[ES] El infarto agudo de miocardio (IAM) es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en los países desarrollados. A lo largo de los últimos años se ha visto que la respuesta inflamatoria que ocurre tras desencadenarse el IAM es muy importante en el desarrollo clínico de esta patología. Si se produce una respuesta inflamatoria exacerbada aumenta el riesgo de remodelado cardiaco adverso y fallo cardiaco, pero el hecho de que no se desencadene la respuesta inflamatoria también tiene consecuencias negativas. Debido a la importancia de la respuesta inflamatoria en el IAM, recientemente se han intentado desarrollar terapias dirigidas frente componentes celulares o moleculares que participan en esta respuesta. Dentro de estas terapias, la terapia celular con células mesenquimales estromales (MSC) se ha postulado como un buen candidato. Las MSC se caracterizan fundamentalmente por su capacidad inmunomoduladora, lo que ha conducido a su empleo como agentes terapéuticos en diferentes enfermedades que cursan con procesos inflamatorios. Sin embargo, a lo largo de los últimos años, numerosos estudios han mostrado que el efecto terapéutico de las MSC está mediado fundamentalmente por las vesículas extracelulares (EVs) que liberan. Estas EVs recapitulan los efectos terapéuticos de las células de origen, por lo que también presentan efectos inmunomoduladores. El empleo de las EVs de MSC como agentes terapéuticos presenta ventajas respecto al uso de las MSC como, por ejemplo, una mayor bioseguridad. No obstante, el uso clínico de las EVs todavía tiene que hacer frente a retos como la obtención de grandes cantidades de EVs que constituyan un producto clínico estable y homogéneo. En este trabajo se ha querido evaluar, por un lado, si las EVs obtenidas de diferentes biopsias de la misma fuente tisular de MSC pueden constituir un producto biológico homogéneo que presente las mismas características y funcionalidad. Por otro lado, se ha evaluado si estas EVs se pueden emplear como agente terapéutico frente a la respuesta inflamatoria que se desencadena tras el IAM. Para ello se ha estudiado el efecto inmunomodulador de las EVs sobre células del sistema inmune, fundamentalmente macrófagos, in vitro y en un modelo in vivo de IAM en ratas. Los resultados mostraron que las EVs favorecen la diferenciación de los macrófagos M1 proinflamatorios hacia un fenotipo similar al M2, aumentando la expresión de marcadores M2 y reduciendo la secreción de citocinas proinflamatorias. Además, las EVs promovieron la activación de neutrófilos in vitro y la reducción de su estrés oxidativo. La administración de EVs en ratas sometidas a IAM amortiguó la caída de la función cardiaca y limitó la extensión de la zona infartada a los 7 y 21 días postinfarto. Las EVs también redujeron el número de macrófagos y neutrófilos proinflamatorios dentro de la zona infartada, favoreciendo la resolución de la inflamación. En conclusión, las EVs empleadas en este trabajo han demostrado ser un producto biológico estable con independencia de la biopsia de la que proceden, y han demostrado ser capaces de ejercer respuestas pro-resolutivas eficaces en un modelo de isquemia miocárdica, lo que las convierte en potenciales agentes terapéuticos para tratar la inflamación en el IAM. / [CA] L'infart agut de miocardi (IAM) és una de les principals causes de morbiditat i mortalitat als països desenvolupats. Al llarg dels darrers anys s'ha vist que la resposta inflamatòria que passa després de desencadenar-se l'IAM és molt important en el desenvolupament clínic d'aquesta patologia. Si es produeix una resposta inflamatòria exacerbada augmenta el risc de remodelat cardíac advers i fallada cardíaca, però el fet que no es desencadeni la resposta inflamatòria també té conseqüències negatives. A causa de la importància de la resposta inflamatòria a l'IAM, recentment s'han intentat desenvolupar teràpies dirigides davant de components cel·lulars o moleculars que participen en aquesta resposta. Dins aquestes teràpies, la teràpia cel·lular amb cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) s'ha postulat com un bon candidat. Les MSC es caracteritzen fonamentalment per la seva capacitat immunomoduladora, cosa que ha conduït a la seva ocupació com a agents terapèutics en diferents malalties que cursen amb processos inflamatoris. Tot i això, al llarg dels últims anys, nombrosos estudis han mostrat que l'efecte terapèutic de les MSC està intervingut fonamentalment per les vesícules extracel·lulars (EVs) que alliberen. Aquestes EVs recapitulen els efectes terapèutics de les cèl·lules dorigen, per la qual cosa també presenten efectes immunomoduladors. L'ús de les EVs de MSC com a agents terapèutics presenta avantatges respecte a l'ús de les MSC com, per exemple, una bioseguretat més gran. Tot i això, l'ús clínic de les EVs encara ha de fer front a reptes com l'obtenció de grans quantitats d'EVs que constitueixin un producte clínic estable i