidência nas plantações de bananas. Estas aranhas são solitárias, errantes (não constroem teias), muito agressivas e responsáveis por muitos casos graves de acidentes por envenenamento e de morte registrados. Estas aranhas são amplamente distribuídas nas regiões temperadas da América do Sul, com várias espécies já descritas. A espécie Phoneutria nigriventer é mais comum nas regiões centroeste e sudeste do Brasil. Um grande número de neurotoxinas tem sido purificado de venenos de aranhas do gênero Phoneutria. No entanto, as neurotoxinas não - protéicas de baixa massa molecular precisam ser isoladas e caracterizadas estrutural e funcionalmente. Essas toxinas são de potencial interesse na neuroquímica como ferramentas para investigações do sistema nervoso. O objetivo do presente estudo foi a caracterização estrutural e funcional da "Nigriventrina", uma nova neurotoxina não-protéica de baixa massa molecular, isolada da fração hidrofílica do veneno da aranha Phoneutria nigriventer por (RPHPLC) sob gradiente de acetonitrila. A elucidação estrutural foi realizada com HRESIMS, ESI-MS, ESI-MS/MS e espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear 1D e 2D. A toxina apresentou massa molecular de 422Da (C12H14N4O13) e foi caracterizada como hidrazil-dioxopiperidina. A caracterização biológica foi realizada pela aplicação icv da Nigriventrina em cérebro de rato, seguido pelo acompanhamento da expressão da proteína Fos e dupla marcação imunoistoquímica. Todos os neurônios duplamente marcados foram associados ao receptor ionotrópico de glutamato NMDA (N-metil-D-aspartato), subtipo NMDA-NR1. A Nigriventrina apresentou afinidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The spiders of the genus Phoneutria (Aranae, Ctenidae) are commonly known as "armed spider" or "banana spider", because of the attack-defense position that they assume against a prey/competitor and their high incidence in banana plantations. These spiders are solitary, wandering (no web), very aggressive, responsible for many cases of severe envenomation and recorded mortality. These spiders are widely distributed in the warm regions of South America, and several species have been described. The Phoneutria nigriventer are the most common in central and south-eastern regions of Brazil. A large number of neurotoxins have been purified from the venoms of Phoneutria spiders. However, the non-proteic low molecular mass neurotoxins must be isolated and structural and functionally characterized. These toxins have an interesting potential in neurochemistry as tools for investigations of nervous system. The objective of the present study was the structural and functional characterization of "Nigriventrine", a novel non-proteic low molecular mass neurotoxin, isolated from the hydrophilic fraction of Phoneutria nigriventer spider venom by (RP-HPLC) under gradient of acetonitrile. The structural elucidation was carried out with HRESIMS, ESI-MS, ESI-MS/MS and Nuclear Magnetic Resonance 1D and 2D spectroscopy. The toxin presented molecular mass of 422Da (C12H14N4O13) and was characterized as hydroxyl-hydrazyl-dioxopiperidine. The biological characterization was performed by the i.c.v application of nigriventrine in rat brain, followed by the monitoring of the expression of Fos protein and doublelabeling immunohistochemistry. All doubly labeled neurons were associated to Nmethyl- D- aspartate/subtype of ionotropic glutamate receptor (NMDA-NR1). The nigriventrine presented affinity mainly to cortical regions, which are linked to perceptions and the voluntary muscles control of the animals... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Mario Sergio Palma / Coorientador: Marta do Nascimento Cordeiro / Banca: Michael Richardson / Banca: Yara Curi / Banca: Claudio Francisco Tormena / Banca: Roberta Cornelio Ferreira Nocelli / Doutor