homogeni. En aquest treball s'ha volgut avaluar, d'una banda, si les EV obtingudes de diferents biòpsies de la mateixa font tissular de MSC poden constituir un producte biològic homogeni que presenti les mateixes característiques i funcionalitat. D'altra banda, s'ha avaluat si aquestes EVs es poden fer servir com a agent terapèutic davant de la resposta inflamatòria que es desencadena després de l'IAM. Per això s'ha estudiat l'efecte immunomodulador de les EV sobre cèl·lules del sistema immune, fonamentalment macròfags, in vitro i en un model in vivo d'IAM en rates. Els resultats van mostrar que les EVs afavoreixen la diferenciació dels macròfags M1 proinflamatoris cap a un fenotip similar al M2, augmentant l'expressió de marcadors M2 i reduint la secreció de citocines proinflamatòries. A més, les VE van promoure l'activació de neutròfils in vitro i la reducció del seu estrès oxidatiu. L'administració d'EVs en rates sotmeses a IAM va esmorteir la caiguda de la funció cardíaca i va limitar l'extensió de la zona infartada als 7 i 21 dies postinfart. Les EVs també van reduir el nombre de macròfags i neutròfils proinflamatoris dins de la zona infartada, afavorint la resolució de la inflamació. En conclusió, les EVs emprades en aquest treball han demostrat ser un producte biològic estable amb independència de la biòpsia de què procedeixen, i han demostrat ser capaços d'exercir respostes pro-resolutives eficaces en un model d'isquèmia miocàrdica, cosa que les converteix en agents terapèutics potencials per tractar la inflamació a l'IAM. / [EN] Acute myocardial infarction (AMI) is one of the main causes of morbidity and mortality in developed countries. Over the last few years, it has been shown that the inflammatory response that occurs after AMI is triggered is very important in the clinical development of this pathology. If an exacerbated inflammatory response occurs, the risk of adverse cardiac remodeling and heart failure increases, but failure to trigger the inflammatory response also has negative consequences. Because of the importance of the inflammatory response in AMI, recent attempts have been made to develop therapies that target cellular or molecular components involved in this response. Within these therapies, cell therapy with mesenchymal stromal cells (MSC) has been postulated as a good candidate. MSC are mainly characterized by their immunomodulatory capacity, which has led to their use as therapeutic agents in different diseases involving inflammatory processes. However, in recent years, numerous studies have shown that the therapeutic effect of MSCs is mainly mediated by the extracellular vesicles (EVs) they release. These EVs recapitulate the therapeutic effects of the cells of origin and therefore also have immunomodulatory effects. The use of MSC-EVs as therapeutic agents has advantages over the use of MSC, such as increased biosafety. However, the clinical use of EVs still faces challenges such as obtaining large quantities of EVs that constitute a stable and homogeneous clinical product. The aim of this study was to evaluate, on the one hand, whether EVs obtained from different biopsies of the same MSC tissue source can constitute a homogeneous biological product with the same characteristics and functionality. On the other hand, we have evaluated whether these EVs can be used as a therapeutic agent against the inflammatory response triggered after AMI. To this end, the immunomodulatory effect of EVs on immune system cells, mainly macrophages, was studied in vitro and in an in vivo model of AMI in rats. The results showed that EVs favored the differentiation of proinflammatory M1 macrophages towards an M2-like phenotype, increasing the expression of M2 markers and reducing the secretion of proinflammatory cytokines. In addition, EVs promoted the activation of neutrophils in vitro and the reduction of their oxidative stress. The administration of EVs in rats subjected to AMI blunted the decline in cardiac function and limited the extent of the infarct zone at 7- and 21-days post-infarction. EVs also reduced the number of proinflammatory macrophages and neutrophils within the infarct zone, favoring the resolution of inflammation. In conclusion, the EVs used in this work have been shown to be a stable biological product regardless of the biopsy from which they are derived and have been shown to be able to exert effective pro-resolving responses in a model of myocardial ischemia, making them potential therapeutic agents to treat inflammation in AMI. / Amaro Prellezo, E. (2024). Las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales de pulpa dental como producto terapéutico frente a la respuesta inmune que se desencadena tras el infarto agudo de miocardio [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202973

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(薬学) / 甲第25233号 / 薬博第868号 / 新制||薬||244(附属図書館) / 京都大学大学院薬学研究科薬学専攻 / (主査)教授 樋口 ゆり子, 教授 寺田 智祐, 教授 山下 富義 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DGAM