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard Charles Garrat / Banca: Antonio José da Costa Filho / Resumo: As serpentes do gênero Bothrops são de grande interesse científico, médico e social para o Brasil, visto que este gênero é responsável por cerca de 90% dos acidentes ofídicos que ocorrem em nosso país. Dois dos principais componentes do veneno desses animais são as fosfolipases A2 e as serino proteases. As fosfolipases A2 são enzimas responsáveis pela destruição da membrana celular através da hidrólise de fosfolipídios Ca2+ dependente. Uma classe destas fosfolipases, as fosfolipases homólogas (Lys49-PLA2s), que se caracteriza pela uma substituição natural na posição 49 de um resíduo de Asp para um resíduo de Lys, não apresenta atividade catalítica, mas é capaz de induzir mionecrose por um mecanismo Ca2+ independente devido, provavelmente, à resíduos da região C-terminal. Neste trabalho, através de estudos por cristalografia de raios-X de Lys49-PLA2s botrópicas nativas e quimicamente modificadas pelo brometo de p-bromofenacila (BPB), revisamos a posição da Lys122 - anteriormente apontado como um dos responsáveis ela ausência da atividade catalítica das Lys49-PLA2s por conta da hiperpolarização que causaria na ligação peptídica Cys29/Gly30 - e concluímos que, por conta de esta hiperpolarização ocorrer apenas em alguns monômeros de Lys49-PLA2s complexadas, a Lys122 não deve estar envolvida no "bloqueio" da atividade catalítica. Além disso, a comparação estrutural do loop de ligação de Ca2+ entre as Lys49 e Asp49-PLA2s nos mostra a importância da conservação da Tyr28 dentre as Asp49-PLA2s para a integridade do loop de ligação do Ca2+. Este resíduo estabiliza essa região através de uma ponte de hidrogênio com a Gly35. Nas Lys49-PLA2s, que possuem um resíduo de Asn na posição 28, não ocorre a formação dessa ponte, o que contribuiria para a desestabilização dessa região nessas proteínas ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakes from Botrops genus are objects with great scientific, medical and social interesting since that these snakes are responsible of 90% of snakebites in our country. Two of the main components of the venom from these animals are the phospholipases A2 and the serine proteases. The phospholipases A2 are enzymes responsible of cellular membrane disruption through phospholipids hydrolysis Ca2+-dependent. A class of these phospholipases, the homolog phospholipases (Lys49-PLA2s) that underwent a natural substitution Lys to Asp substitution in 49 position, does not show catalytic activity. However, these proteins can perform myonecrosis by a Ca2+-independent mechanism probably, due to action of C-termini region residues. In this work, by x-ray crystallography studies with bothropic Lys49-PLA2s in native and chemically modified by p-bromophenacyl bromide (BPB) forms, we revised the position of Lys122, previously pointed as one of the responsibles of Lys49-PLA2s due to hiperpolarization of its side chain on Cys29/Cys30 peptide bond. Here, we conclude that this hiperpolarization are present only in a few monomers and thus, Lys122 may not be involved in the "blocking" of catalytic activity. Furthermore, structural comparisons of Ca2+ binding loop between Lys49 and Asp49-PLA2s revels the importance of the Tyr28 residue conservation to the integrity of this region. This residue stabilizes the Ca2+ binding loop by a hydrogen bond to Gly35. In Lys49-PLA2s that have an Asn residue in 28 position, does not occur the formation of this bond, contributing to unstabilization of this region and difficulting the binding of Ca2+ cofactor. Phylogenetic studies showed that Asp49- PLA2s with reduced catalytic inactivity and capable to induce myonecrosis are phylogenetic more related to Lys49-PLA2s than to others Asp49-PLA2s, forming a ...(Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Patrícia da Rocha Mendes (prmbio@gmail.com) on 2018-08-15T16:34:30Z No. of bitstreams: 1 TESE FINAL 2.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-15T19:06:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mendes_pr_dr_bot.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T19:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mendes_pr_dr_bot.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) Previous issue date: 2016-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os acidentes ofídicos constituem um relevante problema de saúde pública, a qual deve receber cuidados rápidos e eficientes. Em relação ao ofidismo, no Brasil, somente há poucos anos foi definida uma política abrangente que enfocasse as múltiplas questões relacionadas aos acidentes humanos provocados por animais peçonhentos. Os venenos de serpentes apresentam uma mistura de compostos inorgânicos (íons metálicos) e orgânicos, sendo ricos em moléculas biologicamente ativas. Dentre essas moléculas, peptídeos, proteínas e compostos de baixa massa molecular são frequentemente estudados por apresentarem grande potencial terapêutico. Essas moléculas, se bem conhecidas, podem ser utilizadas na investigação de mecanismo moleculares e celulares. Além disso, estabelecem interessantes modelos moleculares para o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas aplicáveis na criação de ferramentas experimentais e/ou agentes terapêuticos para a pesquisa básica e aplicada. Diante disso, a elucidação dos peptídeos hipotensores presentes no veneno crotálico da subespécie Crotalus durissus terrificus é o objetivo do presente trabalho. Este estudo poderá promover a identificação de outras moléculas hipotensoras podendo conter princípios ativos mais eficientes para o tratamento de quadros clínicos de hipertensão, doença esta que acomete milhares de pessoas no mundo todo. No presente trabalho, a porção peptídica do veneno da serpente C.d.t., apresentou rendimento médio de 12,8% em relação ao veneno bruto, sob condições de precipitação das proteínas totais na presença de ácido trifluoracético à 0,1% (v/v) e, quando submetida à estratégia de purificação por cromatografia líquida de fase reversa, 13 frações foram separadas. Por meio de ensaios de contratilidade de tecido isolado in vitro de músculo liso (artéria mesentérica), evidenciou-se que a fração I e a fração V apresentaram efeitos hipotensor e hipertensor, respectivamente. A fração I foi identificada com a sequência QHILIYVGVHD e massa molecular 1274,67 Da. Atualmente, esta molécula hipotensora identificada no presente trabalho foi submetida à síntese peptídica para posteriormente, avaliar-se este peptídeo hipotensor na sua forma sintética, seu efeito hipotensor por meio do ensaio de contratilidade de tecido isolado in vitro de músculo liso em relação ao fármaco Captopril. / The snakebites are an important public health problem, which must receive quick and efficient care. Regarding the ophidism, in Brazil, only a few years ago a comprehensive policy was defined that emphasized multiple issues related to human accidents caused by venomous animals. The snake venoms present a mixture of inorganic and organic compounds, being rich in biologically active molecules. Among these molecules, peptides, proteins and low molecular weight compounds are often studied by their ability therapeutic. Those molecules, when well known, may be used in the investigation of cellular and molecular mechanism. In addition, it provides interesting molecular models for the development of biotechnological strategies applicable in the creation of experimental tools and / or therapeutic agents for basic and applied research. Therefore, the elucidation of hypotensive peptides present in the venom of Crotalus durissus terrificus subspecies is the aim of this study, once this study may promote the identification of other hypotensive molecules may contain more effective active ingredients for the treatment of clinical conditions hypertension, this disease affecting millions of people in the world. In this study, the peptide portion of the venom of the snake Cdt, performed with an average yield of 12.8% compared to the venom under total protein precipitation conditions in the presence of trifluoro acetic acid to 0.1% (v / v) and, when subjected to purification strategy for reversed-phase liquid chromatography, 13 fractions were separated. Using isolated tissue contractility in vitro smooth muscle (mesenteric artery), was evidenced that the fraction I and fraction V showed hypotensive and hypertensive effects, respectively. Fraction I was identified with the QHILIYVGVHD sequence and molecular mass 1274.67 Da. Currently, this hypotensive molecule identified in this study was submitted to the peptide synthesis to subsequently evaluate this hypotensive peptide in its synthetic form, its hypotensive effect through tissue contractility assay isolated in vitro smooth muscle compared to Captopril medicine.