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The Gram-negative bacterium Aggregatibacter actinomycetemcomitans is primarily associatedwith aggressive forms of periodontal disease. Additionally, it has occasionally been found to causemetastatic infections in non-oral sites. This requires the ability to evade the bactericidal activity ofthe complement system of the humoral immune system. Outer membrane proteins, namely,Omp100 and OmpA have been connected to normal human serum resistance for several bacteriaspecies. The objective of this study was to investigate if serum-resistant ompA mutants can beobtained, and to detect changes in OMP expression. We used A. actinomycetemcomitansserotype a strain D7SS and D7SS ompA knockouts. The strains were incubated in 50 % NHS.This resulted in a substantial decrease of survival among D7SS ompA knockouts. D7SS ompAknockouts were exposed to 50 % NHS once more to confirm stable serum resistance. 13 out of14 tested clones showed growth, indicating that serum resistant ompA mutants could begenerated. SDS-PAGE gel of extracted outer membrane vesicles revealed an additional proteinband of approximately 34 kDa in at least 4 of 5 tested serum resistant ompA mutants. This proteinband has been analyzed in the laboratory, and according to LC-MS/MS it contains an OmpAhomologue, which has been named OmpA2. We conclude that OmpA2 expression might be amajor mechanism for serum survival in A. actinomycetemcomitans serotype a strain D7SS ompAknockouts.

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O Melanoma é um tipo de neoplasia que se origina de melanócitos normalmente presentes na epiderme. Uma das características do melanoma é a capacidade de adquirir resistência a terapias. As células de melanoma podem aumentar a liberação de vesículas extracelulares (VEs) em resposta ao tratamento com quimioterápicos. A cisplatina (CDDP) e a temozolomida (TMZ) são drogas utilizadas para o tratamento de tumores. Ambas as drogas formam adutos no DNA, mas as vias de sinalização que deflagram a morte celular são distintas. O objetivo desse estudo é investigar a morte celular da linhagem B16-F10 na presença de VEs oriundas de células B16-F10 tratadas com cisplatina CDDP ou TMZ. Inicialmente as VEs oriundas de células de melanoma murino, B16-F10, tratadas com CDDP ou TMZ e seus controles, foram isoladas por ultracentrifugações sucessivas. Para os experimentos in vitro, as células foram tratadas com as drogas em combinação com as respectivas VEs. As amostras foram realizados avaliações de ciclo celular e de morte e ensaio clonogênico. Para os experimentos in vivo, as células B16-F10 foram pré-tratadas com VEs, e posteriormente, as células foram inoculadas via subcutânea em camundongos C57BL/6 e os tumores foram mensurados diariamente. Em nosso estudo concluimos que a metodologia do isolamento de VEs é eficiente. Além disso, observamos que o tratamento com CDDP ou TMZ aumenta a liberação de VEs por células tumorais. Apesar do resultado contraditorio, as VEs liberadas por células tumorais tratadas com quimioterápicos aumentam a capacidade de sobrevivência das células de melanoma in vitro. VEs oriundas de células de melanoma não participam inicialmente da sensibilização à morte de células tumorais causada pelas mesmas drogas, mas a longo prazo, as VEs oriundas de células tratadas com a TMZ podem conferir uma resposta celular de sobrevivência às células tumorais in vitro. In vivo, o resultado é inconclusivo, uma vez que para confirmar se as VEs fazem parte da adaptação tumoral conferindo fenômenos de sobrevivência celular in vivo, é necessário avaliar em outros modelos celulares e animais / Melanoma is a neoplasm derived from melanocytes normally present in the skin specifically in the epidermis. One of the malignancies of melanoma is the ability to acquire chemoresistance. Cisplatin (CDDP) and temozolomide (TMZ) are drugs used for the treatment of tumors. Both drugs can form alkylating adducts in DNA, however, the pathways that trigger cell death are distinct. Tumor cells, including melanoma, may increase the release of extracellular vesicles (EVs) in response to chemotherapeutic treatment. The aim of this study is to investigate the cell death phenomenon in B16-F10 cell line in presence of EVs derived from chemotherapeutic-treated B16-F10 cells. For in vitro experiments, the cells were treated with CDDP or TMZ in combination with EVs from chemotherapictreated samples. For in vivo experiments, B16-F10 cells were exposed to EVs and inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. The growth was measured daily. In this work, we established and characterized VEs released by melanoma cells treated with chemotherapics and we established chemotherapics treatments to isolate EVs for next EVs isolation. Our results showed that CDDP or TMZ treatment increase the release of EVs by tumor cells. The EVs released by melanoma cells after CDDP or TMZ treatment seem to increase the survival capacity of melanoma cells. Thus, we concluded that EVs derived from melanoma cells do not participate in the cell death sensitization induced by CDDP or TMZ. However, EVs derived from TMZ treated cells may offer a survival effect to tumor cells in vitro a long term. In vivo, The result is inconclusive since to confirm how VEs are part of the tumor adaptation conferring cellular survival phenomena in vivo, it is necessary to evaluate in other cellular and animal models