SOUSA, Paulo Cesar Pereira de. Estudos das alterações renais e vasculares induzidos pelo veneno e frações isoladas de abelha Apis mellifera.2012. 176 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação de Biotecnologia, Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:44:54Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) Previous issue date: 2012 / The increase in accidents involving Africanized bees in Brazil and throughout Latin America in recent decades has become the object of surveillance by the health authorities, because of accidents with hundreds of bees to be associated with frames of poisoning. The venom of the honeybee Apis mellifera is a mixture of toxic peptides with various local and systemic actions. The objective of this study was to evaluate the renal and vascular changes promoted by the whole venom of the bee A. mellifera and its fractions PLA2 and melittin. Male Wistar rats (250-300g) whose kidneys were isolated and perfused with Krebs-Henseleit solution containing modified 6g% bovine albumin previously dialyzed. The evaluation of the vascular effects of the venom of Apis mellifera in pots was carried out using conductance tests ring of isolated rat aorta. The results showed that the whole venom of A. mellifera and the complexed fraction (PLA2+melittin) promoted significant changes in all renal parameters studied, producing an increase in renal perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (FU) and the glomerular filtration rate (GFR), all these changes were seen at concentrations of 3μg/mL and 10μg/mL. However, the lower concentration (1μg/mL) had no effect on the evaluated parameters. It was observed a significant reduction in the percentage of tubular transport of sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-), suggesting that the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) engaged on the renal tubular injury. Were also observed in protein deposition in the renal tubules histological focal regions with necrosis/apoptosis, and was found reduced the viability of the MDCK cells and an increased of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), whose concentration dependent cytotoxic effect with a value IC50 47.84μg/mL. In this sense, the results suggest that the renal lesions were necrosis in the tested conditions. It had been shown in the protocol of aortic ring an increase in contractility. In conclusion, the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) of bee Apis mellifera caused nephrotoxicity, suggesting a direct action on cell death in renal tubule cells by necrosis. The contractile effect of bee venom involves the opening of calcium channels operated by voltage and suggest a role of alpha adrenergic receptors via activation of phospholipase C. This finding confirms the results found in the isolated rat kidney and there was an increase in pressure due to renal perfussão possible vasoconstriction of the vessels supplying the kidney. Studies of the venom and its fractions in different systems provide a greater understanding of the pathophysiology and an elucidation of the mechanisms observed. Thus, it can lead to the discovery of pharmacological tools and bioprospecting in the components present in the venom. / O aumento dos acidentes envolvendo abelhas africanizadas no Brasil e em toda a América, nas últimas décadas, passou a ser objeto de vigilância das autoridades sanitárias, devido ao fato dos acidentes com centenas de abelhas estarem associadas a quadros de envenenamento. O veneno da abelha Apis mellifera é uma mistura de peptídeos tóxicos com diversas ações locais e sistêmicas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar as alterações renais e vasculares promovidas pelo veneno total da abelha A. mellifera e de suas frações PLA2 e melitina. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g), cujos rins foram isolados e perfundidos com solução de Krebs-Henseleit modificado contendo 6g% de albumina bovina previamente dialisada. A avaliação dos efeitos vasculares do veneno de Apis mellifera em vasos de condutância foi realizada através dos ensaios em anel de aorta isolado de rato. Os resultados encontrados demonstraram que o veneno total de A. mellifera e da fração complexada (PLA2 + melitina) promoveram alterações significativas em todos os parâmetros renais estudados, produzindo um aumento na pressão de perfusão renal (PP), na resistência vascular renal (RVR), no fluxo urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), todas essas alterações foram verificadas nas concentrações de 3µg/mL e 10µg/mL. Porém, a menor concentração (1µg/mL) não apresentou efeito nos parâmetros avaliados. Foi verificada uma redução significativa no percentual de transporte tubular de sódio (Na+), potássio (K+) e cloreto (Cl-), sugerindo que o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) exerçam injúria sobre os túbulos renais. Também foram observadas depósito de proteínas nos túbulos renais nas análises histológicas com regiões focais de necrose/apoptose, bem como foi constatada redução da viabilidade das células MDCK e do aumento da enzima lactato desidrogenase (LDH), cujo efeito citotóxico dependente de concentração com um valor de IC50 47.84µg/mL. Nesse sentido, os resultados sugerem que as lesões renais foram por necrose nas condições testadas. Foi demonstrado no protocolo de anel de aorta um aumento na contratilidade. Em conclusão, o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) da abelha Apis mellifera causaram nefrotoxicidade, sugestivo de uma ação direta com morte celular em células do túbulo renal por necrose. O efeito contrátil do veneno de abelha envolve a abertura de canais de cálcio operados por voltagem e sugerem a participação dos receptores alfa adrenérgicos via ativação da enzima fosfolipase C. Esse achado corrobora com os resultados encontrados em rim isolado de rato, verificando-se um aumento da pressão de perfusão renal devido a uma possível vasoconstricção dos vasos que irrigam o rim. Os estudos do veneno e suas frações em diferentes sistemas propiciam um maior conhecimento da fisiopatologia e uma elucidação dos mecanismos observados. Desta forma, pode levar à descoberta e bioprospecção de ferramentas farmacológicas em componentes presentes no veneno.