Na primeira parte deste trabalho foi estudada a interação da porfirina catiônica meso-tetrakis N-metil-4-piridil (TMPyP) e a porfirina aniônica meso-tetrakis 4-fenilsulfonato (TPPS4) nas formas de base livre com sistemas modelos de membrana biológica (micelas iônicas, micelas mistas e vesículas de fosfolipídios) em soluções aquosas, através das técnicas de absorção ótica, espalhamento de luz ressonante (RLS do inglês \"resonante light scattering), fluorescência e SAXS, do inglês \"Small Angle X-Ray Scattering\". As curvas de SAXS das micelas catiônicas de CTAC (cloreto de cetiltrimetilamônio) foram ajustadas como um elipsóide prolato na ausência e na presença de 2-10 mM de TPPS4. Os dados de SAXS mostraram que a presença da porfirina TPPS4 modifica o centro hidrofóbico micelar, levando a formação de micelas menores. Através das análises dos dados de SAXS das micelas de SDS (dodecilsulfato de sódio) observamos que a forma da micela na ausência e na presença de 2-10 mM TMPyP apresenta a forma de um elipsóide prolato sem mudanças. Entretanto, o coeficiente de ionização, diminuiu com o aumento da concentração de porfirina, sugerindo a \"blindagem\" da carga aniônica do SDS pela porfirina catiônica. A supressão de fluorescência da TPPS4 e TMPyP foi estudada na ausência e na presença de diferentes micelas de surfactantes, tais como as de SDS, CTAC, HPS (N-hexadecil-N,N,dimetil-3-amônio-1-propano sulfato) e TX-100 (t-octil-fenoxi-polietoxi-etanol). O iodeto de potássio (KI) foi utilizado como supressor. Os gráficos de Stern-Volmer dos dados de fluorescência no estado estacionário foram ajustados pela equação quadrática, incluindo a supressão dinâmica (KD) e estática (KS). Os valores de KS são muito menores do que os valores de KD. Os resultados da TMPyP são consistentes com as constantes de ligação reportadas na literatura: uma redução significativa de supressão acontece para a TMPyP na presença de SDS, e uma redução moderada é observada para o sistema TMPyP-HPS e quase nenhuma mudança é vista para a TMPyP na presença de TX-100. Para o sistema CTAC-TPPS4 um aumento na supressão foi observado quando comparada com a TPPS4 em tampão puro. Isto provavelmente é associado ao acúmulo de iodeto na interface da micela catiônica. A atração entre a cabeça polar do CTAC e I-, e a repulsão entre SDS e I-, aumenta e reduz a supressão de fluorescência, respectivamente, das porfirinas que se localizam na interface micelar. A pequena supressão da TPPS4 em TX-100 é coerente com a forte ligação entre a TPPS4-TX-100 reportada na literatura. A TPPS4 e a TMPyP na presença de concentrações baixas dos surfactantes CTAC e SDS, respectivamente, apresentaram formação de agregados pré-micelares. A adição de surfactante neutro, TX-100, reduziu o efeito de agregação, acompanhada pelas várias técnicas espectroscópicas utilizadas neste trabalho. Portanto, sob condições onde temos a máxima formação de agregados (porfirina-surfactante), a titulação da TPPS4 com micelas de 40%CTAC-60%TX-100 e a TMPyP com micelas de 80%SDS-20%TX-100 não foi suficiente para eliminar a agregação, apesar da diminuição significativa do efeito de supressão de fluorescência e da intensidade de luz espalhada. A interação da TMPyP com 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicero)] (POPG) e a mistura POPC + POPG é predominantemente devido à contribuição de eletrostática. O aumento da carga negativa, devido à adição de POPG, favorece a interação das vesículas com a porfirina catiônica. Na segunda parte deste trabalho foram estudados os efeitos de três surfactantes na estrutura oligomérica da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) na sua forma oxi. O estudo com o SDS, CTAC e HPS permitiu diferenciar os efeitos de cargas opostas da cabeça polar dos surfactantes na dissociação da estrutura oligomérica e na autoxidação da hemoglobina. A interação do HPS com HbGp foi claramente menos intensa que a interação desta hemoglobina com os surfactantes catiônico (CTAC) e aniônico (SDS). Provavelmente, esta menor interação da HbGp com HPS, quando comparada com o SDS e o CTAC, é devido a menor atração eletrostática entre o HPS e os sítios iônicos da proteina. Dados espectroscópicos foram discutidos e comparados com os da literatura, afim de compreender a interação hemoglobina-surfactante, e como o ponto isoelétrico ácido (pI) pode influenciar na relação da estrutura-atividade das hemoglobinas gigantes extracelulares. As amostras de HbGp foram estudadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS do inglês \"Dynamic light scattering\"). Na faixa de pH 6.0 a 8.0, HbGp é bastante estável e a distribuição de tamanho das partículas é monodispersa com um diâmetro hidrodinâmico médio (Dh) de 27 nm. O aumento dos valores de pH (pH>9.0) induziu um processo de dissociação irreversível, resultando num valor do Dh menor (10 nm). A diminuição do Dh sugere uma dissociação completa da hemoglobina. Em pH>9,0 a cinética de dissociação é lenta, com um mínimo 24 h para ser completada. As constantes cinéticas de dissociação aumentam progressivamente, com o aumento do valor do pH. As curvas de melting point para HbGp apresentaram dissociação oligomérica e desnaturação da proteina em função do pH. Os processos de autoxidação e dissociação estão intimamente relacionados, de modo que a dissociação da proteina oligomérica promove um aumento na velocidade de autoxidação e vice-versa. / In the first part of this work interactions of the cationic meso tetrakis (4-N-methilpyridil) porphyrin (TMPyP) and meso-tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrin (TPPS4) in the free base forms with membrane model systems (ionic micelles, mixed micelles and phospholipids vesicles) in aqueous solutions, have been investigated by optical absorption, resonance light scattering (RLS), fluorescence and SAXS (Small Angle X-Ray Scattering). The best-fit SAXS curves were obtained assuming for cetyltrimethylammonium chloride (CTAC) micelle a prolate ellipsoidal shape in the absence and upon incorporation of 2-10 mM TPPS4. SAXS results show that the presence of TPPS4 impacts on micellar hydrophobic core, leading to a micellar reassembling into smaller micelles. SAXS data analysis demonstrated a prolate ellipsoidal shape for sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles; no significant changes in shape and size were observed for SDS-TMPyP co-micelles. Moreover, the ionization coefficient, α, decreases with the increase of the porphyrin concentration, suggesting the \"screening\" of the anionic charge of SDS by the cationic porphyrin. These results are consistent with optical absorption, fluorescence and RLS spectroscopies data, allowing to conclude that neutral surfactants present a smaller interaction with the cationic porphyrin as compared with ionic surfactants. Fluorescence quenching of TPPS4 and TMPyP is studied in aqueous solution and upon addition of micelles of SDS, CTAC, N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propanesulfonate (HPS) and t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100). Potassium iodide (KI) was used as quencher. Steady-state Stern-Volmer plots were best fitted by a quadratic equation, including dynamic (KD) and static (KS) quenching. KS was significantly smaller than KD. For TMPyP quenching results are consistent with reported binding constants: a significant reduction of quenching takes place for SDS, a moderate reduction is observed for HPS and almost no change is seen for Triton X-100. For CTAC-TPPS4 system an enhancement of quenching was observed as compared to pure buffer. This is probably associated to accumulation of iodide at the cationic micellar interface. The attraction between CTAC headgroups and I-, and repulsion between SDS and I-, enhances and reduces the fluorescence quenching, respectively, of porphyrins located at the micellar interface. The small quenching of TPPS4 in Triton X-100 is consistent with strong binding as reported in the literature. Anionic TPPS4 and cationic TMPyP in the presence of low concentrations of the surfactants CTAC and SDS, respectively, showed formation of aggregates, monitored by optical absorption, fluorescence and resonance light scattering intensity (RLS). The addition of nonionic surfactant, Triton X-100, reduced the effect of aggregation monitored by the various techniques used in the present work. Therefore, under conditions for the maximum of aggregate formation (porphyrin-surfactant), apparently, the CTAC: TX-100 ratio equal to 40:60 and SDS:TX-100 ratio equal to 80:20 are not sufficient to eliminate aggregation, despite the significant decrease of the quenching effect of fluorescence and of the light scattering intensity. The interaction of TMPyP with 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (POPC), 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1- glycerol)] (POPG) and the mixture POPC+POPG is predominantly due to the electrostatic contribution. The increase of the negative charge, due to addition of POPG, favors the interaction of vesicles with the cationic porphyrin. On the second part of this work the effects of three surfactants upon the oligomeric structure of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in the oxy - form was studied. The use of SDS, CTAC and HPS has allowed to differentiate the effects of opposite headgroup charges on