Acetylcholinesterase (AChE) belongs to a distinct family of serine hydrolases and is found in both synaptic and non-synaptic locations. At the synapses, it plays a major role in the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh) while in non-synaptic tissue its function is unclear. Snake venom, particularly from the Elapidae family, is a common non-synaptic source of AChE. The venom of krait (Bungarus sindanus), an Elapidae snake, contained a high level of AChE activity. As there is no literature study about Bungarus sindanus venom AChE, it was selected as a main source of AChE activity. We characterized the venom AChE following comparative inhibitory studies with human, horse and rat cholinesterase using different ligands (tacrine, malathion, carbofuran, paraquat, antidepressants, TEMED). The enzyme of krait venom showed optimum activity at alkaline pH 8.5 with an optimal temperature of 45oC. We observed a significant reduction in substrate inhibition of krait venom AChE by using a high ionic strength buffer. With a low ionic strength buffer (10 mM PO4 pH 7.5) the enzyme was inhibited by 1.5 mM AcSCh, while with a high ionic strength buffer (62 mM PO4 pH 7.5) the enzyme was inhibited by 1mM AcSCh. Furthermore, we found that krait 5 venom acetylcholinesterase is thermally stable at 45oC. The enzyme lost only 5% of its activity after incubation at 45oC for 40 min. The Michaelis-Menten constant (Km) for the hydrolysis of acetylthiocholine iodide was found to be 0.052 mM. We noted that snake venom AChE was also inhibited by ZnCl2, CdCl2 and HgCl2 in a concentration dependent manner. In addition, this enzyme showed high sensitivity to tacrine, which is known to inhibit synaptic AChE. We observed that tacrine caused a mixed type of inhibition in krait venom as well as in human serum BChE. Snake venom AChE presents similar inhibitory behavior toward commonly used pesticides and herbicides as that of human serum BChE. The snake venom AChE exhibited a mixed type of inhibition for the pesticides malathion and carbofuran and the herbicide paraquat while human serum BChE presented a mixed inhibition for malathion and paraquat and an uncompetitive inhibition for carbofuran. The krait venom AChE was also affected by antidepressants such as paroxetine, imipramine, clomipramine and sertraline. Paroxetine and sertraline caused a mixed type of inhibition, while imipramine and clomipramine exhibited a competitive inhibition. Moreover, the well-known chemical N,N,N´,N´-tetramethylethylene diamine (TEMED) caused a mixed type of inhibition in snake (Bungarus) venom as well as in horse serum BChE. Futhermore, the inhibition of TEMED, was also confirmed from in vivo study in different structures of the brain, such as striatum, hippocampus, cortex, hypothalamus and cerebellum. Decrease in AChE activity was observed in all treated groups. The results suggest that TEMED exhibits toxic effect via inhibition of cholinesterase. Taken together the krait venom AChE showed similar behavior towards different ligands (tacrine, malathion, carbofuran, paraquat, antidepressants, TEMED) like other sources of cholinestease. Furthermore, krait venom contains large amount of acetylcholinesterase having highest catalytic activity and comparatively more stable than any other sources, making it more valuable for biochemical analysis. / A enzima acetilcolinesterase (AChE, E.C. 3.1.1.7) faz parte de uma família distinta de serina hidrolases, sendo uma importante enzima regulatória, encontrada principalmente no encéfalo, músculos, eritrócitos, neurônios colinérgicos e também em veneno de cobra. Nas sinapses, a sua principal função é a hidrólise no neutrotransmissor acetilcolina (ACh), enquanto que em tecidos não-sinápticos a sua função é desconhecida. O veneno de cobra, principalmente da família Elapidae, é uma fonte não sináptica abundante de AChE. Por exemplo, a espécie Bungarus sindanus, possui um alto conteúdo de AChE. No entanto, na literatura não existem muitos relatos sobre o estudo desta enzima neste veneno. Sendo assim, o veneno de cobra da espécie Bungarus sindanus, foi selecionado comno a principal fonte de AChE neste estudo. A partir dele fez-se estudos de caracterização, comparação com outras fontes de colinesterases (soro eqüino, encéfalo de ratos e sangue humano) e estudos de inibição da enzima por diversos agentes (tacrina, malation, carbofuran, paraquat e 2 antidepressivos). Foi observado que a enzima de veneno de cobra possui um pH ótimo alcalino de pH 8.5 e uma temperatura ótima de ensaio de 45oC. A inibição por substrato, característica cinética da AChE, foi reduzida significativamente ao se usar um tampão com alta força iônica (10 mM PO4 pH 7.5). A enzima possui estabilidade térmica a 45oC. A enzima perdeu somente 5% de sua atividade após 45 min de incubação à 45oC. A constante de Michaelis-Menten (Km) para a hidrólise de ACh foi de 0.052 mM com uma Vmax de 530 μmoles/min/mg de proteína. Também, foi observado que a AChE de veneno da cobra Bungarus sindanus é inibida por ZnCl2, CdCl2 e HgCl2. A enzima apresentou alta sensibilidade a tacrina, a aqual é sabidamente um inibidor da AChE sináptica. A inibição observada foi de tipo mista, tanto em veneno de cobra, tanto quanto em cholinesterase de soro humano (BChE). Também, a enzima apresentou padrão inibitório similar com a colinesterase de soro humano quando foram testados agentes pesticidas e herbicidas. A AChE de veneno de cobra exibiu uma inibição de tipo mista para os pesticidas malation e carbofuran e para o herbicida paraquat. A única diferença foi o padrão de inibição da BChE em relação ao carbofuran, que foi do tipo incompetitivo. A atividade da enzima AChE de veneno de cobra foi inibida, também, pelos antidepressivos paroxetina, imipramina, clomipramina e sertralina. A paroxetina e a sertralina causaram uma inibição de tipo mista, enquanto que a imipramina e a clomipramina exibiram um padrão de inibição competitivo. Também, o bem conhecido composto químico N,N,N´,N´-Tetramethylethylene diamine (TEMED), o qual é rotineiramente utilizado para iniciar processos de polimerização de géis de poliacrilamida causou uma inibição de tipo mista na Ache de veneno de cobra bem como em BChE de soro eqüino. Além disto, a inibição da AChE por TEMED foi observada em diferentes estruturas cerebrais de ratos, tais como estriato, hipocampo, cortex, hipotálamo e cerebelo. Estes resultados confirmam a hipótese de que o TEMED é colinotóxico. Analisando, em conjunto, os resultados podemos concluir que a AChE do veneno da cobra Bungarus Sindanus apresentou padrão cinético inibitório quase similar a outras colinesterases para os compostos tacrina, malation, carbofuran, paraquat, antidepressivos e TEMED. Além disto, o veneno desta cobra possui altas quantidades de AChE o que o torna uma fonte valiosa para estudos bioquímicos e cinéticos desta enzima.