the oligomeric structure dissociation and hemoglobin autoxidation. Furthermore, the interaction of HPS with HbGp was clearly less intense than the interaction of this hemoglobin with cationic (CTAC) and anionic (SDS) surfactants. Probably, this lower interaction with HPS is due to the lower electrostatic attraction between the HPS surfactant and the protein surface ionic sites when compared to the electrostatic interaction between HbGp and cationic and anionic surfactants. Spectroscopic data are discussed and compared with the literature in order to improve the understanding of hemoglobin-surfactant interaction as well as the acid isoelectric point (pI) influence of the giant extracellular hemoglobins on its structure-activity relationship. HbGp samples were studied by dynamic light scattering (DLS). In the pH from range 6.0 to 8.0, HbGp is stable and a monodisperse size distribution with a z-average hydrodynamic diameter (Dh) of 27±1 nm is observed. More alkaline pH (pH>9.0) induced an irreversible dissociation process, resulting in smaller Dh of 10±1 nm. Dh decrease suggests a complete hemoglobin dissociation. At pH 9.0 the dissociation kinetics is slow, taking a minimum of 24 h to be completed. Dissociation rate constants progressively increase at higher pH. Melting curves for HbGp showed oligomeric dissociation and protein denaturation as a function of pH. Autoxidation and dissociation processes are intimately related, so that oligomeric protein dissociation promotes the increase of autoxidation rate and vice-versa.

Hidrogéis (redes poliméricas tridimensionais capazes de absorver grandes quantidades de água) micro e nanoestruturados têm grande potencial como biomateriais em aplicações tais como dispositivos de liberação de fármacos e agentes embólicos. Neste trabalho foram estudadas técnicas de produção desses hidrogéis micro e nanoestruturados à base de poli(N-vinil-2-pirrolidona) (PVP), a partir da reticulação do polímero através de reações de Fenton, foto-Fenton e fotólise direta. Microgéis de PVP foram obtidos a partir da reticulação de esferas obtidas por eletropulverização ou de gotículas de solução aquosa do polímero em emulsão a/o. No primeiro caso, obtiveram-se partículas que, quando reticuladas com a reação de Fenton durante o processo de eletropulverização, apresentaram formato indefinido. No segundo caso, foram obtidas microesferas de PVP, tanto pela reticulação com a reação de Fenton, obtendo-se partículas menores da - ordem de 1 µm - como com a reação de foto-Fenton, que gerou partículas maiores de - 34 µm. Hidrogéis sub-micrométricos foram obtidos a partir da formatação em vesículas de lecitina e reticulados por meio da reação de foto-Fenton. Essas vesículas foram capazes de encapsular grande quantidade de polímero, mesmo sendo este de alta massa molar média. Os hidrogéis sintetizados apresentam estreita distribuição de diâmetro, porém sem forma definida e com baixo índice de intumescimento. Por fim, nanogéis (nanopartículas de hidrogéis) foram obtidos da reticulação de PVP com a reação de Fenton (Fe2+ na presença de H2O2), utilizando como sistema formatador o interior aquoso de micelas reversas de CTAB. Os nanogéis assim formados são esféricos e apresentam propriedades interessantes, como fator de intumescimento de até 6000, inédito na literatura, que os colocam na categoria de hidrogéis superabsorventes. Além disso, o intumescimento é passível de controle tanto pela remoção dos íons Fe3+ complexados, como pela acidez e composição iônica do meio. Durante o desenvolvimento da síntese dos nanogéis foi possível estudar a influência do Fe3+ na estruturação da solução polimérica e do hidrogel. Além disso, a cinética da reticulação do polímero dentro das micelas e uma comparação entre dois sistemas micelares diferentes na formatação do nanogel foram analisados. A análise do produto também permitiu constatar a baixa toxicidade do material obtido com testes in vitro utilizando macrófagos e fibroblastos. / Micro and nanostructured hydrogels (three-dimensional polymeric networks capable of absorbing large amounts of water) have great potential as biomaterials in applications such as drug delivery devices and embolic agents. In this work techniques to produce micro and nanostructured hydrogels from poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) (PVP) were studied from various crosslinking reactions like Fenton, photo-Fenton and direct photolysis. PVP microgels were obtained from crosslinking of polymer spheres obtained by electrospraying a polymer solution or from droplets of aqueous polymer solution in w/o emulsion. In the first case, particles were obtained that, when crosslinked with the Fenton reaction, showed undefined morphology. In the second case, spherical PVP hydrogel microparticles were obtained, which were formed by crosslinking with Fenton reaction, resulting in smaller particles - about 1µm - while with photo-Fenton reaction it generated larger particles - about 34 µm. Sub-micrometric hydrogels were obtained from lecithin vesicles as formatting system through crosslinking with photo-Fenton reaction. These vesicles were able to encapsulate large amounts of polymer, in spite of its high average molecular weight. Hydrogels synthesized by this method are formless, with narrow diameter distribution and low swelling properties. Finally, nanogels (hydrogel nanoparticles) were obtained from crosslinking of PVP by the Fenton reaction (Fe2+ in presence of H2O2), using aqueous pool of CTAB reverse micelles as formatting system. The thus formed nanogels are spherical and present interesting properties such as swelling ratio of 6000, a level unreported in literature, which classifies them as superabsorbent hydrogels. Moreover, the swelling is susceptible to control either by the removal of complexed Fe3+ ions or by acidity and ionic composition of the medium. During the nanogels synthesis development, the influence of Fe3+ in the arrangement of the polymer solution and of the hydrogel was studied. Morever, the polymer crosslinking kinetics inside the micelles and a comparison between two different micellar systems in formatting of nanogel were analyzed. The product analysis also revealed low toxicity of the obtained material by in vitro experiments using macrophages and fibroblasts.

As células que compõem o tumor podem interagir entre si, através da liberação e incorporação de vesículas extracelulares, muitas vezes contribuindo para a progressão tumoral. Dessa maneira, o presente trabalho teve como objetivo observar se as vesículas extracelulares , como as microvesículas e os exossomas liberados pelas células cancerosas em condições de estresse celular, após quimioterapia e indução de hipóxia conferem alguma vantagem adaptativa às células tumorais. Nossos resultados mostram que vesículas liberadas por células de melanoma humano em hipóxia ou normóxia apresentam tamanho médio característico de exossomos e microvesículas e não modulam os processos de proliferação, morte e migração celular. As vesículas liberadas pelas células após tratamento com o quimioterápico temozolamida também apresentam tamanho característico de exossomos e microvesículas; em adição, o tratamento com a temozolamida induziu um aumento na secreção dessas vesículas pelas células de melanoma. A incubação das células tumorais com vesículas oriundas da terapêutica com a temozolamida aumentou a proliferação celular, conferindo vantagem proliferativa às células de melanoma humano / Tumor cells can interact with each other by releasing and incorporating extracellular vesicles, contributing to tumor progression. Therefore, the aim of this study was to evaluate if extracellular vesicles, such as microvesicles and exossomes, released by cancer cells under cell stress conditions like chemotherapy and hypoxia, induce an adaptive advantage to tumor cells. Our results show that vesicles shed by human melanoma cells under hypoxia, or normoxia exhibit the characteristic size of exossomes and microvesicles and do not modulate cell proliferation, death or migration. The vesicles released by melanoma cells after temozolomide treatment also showed the average size of exossomes and microvesicles; moreover, temozolomide treatment induced an increase in extracellular vesicles shedding by tumor cells. Incubation of tumor cells with vesicles released under temozolamide therapeutics caused an increase in cell proliferation, providing a proliferative advantage to human melanoma cells

In der synaptischen Vesikelmembran adulter Neuronen bildet Synaptobrevin mit Synaptophysin den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex. Der Komplex wird im Gegensatz zum SNARE-Komplex nicht in embryonalen Membranen gebildet, sondern erst während der neuronalen Entwicklung hochreguliert. Dabei erfährt Synaptophysin wahrscheinlich eine posttranslationale Modifizierung, die durch einen niedermolekularen Faktor bewirkt wird. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex spielt eine entscheidende Rolle innerhalb der Präsynapse bei der Bereitstellung von Synaptobrevin zur Bindung seiner SNARE-Partner an der Plasmamembran. Im Zustand erhöhter exozytotischer Aktivität der Synapse beschleunigt der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex die Rekrutierung von Synaptobrevin für eine erneute Bildung des SNARE-Komplexes und ermöglicht damit schnelle Exozytose-Endozytose-Zyklen bei erhöhter präsynaptischer Stimulation. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und der SNARE-Komplex schließen sich gegenseitig aus. Synaptische Membranen sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaut, welche miteinander in Wechselwirkungen stehen. Innerhalb der Membranen formieren sich Subdomänen wie Lipid Rafts die durch eine besondere Lipidzusammensetzung stabilisiert werden und mit speziellen Proteinen bevorzugt assoziieren. Durch die spezielle Organisation des Membranaufbaus können die Prozesse der Endozytose und der Exozytose zum Teil reguliert werden. Synaptische Vesikel, die zu den kleinsten Zellorganellen zählen, zeigen einen besonders hohen membranären Cholesterolgehalt. Synaptophysin ist ein integrales Membranprotein synaptischer Vesikel und konnte zusätzlich als spezifisch cholesterolbindendes Protein identifiziert werden. Durch die Assoziation mit cholesterolreichen Nanodomänen der synaptischen Vesikelmembran könnten die Funktionen von Synaptophysin bei der Membranstabilisation und im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex der synaptischen Vesikelmembran beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nach Cholesterolverminderung der Membranen von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen mittels Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin Synaptophysin in dem Detergens Triton X-100 unlöslicher wird. Die Cholesterolverminderung der Membranen von Neuronen aus Rattengehirngewebe und Hippokampuskulturen mittels Methyl-ß-cyclodextrin und Lovastatin führte weiterhin zu einer verminderten Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in der synaptischen Vesikelmembran. Somit scheint die Cholesterolassoziation von Synaptophysin und damit die Organisation der synaptischen Vesikelproteine innerhalb von Membrandomänen entscheidend an der Regulation der Proteininteraktionen im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex beteiligt zu sein. Zusätzlich trägt Synaptophysin durch seine Cholesterolbindung wahrscheinlich zur Stabilisierung des hohen Krümmungsgrades der Membran der synaptischen Vesikel bei. Die Auswirkungen des verminderten Cholesterolgehaltes auf Synaptophysin und den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex konnten auch bei homozygoten Mausmutanten für die Niemann-Pick Krankheit nachgewiesen werden. Der Cholesterolgehalt synaptischer Vesikel ist also für die Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes entscheidend und beeinflusst direkt die synaptische Effizienz. / Synaptobrevin interacts with synaptophysin in membranes of adult small synaptic vesicles and forms the synaptophysin/synaptobrevin complex. In contrast to the SNARE complex the synaptophysin/synaptobrevin complex only occurs in adult rat brain but is absent in embryonic brain. Changes in the binding properties of synaptophysin are probably induced by a factor of low molecular weight and correlate with posttranslational modifications of the protein. The synaptophysin/synaptobrevin complex plays an important role within the presynaptic terminal promoting synaptobrevin to bind its SNARE partners at the plasma membrane. In times of increased synaptic activity at the synapse the synaptophysin/synaptobrevin complex accelerates the recruitment of synaptobrevin to form new SNARE complexes and allows for fast exocytotic/endocytotic cycles. The synaptophysin/synaptobrevin complex and the SNARE complex are mutually exclusive. Major constituents of synaptic membranes are lipids and proteins which are subjected to continuous interactions. Within the membrane form specialized environments known as lipid rafts that are stabilized through tightly packed lipids and proteins that associate preferentially with these domains. The characteristic organisation of membrane structures is crucial for regulating the process of endocytosis and exocytosis. Synaptic vesicles are among the smallest cell organelles and are especially enriched in cholesterol. The integral membrane protein synaptophysin in addition was identified as a major specifically cholesterol-binding protein. Lateral association with cholesterol enriched subunits of the synaptic vesicle membrane may contribute to mediate the functions of synaptophysin in stabilising membrane structures and may in part regulate synaptophysin/synaptobrevin complex formation. Here we show that depletion of the cholesterol content of CHOp38 cell and PC12 cell membranes by Filipin and Methyl-ß-cyclodextrin significantly changes the solubility of synaptophysin in non-ionic detergents like Triton X-100. After cholesterol depletion of adult rat brain and primary cultures of mouse hippocampus by Methyl-ß-cyclodextrin and the HMGCoA-reductase inhibitor Lovastatin the synaptophysin/synaptobrevin complex was seen to be downregulated. Thus, the synaptophysin/synaptobrevin interaction critically depends on high cholesterol content of the synaptic vesicle membrane. Thereby, synaptophysin likely contributes to stabilise the high membrane curvature of synaptic vesicles. The effects of cholesterol depletion on functional properties of synaptophysin and the synaptophysin/synaptobrevin complex could also be shown on homozygous littermates of the mouse model of Niemann-Pick type C disease. Our investigation indicates that the cholesterol content of synaptic vesicles appears to be important for the fusion of the synaptophysin/synaptobrevin complex and directly affects synaptic efficiency.